공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

이 실험의 전반적인 목표는 안지오텐신 2 처리 후 안지오텐신 1형 수용체 리소좀 공동 국소화에 대한 정량적, 공간적, 시간적 증거를 얻는 것입니다. 이 방법은 Y형 수용체와 돌연변이 수용체의 세포 내 처리의 차이를 감지하기 위해 고안되었으며, 내부화 과정에서와 같이 리간드 시뮬레이션에 대한 응답으로 발화합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 이미징, 고정 및 세제 투과성 세포에서 아티팩트를 제거하고 수용체 국소화의 동적 변화를 실시간으로 평가할 수 있다는 것입니다.

먼저 적절한 1.4 개구수 대물렌즈를 선택하고 대물렌즈를 현미경 스테이지의 중앙에 놓습니다. 고점도, 낮은 자동 형광 이멀젼 오일을 대물렌즈에 한 방울 떨어뜨리고 형질전환된 세포가 있는 챔버를 현미경 스테이지로 옮깁니다. 오일이 첫 번째 슬라이드의 바닥에 닿을 때까지 대물렌즈를 부드럽게 올리고 어두운 셀을 찾습니다.

건강한 관심 세포가 있는 상태에서 시야 중앙에 컨포칼 모드로 전환하고 세포가 잘 퍼져 있고 복부 쪽이 커버 슬립과 밀접하게 병치되어 있는지 확인합니다. Z 스택 대화 상자를 열고 Live를 클릭한 다음 셀 맨 위에 포커스를 놓고 시작을 클릭합니다. 그런 다음 셀의 맨 아래에 초점을 맞추고 Z 단계 크기 1.00 마이크로미터를 입력한 다음 끝을 클릭합니다.

그런 다음 상단의 획득 설정에서 XYZT 모드를 선택합니다. 마지막으로, 리소좀에 대한 GFP 표지 Angiotensin Type 1A 수용체의 표적을 관찰하기 위해 스캔 시간 간격과 스캔 시간을 설정합니다. 그런 다음 리간드 자극을 시작하려면 이미징 중인 웰에 3마이크로리터의 100X 리간드 스톡 용액을 추가하고 시작을 클릭하여 원하는 기간 및 빈도에 대한 반응을 3D로 이미지화합니다.

라이브 셀 이미지를 분석하려면 적절한 3D 이미지 정량화 소프트웨어를 엽니다. 이 프로토콜에서는 Velocity입니다. 이미지 필드 내부를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 속성을 선택합니다.

리간드 처리에 대한 반응으로 GFP 태그가 지정된 수용체, 소포 및 홀 세포 강도를 분석하기 위한 측정 시퀀스를 생성하기 위한 적절한 XY 및 Z 이미지 픽셀 속성을 입력합니다. 2D 메뉴에서 확장 초점 모드를 선택하여 셀을 관찰합니다. 그런 다음 자유형 영역 도구를 사용하여 셀 주위에 관심 영역을 그리고 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 선택 영역으로 자르기를 선택합니다.

새 이미지 항목이 생성됩니다. 이미지 이름을 클릭하여 자른 셀 이미지를 선택하고 측정 탭을 엽니다. 내부화된 소포의 GFP 표현식을 측정하려면 Find Objects from Finding을 위의 시퀀스 상자로 드래그합니다.

개체 찾기 채널을 GFP로 설정하고 설정 아이콘을 열어 임계값을 표준 편차로 설정하고 하한을 6으로 설정하여 GFP 강도가 가장 밝은 개체를 선택합니다. 최소 개체 크기를 0마이크로미터 세제곱으로 설정합니다. 그런 다음 측정을 클릭하고 채널과 측정 유형을 선택합니다.

전체 셀을 식별하기 위한 임계값 및 필터를 정의하고 총 GFP 강도를 측정하려면 두 번째 개체 찾기 상자를 드래그합니다. 다음으로, 개체 찾기 채널을 GFP로 설정하고 표준 편차를 0으로 설정하여 GFP 강도와 최소 개체 크기가 2마이크로미터 큐브인 개체를 선택합니다. Filter Population을 Population two Find Objects 상자로 끌어 놓고 100보다 큰 마이크로미터 세제곱 볼륨을 선택하여 전체 셀을 선택하고 더 작은 개체를 모두 제거합니다.

