Name: 형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 학습하세요 형광 현미경을 이용한 살아있는 세포의 미토콘드리아 칼슘 흡수와 막 전위 동시 측정 방법을. 유전자 조작 없이 실시간으로 미토콘드리아 기능을 연구할 수 있는 이 기술은 세포생물학 및 퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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우리는 금융 지원을 위해 박사 Kirstin Elgass 및 기술 지원 모나 마이크로 이미징 박사 사라 크리드, 그리고 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)과 의료 연구위원회 UK 감사합니다. MMcK는 호주 연구위원회 미래 원정대 제도 (FT120100459), 윌리엄 버클 랜드 재단, 호주 미토콘드리아 질환 재단 (AMDF), 의료 연구 및 모나 쉬 대학의 허드슨 연구소 지원됩니다. 이 작품은 빅토리아 정부 운영 인프라 지원 제도에 의해 지원되었다.

세포의 1. 준비 <ol><li> 10cm 세포 배양 접시에 세포 또는 75cm 성장 5 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S가 보충 배지 [10 ㎖ 둘 베코 변형 이글스 중간 (DMEM)에서 두 플라스크 ) 37 ° C / 5 % CO 2에서. </li><li> 세포를 수확하려면 다음 5 ml의 1 배 인산염 완충 생리 식염수 (1X PBS)로 세척, 흡인에 의해 용지를 제거합니다. 다음 (w / v)의 트립신 / 0.25 %를 1.5 ml의 0.25 %를 추가, 흡인 1X PBS를 제거 (/ w를 v)의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 2 분 동안 37 ° C / 5 % CO 2에서 배양한다. 접시를 누르거나 다음 5 ml의 배양 배지에 재현 탁, 세포를 제거하기 위해 조심스럽게 플라스크. </li><li> 혈구에 재현 탁하고 세포를 12 μl를 첨가하여 세포를 카운트. </li><li> 요리 또는 공 촛점 이미징 챔버 커버 슬립에 플레이트 세포. 참고 :이 거꾸로 현미경과 함께 사용하도록 설계되었습니다 적합한 플라스틱이나 유리 바닥을해야합니다. </li><li> 플레이트 세포 일 때문에~ 80 %의 컨 플루 이미징 당일 달성된다. 예를 들어, 약 2 × 104 (143B)의 골육종 세포 촬상 전에 8 웰 챔버 슬라이드 1 일 잘 하나에 도금 될 수있다. </li><li> 세포 부착 및 복구 할 수 있도록 37 ° C / 5 % CO 2에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션. </li></ol> TMRM 및 FLUO-4 영상 2. 버퍼 <ol><li> 156 mM의 NaCl을 3 밀리미터의 KCl, 2 mM의 황산을 포함하는 기록 솔루션 (RS)를 준비 1.25 밀리미터 KH 2 PO 4, 10mM의 D-글루코오스, 2 mM의 CaCl2를 10 mM의 HEPES pH를 7.35. -20 ºC에서 분취에 보관 RS. </li><li> 준비 세포 내 중간 (IM) 6 mM의 NaCl을 130 밀리미터의 KCl, 7.8 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 KH 2 PO 4, 0.4 mM의 CaCl2를, 2 mM의 EGTA, 10mM의 HEDTA, 2 mM의 말산, 2 mM의 글루타메이트, 2 밀리미터 포함 ADP와 20 mM의 HEPES pH가 7.1. 말산, 글루탐산 ADP 200 mM의 스톡 용액은 별도로 제조 분취하고 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 세인트ocks은 사용 전에 IM에 첨가 될 수있다. </li><li> 2+ 자유 행크 완충 염 용액 (HBSS)을 얻을 수있다 Ca는 상업적 공급자로부터 미리 제조. 에틸렌 글리콜 비스 (β 아미노 에틸 에테르)를 첨가 -N, N, N &#39;, 500 μM의 최종 농도 N&#39;- 테트라 아세트산 (EGTA). </li><li> 100 % 메탄올의 10 밀리미터 테트라 메틸, 메틸 에스테르, 퍼클로레이트 (TMRM)의 스톡 용액을 제조 하였다. 