Name: 1,2- Azaborines의 합성과 T4 리소자임 돌연변이와 그들의 단백질 복합체의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 학습하세요 1,2-azaborine 합성 및 T4 리소자임 돌연변이와의 단백질 복합체 제조 방법을. 이 기술은 생의학 연구에서 새로운 약물 개발 가능성을 탐구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) NIGMS (R01-GM094541)와 보스턴 칼리지(Boston College)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Ducruix, A., Giége, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDucruix%2C+A+%22Crystallization+of+Nucleic+Acids+and+Proteins%2C+A+Practical+Approach%22">Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach</a>. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).</li>
<li>Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v08-110#.WLBilzsrLIU">B-N as a C-C substitute in aromatic systems.</a> Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).</li>
<li>Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644658">Recent Advances in Azaborine Chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).</li>
<li>Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25469827">Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties.</a> Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).</li>
<li>Zhou, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+isomerism%3A+a+boron-nitrogen+surrogate+for+a+carbon-carbon+double+bond+increases+the+chemical+diversity+of+estrogen+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands.</a> Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).</li>
<li>Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+binding+property+of+isoelectronic+analogues+of+nucleobases%2C+B%286%29-substituted+5-aza-6-borauracils+and+-thymines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines.</a> Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).</li>
<li>Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BN%2FCC+isosterism+in+borazaronaphthalenes+towards+phosphodiesterase+10A+%28PDE10A%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).</li>
<li>Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzazaborinines+as+Novel+Bioisosteric+Replacements+of+Naphthalene%3A+Propranolol+as+an+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example.</a> J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).</li>
<li>Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01060a034">New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).</li>
<li>White, D. G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00905a022">2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).</li>
<li>Ashe III, A. J., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthesis+of+Aromatic+Five-+and+Six-Membered+B%E2%88%92N+Heterocycles+via+Ring+Closing+Metathesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis.</a> Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).</li>
<li>Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hybrid+Organic%2FInorganic+Benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Hybrid Organic/Inorganic Benzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).</li>
<li>Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+Group-Free+Synthesis+of+1%2C2-Azaborines%3A+A+Simple+Approach+to+the+Construction+of+BN-Benzenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).</li>
<li>Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodium-catalyzed+boron+arylation+of+1%2C2-azaborines%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).</li>
<li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond%3A+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1%2C2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li>
<li>Knack, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355270">BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).</li>
<li>Eriksson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+a+Protein+Structure+to+Cavity-Creating+Mutations+and+Its+Relation+to+the+Hydrophobic+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect.</a> Science. 255 (5041), 178-183 (1992).</li>
<li>Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cavity-containing+mutant+of+T4+lysozyme+is+stabilized+by+buried+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene.</a> Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).</li>
<li>Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+Origins+of+Specificity+of+Ligand+Binding+in+an+Interior+Nonpolar+Cavity+of+T4+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme.</a> Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).</li>
<li>Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+Binding+Site+for+Testing+Scoring+Functions+in+Molecular+Docking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking.</a> J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).</li>
<li>Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Bonding+of+1%2C2-Azaborines+in+the+Binding+Cavity+of+T4+Lysozyme+Mutants%3A+Structures+and+Thermodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics.</a> J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).</li>
<li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280707532_Organoboranes_43_A_convenient_highly_efficient_synthesis_of_triorganylboranes_via_a_modified_organometallic_route">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li>
</ol>

모든 저자는 이 원고에 대해 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜의 첫 번째 부분에서는 이전에보고 된 방법 (12, 13)에 기초하여 1,2- azaborines의 변형 합성을 설명했다. Triallylborane 22 제조 allyltriphenyl 주석 칼륨 allyltrifluoroborate를 사용 경로에 대한 대체물로서 사용 하였다 N 알릴 N -TBS- B 알릴 클로라이드의 부가 물 (1). 이 방법은 더 많은 원자를 경제적이고 환경 친화적 인 접근을 허용한다. N -TBS- B -Cl -1,2- azaborine (3)의 합성에 대해, 한 포트, 두 단계의 순서 (산화이어서 복분해 폐쇄 링)은 이전보다 더 높은 절연 수율로 이어지는 채용했다 중간체 (2)</strong...

