Name: 신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 신생아 마우스 췌장에서 랑게르한스 섬을 효과적으로 분리하는 방법을. 콜라게나제 소화와 수동 채취를 통해 20~80개의 섬 클러스터를 얻을 수 있으며, 이는 인슐린 분비 및 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

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동물 사용이 프로토콜 M에 규정 된 절차를 다음 / 구에 대한 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 / (181) 11. CD1 또는 CBA / BL6 마우스는 상용 공급 업체에서 구입 및 신생아 쥐를 얻기 위해 밴더빌트 동물 시설에서 교차했다. 마우스 1. 준비, 재고 솔루션 및 장비 <ol><li> 마우스 크로스의 경우 : 마우스 십자가를 설정하고 실험 계획을 돕기 위해 연결 날짜를 기록합니다. CD1 마우스는 보통 짝짓기 후 하루 (19)의 주위에 출산을 제공합니다. 사용 CD1 또는 CBA / BL6은 각각 CD1 또는 CBA / BL6 신생아를 얻기 위해 십자가. 두 선 사이의 Intercrosses는 CD1의 여성과 CBA / BL6 남성을 사용한다. </li><li> 콜라게나 주식에 대한 : 고정밀 밸런스 200 mg의 콜라겐 유형 IV 무게. 50 ML의 원심 분리기 튜브에 전송합니다. 칼슘 40 ㎖의 HBSS에 용해 2+ / 마그네슘 2+ (각각 1.26와 0.5 밀리미터는) 5 ㎎ / ㎖의 원액을 확인합니다. <ol><li> 에 콜라게나 허용부드러운 흔들림과 함께 ~ 30 분 동안 용해. 나누어지는 및 1 년 이상 활성 상태를 유지 재고 한 -20 ° C에 냉동 솔루션을 유지. </li></ol></li><li> 해부 및 섬 따기위한 핀셋, 가위, 및 P20 팁 몇 쌍을 소독하기 위해 압력솥. </li><li> 1 M 포도당 주식에 대한 : 50 mL의 원심 분리기 튜브에 9g 포도당 무게 포도당을 용해 50 mL의 RPMI에게 1640 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사용할 때까지 4 ° C에 보관하지,하지만 6 개월 이상. </li></ol> 2. 작업 솔루션 참고 : 섬 분리의 날, 다음과 같은 시약을 준비합니다. <ol><li> 콜라게나 제 타입 IV 가공 솔루션 : 해동 얼음에 콜라게나 주식을 희석. 각각 1.7 mL의 미세 원심 분리 관에 0.15 mL의 주식을 분배. 칼슘 / 마그네슘 2+와 1.35 ㎖의 HBSS를 추가합니다. 튜브 5 번 반전. 15 분 동안 얼음에 둡니다. <ol><li> 미세 원심에서 3 분 동안 고속으로 회전. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 사용할 때까지 얼음에 남겨주세요. 불용성 이물질와 튜브를 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 전체 RPMI 1640 미디어 : 500 ㎖의 RPMI 1640 미디어에 2.5 mL의 1 M 포도당, FBS 불 활성화 50ml의 열, 5 ㎖의 100 배 펜 연쇄상 구균 주식을 추가합니다. 사용할 때까지 얼음에 둡니다. </li></ol> 3. 췌장의 분리 및 소화 <ol><li> 승인 된 프로토콜에 따라 잘린 다음 이소 플루 란과 신생아를 안락사. </li><li> 배꼽이 위를 향와 마우스를 놓습니다. 살균 70 % 에탄올로 스프레이. </li><li> 핀셋으로 배꼽 피부를 들어 올려 흉곽의 생식기 영역에서 가위와 정중선을 따라 길이 방향으로 피부와 근육 층을 잘라. 