이 주식에서 증류수 H 2 O 2 μM의 작업 재고를 확인 </li><li> 100 % 에탄올 중 10 mM의 베라파밀의 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 FLUO -4- 아세 톡시 메틸 에스터 (FLUO-4 AM)의 스톡 용액 (V / w) 1 ㎎ / ㎖를 준비한다. 참고 : FLUO-4, AM은 칼슘 결합에 형광을 증가 전시회 칼슘 지표입니다. FLUO-4는 불소로 치환 두 염소 치환체, FLUO-3의 아날로그이다. 이것은 488 nm에서의 형광 증가 여기 높은 형광 신호 레벨을 초래한다. 그만큼AM 에스테르 기 세포막을 투과 할 수있는 대전 된 FLUO-4 분자를 초래한다. 세포 내부되면 AM 에스터 셀 내에 갇혀 FLUO-4 충전 된 형태의 결과 특이성 에스 테라 제에 의해 분해된다. </li><li> 100 % 에탄올에 1 mM의 카본 시안화 P-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)의 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 증류수 H 2 O의 주식 25 ㎎ / ㎖의 용액 (w / v)의 디기 토닌 준비 </li><li> DMSO 100 μM의 쌥시 가르 긴의 재고 솔루션을 준비합니다. </li><li> 증류 H 2 O. 40mm의 염화칼슘 (CaCl2를)의 스톡 용액을 준비 </li></ol> TMRM 및 FLUO-4 AM 셀들 3. 염색법 <ol><li> 20 nM의 TMRM와 RS 염색 솔루션을 준비, 5 μg의 / ㎖ (W / V) FLUO-4, AM 및 플루로 닉 F-127 RS에서와 같은 0.005 % 계면 활성제. 참고 :이 계면 활성제 FLUO-4, AM의 가용화를 용이하게하는 비이 온성 폴리올이다. 참고 : 10 μM 베라파밀 inhibi 또한 첨가 될 수있다이 세포 유형에서 발현된다면 세포막 다제 수송하여 t TMRM 보 분석된다. </li><li> 피펫으로 세포 배양 배지를 제거하고 PBS 1 배 100 μL 세척. </li><li> 피펫 1X PBS를 제거하고, 실온에서 45 분 동안 250 ㎕의 RS의 염색 액에 세포를 배양한다. 주 : FLUO-4, AM은 셀에 진입하면, AM 에스테르 셀룰러 에스 테라 제에 의해 분해된다. 실온에서 배양하면 FLUO-4, AM은 미토콘드리아를 입력 할 수 있도록, 에스 테라 제 활성을 억제한다. </li><li> 피펫에 의해 RS의 염색 액을 제거하고 초과 FLUO-4, AM 및 TMRM을 제거하기 위해 칼슘 2 + μL (100)에 무료 HBSS를 세포를 씻는다. </li><li> 25 μg의 / ml의 IM 이미징 솔루션을 준비 디기 토닌 (/ V w), 200 nM의 TMRM 및 IM 1 μM의 쌥시 가르 긴. 참고 디기 토닌의 농도가 발생하지 미토콘드리아 내막의 permeabilization을 위해 조정될 필요가있다. 이것은 강도를 평가함으로써 실험적으로 결정될 수있다디기 토닌 상이한 농도에서 TMRM 신호. </li><li> 피펫으로 칼슘 2 + 무료 HBSS를 제거하고 세포 IM 이미징 솔루션의 300 μl를 추가합니다. 10 분 동안 실온에서 평형 셀을 떠난다. 셀은 염화칼슘이 추가와 이미징을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 4. 세포 이미징 <ol><li> 반전 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 접시 또는 IM 이미징 솔루션 세포와 챔버 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> TMRM 및 FLUO-4의 여기 및 방출 스펙트럼에 대한 현미경 레이저에 설정을 사용합니다. 예를 들어, 각각 TMRM 및 FLUO-4를 가진시키기 위해 543 nm의 HE-(NE)와 473 nm의 아르곤 레이저 라인을 사용한다. 셀 어떤 광 손실을 최소화하기 위해 약 5 %의 낮은 레이저 파워를 사용한다. </li><li> 이미지마다 25 초를 스캔 현미경을 설정합니다. 