헤테로 사이클 (즉, 1,2- azaborines)를 포함하는 붕소 - 질소는 최근 아렌의 isosteres로 크게 주목 받고있다. 이 isosterism 화학 공간 2, 3, 4를 확장 기존 구조 모티프의 다변화로 이어질 수있다. Azaborines 특히 화학자 라이브러리 구조적 기능적으로 중요한 분자의 합성을 수행하는 의약 화학 분야에서 생물 의학 연구 5, 6, 7, 8에서의 응용 가능성 유용성을 갖는다. 현저하게, 그러나 동시에 사용할 아렌 - 함유 분자에 다수의 잘 개발 된 합성 경로가, azaborines의 합성 방법에 한정 수가보고되었다 (9), (10) </s&gt; 11, 12, 13입니다. 이는 합성 순서의 초기 단계에서의 붕소 원과 공기와 분자의 습기 민감성 옵션의 수가 제한을 주로한다. 이 문서의 첫 부분에서, 우리는 (3)의 표준 공기없는 기술을 사용하여 N -TBS- B -Cl -1,2- azaborine의 멀티 그램 규모의 합성을 설명한다. 이 화합물은 더 이상의 구조적으로 복잡한 분자 (14) (15)에 작용 화 될 수있는 다목적 중간체로서 작용한다. 3부터 단백질 결합 연구에 사용하기위한 N -H- B의 에틸 -1,2- azaborine (5)의 합성 및 정제를 설명한다. (5)의 변동성으로 인해 효율적인 분리는 반응 온도, 시간, DIST의 정밀한 제어를 필요추리 조건. 두 번째 부분에서, 단백질 발현 및 T4 라이소자임 돌연변이 (L99A 및 L99A / M102Q) (17), (18, 19)의 분리를위한 프로토콜은 20 단백질 결정화 단백질 - 리간드 결정 복합체의 제조 다음으로 제시한다. T4 라이소자임 돌연변이 L99A 및 L99A / M102Q는 NH가 azaborine 분자 (17)를 함유 한 수소 결합 능력을 조사하는 생물학적 시스템 모델로 선택했다. 표준 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 단백질을 대장균 RR1 균주에서 발현 및 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)에 유도된다. 단백질 정제는 이온 교환 컬럼 크로마토 그래피를 이용하여 수행된다. 단백질 결정화 매달려 사용 (겔 전기 영동으로&gt; 95 % 순도) 정제 된 단백질의 고농도 용액으로 수행증기 확산 방법을 놓습니다. 때문에 산소 본 연구의 리간드의 민감성, 단백질 - 리간드 복합체는 공기가없는 조건에서 제조된다.

<table><tbody><tr><td>테트라하이드로푸란(THF), 억제제 없음, HPLC용, &ge; 99.9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 에테르(Et2O), HPLC용, &ge; 99.9%, 억제제가 없는</td><td>시그마 알드리치</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 클로라이드&nbsp; (CH2Cl2), (안정화/인증 ACS)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>펜탄, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 하이드라이드(CaH2), 시약 등급, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td></td></tr><tr><td>활성탄에 발화성 팔라듐 (Pd / C), 10 중량 % Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M 삼염화 붕소 용액 헥산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td><td>고독성 / 발화성</td></tr><tr><td>트리 에틸 아민, &ge; 99.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st 세대 촉매&nbsp;</td><td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol, 무수, 99.8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>에틸리튬 용액, 0.5&nbsp; 벤젠 / 시클로 헥산</td><td>시그마 알드리치</td><td>561452</td><td>고독성 / 발화성</td></tr><tr><td>HCl 용액의 M, Et2O</td><td>시그마 알드리치</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-메틸 부탄, 무수, &ge에서 2.0 M; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani 및 Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4 라이소자임 WT* (L99A)</td><td>애드진</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 라이소자임 돌연변이(S38D L99A M102Q N144D)</td><td>애드진</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨염</td><td>시그마 알드리치</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필-&베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>소듐 포스페이트 단염기성 무수</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>소듐 인산염 이염기성 무수</td><td>피셔</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>소듐 클로라이드</td><td>피셔</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>부식성</td></tr><tr><td>열 과학 피어싱 DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; Sepharose 빠른 흐름 양이온 교환 미디어</td><td>피셔</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 아지드</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>고독성</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>피셔</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>싸토리우스&nbsp; Vivaspin 20 원심 농축기</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxyethyl disulfide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paratone&nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC 투석 멤브레인 튜빙 12,000에서 14,000 Dalton MWCO&nbsp;</td><td>피셔</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>극저온 튜브,</td></tr><tr><td>루프 모양 CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td>, <td>극저온 통</td></tr>, <tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>소프트웨어에서 전자 밀도 이미지가 생성됩니다.</td></tr></tbody></table>