이것은 모든 내부 장기를 노출 복강을 엽니 다. </li><li> 핀셋으로 100cm 접시에 모든 내부 장기를 전송합니다. 위장과 비장과 십이지장 (11)에 달라 붙는 복부 부분에 달라 붙는 지느러미 부분과 분산 - 장기 인 췌장을 찾습니다. </리&gt; <li> 장기 잠수함하기 위해 접시에 HBSS를 추가합니다. 용액에서, 췌장 조직이 더 이상 십이지장, 위, 비장에 집착하지 않는다. 이 때문에 전형적인 화이트 색상의 해부 범위에서 쉽게 인식 할 수있다. HBSS로 새로운 60mm 요리에 떨어져 주변 조직 및 전송에서 췌장 조직을 박리 핀셋을 사용합니다. </li><li> 어떤 차원에서 5mm보다 작은 조각으로 가위 각각의 췌장을 잘라. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 최대 5 pancreata는 (P7 미만) 하나의 튜브에 소화 할 수있다. P8-P16 마우스의 경우, 췌장 당 하나의 튜브를 사용합니다. </li><li> 각각의 튜브에 1 ML의 콜라게나 작업 용액 (각 P1-P7 췌장 0.2 mL 씩 P8-P16 췌장 0.5 mL로 사용합니다.) - 0.5를 추가합니다. 최대 15 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 튜브를 남겨주세요. 튜브 두 번 모든 분을 반전. </li><li> ~ 5 분 후, 췌장 조직의 분해 상태를 모니터링하기 위해 상기 튜브를 탭. 췌장의 대부분까지 소화 과정을 계속조직은 직경 &lt;2mm와 같은 파편 세포 클러스터를 나타납니다. 해물 정상 선방 세포자가 분해에 의한 흐림을 나타납니다. </li></ol> 4. 해물 세척 <ol><li> 미세 원심에서 10 초 동안 500 XG에 해물 스핀. P1,000의 pipetman에 뜨는 층을 제거합니다. 상층 액은 혼탁하지만 세포 클러스터없는 나타납니다. 빠르게 인해 일부 끈적 DNA의 존재에 맨 아래에있는 조직 조각을 멀리 대기음 수있는 구토물이기도를 사용하지 마십시오. </li><li> 1 mL의 RPMI 1640 전체 미디어를 추가합니다. 조각난 해물을 재현 탁 부드럽게 튜브를 누릅니다. 최대 반전 10 배 아래로. 단계를 반복 4.1. </li><li> 단계를 반복 4.2 두 번 이상 또는 상등액을 분명히 나타날 때까지. 1 mL의 완전한 RPMI 1640 배지에서 세척 췌장 조각을 다시 일시 중지합니다. </li></ol> 5. 작은 섬 격리 참고 : pancreata의 작은 번호는 직접 손으로 따기 아래 (5.1) 섬의 ISOL 사용할 수 있습니다ATION. pancreata 많은 경우 (&gt; 6), 5.2에서 설명하는 방법이 바람직하다. <ol><li> 직접 손으로 따기 : <ol><li> 60 밀리미터 접시 단계 4.3에서 해물을 전송합니다. 5 ㎖ 전체 RPMI 1640 미디어를 추가합니다. 해부 현미경으로 가져옵니다. </li><li> 현미경의 시야 조명을 설정합니다. 빛의 세기 최대 전력의 ~ 50 %를 조정합니다. 이 상태에서, 독도는 선포 세포와 같은 어두운 불규칙한 모양의 클러스터 반면 (그림 1A)로 약간 핑크 클러스터를 나타납니다. ~ 50X (목적의 힘과 눈 조각을 결합)의 확대가 가시화 섬의 가장 좋은 방법 및 따기위한 동시에 피펫 팁 오프닝을 제공하는 것이 좋습니다. </li><li> 선포 클러스터를 피하면서 P20 피펫 팁과 섬을 선택합니다. 분배 RPMI 전체 미디어 (그림 1B)와 새로운 60mm 요리에 분수를 섬이 풍부한. </li><li> 두 번 더 핸드 피킹 과정을 반복합니다. 