Name: 신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 신생아 마우스 췌장에서 랑게르한스 섬을 효과적으로 분리하는 방법을. 콜라게나제 소화와 수동 채취를 통해 20~80개의 섬 클러스터를 얻을 수 있으며, 이는 인슐린 분비 및 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 NIDDK(GG의 경우 DK065949)의 보조금으로 지원되었습니다. 원고를 읽어주신 Brenda M. Jarvis 박사와 Jeff Duryea Jr.에게 감사드립니다.

동물 사용이 프로토콜 M에 규정 된 절차를 다음 / 구에 대한 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 / (181) 11. CD1 또는 CBA / BL6 마우스는 상용 공급 업체에서 구입 및 신생아 쥐를 얻기 위해 밴더빌트 동물 시설에서 교차했다. 마우스 1. 준비, 재고 솔루션 및 장비 <ol><li> 마우스 크로스의 경우 : 마우스 십자가를 설정하고 실험 계획을 돕기 위해 연결 날짜를 기록합니다. CD1 마우스는 보통 짝짓기 후 하루 (19)의 주위에 출산을 제공합니다. 사용 CD1 또는 CBA / BL6은 각각 CD1 또는 CBA / BL6 신생아를 얻기 위해 십자가. 두 선 사이의 Intercrosses는 CD1의 여성과 CBA / BL6 남성을 사용한다. </li><li> 콜라게나 주식에 대한 : 고정밀 밸런스 200 mg의 콜라겐 유형 IV 무게. 50 ML의 원심 분리기 튜브에 전송합니다. 칼슘 40 ㎖의 HBSS에 용해 2+ / 마그네슘 2+ (각각 1.26와 0.5 밀리미터는) 5 ㎎ / ㎖의 원액을 확인합니다. <ol><li> 에 콜라게나 허용부드러운 흔들림과 함께 ~ 30 분 동안 용해. 나누어지는 및 1 년 이상 활성 상태를 유지 재고 한 -20 ° C에 냉동 솔루션을 유지. </li></ol></li><li> 해부 및 섬 따기위한 핀셋, 가위, 및 P20 팁 몇 쌍을 소독하기 위해 압력솥. </li><li> 1 M 포도당 주식에 대한 : 50 mL의 원심 분리기 튜브에 9g 포도당 무게 포도당을 용해 50 mL의 RPMI에게 1640 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사용할 때까지 4 ° C에 보관하지,하지만 6 개월 이상. </li></ol> 2. 작업 솔루션 참고 : 섬 분리의 날, 다음과 같은 시약을 준비합니다. <ol><li> 콜라게나 제 타입 IV 가공 솔루션 : 해동 얼음에 콜라게나 주식을 희석. 각각 1.7 mL의 미세 원심 분리 관에 0.15 mL의 주식을 분배. 칼슘 / 마그네슘 2+와 1.35 ㎖의 HBSS를 추가합니다. 튜브 5 번 반전. 15 분 동안 얼음에 둡니다. <ol><li> 미세 원심에서 3 분 동안 고속으로 회전. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 사용할 때까지 얼음에 남겨주세요. 불용성 이물질와 튜브를 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 전체 RPMI 1640 미디어 : 500 ㎖의 RPMI 1640 미디어에 2.5 mL의 1 M 포도당, FBS 불 활성화 50ml의 열, 5 ㎖의 100 배 펜 연쇄상 구균 주식을 추가합니다. 사용할 때까지 얼음에 둡니다. </li></ol> 3. 췌장의 분리 및 소화 <ol><li> 승인 된 프로토콜에 따라 잘린 다음 이소 플루 란과 신생아를 안락사. </li><li> 배꼽이 위를 향와 마우스를 놓습니다. 살균 70 % 에탄올로 스프레이. </li><li> 핀셋으로 배꼽 피부를 들어 올려 흉곽의 생식기 영역에서 가위와 정중선을 따라 길이 방향으로 피부와 근육 층을 잘라. 이것은 모든 내부 장기를 노출 복강을 엽니 다. </li><li> 핀셋으로 100cm 접시에 모든 내부 장기를 전송합니다. 위장과 비장과 십이지장 (11)에 달라 붙는 복부 부분에 달라 붙는 지느러미 부분과 분산 - 장기 인 췌장을 찾습니다. </리&gt; <li> 장기 잠수함하기 위해 접시에 HBSS를 추가합니다. 용액에서, 췌장 조직이 더 이상 십이지장, 위, 비장에 집착하지 않는다. 이 때문에 전형적인 화이트 색상의 해부 범위에서 쉽게 인식 할 수있다. HBSS로 새로운 60mm 요리에 떨어져 주변 조직 및 전송에서 췌장 조직을 박리 핀셋을 사용합니다. </li><li> 어떤 차원에서 5mm보다 작은 조각으로 가위 각각의 췌장을 잘라. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 최대 5 pancreata는 (P7 미만) 하나의 튜브에 소화 할 수있다. P8-P16 마우스의 경우, 췌장 당 하나의 튜브를 사용합니다. </li><li> 각각의 튜브에 1 ML의 콜라게나 작업 용액 (각 P1-P7 췌장 0.2 mL 씩 P8-P16 췌장 0.5 mL로 사용합니다.) - 0.5를 추가합니다. 최대 15 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 튜브를 남겨주세요. 튜브 두 번 모든 분을 반전. </li><li> ~ 5 분 후, 췌장 조직의 분해 상태를 모니터링하기 위해 상기 튜브를 탭. 췌장의 대부분까지 소화 과정을 계속조직은 직경 &lt;2mm와 같은 파편 세포 클러스터를 나타납니다. 해물 정상 선방 세포자가 분해에 의한 흐림을 나타납니다. </li></ol> 4. 