Name: 비 침습적 In Vivo 활성화 가능한 형광 이미징 에이전트를 사용한 염증성 MMP 활성의 형광 광학 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 배우세요 비침습적 형광 광학 이미징을 사용하여 염증성 질환에서 MMP 활성을 실시간으로 시각화하는 방법을. 활성화 가능한 형광 프로브를 이용한 이 기술은 빠르고 경제적이며 다양한 생물학적 과정 연구에 활용됩니다.

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탁월한 기술 지원에 대해 Daniel Bukala, Natalie Altmeyer 및 Funda Cay에게 감사드립니다. 원고를 편집 한 Jonathan Cotton, Greg Bowden 및 Paul Soubiran에게 감사드립니다. 이 작업은 Werner Siemens-Foundation과 Eberhard Karls University Tübingen의 의학 교수 ( &quot;Promotionskolleg&quot;) 및 CRC 156 (프로젝트 C3)을 통한 DFG의 지원을 받았다.

이 문서에 설명 된 모든 절차는 지침과 관리 및 실험 동물의 사용의 국제 표준을 따라 국가위원회 튀빙겐, 독일의 지역 동물 복지와 윤리위원회에 의해 승인되었다. 12 시간 광 : - 8 ~ 12 주령 BALB / C 및 C57BL / 6 마우스는 12 시간에 보관 하였다 암주기를 2 그룹으로 22 ± 1 ℃에서 IVCs 표준화 된 환경 조건에 수납 된 - 물 (5) 음식 액세스 수의. 1. 재료 준비 <ol><li> 사출 직전 각 데이터 시트에 따른 근 적외 형광 영상을위한 OI 염료 희석. 생체 내에서 MMP의 측정을 기동 OI 염료 (680 nm에서 여기 상업용 프로브)를 1.5 ml의 PBS 1X 20 nmol의 농도로 사용할 수 있습니다. 부드럽게 흔들거나 사용하기 전에 솔루션을 소용돌이. 빛으로부터 보호 할 때 최대 6 개월 동안 11 °의 C - OI 염료 2에 저장 될 수있다. </li&gt; <li> 정맥 내 (IV) 주사는 정맥 카테터를 준비한다. 20 U (50 ㎖ 헤파린 10 개 분사 유니트를 포함)는 0.9 % 식염수 용액으로 채워진 (0.5 mL) 중 인슐린 주사기 및 폴리에틸렌 카테터에 부착 된 30 게이지 바늘을 사용한다. OI가 염료의 마우스 당 2 nmol의 권장 복용량을 주입한다. </li></ol> 류마티스 관절염 및 만성 연락 과민 반응 2. 유도 <ol><li> 류마티스 관절염: <ol><li> RA를 유도하는 1X PBS (200 μL)를 1 (K / BxN 마우스 (10)로부터 얻은) 혈중 글루코스 -6- 포스페이트 이소 머라 제 (GPI)에 대해 1 함유 항체 (AB)의 100 μL 희석. -80 ° C에서 희석 된 혈청을 저장합니다. RA의 유도에 대한 상세 절차는 Monach 동부 등에 의해 설명된다. 8. </li><li> RA를 유도하기 위해 꼬리에 의해 부드럽게 각 마우스를 올려 t의 일 0에 희석 된 혈청 복강 내 (IP)의 200 μL를 주입그는 실험했다. 주입 후 마우스를 직접 케이지에 넣으십시오. </li><li> 선택적으로, AB 주입 전에 각 발목의 발목 직경을 측정하고 &quot;관절염 점수&quot;( 그림 1A )를 정의하십시오. 기계적 측정 장치 (마이크로 미터)를 사용하여 GPI- 혈청 후 ​​6 일째까지 매일 발목 부종을 측정하십시오. </li><li> RA 생쥐의 꼬리 정맥 에 생체 내 MMP 활성을 측정하기 위해 활성화 가능한 OI 염료 (단계 1.1 - 1.2)를 주사 GPI- 혈청 주사 후 5 일째 및 대조군 마우스의 꼬리 정맥 내로 투여 하였다. 