새로운 60 순수한 독도를 남겨4 mL의 전체 RPMI 미디어 (그림 1C)와 mm 접시. </li></ol></li><li> 그라데이션 원심 분리 : <ol><li> 1.077 g / ㎖의 밀도로 2 ML의 polysucrose 나트륨 diatrizoate 미리로드 된 15 mL의 원심 분리기 튜브를 준비합니다. 사용할 때까지 얼음 튜브를 남겨주세요. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 polysucrose 나트륨 diatrizoate 솔루션의 상단에 단계 4.3에서 정지를 전송합니다. 바닥 층을 방해하지 마십시오. 최대 새로 태어난 10 2 pancreata P17에서 조직은 각각 15 mL의 튜브에로드 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 스윙 로터에 ~ 600 XG에 튜브를 스핀. 브레이크 오프 설정을 사용합니다. </li><li> 원심 분리 후, 새로운 15ml를 튜브에 미디어 및 계면 층 (이상적인 동작 조건에서 아일렛 원심 분리 후 polysucrose 문화 매체 사이의 계면에 위치 될 것이라는 점에 유의) 옮긴다. 10 mL의 미디어를 추가 부드럽게 잘 섞는다. </li><li> 작은 섬이 풍부한 부분을 스핀 다운5 분 300 XG에. 세척 용지를 제거합니다. 전체 RPMI 매체와 세척을 한 번 더 반복합니다. 대부분 섬 및 덕트 (그림 1D)를 포함 4 mL의 미디어에의를 Resuspend 펠릿. </li><li> 5.1 절에 설명 된대로 독도를 손으로 선택합니다. </li></ol></li></ol> 격리 된 독도 6. 국제 대학원 분석 실험 <ol><li> 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간 동안 전체 RPMI 미디어의 단계 5.1.4에서 독도를 품어. </li><li> 해부 현미경 RPMI을 제거하는 피펫을 사용합니다. 플레이트 (3)에 2.8 mM의 포도당과 3 mL의 KRB 솔루션을 추가합니다. 독도를 씻어 10 회 소용돌이 친다. KRB 솔루션을 제거합니다. <ol><li> 한 번 세척 과정을 반복합니다. 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C에서 3 ㎖ KRB 용액 독도 부화. </li></ol></li><li> 12 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 분취 KRB. 인큐베이터에서 37 ° C로 KRB 재고 및 플레이트를 사전 따뜻하게. </li><li> 6.2에서와 같이 미리 예열 KRB 두 번 독도를 씻으십시오. 트랜스FER 미리 예열 플레이트의 각 웰에 10 아일렛. 37 ° C 배양기에서 품어. </li><li> 45 분 후, 상층 액 50 μL를 철회. 이것은 기초 포도당에서 분비되는 인슐린 솔루션이 포함되어 있습니다. </li><li> 32 μL 500 mM의 포도당을 추가합니다. 솔루션을 섞어 판 20 회 소용돌이 친다. 37 ° C 배양기에서 품어. 판을 한 번에 5 시간마다 5 분 소용돌이 친다. </li><li> 45 분 후, 50 μL 상층 액을 철회. 이 높은 포도당에서 분비되는 인슐린이다. </li><li> 1.5 ㎖의 튜브에 모든 섬을 전송합니다. 30 분 동안 -20 ℃에서 동결. 실온에서 5 분 동안 해동. 냉동과 해동 과정을 반복합니다. </li><li> 20 mM의 염산 0.5 mL의 70 % 에탄올을 추가합니다. 하룻밤 둡니다. 이 섬에 남아 인슐린이다. </li><li> 인슐린 수치를 분석하기 위해 기존의 ELISA를 사용하여 이전에 3 설명했다. </li></ol>