해물 세척 <ol><li> 미세 원심에서 10 초 동안 500 XG에 해물 스핀. P1,000의 pipetman에 뜨는 층을 제거합니다. 상층 액은 혼탁하지만 세포 클러스터없는 나타납니다. 빠르게 인해 일부 끈적 DNA의 존재에 맨 아래에있는 조직 조각을 멀리 대기음 수있는 구토물이기도를 사용하지 마십시오. </li><li> 1 mL의 RPMI 1640 전체 미디어를 추가합니다. 조각난 해물을 재현 탁 부드럽게 튜브를 누릅니다. 최대 반전 10 배 아래로. 단계를 반복 4.1. </li><li> 단계를 반복 4.2 두 번 이상 또는 상등액을 분명히 나타날 때까지. 1 mL의 완전한 RPMI 1640 배지에서 세척 췌장 조각을 다시 일시 중지합니다. </li></ol> 5. 작은 섬 격리 참고 : pancreata의 작은 번호는 직접 손으로 따기 아래 (5.1) 섬의 ISOL 사용할 수 있습니다ATION. pancreata 많은 경우 (&gt; 6), 5.2에서 설명하는 방법이 바람직하다. <ol><li> 직접 손으로 따기 : <ol><li> 60 밀리미터 접시 단계 4.3에서 해물을 전송합니다. 5 ㎖ 전체 RPMI 1640 미디어를 추가합니다. 해부 현미경으로 가져옵니다. </li><li> 현미경의 시야 조명을 설정합니다. 빛의 세기 최대 전력의 ~ 50 %를 조정합니다. 이 상태에서, 독도는 선포 세포와 같은 어두운 불규칙한 모양의 클러스터 반면 (그림 1A)로 약간 핑크 클러스터를 나타납니다. ~ 50X (목적의 힘과 눈 조각을 결합)의 확대가 가시화 섬의 가장 좋은 방법 및 따기위한 동시에 피펫 팁 오프닝을 제공하는 것이 좋습니다. </li><li> 선포 클러스터를 피하면서 P20 피펫 팁과 섬을 선택합니다. 분배 RPMI 전체 미디어 (그림 1B)와 새로운 60mm 요리에 분수를 섬이 풍부한. </li><li> 두 번 더 핸드 피킹 과정을 반복합니다. 새로운 60 순수한 독도를 남겨4 mL의 전체 RPMI 미디어 (그림 1C)와 mm 접시. </li></ol></li><li> 그라데이션 원심 분리 : <ol><li> 1.077 g / ㎖의 밀도로 2 ML의 polysucrose 나트륨 diatrizoate 미리로드 된 15 mL의 원심 분리기 튜브를 준비합니다. 사용할 때까지 얼음 튜브를 남겨주세요. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 polysucrose 나트륨 diatrizoate 솔루션의 상단에 단계 4.3에서 정지를 전송합니다. 바닥 층을 방해하지 마십시오. 최대 새로 태어난 10 2 pancreata P17에서 조직은 각각 15 mL의 튜브에로드 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 스윙 로터에 ~ 600 XG에 튜브를 스핀. 브레이크 오프 설정을 사용합니다. </li><li> 원심 분리 후, 새로운 15ml를 튜브에 미디어 및 계면 층 (이상적인 동작 조건에서 아일렛 원심 분리 후 polysucrose 문화 매체 사이의 계면에 위치 될 것이라는 점에 유의) 옮긴다. 10 mL의 미디어를 추가 부드럽게 잘 섞는다. </li><li> 작은 섬이 풍부한 부분을 스핀 다운5 분 300 XG에. 세척 용지를 제거합니다. 전체 RPMI 매체와 세척을 한 번 더 반복합니다. 대부분 섬 및 덕트 (그림 1D)를 포함 4 mL의 미디어에의를 Resuspend 펠릿. </li><li> 5.1 절에 설명 된대로 독도를 손으로 선택합니다. </li></ol></li></ol> 격리 된 독도 6. 국제 대학원 분석 실험 <ol><li> 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간 동안 전체 RPMI 미디어의 단계 5.1.4에서 독도를 품어. </li><li> 해부 현미경 RPMI을 제거하는 피펫을 사용합니다. 플레이트 (3)에 2.8 mM의 포도당과 3 mL의 KRB 솔루션을 추가합니다. 독도를 씻어 10 회 소용돌이 친다. KRB 솔루션을 제거합니다. <ol><li> 한 번 세척 과정을 반복합니다. 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C에서 3 ㎖ KRB 용액 독도 부화. </li></ol></li><li> 12 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 분취 KRB. 인큐베이터에서 37 ° C로 KRB 재고 및 플레이트를 사전 따뜻하게. </li><li> 6.2에서와 같이 미리 예열 KRB 두 번 독도를 씻으십시오. 트랜스FER 미리 예열 플레이트의 각 웰에 10 아일렛. 37 ° C 배양기에서 품어. </li><li> 45 분 후, 상층 액 50 μL를 철회. 이것은 기초 포도당에서 분비되는 인슐린 솔루션이 포함되어 있습니다. </li><li> 32 μL 500 mM의 포도당을 추가합니다. 솔루션을 섞어 판 20 회 소용돌이 친다. 37 ° C 배양기에서 품어. 판을 한 번에 5 시간마다 5 분 소용돌이 친다. </li><li> 45 분 후, 50 μL 상층 액을 철회. 이 높은 포도당에서 분비되는 인슐린이다. </li><li> 1.5 ㎖의 튜브에 모든 섬을 전송합니다. 30 분 동안 -20 ℃에서 동결. 실온에서 5 분 동안 해동. 냉동과 해동 과정을 반복합니다. </li><li> 20 mM의 염산 0.5 mL의 70 % 에탄올을 추가합니다. 하룻밤 둡니다. 이 섬에 남아 인슐린이다. </li><li> 인슐린 수치를 분석하기 위해 기존의 ELISA를 사용하여 이전에 3 설명했다. </li></ol>