꼬리 정맥 주사 후 24 시간 동안 광학 이미징 실험을 수행하십시오. </li></ol></li><li> 과민 반응에 연락하십시오 : <ol><li> C57BL / 6 생쥐의 sensitization 들어, 아세톤 / 오일의 4 : 1 혼합물에 용해 5 % TNCB 솔루션을 준비합니다. </li><li> 100 % 산소 (1.5 L / 분)로 증발 된 1.5 % 이소 플루 란을 사용하여 C57BL / 6 마우스를 마취시킨다. 마우스가 anesthetized되면, 자기 미친에 넣어<html> e 코 콘 (1.5 vol % 이소 플루 란 관에 연결된 5 ml 폴리에틸렌 주사기를 자르십시오)을 마취 유지하십시오. Anesthetized 동안 마른 동물의 눈 건조를 방지하기 위해 수의사 용 연고를 바르십시오. </li><li> 작은 동물 머리 트리머를 사용하여 배를 조심스럽게 (2 x 2 cm) 면도하십시오. 동물의 비특이적 인 형광 신호를 유발할 수 있고 연구 결과에 영향을 줄 수 있으므로 피부 손상을 피하십시오. </li><li> 동물을 sensitizing 100 μL 피펫을 사용하여 면도 복부 영역에서 천천히 5 % TNCB 솔루션의 80 μL를 적용합니다. 각막 손상을 방지하고 회복기 동안 낮은 체온을 피하기 위해 마우스의 눈이 침구와 닿지 않도록주의하면서 새장에 부드럽게 다시 놓습니다. </li><li> 민감화 6 일 후에 1 % TNCB 용액 (아세톤 / 오일의 9 : 1 혼합물에 용해)을 준비하고 급성 및 만성 CHSR을 유도하기 위해 피펫을 사용하여 오른쪽 귀에 20 μL를 적용합니다.&quot;&gt; 1 <ol><li> 100 μL 피펫을 사용하여 1 % TNCB 솔루션의 20 μL와 오른쪽 귀 양쪽에 1 차 도전 과제로 시작하고 CHR ( 그림 1B )를 이끌어 내기 위해 매 5 일 (감작 후 15 일) . 마이크로 미터 측정 장치를 사용하여 매일 귀 두께를 측정하십시오. </li></ol></li><li> 챌린지 12 시간 후 CHR 마우스의 생체 내 에서 MMP 활성을 측정하기 위해 활성화 가능한 OI 염료 (680 nm에서 여기가있는 상용 프로브)를 주입합니다 (1.1-1.2 단계). 꼬리 정맥 주사 24 시간 후 광학 이미징 실험을 수행하십시오 ( iv ). </li></ol></li></ol> 3. 광학 이미징을위한 동물 준비 <ol><li> 사용 된 OI 요원의 형광 신호와 자동 형광 (약 700 nm)의 간섭을 피하기 위해 낮은 또는 비 형광 chow ( 예 : 망간 무료)에 마우스 chow (적어도 이미징하기 전에 3) 스위치. </li><li> 동물을에 넣으십시오.(1.5 L / 분) (산소는 공기로 대체 될 수 있지만 하나의 실험 내에서 표준화 될 필요가 있음)로 증발 된 1.5 부피 %의 이소 플루 란을 사용하여 마취시킨다. </li><li> 마우스가 눈으로 마취되면, 자기 - 만든 코 콘 (1.5 vol % isoflurane 튜브에 연결된 절단 5 ML 폴리에틸렌 주사기에 의해 빌드)에 배치하고 마취를 유지합니다. </li><li> 작은 동물 머리 트리머를 사용하여 대상 부위 (2 cm x 2 cm)에 동물을 면도하십시오. 동물의 비특이적 인 형광 신호를 유발할 수 있고 연구 결과에 영향을 줄 수 있으므로 피부 손상을 피하십시오. 참고 : Hairs는 관심 부위 (ROI)에 따라 OI (마우스 스트레인에 따라 다르지만 흡수가 많거나 적음) 동안 형광 신호를 흡수 할 수 있습니다. </li><li> iv 주사의 경우, 따뜻한 물에 마우스의 꼬리를 두어 혈관 확장을 유도하고 주사 부위의 피부를 알코올로 부드럽게 씻고 카테터를꼬리의 말초 사이트. (가) 꼬리 정맥에 20 °의 각도에있는 바늘의 끝을 &quot;잘라&quot;주사기를 다시 현탁 카테터의 정확한 배치를 테스트 놓는다. </li><li> 카테터가 올바르게 위치되면, 주사기를 교체하고 OI 프로브 (2 nmol의)을 분사. 