그런 다음 측정 및 측정 항목을 선택하여 모든 시점에서 측정합니다. 시간 경과에 따른 소포 및 전체 세포에서 측정된 GFP 발현을 분석하려면 이미지 이름 아래에 있는 측정 항목 파일 이름을 클릭합니다. 총 데이터에서 GFP 및 소포에 대한 데이터를 추출하려면 원시 탭을 열고 population one을 선택합니다.

그런 다음 분석된 탭을 열고 데이터를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 분석을 선택한 다음 분석을 제한하여 모집단 1을 선택합니다. 전체 세포에서 GFP의 양을 측정하려면 둘 다 모집단 2로 변경합니다. Analyze These Data and Summarized By(다음 데이터 분석 및 요약 기준)에서 sum(합계), GFP color channel(GFP 색상 채널 합계) 및 합계를 선택합니다.

그런 다음 Organize the data by(데이터 구성 기준) 및 행에서 시점을 선택합니다. 리소좀의 GFP 양에 대한 데이터를 추출하려면 모집단 1에 대한 개체 찾기에서 개체 찾기 채널을 빨간색 채널로 설정합니다. 대화 상자 내의 휠 아이콘에서 임계값을 표준 편차로 설정하고, 하한을 6으로 설정하여 강도가 가장 밝은 빨간색 개체를 선택하고, 최소 개체 크기를 0.017마이크로미터 세제곱으로 설정합니다.

측정을 선택하고 측정 항목을 만들어 모든 시점에서 측정을 수행합니다. 리소좀에서 측정된 GFP 발현을 분석하려면 이미지 이름 아래에 있는 측정 항목 파일 이름을 클릭합니다. 익지않는 탭에서 population one를 선택하고, 그 후에 population one를 선택하고 분석 탭에서 GFP 색깔 수로를 합계하고 빨간 소포에 있는 GFP 양을 측정하기 위하여 이전과 같이 오른쪽 클릭하여

리간드 자극 전에, GFP 표지된 안지오텐신 1A형 수용체는 주로 원형질막에 국한되어 있습니다. 그러나 안지오텐신 2호를 첨가한 후 2.5분 이내에 이러한 수용체가 내재화되어 밝은 소포를 형성하고 나중에 클러스터링되고 큰 파라핵생물 소포를 형성합니다. Angiotensin 2 induced ruffling은 이러한 대표적인 GFP 발현 측정 데이터에서 관찰된 바와 같이 총 소포 GFP 강도의 정량화를 복잡하게 만듭니다.

크기 필터링은 더 큰 주름 장식과 군집 소포를 구별하지 않지만 더 작은 물체의 GFP가 더 큰 물체의 GFP보다 더 빨리 증가한다는 것을 보여줍니다. 자동 초점이 없는 GFP 발현의 이 대표적인 시간 과정에서, 내재화된 GFP는 총 세포 GFP 퍼센트로 측정되었습니다. 세포 내 총 GFP를 분석한 결과, 이 세포는 시간이 지남에 따라 눈에 띄게 광표백제를 방출하지 않는 것으로 나타났습니다.

형질주입된 세포의 리소좀에서 GFP의 정량화는 또한 리소좀 내에 존재하는 안지오텐신 유형 1A 수용체의 강도가 안지오텐신 2회 투여 후 최대 24분 동안 변하지 않음을 나타냅니다. 이 절차를 수행하는 동안에는 이미징 전과 이미징 중에 세포의 건강을 모니터링하는 것이 중요하며, 절차에는 시간이 많이 걸리기 때문에 세포 배양이 어떤 식으로든 비정상적일 경우 실험을 중단해야 합니다. 이 절차에 따라 면역염색 및 FRET 또는 FLIM을 사용하여 수용체의 세포 내 국소화를 검출하고 확인할 수 있습니다.

서부 블롯은 수용체 이동 중에 관련된 신호 분자의 정체성과 변화를 해결하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 리소좀과 다른 세포 내 구획을 표적으로 하는 리간드 유도 막관통 수용체를 측정하기 위해 라이브 셀 이미징 및 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.