1,2- azaborines의 합성과 t4 리소자임 돌연변이와 그들의 단백질 복합체의 제조

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

우리는 표준 air-free 기술과 증기 확산에 의한 T4 라이소자임 돌연변이와의 단백질 복합체 준비를 사용하여 1,2-azaborines의 일반적인 합성을 설명합니다. 산소 및 수분에 민감한 화합물은 진공 가스 매니폴드 또는 글로브 박스를 사용하여 불활성 대기(N2) 하에서 준비되고 분리됩니다. 아자보린 합성의 예로, 휘발성 N-H-B-에틸-1,2-아자보린의 합성 및 정제를 제품 분리를 위한 증류 및 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 5단계 시퀀스로 입증합니다. T4 라이소자임 돌연변이 L99A 및 L99A/M102Q는 대장균 RR1 균주로 발현됩니다. 카르복시메틸 이온 교환 컬럼을 사용한 화학적 세포 용해 후 정제를 위한 표준 프로토콜은 결정화를 위한 충분히 높은 순도의 단백질을 제공합니다. 단백질 결정화는 행잉 드롭 증기 확산 방법을 사용하여 서로 다른 pH 범위에서 다양한 농도의 침전제에서 수행됩니다. 작은 분자를 사용한 복합 준비는 불활성 분위기 하에서 증기 확산 방법으로 수행됩니다. 결정 복합체의 X선 회절 분석은 단백질 결합 부위와 1,2-아자보린 사이의 결합 상호 작용에 대한 명확한 구조적 증거를 제공합니다.

1,2-azaborines에 대한 개략적 인 합성 경로는 그림 1과 같다. 이 프로토콜은 다섯 가지 붕소 - 질소 함유 분자의 합성에 적용됩니다. 도 2는 목적하는 생성물 (3)의 형성을 모니터링하는 단계 130의 과정 동안 측정 된 11 B NMR 스펙트럼을 나타낸다. 단백질 정제는 저압 크로마토 그래피 시스템 및 대표적인 크로마토 그램은도 3에 도시를 사용하여 수행 하였다. 수집 된 분획의 순도는 SDS-PAGE에 의해 결정 하였다. T4 라이소자임 돌연변이 L99A의 결정도 4에 도시된다. 그림 5는 않은 모델로 전자 밀도와 결합 리간드 5 정제 후 바인딩 공동으로 L99A 바인딩 주머니를 보여줍니다.

1,2-azaborines의 합성 및 T4 lysozyme 돌연변이와의 단백질 복합체의 준비를 위한 프로토콜이 제시됩니다.

1,2- Azaborines의 합성과 T4 리소자임 돌연변이와 그들의 단백질 복합체의 제조

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 1, 2-Azaborine을 합성하는 일반적인 방법과 생의학 연구에서의 잠재적 응용 분야를 설명하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 어디서나 볼 수 있는 벤젠 모티프의 융합 붕소 함유 이소스터인 1, 2-azaborine 화합물을 확실하게 합성할 수 있다는 점입니다. 설명된 전구체는 잠재적으로 더 복잡한 분자로 추가 기능화될 수 있습니다.1, 2-azaborine을 이용한 단백질 복합체 제조는 향후 생의학 연구 적용에 대한 통찰을 제공할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고리 폐쇄 생성물을 준비하십시오. 톨루엔에 녹아 있는 이 준비된 생성물에 14 g의 팔라듐 탄소 촉매를 첨가하십시오.그 다음, 박스에서 플라스크를 꺼냅니다. 질소로 퍼지하고 냉각수가 연결된, 오븐 건조된 24/40 환류 냉각기를 플라스크에 장착합니다. 플라스크를 오일 배스에 넣고, 교반하면서 반응물을 135 °C에서 격렬하게 환류될 때까지 가열합니다.반응물을 16시간 동안 환류 상태로 유지합니다. 그 후, 플라스크를 오일 배스에서 꺼내어 반응물을 실온까지 냉각합니다. 냉각이 완료되면, 반응 플라스크의 환류 냉각기를 셉텀으로 교체합니다.오븐에서 건조한 Luer Lock 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 5 milliliter 분주액을 취합니다. 이 분주액을 스크류 캡 NMR 튜브로 옮깁니다. Boron-11 NMR을 통해 샘플을 분석합니다.반응이 불완전한 경우, 반응 플라스크를 글로브 박스로 옮깁니다. 그런 다음, 팔라듐 탄소 3g을 추가로 넣습니다. 다음으로, 플라스크를 글로브 박스에서 꺼냅니다.질소로 퍼지하고 냉각수가 연결된 24/40 환류 냉각기를 플라스크에 장착합니다. 오일 배스를 사용하여 반응물을 135 °C에서 격렬하게 환류시키며 24시간 동안 교반하며 가열합니다. Boron-11 NMR을 사용하여 다른 분취액을 분석함으로써 반응이 완료되었는지 확인합니다.그 후, 반응 플라스크를 다시 글로브 박스로 옮깁니다. 페이퍼 와이프로 충전된 플래시 크로마토그래피 컬럼에 반응 혼합물을 통과시킵니다. 그런 다음, 교반 바가 들어 있는 1 L 라운드 바텀 플라스크에 여과액을 수집합니다.컬럼을 50 milliliters의 toluene으로 세척합니다. 여과액이 담긴 용기를 글로브 박스에서 꺼내 질소 라인이 연결된 진공 가스 매니폴드에 연결합니다. 플라스크 아래에 항온수조를 배치하고, 용매를 포

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록...