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<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li>
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</ol>

저자는 설명된 작업에 대해 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기, 우리는 기존의 관류 너무 작은 pancreata에서 섬 분리에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 등과 베타 세포의 정제, 유전자 발현 분석, 췌장 베타 세포의 성숙, 증식, 세포 스트레스 반응, 세포 생존, 대사 및 작용 GSIS 유지, 모든 섬 기반 연구 준비 아일렛을 수득 할 것으로 예상된다. 이것은 우리의 지식, 신생아 쥐에서 섬 격리을 수행하는 새로운 연구를 안내하는 최초의 상세한 영상 프로토콜의 최선이 될 것입니다. 이 시각 보좌관하지 않고, 광범위한 시행 착오가 작은 pancreata에서 성공적인 췌도 분리를 달성하기 위해 대부분의 연구자 예상된다. 단계 3.6에 설명 된대로 성공적으로 섬 격리를위한 가장 중요한 요소는 췌장 소화의 적절한 정도 - 3.8. 일반적으로 이해하고 과잉 소화 모두 섬 수율을 줄일 수 있습니다. 오버 소화 더 타협 섬 아키텍처, 막 &#39;그들은 기능 분석을위한 적합하지 말이지. 가장 분해 결과를 달성하기 위해,...

순수한 췌장섬을 분리하는 것은 베타 세포의 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)를 분석하고 사체 기증자로부터 섬을 이식하는 데 필수적입니다 1-3. 또한 섬세포에서 내분비 유전자 발현을 확립할 필요가 있다 4, 5. 이를 위해 큰 췌장섬을 큰 췌장섬으로부터 분리할 수 있도록 상세한 프로토콜이 수립되었습니다(6 및 그 안에 있는 참고 문헌). 이러한 방법은 효소 관류를 기반으로 하여 섬 조직에서 acinar를 해리하고 gradient separation 및 hand picking과 결합합니다. 따라서 큰 췌장에서 섬을 분리하는 것은 대부분의 실험실에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 반면에, 너무 작아서 관류할 수 없는 췌장에서 섬을 분리할 수 있는 상세한 단계별 프로토콜은 없습니다.
신생아 섬의 유전자 발현과 기능을 연구하는 것은 중요합니다. 신생아 섬은 인슐린 분비 및 증식 능력에서 성인과 다른 특성을 가지고 있습니다 7, 8. 그러나 새로 태어난 동물, 특히 쥐로부터 섬을 분리하는 것은 새로 태어난 췌장의 크기가 작기 때문에 어렵습니다. 이 크기는 췌관을 통해 콜라겐 분해 효소가 주입 될 때 일반적인 관류 과정을 방지합니다. 실제로, 몇몇 논문에서는 효소 또는 비효소 보조 분리 절차 7, 9, 10과 같은 연구를 발표했습니다. 그러나 시각 자료를 사용한 섬 분리 과정에 대한 자세한 설명은 7, 9가 부족하여 대부분의 연구자들이 유사한 연구를 수행하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 
우리는 신생아 마우스에서 고품질 섬을 생산하는 몇 가지 다른 조건을 탐구했습니다. 여기에서는 연구자들이 섬 격리 과정의 주요 세부 사항을 배우는 데 도움이 될 것으로 기대되는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생후 2주령까지 쥐의 췌장에 적용할 수 있으며, 그 후에는 일상적인 섬 격리를 위해 관류를 수행할 수 있습니다. Islet은 인슐린 분비 및 유전자 발현 분석에 직접 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+</td><td>Mediatech/Cellgro, Manassas, VA</td><td>MT21020CV</td><td>Ca2+/Mg2+가 있는 HBSS를 얻은 경우 CaCl2 및 MgSO4를 추가할 수 있습니다. 각각 1.26 및 0.5 mM.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 포도당 없음</td><td>Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td><td>11879-020</td><td>포도당은 이후의 섬 사용을 방해하지 않도록 특정 수준으로 첨가해야 합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마 Aldrich, St Louis, MO</td><td>G-7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>폴리수크로오스 및 디아트리조산 나트륨 용액</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>Leica M165</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5417C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>15-mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50-mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>정밀 저울</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>마이크로fuge 튜브</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm 접시</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm 접시</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>CD1 마우스</td><td>Charles River Laboratories, Wilminton, MA&nbsp;</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>잭슨 연구소, 파밍턴, 코네티컷&nbsp;</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1/J</td><td>잭슨 연구소, 파밍턴, 코네티컷&nbsp;</td><td>B6CBAF1/J</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

큰 포유 동물 pancreata에서 관류 기반의 섬 - 격리 프로토콜은 잘 확립되어있다. 이러한 프로토콜은 쉽게 인해 준비 콜라겐 주입 및 이후의 조직 관류를 허용 췌관의 큰 크기로 많은 실험실에서 실시하고 있습니다. 관류 쉽게 작은 pancreata에서 얻을 수 없기 때문에 반대로, 작은 pancreata에서 섬 격리는, 신생아 쥐처럼, 도전이다. 여기에서 우리는 시각적 인 도움으로 새로 태어난 쥐에서 독도의 상당한 숫자를 복구 상세한 간단한 절차를 설명합니다. 갓 해부 전체 pancreata는 마이크로 원심 튜브에서 37 ° C에서 행크스 균형 염 용액 (HBSS)에 용해하고, 0.5 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 IV로 분해 하였다. 튜브는 조직의 분산을 돕기 위해 정기적으로 도청했다. 조직의 대부분이 1mm 주위에 작은 클러스터에 분산시킨 경우, 용 해물을 10 % 소 태아 혈청 (FBS)로 배양 배지와 서너 번 세척 하였다. 섬 클러스터,인식 선포 조직의 결여, 다음 입체경을 해부에서 복구 할 수 있습니다. 새로 태어난 마우스의 췌장 당 대형 섬에 80 소형 -이 방법은 (20)를 복구합니다. 이 섬은 인슐린 분비, 유전자 발현, 문화를 포함한 대부분의 생각할 수있는 다운 스트림 분석에 적합하다. 인슐린 분비 분석의 예는 분리 프로세스를 검증하기 위해 제공된다. 유전 적 배경과 소화의 정도는 수익률을 결정하는 가장 큰 요인이다. 이 내분비 - 외분비 격리 에이즈로 높은 활성 갓 만든 콜라겐 용액은 바람직하다. 세척의 모든 솔루션 및 소 태아 혈청에있는 양이온의 존재 [칼슘 (Ca 2+)과 마그네슘 (Mg를 2+)] / 따기 매체는 적절한 무결성 섬의 좋은 수율이 필요하다. 좋은 대조 및 확대와 해부 범위도 도움이 될 것입니다.

