형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

이 절차의 전반적인 목표는 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수량과 미토콘드리아 막 전위를 동시에 측정할 수 있는 간단한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아가 세포 내 칼슘 농도를 엄격하게 조절하기 위해 국소 칼슘 저장고로 어떻게 작용하는지와 같은 미토콘드리아 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미토콘드리아 칼슘과 미토콘드리아 막 전위를 유전자 조작 없이 살아있는 세포에서 동시에 특이적으로 측정할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 미토콘드리아 질환 병리학에서 칼슘 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 소변기 칼슘 조절이 중요한 다른 새로운 퇴행성 질환을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 절차에서는 섭씨 37도의 배양 배지에서 10cm 세포 배양 접시 또는 75제곱센티미터 플라스크에서 24시간 동안 세포를 성장시킵니다. 세포를 수확하려면 흡인으로 배지를 제거하고 5ml의 PBS로 세포를 세척합니다.

그 후, 흡인에 의해 PBS를 제거하십시오. 그런 다음 1.5ml의 트립신 EDTA를 넣고 섭씨 37도에서 2분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 접시를 부드럽게 두드려 세포를 제거합니다.

5ml의 배양 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음 혈구계로 세포를 계수합니다. 컨포칼 이미징 전날, 접시 또는 챔버 커버 슬립에서 60-70% 농도로 세포를 플레이트

그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양하여 세포가 부착하고 회복할 수 있도록 합니다. 이 절차에서는 TMRM, Fluo 4 AM 및 계면활성제를 함유한 기록 염색 용액을 준비합니다. 배양 배지를 제거하고 100마이크로리터의 PBS로 세포를 세척합니다.

다음으로 PBS를 제거하고 실온에서 45분 동안 100마이크로리터의 기록 염색 용액에 세포를 배양합니다. 그런 다음 기록 염색 용액을 제거하고 칼슘이 없는 HBSS 100마이크로리터로 세포를 세척하여 과도한 Fluo 4 AM 및 TMRM을 제거합니다. 그런 다음 디지토닌(digitonin), TMRM 및 탑시가르진(thapsigargin)을 함유한 세포 내 이미징 용액을 준비합니다.

다음으로 칼슘이 없는 HPSS를 제거하고 300마이크로리터의 IM 이미징 솔루션을 세포에 추가합니다. 세포를 실온에서 10분 동안 평형을 이룬 후 염화칼슘 첨가물로 이미징합니다. 약 5%의 낮은 레이저 출력을 사용하여 셀의 광 손상을 최소화합니다.

TMRM 및 Fluo 4 AM의 여기 및 방출 스펙트럼에 대해 현미경 레이저의 설정을 사용합니다. 셀의 광 손상을 최소화하기 위해 높은 게인으로 약 5%의 낮은 레이저 출력을 사용합니다. 그런 다음 25초마다 이미지를 스캔하도록 현미경을 설정합니다. TMRM 및 Fluo 4 신호에 대한 기준선 판독값을 설정하기 위해 10분 동안 세포를 스캔합니다.

그런 다음 이미지 스캔을 일시 중지하고 300마이크로리터의 IM 이미징 용액에 있는 세포에 40밀리몰라 염화칼슘 원액 3마이크로리터를 직접 추가합니다. 피펫으로 부드럽게 섞습니다. 세포에 칼슘 용액을 첨가할 때 현미경 단계에서 접시를 움직이지 않도록 주의하십시오.

약 4분 동안 이미지 스캔을 계속합니다. 그런 다음 원하는 TMRM 또는 Fluo 4 신호에 도달할 때까지 4분마다 염화칼슘 첨가를 반복하며, 일반적으로 약 8-10회 첨가합니다. 그런 다음 1 밀리몰 FCCP를 1 - 100 희석하여 세포에 직접 첨가하여 내막 전위를 소멸시킵니다.

그런 다음 실험이 완료되기 전에 5분 동안 세포를 이미지화합니다. 이미징이 완료되면 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 Fluo 4 및 TMRM 신호의 강도를 결정합니다. 이렇게 하려면 이미지를 열고 선택 도구를 클릭한 다음 미토콘드리아가 포함된 관심 영역을 선택합니다.

여러 관심 영역은 Analyze(분석), Tools(도구), ROI Manager(ROI 관리자)를 열어 측정할 수 있습니다. Add(추가)를 클릭하여 강도 측정을 위해 선택한 ROI를 포함합니다. 모든 ROI가 ROI 관리자에 추가될 때까지 이전 단계를 반복합니다.

more multi measure function을 선택하여 각 관심 영역에 대한 TMRM 및 Fluo 4 신호의 평균 형광 강도를 측정합니다. 모든 조각 측정이 선택되어 있고 조각당 한 행이 선택 취소되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 각 시점에서 각 ROI에 대한 TMRM 및 Fluo 4 신호의 평균 형광 강도 테이블을 가져옵니다.

그런 다음 데이터를 결합하여 TMRM 및 Fluo 4 신호에 대한 평균 강도와 표준 편차를 계산합니다. 이 실험에서는 143B 세포에 디지토닌으로 투과화하기 전에 Fluo 4 AM 및 TMRM을 사전 로드했습니다. 염화칼슘이 추가될 때마다 칼슘 이온이 미토콘드리아로 유입되어 미토콘드리아 막 전위가 소멸됨에 따라 TMRM 신호가 감소합니다.

10 마이크로몰 FCCP를 추가해도 여전히 막 전위의 붕괴를 유도하기 때문에 투과성 전이 후 작은 막 전위가 분명합니다. 여기서 Fluo 4 신호로 표시되는 미토콘드리아 칼슘 농도는 매체의 유리 칼슘이 0.32마이크로몰에 도달할 때 두 번째 염화칼슘 추가 후 증가하기 시작합니다. 그 후 염화칼슘이 첨가될 때마다 미토콘드리아 칼슘이 점진적으로 증가했습니다.

여기에 표시된 것은 미토콘드리아 칼슘의 막 전위를 동시에 측정한 이미지입니다. 빨간색 신호는 TMRM을 나타내고 녹색 신호는 Fluo 4를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 2시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 투과성 세포에 외인성 칼슘을 첨가하여 컨포칼 현미경 검사에서 미토콘드리아 칼슘 수치와 미토콘드리아 막 전위를 동시에 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. FCCP 및 디지토닌으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행할 때 항상 PPE 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.