주입 후 주사기를 교체하고 0.9 % 생리 식염수 폴리에틸렌 관의 완전히 명확 죽은 볼륨의 25 μL를 주입. 주 : 사용 OI 염료의 조직 반감기 시간 생체 MMP 활성을 측정 (680 nm에서 여기와 상용 프로브)는 72 시간이다. 완전한 통관을 보장하기 위해, 염료의 재 주입은 이전에 주입 한 후 이전 칠일 이상 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 광학 이미징 <ol><li> 시야 (FOV)의 중심에 OI 스캐너의 블랙 박스 검은 플라스틱 또는 종이 시트를 배치했다. </li><li> 측정 프로토콜을 설정하고 적절한 파장을 선택합니다 (여기 : 680 ± 10 nm의 전자임무 : 700 ± 10 nm) 및 영상 매개 변수. 참고 : 일부 OI 시스템에서는 몇 가지 이미징 염료에 대한 설정이 미리 정의되어 있습니다. </li><li> 형광 이미징을위한 올바른 프로토콜을 선택하려면 이미징 소프트웨어 (제조업체가 제공함)를 열고 시스템을 초기화하십시오. 대부분의 CCD 카메라는 작동 온도까지 냉각해야하며 10 분 정도 걸릴 수 있습니다. 안정적인 결과를 얻으려면 시스템이 준비 될 때까지 기다리십시오. </li><li> 생체 내 이미징 시스템 수집 컨트롤 패널 팝업을 관찰하면 선택한 각 필터 쌍이 시퀀스의 한 이미지를 나타냅니다. 이 경우 각각 680 ± 10 nm 및 700 ± 10 nm의 여기 및 방출 파장을 가진 상업용 염료에 대한 필터 쌍으로 하나의 이미지를 수집하고 측정을 시작하십시오 ( &quot;Acquire sequence&quot;). 자세한 내용은 제조업체 설명서를 참조하십시오. </li><li> 이미지에 적절하게 라벨을 지정하고 &quot;이미지 편집&quot;획득 순서 &quot;레이블&quot;는 다음 나타납니다 창 &quot;. </li><li> OI가 염료를 주입하기 전에, 각 동물의 기준 검사를 취하거나, 배경 신호를 구별하기 나이브 대조군을 사용한다. </li><li> OI가 염료의 꼬리 정맥 주사 후 시간은 OI 시스템에서 가장 높은 신호를 측정 할 수있는 위치에서, FOV의 중심에 동물을 배치하고, 측정을 시작한다. 참고 : 중요 : 저체온증 크게 이미징 에이전트의 분포에 영향을 미칠 수있다. 무대는 동물의 저체온증을 방지하기 위해 37 ° C까지 가열되어 있는지 확인합니다. 영상은 1 내지 5 개의 마우스의 동물 군에서 동시에 수행 될 수있다. 동시에 측정하는 동물의 수에 따라 FOV의 크기를 선택합니다. 각 마우스의 표시 여부를 확인하기 위해 밝은 필드 이미지를 취할 수 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 참고 : 다음 이미지 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행제조업체의 프로토콜. <ol><li> RA의 측정을 위해서는 그림 2 와 같이 보정 된 광자 방출 단위를 사용하는 반면, 만성 CHSR은 신호 세기 (%)로 묘사됩니다. </li><li> ROI를 수동으로 그리려면 툴 플레이트를 사용하십시오. RA 이미지의 분석을 위해 각 동물의 모든 발목과 발에서 가장 높은 신호 주위에 배치 된 표준화 된 원을 사용하십시오. CHSR을 분석하려면 밝은 영역 이미지에 따라 ROI를 전체 오른쪽 귀와 왼쪽 귀 주위에 배치하십시오. </li><li> 특정 그린 ROI에서 광자 방출 또는 신호 강도 값을 측정하려면 &quot;측정&quot;을 누릅니다. 이 시스템은 설명적인 통계 분석을 위해 그려진 ROI에 값을 제공합니다. </li></ol>