10 분 동안 스캔 세포는 TMRM와 FLUO-4 신호를 기준 판독 값을 설정합니다. 주 : FLUO-4 신호가 휴식 칼슘 승낙에 약하거나 탐지 할 수있다식료품. </li><li> IM 이미징 솔루션의 300 μl를 직접 세포에 40 mM의 CaCl2를 원액의 3 μl를 추가 (1 : 100 희석)와 피펫으로 가볍게 섞는다. 추가하고, 필요한 경우 CaCl2를 혼합하면서 화상 검색을 일시 정지. 주 : 최종 자유 칼슘 이온 농도 [칼슘 상기 IM 촬상 용액 등 Maxchelator WEBMAXC 같은 소프트웨어를 사용하여 계산 될 수 EXTENDED ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) 또는 킬레이트 11. 최종 자유 칼슘 이온 농도를 계산하는 방법에 대한 자세한 설명은 [캘리포니아 2+] 아래의 (6)에 기재되어있다. </li><li> 약 4 분의 이미지 스캔을 계속하고 일반적으로 약 8 10 추가에 도달 원하는 TMRM 또는 FLUO-4 신호까지 염화칼슘 2 추가 매 4 분을 반복합니다. </li><li> 1 mM의 FCCP 100 희석 (최종 C : 피펫을 사용하여 1을 추가직접 세포에 oncentration 10 μM)는 ΔΨ 분을 발산합니다. 또 5 분 동안 이미지 세포. 실험은 이제 완료됩니다. </li></ol> 5. 이미지 분석 <ol><li> 이미지가 완료되면 http://downloads.openmicroscopy.org/bio에서 바이오 형식 플러그인 (다운로드 &#39;bioformats_package.jar&#39;로 예시 ImageJ에 소프트웨어, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 FLUO-4와 TMRM 신호의 강도를 판정 -formats /과에 저장 &#39;C : 프로그램 파일 ImageJ에 플러그인&#39;폴더). </li><li> ImageJ에있는 (예를 들어 .oif 파일) 이미징 파일을 엽니 다. 미토콘드리아가 포함 된 선택 도구를 클릭하고 관심 (ROI)의 영역을 선택합니다. 투자 수익 (ROI)을 선택합니다 초기 TMRM 신호를 사용합니다. </li><li> 열기 &#39;분석&gt; 도구&gt; 투자 수익 (ROI) 관리자&#39;강도 측정을위한 선택 투자 수익 (ROI)을 포함하는 &#39;추가&#39;를 클릭합니다. 복수의 ROI는 측정을위한 하나의 이미지를 선택할 수 있습니다. 모든 ROI 때까지 반복하여 이전 단계s는 투자 수익 (ROI) 관리자에 추가되었습니다. </li><li> &#39;더보기&gt; 멀티 측정&#39;을 클릭 선택 &#39;모든 조각을 측정합니다&#39;있는지 확인하고 &#39;조각 당 하나의 행이&#39;선택 해제되어 있는지, 다음 TMRM 및 FLUO-4 신호의 평균 형광 강도의 표를 얻기 위해 &#39;확인&#39;을 클릭 각 시점에서 각 ROI합니다. </li><li> TMRM 및 FLUO-4 신호 강도의 평균과 표준 편차를 계산하기 위해 모든 ROI들로부터 데이터를 사용한다. </li></ol> 6. 최종 무료 칼슘 이온 농도 [칼슘 2 +] 계산 <ol><li> 유리 칼슘 이온 농도 IM 촬상 용액 [칼슘]는 Maxchelator WEBMAXC EXTENDED (같은 소프트웨어를 사용하여 결정될 수있다 <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) 또는 킬레이트 11. = 온도를 24 ° C, pH가 7 예를 들어, 다음과 같이 WEBMAXC의 변수 확장 설정합니다.1, 이온 강도 = 0.162, EGTA = 0.002 M, HEDTA = 0.01 M, 칼슘 2 + = 0.0004 M과의 Mg 2+ = 0.0078 M.이 최종 무료 칼슘 이온 농도 [칼슘 2 +] 62 nM의의 결과 . 이 프로그램은 시약의 순도 측정과 pH를 측정의 정확도로, 계정에 모든 변수를 취할 수 없습니다. 유리 칼슘 이온 농도를 결정하는 가장 정확한 방법은 교정 된 칼슘 선택성 전극을 사용하는 것이다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