<ol><li>Matsumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+pancreatic+islet+cell+isolation+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+%28Bayl+Univ+Med+Cent%29%22%5BJournal%5D)">Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galphao+represses+insulin+secretion+by+reducing+vesicular+docking+in+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).</li>
<li>Planas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+for+the+human+pancreas+and+purified+islets+in+type+1+diabetes%3A+new+findings+at+clinical+onset+and+in+long-standing+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes.</a> Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).</li>
<li>Tonne, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiling+of+pancreatic+islets+in+mice+during+streptozotocin-induced+beta-cell+damage+and+pancreatic+Glp-1+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).</li>
<li>London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+functional+evaluation+of+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).</li>
<li>Rorsman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+glucose+to+elicit+a+normal+secretory+response+in+fetal+pancreatic+beta+cells+results+from+glucose+insensitivity+of+the+ATP-regulated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).</li>
<li>Hellerstrom, C., Swenne, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+and+proliferation+of+fetal+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).</li>
<li>Blum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+beta-cell+maturation+is+marked+by+an+increased+glucose+threshold+and+by+expression+of+urocortin+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).</li>
<li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li>
<li>Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), e102445(2015).</li>
<li>White, J., White, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+J+%22Source+Book+of+Enzymes%2C+Source+Book+of+Enzymes%22">Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes</a>. , C.R.C. Press. (1997).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
</ol>