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

시스의 입체 이성질체 한 냄비 준비를위한 프로토콜 - N-TS-iodoaziridines 설명한다. N-TS aldimines과 보석 - 디요오다 이드 iodoaziridines에 중간 아미노산이 입증되고의 고리 화 반응에 diiodomethyllithium, 추가의 생성. 또한 신속하고 정량적 크로마토 그래피에 가장 적합한 고정상을 평가하는 프로토콜이 포함된다.

합성 및 크로마토 그래피에 대한 최적의 고정상의 양이 선택의 참여 Iodoaziridines의 정화

여기에서는 아지드 함유 아미노산을 유전적으로 통합한 후 균주 촉진 아지드-알킨 고리첨가(SPAAC)에 의해 아지드를 화학 프로브와 결합하여 항체 조각에 화학적 프로브를 부위 특이적으로 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

1-azoniabicyclo [4.1.0] 헵 tosylate 같은 bicyclic aziridinium 이온 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]에서 생성 된 대체 piperidines regio-및 stereospecific 통해 azepanes의 준비를 위해 이용 되었다 aziridine 반지-다양 한 nucleophiles로 확장입니다. 이 매우 효율적인 프로토콜을 사용 하면 다양 한 azaheterocycles fagomine, febrifugine 아날로그 및 balanol 같은 천연 제품을 포함 하 여 준비 수 있었습니다.

Azaheterocycles의 합성에 대 한 안정적인 Bicyclic Aziridinium 이온과 그들의 반지 개통 준비

3-Aroyl-N-하이드록시-5-니트로인돌은 1단계 열 절차에서 공액말단 알키논과 함께 4-니트로니트로소벤젠의 사이클로첨가에 의해 합성되었다. 니트로소아렌 및 알키논의 제조는 상응하는 음일린 및 알키놀상에서 산화 절차를 통해 적절히 보고되었다.

알키논을 곁들인 4-니트로니트로소벤젠의 사이클로추가에 의한 3-Aroyl-N-hydroxy-5-니트로인돌의 직접, Regioselective 및 원자-경제적 합성

이 연구에서, 우리는 비에마미드 B와 D를 포함한 알칼로이드의 비대칭 합성에 사용되는 아지리딘-2-카르복실레이트의 거울상 이성질체와 (-)-에피알로-이소무스카린을 모두 준비한다.

에난티오퓨어 비활성화 아지리딘의 제조 및 비에마미드 B, D, 및 에피알로-이소무스카린의 합성

이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.

돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

비활성화 및 활성화된 아지리딘을 함유하는 인접한 비사지리딘을 비대칭 유기 분석적 아지리디네이션에 의해 합성한 후, 산성 또는 염기성 조건 하에서 화학선택성 개환 반응을 실시하였다. 활성화되지 않은 아지리딘 고리는 산성 조건에서 반응성이 적은 친핵체로 열리는 반면, 활성화된 아지리딘 고리는 염기성 조건에서 더 반응성이 높은 친핵체로 열립니다.

위치 선택적 개환 반응을위한 연속 비사 지리딘의 제조

이 프로토콜은 양이온성 펩타이드 Mel4와 펩타이드 모방 RK758의 항균 활성과 세포독성을 생성하고 평가하는 방법을 설명합니다. 화학 합성, 재조합 발현, 표준화된 기능 분석법을 통합함으로써, 펩타이드 및 소분자 모방체의 생산 및 시험을 위한 효율적인 워크플로우를 제공합니다.

항균 펩타이드 및 그 모방체의 생산 및 시험

X선 자유전자 레이저 및 싱크로트론 소스에서 연속 결정학을 위한 지질 입방상의 막 단백질 미세결정의 준비 및 전달 절차를 설명합니다. 이러한 프로토콜은 또한 용해성 단백질 미세결정의 통합 및 전달에 적용할 수 있으며, 이로 인해 액체 주입에 비해 샘플 소비를 크게 줄일 수 있습니다.

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

학습하세요 1,2-azaborine 합성 및 T4 리소자임 돌연변이와의 단백질 복합체 제조 방법을. 이 기술은 생의학 연구에서 새로운 약물 개발 가능성을 탐구하는 데 활용됩니다.

1,2- Azaborines의 합성과 T4 리소자임 돌연변이와 그들의 단백질 복합체의 제조

더 많은 동영상 탐색