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OI는 전임상 연구 에서 비 침습적 생체 내 분자 이미징을위한 매우 유용하고 빠르며 저렴한 도구입니다. OI의 특별한 강점은 염증 반응과 같은 매우 역동적 인 과정을 모니터하는 능력입니다. 또한 OI는 수 일에서 수주에 이르는 장기간의 질병 경과를 추적 할 수있게 해줍니다. OI는 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 또는 자기 공명 영상 (MRI)과 같은 다른 생체 내 이미징 방식보다 몇 가지 장점이 있습니다. 이는 시간과 비용이 매우 효율적이기 때문입니다. 획득 당 최대 5 마리의 동물을 이용한 높은 처리량 분석이 가능합니다. 또한, 많은 다른 생물학적 과정을 목표로하는 많은 수의 프로브가 이용 가능하다. 추가 해부학 정보를 제공하기 위해 OI는 MRI 또는 ​​X 선과 같은 다른 이미징 기술과 결합 될 수 있습니다. 또 다른 한계는 낮은 조직 침투 깊이가 예 를 들어 functional PET ...

류마티스 성 관절염 (RA)이나 건선의 건선과 같은자가 면역 질환은 지연 형 과민 반응 (DTHR)으로 분류됩니다. 1 RA는 부식성 윤 활막염과 관절 파괴를 특징으로하는 일반적인자가 면역 질환입니다. 염증 세포의 침투와 증식, 염증 세포의 발현 증가로 판 누스 형성, 연골 및 뼈 파괴를 일으키는 염증 관절염 관절. matrix metalloproteinases (MMPs)에 의한 콜라겐과 같은 세포 외 기질 분자의 절단은 조직 전환과 혈관 신생에 필수적이며 조직 파괴를 유발합니다. 5 , 6 접촉 과민 반응 (CHR)은 호중구가 응집되어 산화가 일어난다는 특징이 있습니다. RA와 유사하게 CHR의 MMP는 변이 형이다만성 염증을 설정하기 위해 조직 변환, 세포의 이동과 혈관 신생에 VED. RA를 조사하기 위해, 글루코스 -6- 포스페이트 이소 머라 제 (GPI) -serum 주입 마우스 모델을 사용 하였다. GPI에 대한 항체를 포함하는 트랜스 제닉 K / BxN 마우스 8 혈청 류마티스 염증 GPI 혈청 주입 후 6 일째에 부은 발목 최대 24 시간 (1.1 참조)에서 개발하기 시작 후 나이브 BALB / c 마우스에 주입 하였다. 만성 CHR을 분석하기 위해, C57BL / 6 마우스는 복부에 trinitrochlorobenzene (TNCB)에 민감했다. 오른쪽 귀는 감작 후 일주를 시작하기 5 회까지 도전되었다 (도 1.1 및 1.2 참조). 비침 작은 동물 OI 주로 임상 연구에서 사용되어, 직관 형 형광등 chemiluminescent- 및 생물 발광-신호의 생체 내 연구에 기초한 기술이다. 취득한 반 정량적 데이터는 molec에 대한 통찰력을 제공합니다울라 기관의 메커니즘과 건강의 조직뿐만 아니라 병에 걸린 실험 동물 모델 및 측정을 따라 길이 방향의 수 (예를 들어 생체 내에서 치료 반응 프로파일을 평가하기 위해). 같은 동물이 아닌 시점에 따라 다른 마우스를 사용하는 여러 시점에서 후속 연구에서 측정 할 수있는 종 연구의 큰 장점은 동물 수의 감소이다. OI의 해상도는 기관의 상세한 기능 이미징 및 실험 동물에서 더 작은 조직 구조를 할 수 있습니다. -70 ° C까지 많은 장치에서 냉각되어 좁은 투과 스펙트럼, A A 차광판에 의해 산란 빛으로부터 보호 &quot;어두운 박스&quot;및 대전 성 결합 소자 (CCD) 카메라와 특정한 여기 및 방사 필터를 사용 매우 특정한 수 있고 형광 신호 민감한 측정. excitation-과 함께 형광 제를 사용하여근적외선 형광 창 (650 - 950 nm)의 방출 스펙트럼에서 신호 대 잡음비가 크게 향상 될 수 있습니다. 근적외선 형광 창은 헤모글로빈과 물에 의한 신호 흡수가 상대적으로 낮을뿐만 아니라 배경 자동 자기장이 낮다는 특징이 있습니다. 9 이것은 작은 동물의 조직에서 2cm까지 침투 깊이를 허용합니다. OI- 프로브는 표적 조직을 직접 ( 예 : 형광 표지 된 항체에 의해) 처리하거나 표적 조직에서 활성화시킬 수 있습니다 ( 예 : 프로테아제). 활성화 가능한 OI 프로브는 Förster 공명 에너지 전달 (FRET)으로 인해 비활성화 된 형태로 광학적으로 침묵하며, 이는 분자 내의 여기 에너지를 다른 영역으로 이동시키는 퀀칭 부분 (quenching moiety)으로 향하게됩니다. 