저자는 설명된 작업에 대해 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기, 우리는 기존의 관류 너무 작은 pancreata에서 섬 분리에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 등과 베타 세포의 정제, 유전자 발현 분석, 췌장 베타 세포의 성숙, 증식, 세포 스트레스 반응, 세포 생존, 대사 및 작용 GSIS 유지, 모든 섬 기반 연구 준비 아일렛을 수득 할 것으로 예상된다. 이것은 우리의 지식, 신생아 쥐에서 섬 격리을 수행하는 새로운 연구를 안내하는 최초의 상세한 영상 프로토콜의 최선이 될 것입니다. 이 시각 보좌관하지 않고, 광범위한 시행 착오가 작은 pancreata에서 성공적인 췌도 분리를 달성하기 위해 대부분의 연구자 예상된다. 단계 3.6에 설명 된대로 성공적으로 섬 격리를위한 가장 중요한 요소는 췌장 소화의 적절한 정도 - 3.8. 일반적으로 이해하고 과잉 소화 모두 섬 수율을 줄일 수 있습니다. 오버 소화 더 타협 섬 아키텍처, 막 &#39;그들은 기능 분석을위한 적합하지 말이지. 가장 분해 결과를 달성하기 위해,...

순수한 췌장섬을 분리하는 것은 베타 세포의 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)를 분석하고 사체 기증자로부터 섬을 이식하는 데 필수적입니다 1-3. 또한 섬세포에서 내분비 유전자 발현을 확립할 필요가 있다 4, 5. 이를 위해 큰 췌장섬을 큰 췌장섬으로부터 분리할 수 있도록 상세한 프로토콜이 수립되었습니다(6 및 그 안에 있는 참고 문헌). 이러한 방법은 효소 관류를 기반으로 하여 섬 조직에서 acinar를 해리하고 gradient separation 및 hand picking과 결합합니다. 따라서 큰 췌장에서 섬을 분리하는 것은 대부분의 실험실에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 반면에, 너무 작아서 관류할 수 없는 췌장에서 섬을 분리할 수 있는 상세한 단계별 프로토콜은 없습니다.
신생아 섬의 유전자 발현과 기능을 연구하는 것은 중요합니다. 신생아 섬은 인슐린 분비 및 증식 능력에서 성인과 다른 특성을 가지고 있습니다 7, 8. 그러나 새로 태어난 동물, 특히 쥐로부터 섬을 분리하는 것은 새로 태어난 췌장의 크기가 작기 때문에 어렵습니다. 이 크기는 췌관을 통해 콜라겐 분해 효소가 주입 될 때 일반적인 관류 과정을 방지합니다. 실제로, 몇몇 논문에서는 효소 또는 비효소 보조 분리 절차 7, 9, 10과 같은 연구를 발표했습니다. 그러나 시각 자료를 사용한 섬 분리 과정에 대한 자세한 설명은 7, 9가 부족하여 대부분의 연구자들이 유사한 연구를 수행하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 
우리는 신생아 마우스에서 고품질 섬을 생산하는 몇 가지 다른 조건을 탐구했습니다. 여기에서는 연구자들이 섬 격리 과정의 주요 세부 사항을 배우는 데 도움이 될 것으로 기대되는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생후 2주령까지 쥐의 췌장에 적용할 수 있으며, 그 후에는 일상적인 섬 격리를 위해 관류를 수행할 수 있습니다. Islet은 인슐린 분비 및 유전자 발현 분석에 직접 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+</td><td>Mediatech/Cellgro, Manassas, VA</td><td>MT21020CV</td><td>Ca2+/Mg2+가 있는 HBSS를 얻은 경우 CaCl2 및 MgSO4를 추가할 수 있습니다. 각각 1.26 및 0.5 mM.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 포도당 없음</td><td>Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td><td>11879-020</td><td>포도당은 이후의 섬 사용을 방해하지 않도록 특정 수준으로 첨가해야 합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마 Aldrich, St Louis, MO</td><td>G-7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>폴리수크로오스 및 디아트리조산 나트륨 용액</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>Leica M165</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5417C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>15-mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50-mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>정밀 저울</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>마이크로fuge 튜브</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm 접시</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm 접시</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>CD1 마우스</td><td>Charles River Laboratories, Wilminton, MA&nbsp;</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>잭슨 연구소, 파밍턴, 코네티컷&nbsp;</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1/J</td><td>잭슨 연구소, 파밍턴, 코네티컷&nbsp;</td><td>B6CBAF1/J</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