칼슘은 근육 수축, 신경 신호 전달 및 세포 증식 (13)를 포함한 많은 세포 공정에서 중요한 역할을한다. 세포의 칼슘 농도의 증가는 종종 직접 ATP 생성 3을 높이기 위해 미토콘드리아의 산화 적 인산화를 자극 할 수 칼슘, 에너지 수요와 연결되어 있습니다. 우리가 효과적으로 미토콘드리아 칼슘 축적을 모니터링하고,이 기능은 유전 적 요인 및 약리학 적 제제 모두에 의해 영향을받는 방법을 비교할 수있는 능력을 가지고 있다는 것이 필수적이다. 프로토콜 내에서 중요한 단계 이 프로토콜은 FLUO-4 AM 및 TMRM 동시에 미토콘드리아 칼슘 축적 ΔΨ의 m을 감시하는 기능을 설명한다. 염색 과정은 FLUO-4의 효과를 최적화하기 위해 실온에서 세포를 배양 중요 미토콘드리아 검출에 AM칼슘. 실온에서 인큐베이션 미토콘드리아 막을 통...

미토콘드리아는 지역 칼슘 버퍼 1로 작용하여 세포 내 칼슘 농도를 조절하는데 중요한 역할을한다. 칼슘은 2 +, 칼슘 2 + uniporter 통해 미토콘드리아 내막 (ΔΨ 분) 2에서 존재하는 전기 화학적 구배에 의해 구동되는 과정을 미토콘드리아로 들어갑니다. 일단 미토콘드리아 매트릭스 내부, 칼슘은 구연산 사이클 (3)의 세 가지 속도 제한 탈수소 효소를 자극하여 산화 적 인산화를 활성화 할 수 있습니다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ 분을 유지한다. 미토콘드리아 내의 칼슘 이온 농도가 매우 높아지면, 미토콘드리아 투과성 천이 ΔΨ의 m의 손실의 결과로, 초기화 될 수 있으며, cessatio산화 적 인산화 n 및 4 경로 신호 세포사의 유도. 미토콘드리아는 세포 칼슘의 공간 버퍼링에서 재생 중요한 역할은 미토콘드리아 칼슘의 정확한 모니터링이 중요합니다. 다양한 방법 로다 계 염료의 사용을 포함 미토콘드리아 칼슘을 모니터하기 위해 설립되었다. 그러한 염료, 루비로드-2, AM은 6 미토콘드리아 칼슘 레벨 5를 측정하는 미토콘드리아에 파티션에 매우 효과적이다. 몇몇 염료는 리포좀과 같은 다른 소기관에 축적 또는 세포 세포질에 남아 그러나, 치료가 사용되어야한다. 그럼에도 불구하고, 하류 분석 미토콘드리아 7 것과 이러한 신호들을 구별하기 위해 사용될 수있다. 미토콘드리아 칼슘을 모니터링하는 다른 기술은 형광 리포터 (8)를 구성 이용한다 </s<html> &gt;입니다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 이점은 특히, 예를 들어 인간 COX 소단위 VIII의 N- 말단 타겟팅 신호 내인성 N 말단 펩티드를 이용하여 미토콘드리아를 타겟팅 할 수 있다는 것이다. 이 시스템은 9 신호 미토콘드리아 칼슘 조사 매우 유용 입증되었다 미토콘드리아 타겟팅 쿼린 프로브를 생성하는데 사용되어왔다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 주요 단점은 일시적인 발현에 의해 세포 내로 도입 될 필요가 (특정 세포 유형에 대해 가능하지 가변 결과를 얻을 수 있음) 또는 안정한 발현 시스템 (이는 시간이 소비된다) 만들어 있다는 것이다. 위에 설명 된 문제를 회피하기 위해, 우리는 동시에 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ m을 측정하는 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜은 투과성이 세포에 외인성 칼슘을 추가하는 전술 한 방법에 기초S = &quot;외부 참조&quot;&gt; 10. 우리의 프로토콜은 다른 방법을 통해 세 가지 주요 이점이있다 : 첫째로, 우리는 FLUO-4, AM 및 TMRM는 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ 분, 매우 독특한 스펙트럼 특성을 갖는 두 개의 염료를 모니터링하는 데 사용할; 둘째, 세포는 FLUO-4 신호는 미토콘드리아 칼슘 감지하는 2 +와 칼슘이 다른 세포 소기관이나 세포의 세포질에 지역화되지 않도록 투과성이있다; 셋째, FLUO-4의 사용 2+ 미토콘드리아 칼슘 감지 유 전적으로 인코딩 된 프로브를 사용하는 경우 존재하는 세포 또는 형질 전환 문제를 부정 빠르고 간단한 세포 염색을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>둘베코의 변성 이글 배지(DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100x 페니실린/스트렙토마이신(p/s)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신/0.25% EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>8-웰 챔버 커버슬립</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9541&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td> <td>시그마-알드리치</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E4378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>H8126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>말라테</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>글루타메이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ 프리 행크' s 완충염 용액(HBSS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸로다민, 메틸 에스테르, 과염소산염(TMRM)</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>베라파밀</td><td>시그마-알드리치</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>플루오-4 아세톡시메틸 에스테르(플루오-4, AM)</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>카르보닐 시안화물 p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>써모피셔</td><td>P3000MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>10cm 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>75cm2 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