염료가 (예를 들어 프로테아제에 의해) 절단되면, 에너지는 더 이상 분자 내에서 전달되지 않으며, 형광 신호는 OI에 의해 검출 될 수있다. 이것은 높은 특이성을 갖는 OI 프로브의 설계를 허용합니다뚜렷한 생물학적 과정과 탁월한 신호 대 잡음비. 다음 프로토콜은 동물의 준비, 생체 내에서 MMP-2, -3, -9 및 -13 활성 및 염증의 두 실험 모델 (RA, CHR)을 이미지화하기 위해 Activatable OI 프로브를 사용하여 OI 측정을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Cornergel</td><td>Gerhard Mann GmbH</td><td>1224635</td><td>안과 연고&nbsp;</td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott GmbH</td><td>4831850</td><td>isoflurane</td></tr><tr><td>U40 인슐린 주사기</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>324876</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sintetica</td><td>6093089</td><td></td></tr><tr><td>High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm</td><td>Reichelt Chemietechnik GmbH+Co</td><td>28460</td><td>폴리에틸렌 튜빙, 내경 0.28 mm, 외경 0.61&nbsp; mm&nbsp;</td></tr><tr><td>BD 레귤러 베벨 바늘, 30G</td><td>Becton Dickinson & Co. Ltd.</td><td>305106</td><td>30G 주입 캐뉼라</td></tr><tr><td>RTA-0011 이소 플루란 기화기</td><td></td> <td>Vetland Medical Sales and Services LLC-Artagain</td><td></td></tr> <tr><td>드로잉 페이</td>퍼 <td>Strathmore 아티스트 페이퍼</td><td>446-8</td><td>석탄 블랙</td></tr><tr><td>IVIS 스펙트럼</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>광학 이미징 시스템</td></tr><tr><td>BD 일반 베벨 바늘, 25G</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-클로로-1,3,5-트리니트로벤젠</td><td>시그마 알드리치 GmbH</td><td>7987456F</td><td>TNCB</td></tr><tr><td>MMPSense 680</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>NEV10126</td><td>형광 이미징 염료</td></tr><tr><td>Oditest&nbsp;</td><td>Koreplin GmbH</td><td>C1X018</td><td>기계적 측정</td></tr><tr><td>Miglyol 812</td><td>SASOL-Oil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; BALB/C, C57BL/6</td><td>찰스 리버 연구소&nbsp;</td><td>-</td><td>실험에 사용되는 마우스</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td></td><td>RA 혈청 희석용&nbsp;</td></tr><tr><td>피펫(100 &마이크로; L)</td><td>에펜도르프&nbsp;</td><td></td><td>TNCB 응용 프로그램에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>면도기&nbsp;</td><td>월&nbsp;</td><td>9962</td><td>애니멀 헤어 트리머</td></tr><tr><td>리빙 이미지&nbsp;</td><td>퍼킨 엘머&nbsp;</td><td></td><td>OI를 측정하기 위한 이미징 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