큰 포유 동물 pancreata에서 관류 기반의 섬 - 격리 프로토콜은 잘 확립되어있다. 이러한 프로토콜은 쉽게 인해 준비 콜라겐 주입 및 이후의 조직 관류를 허용 췌관의 큰 크기로 많은 실험실에서 실시하고 있습니다. 관류 쉽게 작은 pancreata에서 얻을 수 없기 때문에 반대로, 작은 pancreata에서 섬 격리는, 신생아 쥐처럼, 도전이다. 여기에서 우리는 시각적 인 도움으로 새로 태어난 쥐에서 독도의 상당한 숫자를 복구 상세한 간단한 절차를 설명합니다. 갓 해부 전체 pancreata는 마이크로 원심 튜브에서 37 ° C에서 행크스 균형 염 용액 (HBSS)에 용해하고, 0.5 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 IV로 분해 하였다. 튜브는 조직의 분산을 돕기 위해 정기적으로 도청했다. 조직의 대부분이 1mm 주위에 작은 클러스터에 분산시킨 경우, 용 해물을 10 % 소 태아 혈청 (FBS)로 배양 배지와 서너 번 세척 하였다. 섬 클러스터,인식 선포 조직의 결여, 다음 입체경을 해부에서 복구 할 수 있습니다. 새로 태어난 마우스의 췌장 당 대형 섬에 80 소형 -이 방법은 (20)를 복구합니다. 이 섬은 인슐린 분비, 유전자 발현, 문화를 포함한 대부분의 생각할 수있는 다운 스트림 분석에 적합하다. 인슐린 분비 분석의 예는 분리 프로세스를 검증하기 위해 제공된다. 유전 적 배경과 소화의 정도는 수익률을 결정하는 가장 큰 요인이다. 이 내분비 - 외분비 격리 에이즈로 높은 활성 갓 만든 콜라겐 용액은 바람직하다. 세척의 모든 솔루션 및 소 태아 혈청에있는 양이온의 존재 [칼슘 (Ca 2+)과 마그네슘 (Mg를 2+)] / 따기 매체는 적절한 무결성 섬의 좋은 수율이 필요하다. 좋은 대조 및 확대와 해부 범위도 도움이 될 것입니다.

각각의 작은 마우스의 췌장에서 아일렛 80 - 최적 조건에서 제시된 방법 (20)을 수득 할 수있다. 이 번호는 마우스의 유전 적 배경, 나이에 의존하고, 섬의 크기를 회복한다. 일반적으로 사용되는 가운데, CD1가에서 자란와 C57BL / 6J 순종 마우스 CD1 및 C57BL / 6 또는 상업적 B6CBAF1 사이의 잡종보다 작은 크기의 작은 섬을 생산 / J 마우스는 않습니다. 일반적으로 따기 직접 손으로 인해 외분비 조직 (그림 1A-C)와 혼합 할 때 인정하기 어려울 수 있습니다 작은 섬의 배제에 독도의 적은 수의 가능성을 주었다. 그라데이션 원심 분리 믹스 (그림 1D)의 작은 섬을 포함하여 많은 섬을 얻을 수 있습니다. 출산 후 계속 섬의 증식에서 예상대로 이전 마우스는 또한, 더 큰 섬을 생산하고 있습니다. 흥미롭게도, 회수 된 아일렛 수 직접 췌장 크기와 상관되지 않는다 : CD1 생쥐는 보통...