각각의 작은 마우스의 췌장에서 아일렛 80 - 최적 조건에서 제시된 방법 (20)을 수득 할 수있다. 이 번호는 마우스의 유전 적 배경, 나이에 의존하고, 섬의 크기를 회복한다. 일반적으로 사용되는 가운데, CD1가에서 자란와 C57BL / 6J 순종 마우스 CD1 및 C57BL / 6 또는 상업적 B6CBAF1 사이의 잡종보다 작은 크기의 작은 섬을 생산 / J 마우스는 않습니다. 일반적으로 따기 직접 손으로 인해 외분비 조직 (그림 1A-C)와 혼합 할 때 인정하기 어려울 수 있습니다 작은 섬의 배제에 독도의 적은 수의 가능성을 주었다. 그라데이션 원심 분리 믹스 (그림 1D)의 작은 섬을 포함하여 많은 섬을 얻을 수 있습니다. 출산 후 계속 섬의 증식에서 예상대로 이전 마우스는 또한, 더 큰 섬을 생산하고 있습니다. 흥미롭게도, 회수 된 아일렛 수 직접 췌장 크기와 상관되지 않는다 : CD1 생쥐는 보통...

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

본 절차의 전반적인 목표는 신생 마우스 췌장에서 온전한 랑게르한스 섬을 분리하는 것입니다. 이 방법은 인슐린 분비, 유전자 발현, 파라 세포의 생존 및 기능 유지와 같은 발달 및 기능에 관한 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법의 주요 장점은 간단하고 직관적이어서 신입 연구자들도 하류 연구(downstream studies)를 위해 충분한 수의 온전한 췌도(islet)를 분리할 수 있다는 것입니다. 먼저, 등을 대고 누운 자세(supine position)의 신생쥐에 70% ethanol을 분사합니다. 그런 다음, 핀셋을 사용하여 복부의 피부를 들어 올리고 생식기부터 늑골까지 정중선을 따라 피부와 근육층을 세로로 절개합니다.다음으로, 모든 내부 장기를 100 centimeter 접시에 옮긴 후 췌장을 찾습니다. 췌장은 흰색의 흩어진 형태의 장기로, 복측 부분은 십이지장에 붙어 있고 배측 부분은 위와 비장에 붙어 있습니다. 장기가 잠기도록 접시에 HBSS를 추가하여 췌장 조직이 더 이상 십이지장, 위 또는 비장에 붙어 있지 않게 합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 주변 조직에서 췌장을 떼어냅니다.췌장을 HBSS가 담긴 새로운 60 millimeter 디쉬로 옮기고 가위를 사용하여 1~5개의 췌장을 5 millimeter 이하의 크기로 절단합니다. 모든 조직을 잘게 다지면, 조각들을 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 샘플에 콜라게나제 작업 용액을 첨가합니다. 그 후 조직 조각들을 37 degrees celsius에서 배양하며, 1분마다 튜브를 두 번씩 뒤집어 줍니다.5분 후, 튜브를 가볍게 쳐서 조직 조각의 소화 상태를 확인합니다. 용해물이 탁해지고 대부분의 췌장이 직경 2mm 미만의 조각난 세포 클러스터로 보일 때까지 10분 더 소화를 진행합니다. 소화가 끝나면 미세원심분리기를 이용하여 용해물을 침전시키고, p1000 피펫을 사용하여 세포 클러스터 없이 탁하게 보이는 상층액을 조심스럽게 제거합니다.다음으로, 펠렛에 신선한 RPMI 16/40 완전 배지 1 mL를 추가합니다. 그런 다음 가볍게 쳐서 분쇄된 용해물 조각들을 재현탁하고 튜브를 10회 반전시킵니다. 원심분리 후, 방금 시연한 것처럼 상층액이 투명해질 때까지 재현탁된 용해물을 최소 2회 더 반전시킵니다.그런 다음 최종 펠렛을 1 mL의 신선한 완전 배지에 재현탁하고, 15 mL 원추형 튜브에 1.077 g/ml 밀도의 폴리수크로스(polysucrose)와 소듐 디아트라조에이트(sodium diatrazoate) 2 mL를 넣고 얼음 위에 둡니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 층이 섞이지 않도록 용해물을 구배 용액 위에 조심스럽게 층을 쌓고, 원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 배지와 인터페이스 층이 포함된 아일렛을 새 15 mL 튜브로 옮기고, 10 mL의 신선한 배지를 넣어 아일렛을 부드럽지만 철저하게 혼합한 후 원심분리합니다.두 번째 세척 후 새로운 완전 배지를 첨가하고, islet과 duct가 포함된 펠렛을 4 mL의 새로운 완전 배지에 재현탁합니다. 