외에도 ATP를 생성하는 자신의 중요한 역할에서, 미토콘드리아는 (칼슘) 단단히 세포 내 칼슘 농도를 조절하는 버퍼 지역 칼슘 역할을합니다. 이렇게하려면 미토콘드리아는 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (ΔΨ 분)에 걸쳐 전기 잠재력을 활용합니다. 미토콘드리아에 칼슘 이온의 유입은 산화 적 인산화 (OXPHOS) 착체를 통해 전자 전달을 증가 시트르산 사이클의 세 속도 제한게나 제를 자극한다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ 분을 유지한다. 우리는 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ의 m 여기하는 방법을 설명합니다. 세포를 permeabilizing, 미토콘드리아 칼슘에 의해 2+ 수형광 염료를 사용하여 테트라 메틸 ΔΨ m의 메틸 에스테르, 퍼클로레이트 (TMRM)의 측정을, 형광 칼슘 지표 FLUO-4 AM을 사용하여 측정 될 수있다. 이 시스템의 이점은 형광 염료 사이의 아주 작은 스펙트럼 오버랩 동시에 정확한 미토콘드리아의 Ca 2+ 및 측정 ΔΨ의 m을 수 있다는 것이다. 칼슘 분취의 순차 첨가를 사용하여 미토콘드리아 칼슘 흡수를 모니터 할 수 있으며, 칼슘 미토콘드리아 막 투과성 전이 및 ΔΨ의 손실을 유도하는 농도 결정 해요.

우리는 칼슘 (12)의 증가를 버퍼링 143B 세포 미토콘드리아의 능력에 MT-ND5 돌연변이의 영향을 조사하기 위해 프로토콜을 사용 하였다. 여기에 도시 된 예에서, 제어부 (143B) 세포 TMRM FLUO-4와 함께로드하고, 디기 토닌와 permeabilization 전에 AM. 촬상 5 분 후, 1 여덟 순차 추가 : CaCl2를 40 mM의 외인성 100 희석 최종 자유 칼슘 이온 농도로 만들어 하였다 캘리포니아 2+] 계산. 각 CaCl2를 첨가 후, TMRM 신호는 미토콘드리아 막 전위 ΔΨ의 m (그림 1) 방산 2+ 이온 미토콘드리아에 칼슘...