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

본 절차의 전반적인 목표는 신생 마우스 췌장에서 온전한 랑게르한스 섬을 분리하는 것입니다. 이 방법은 인슐린 분비, 유전자 발현, 파라 세포의 생존 및 기능 유지와 같은 발달 및 기능에 관한 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법의 주요 장점은 간단하고 직관적이어서 신입 연구자들도 하류 연구(downstream studies)를 위해 충분한 수의 온전한 췌도(islet)를 분리할 수 있다는 것입니다. 먼저, 등을 대고 누운 자세(supine position)의 신생쥐에 70% ethanol을 분사합니다. 그런 다음, 핀셋을 사용하여 복부의 피부를 들어 올리고 생식기부터 늑골까지 정중선을 따라 피부와 근육층을 세로로 절개합니다.다음으로, 모든 내부 장기를 100 centimeter 접시에 옮긴 후 췌장을 찾습니다. 췌장은 흰색의 흩어진 형태의 장기로, 복측 부분은 십이지장에 붙어 있고 배측 부분은 위와 비장에 붙어 있습니다. 장기가 잠기도록 접시에 HBSS를 추가하여 췌장 조직이 더 이상 십이지장, 위 또는 비장에 붙어 있지 않게 합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 주변 조직에서 췌장을 떼어냅니다.췌장을 HBSS가 담긴 새로운 60 millimeter 디쉬로 옮기고 가위를 사용하여 1~5개의 췌장을 5 millimeter 이하의 크기로 절단합니다. 모든 조직을 잘게 다지면, 조각들을 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 샘플에 콜라게나제 작업 용액을 첨가합니다. 그 후 조직 조각들을 37 degrees celsius에서 배양하며, 1분마다 튜브를 두 번씩 뒤집어 줍니다.5분 후, 튜브를 가볍게 쳐서 조직 조각의 소화 상태를 확인합니다. 용해물이 탁해지고 대부분의 췌장이 직경 2mm 미만의 조각난 세포 클러스터로 보일 때까지 10분 더 소화를 진행합니다. 소화가 끝나면 미세원심분리기를 이용하여 용해물을 침전시키고, p1000 피펫을 사용하여 세포 클러스터 없이 탁하게 보이는 상층액을 조심스럽게 제거합니다.다음으로, 펠렛에 신선한 RPMI 16/40 완전 배지 1 mL를 추가합니다. 그런 다음 가볍게 쳐서 분쇄된 용해물 조각들을 재현탁하고 튜브를 10회 반전시킵니다. 원심분리 후, 방금 시연한 것처럼 상층액이 투명해질 때까지 재현탁된 용해물을 최소 2회 더 반전시킵니다.그런 다음 최종 펠렛을 1 mL의 신선한 완전 배지에 재현탁하고, 15 mL 원추형 튜브에 1.077

effective-isolation-of-functional-islets-from-neonatal-mouse-pancreas

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

연구 2 형 당뇨병 아일 레츠의 공급 부족이다. 여기 부분 pancreatectomy를 겪고 환자에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유할 수 있습니다. 이 방법은 제 2 형 당뇨병 환자에서 아일 레츠을 얻기위한 독특한 장소를 나타내며 임상 기초 및 임상 연구에 적합한 숫자가 아닌 당뇨병 과목과 일치.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

마우스 작은 섬 격리에 대한 자세한 설명은 collagenase와 중성 단백 분해 효소를 정제의 조합의 현장 췌장 ductal cannulation 및 재관류에의 기술을 사용하여 설명되어 있습니다.

Langerhans 절연의 마우스 작은 섬은 정화의 Collagenase와 중성 단백 분해 효소의 조합을 사용하여

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

배우세요 신생아 마우스 췌장에서 랑게르한스 섬을 효과적으로 분리하는 방법을. 콜라게나제 소화와 수동 채취를 통해 20~80개의 섬 클러스터를 얻을 수 있으며, 이는 인슐린 분비 및 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

더 많은 동영상 탐색