이제 islet을 60 mm 디시에 분주하고 세포에 5 mL의 완전 배지를 추가합니다. 디시를 해부 현미경 아래로 옮기고 명시야 조명을 켠 뒤, 빛의 세기를 최대 출력의 약 50%로 조정합니다.50배 배율에서 소도는 약간 분홍색의 군집으로 보이며, 선방세포는 어둡고 불규칙한 모양의 군집으로 보입니다. p20 피펫 팁을 사용하여 선방세포 군집을 피하며 개별 소도를 수확하고, 소도가 농축된 분획을 완전 배지가 담긴 새로운 60mm 디시에 분주합니다. 원래 디시에서 모든 소도를 채취한 후, 수집 디시의 소도를 4mL의 신선한 완전 배지가 담긴 새로운 60mm 디시로 옮기는 과정을 최종 수집 디시에 순수 소도만 남을 때까지 두 번 더 반복합니다.적절한 소화 및 분리 과정을 거치면 외면이 매끄러운 islet을 얻을 수 있습니다. 콜라게나아제(collagenase) 소화가 불충분할 경우, 육안으로 쉽게 확인될 정도로 큰 islet이 생성되지만 이를 선방 조직(acinar tissues)으로부터 완전히 분리할 수 없어, 더 큰 islet이 만들어짐에도 불구하고 전반적인 islet 수득률은 감소하게 됩니다. 반대로 과도하게 소화시킨 경우에는 선방 조직을 islet으로부터 완전히 분리할 수 있으나, islet 구조가 손상되기 쉬워 현미경 관찰 시 표면이 거친 islet이 나타나게 됩니다.이 방법으로 분리된 신생아 췌도(islets)는 높은 기저 인슐린 분비 수준과 미성숙 췌도 베타 세포의 전형적인 포도당 자극 인슐린 분비 프로필을 보여주며, 이는 이 췌도 분리 절차가 신생아 췌도의 기능적 특성을 상당히 보존함을 시사합니다. 숙련될 경우, 적절히 수행한다면 이 기술은 단 2시간 이내에 완료될 수 있습니다. 절차를 시도할 때, 불용성 잔해물을 제거하기 위해 콜라게나아제(collagenase)를 미리 원심 분리하고, 칼슘 및 마그네슘이 보충된 세척 완충액을 사용하며, 조직 해리를 빠르게 중단시키기 위해 전처리된 세척 완충액을 사용하는 것이 중요합니다.본 절차에서는 신생아 베타 세포의 인슐린 분비 역학과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 포도당 자극 인슐린 분비와 같은 실험을 수행할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 베타 세포 생물학 분야의 연구자들이 유전자 발현이나 기타 대사 연구와 같은 추가적인 분석을 수행할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 영상을 시청하신 후에는 후속 연구를 위해 신생아 생쥐 췌장에서 온전한 췌도(islets)를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.콜라게나제(collagenase) 분말을 다루는 것은 매우 위험하므로, 이 재료를 사용할 때는 항상 장갑과 마스크를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

연구 2 형 당뇨병 아일 레츠의 공급 부족이다. 여기 부분 pancreatectomy를 겪고 환자에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유할 수 있습니다. 이 방법은 제 2 형 당뇨병 환자에서 아일 레츠을 얻기위한 독특한 장소를 나타내며 임상 기초 및 임상 연구에 적합한 숫자가 아닌 당뇨병 과목과 일치.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

마우스 작은 섬 격리에 대한 자세한 설명은 collagenase와 중성 단백 분해 효소를 정제의 조합의 현장 췌장 ductal cannulation 및 재관류에의 기술을 사용하여 설명되어 있습니다.

Langerhans 절연의 마우스 작은 섬은 정화의 Collagenase와 중성 단백 분해 효소의 조합을 사용하여

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

배우세요 신생아 마우스 췌장에서 랑게르한스 섬을 효과적으로 분리하는 방법을. 콜라게나제 소화와 수동 채취를 통해 20~80개의 섬 클러스터를 얻을 수 있으며, 이는 인슐린 분비 및 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

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