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

본 절차의 전체적인 목적은 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 미토콘드리아 칼슘 섭취와 미토콘드리아 막 전위를 동시에 측정할 수 있는 간단한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아가 어떻게 국소적 칼슘 저장소로서 작용하여 세포 내 칼슘 농도를 엄격하게 조절하는지와 같은 미토콘드리아 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 조작 없이도 살아있는 세포에서 미토콘드리아 칼슘과 미토콘드리아 막 전위를 모두 특이적으로 동시 측정할 수 있다는 점입니다.이 방법은 미토콘드리아 질환 병리학에서의 칼슘 조절에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 소변 내 칼슘 조절이 중요한 최신 퇴행성 질환들을 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 본 절차에서는 세포를 10cm 세포 배양 접시 또는 75cm² 플라스크의 배양 배지에서 37°C로 24시간 동안 배양하십시오. 세포를 회수하려면 흡입법으로 배지를 제거하고 5mL의 PBS로 세포를 세척하십시오.그 후, 흡입기로 PBS를 제거합니다. 그런 다음 1.5 milliliters의 Trypsin EDTA를 첨가하고, 37 °C에서 2분 동안 세포를 배양합니다. 다음으로 디쉬를 가볍게 두드려 세포를 떼어냅니다.이를 5 mL의 배양 배지에 재현탁합니다. 그 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 공초점 이미징 전날, 세포를 디쉬 또는 챔버 커버슬립에 60~70% 밀도로 분주합니다.그 다음 세포가 부착되고 회복될 수 있도록 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 과정에서 TMRM, Fluo 4 AM 및 계면활성제를 사용하여 기록 염색 용액을 준비합니다. 배양액을 제거하고 100 µL의 PBS로 세포를 세척합니다.다음으로 PBS를 제거하고 100 µL의 record 염색 용액 내에서 세포를 실온에서 45분 동안 배양합니다. 그 후, record 염색 용액을 제거하고 100 µL의 칼슘 제거 HBSS로 세포를 세척하여 과잉의 Fluo 4 AM 및 TMRM을 제거합니다. 그런 다음 digitonin, TMRM 및 thapsigargin이 포함된 세포 내 이미징 용액을 준비합니다.다음으로 칼슘이 없는 HPSS를 제거하고 300 microliters의 IM 이미징 용액을 세포에 첨가합니다. 염화칼슘을 첨가하여 이미징하기 전, 세포를 상온에서 10분 동안 평형 상태로 둡니다. 세포의 광손상을 최소화하기 위해 약 5%의 낮은 레이저 출력을 사용하십시오.TMRM과 Fluo 4 AM의 여기 및 방출 스펙트럼에 맞춰 현미경 레이저 설정을 조정하십시오. 세포의 광손상을 최소화하기 위해 레이저 출력을 약 5%의 낮은 수준으로 설정하고 게인을 높게 설정하십시오. 다음으로 현미경이 25초마다 이미지를 스캔하도록 설정하십시오. TMRM 및 Fluo 4 신호의 기선(baseline) 수치를 설정하기 위해 10분 동안 세포를 스캔하십시오.그 다음 이미지 스캐닝을 일시 중단하고, 300 µL의 IM 이미징 솔루션에 있는 세포에 40 mM 염화칼슘 스톡 솔루션 3 µL를 직접 첨가합니다. 피펫으로 부드럽게 혼합합니다. 세포에 칼슘 솔루션을 첨가할 때, 현미경 스테이지 위의 디쉬가 움직이지 않도록 주의하십시오.약 4분 동안 이미지 스캔을 계속합니다. 그 후 원하는 TMRM 또는 Fluo 4 신호에 도달할 때까지 4분마다 염화칼슘 첨가를 반복하며, 보통 8~10회 정도 첨가합니다. 이어서 1mM FCCP를 1:100로 희석하여 세포에 직접 첨가하여 내막 전위를 소산시킵니다.그 다음, 실험이 종료되기 전까지 5분 동안 세포를 추가로 이미징합니다. 이미징이 완료되면, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 Fluo 4 및 TMRM 신호의 강도를 측정합니다. 이를 위해 이미지를 열고, 선택 도구를 클릭한 후 미토콘드리아가 포함된 관심 영역을 선택합니다.Analyze, Tools, ROI Manager를 열어 측정할 여러 관심 영역을 선택할 수 있습니다. Add를 클릭하여 선택한 ROI를 강도 측정에 포함합니다. 모든 ROI가 ROI manager에 추가될 때까지 이전 단계들을 반복합니다.더욱 다중 측정(more multi measure) 기능을 선택하여 각 관심 영역(ROI)에 대한 TMRM 및 Fluo 4 신호의 평균 형광 강도를 측정합니다. 이때 모든 슬라이스 측정(Measure All Slices)이 선택되어 있고, 슬라이스당 한 행(One Row Per Slice)은 선택 해제되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 확인(Okay)을 클릭하여 각 시점별 각 ROI에 대한 TMRM 및 Fluo 4 신호의 평균 형광 강도 표를 얻습니다.그런 다음 데이터를 결합하여 TMRM 및 Fluo 4 신호의 평균 강도와 표준 편차를 계산합니다. 본 실험에서는 digitonin으로 투과화하기 전 143B 세포에 Fluo 4 AM과 TMRM을 미리 로딩하였습니다. 각 염화칼슘 첨가 후, 미토콘드리아로의 칼슘 이온 유입으로 인해 미토콘드리아 막 전위가 소실되면서 TMRM 신호가 감소합니다.10 µM FCCP의 첨가가 여전히 막 전위의 붕괴를 유도하는 것으로 보아, 투과성 전이 이후에 소량의 막 전위가 존재함이 분명합니다. 여기서 Fluo 4 신호로 표시된 미토콘드리아 칼슘 농도는 배지 내 유리 칼슘 농도가 0.32 µM에 도달했을 때 두 번째 염화 칼슘 첨가 이후부터 증가하기 시작합니다. 이후 염화 칼슘을 추가로 첨가할 때마다 미토콘드리아 칼슘이 점진적으로 증가하였습니다.여기 Mitochondrial calcium의 막 전위를 동시에 측정한 이미지가 제시되어 있습니다. 빨간색 신호는 TMRM을 나타내고 초록색 신호는 Fluo 4를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 약 2시간 만에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 투과화된 세포에 외인성 칼슘을 첨가하여 공초점 현미경으로 미토콘드리아 칼슘 수치와 미토콘드리아 막 전위를 동시에 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. FCCP와 digitonin을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 개인 보호 장구(PPE) 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

simultaneous-measurement-mitochondrial-calcium-mitochondrial-membrane

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 형광 이미징에 의해 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 이 메서드는 선택 mitochondria로 표현 circularly permutated YFP 기반 듀얼 여기 ratiometric 칼슘 센서 (ratiometric pericam - MT)을 활용합니다.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

우리는 공촛점 현미경을 검색 레이저를 사용하여 살아있는 세포에 느리게 fluxes에서 신속하게 (마이크로초) 칼슘 이벤트를 분리하는 방법을 제시한다. 방법은 세포에 수백 픽셀의 기록 선 검사에 의한 칼슘 지표의 형광 강도 변화를 측정합니다. 히스토그램 분석은 우리가 다른 칼슘 fluxes의 시간 스케일을 분리 할 수​​ 있습니다.

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

Mitochondrial 융합은 시간이 지남에 mitochondrial 네트워크 photoconverted 매트릭스 타겟 GFP의 평균 추적에 의해 측정되었다. 지금까지 하나의 세포는 한 번에 한 시간 동안 운동 분석을 받다 수 있습니다. 우리는 동시에이를 통해 데이터 수집 과정을 속도, 여러 개의 세포를 측정하는 방법을 제시한다.

병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtPA-GFP 기반 Mitochondrial 퓨전 분석

이 비디오는 분리된 미토콘드리아에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 플레이트 리더 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 형광 염료의 형광 신호를 분석하여 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 칼슘 과부하의 역학을 연구합니다.

미토콘드리아 칼슘 흡수 분석법: 분리된 미토콘드리아에서 칼슘 흡수를 측정하기 위한 플레이트 리더 기반 방법

이 동영상은 배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 컨포칼 현미경 이미징 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 형광 염료 Rhod-2/AM을 사용하여 투과 배양 세포에서 미토콘드리아 칼슘을 측정합니다.

배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 칼슘 유입 분석

이 비디오는 쥐의 대뇌 동맥 분절의 내피 세포에서 세포 내 칼슘 수치와 막 전위의 변화를 동시에 측정하는 것을 보여줍니다. 분리된 내피관에는 형광 칼슘 지시약이 적재되어 세포 내 칼슘 방출을 유도하는 약물로 처리되어 막 전위의 변화를 일으킵니다. 지표의 형광을 통해 칼슘 수치를 측정할 수 있으며, 기록 전극을 세포에 삽입하여 막 전위의 변화를 측정합니다.

Simultaneous Measurement of Intracellular calcium and Membrane Potential in a Mouse Cerebral Endothelium(쥐 대뇌 내피에서 세포 내 칼슘 및 막 전위)

이 프로토콜 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.

미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

학습하세요 형광 현미경을 이용한 살아있는 세포의 미토콘드리아 칼슘 흡수와 막 전위 동시 측정 방법을. 유전자 조작 없이 실시간으로 미토콘드리아 기능을 연구할 수 있는 이 기술은 세포생물학 및 퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

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