비 침습적<em&gt; in vivo</em&gt; 활성화 가능한 형광 이미징 에이전트를 사용한 염증성 mmp 활성의 형광 광학 이미징

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

이 논문은 서로 다른 2 가지 마우스 염증 모델 인 류마티스 관절염 (RA)과 접촉 한 생체 내 형광 광학 이미징 (OI) 을 통해 활성화 가능한 형광 프로브에 의한 매트릭스 금속 단백질 분해 효소 (MMP) - 활성을 영상화하는 비 침습적 인 방법을 설명합니다 과민 반응 (CHR) 모델. 근적외선 (NIR) 창 (650 - 950 nm)의 파장을 갖는 빛은 650 nm 이하의 파장에 비해 깊은 조직 침투와 최소한의 신호 흡수를 허용합니다. 형광 OI를 사용하는 주요 이점은 다른 동물 모델에서 저렴하고 빠르고 쉽게 구현할 수 있다는 것입니다. 활성화 가능한 형광성 프로브는 비활성 상태에서는 광학적으로 침묵하지만 프로테아제에 의해 활성화되면 높은 형광성을 갖습니다. 활성화 된 MMP는 조직 파괴를 일으키고 RA 및 CHR과 같은 지연 형 과민 반응 (DTHR)에서 질병 진행에 중요한 역할을합니다. 또한 MMP는연골 및 뼈의 파괴와의 키 프로테아제 - 염증성 사이토 카인에 반응 대 식세포, 섬유 아세포 및 연골 세포에 의해 유발된다. 여기뿐만 아니라 질병의 유도 후 6 일 MMP-2, -3 같은 키 MMP의 활성화되어 프로브, -13 및 -13를 사용하여 근처 RA에서 MMP 활성의 적외선 형광 OI 및 대조군 마우스에 대한 촬상 프로토콜을 기술 급성 (1 배 도전)과 만성 건강한 귀에 비해 오른쪽 손잡이 (5 배 도전) CHR와 마우스에있다.

경구 용 BALB / c 마우스에서 류마티스 성 관절염 (RA)을 유도하기 위해, 동물에게 0 일째에 GPI에 대한자가 항체 (1x PBS로 1 : 1로 희석)를 주사 하였다.이 GPI- 혈청에서 최대 염증 (발목 부종) RA 모델은 주사 후 6 일째 날 11에 있다. 따라서, 2 nmol의 활성화 가능한 OI 염료가 준비되었고 5 일째에 관절염 마우스 및 건강한 대조 동물의 꼬리 정맥에 주사되었다. 주사 후 24 시간 (6 일), 마우스를 마취시키고 섹션 3 도 1a ). CHR을 유도하기 위해, C57BL / 6 마우스를 면도 한 복부에서 0 일째에 5 % TNCB로 감작시켰다. 감작 7 일째에 1 % TNCB를 사용하여 오른쪽 귀에 1 차 시험을 시작했습니다. 만...

이 논문은 염증의 두 가지 실험 모델에서 키 매트릭스 메탈의 생체 내 활성을 시각화 기동 광학 이미징 프로브를 사용하여 형광 이미지의 적용을 설명한다.

비 침습적<em&gt; In Vivo</em&gt; 활성화 가능한 형광 이미징 에이전트를 사용한 염증성 MMP 활성의 형광 광학 이미징

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 광학 이미징을 사용하여 활성 가능 프로브를 시각화함으로써 염증 실험 모델 내 주요 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteases, MMPs)의 생체 내(in vivo) 활성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 염증성 질환의 기저 생물학적 기전에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석 속도가 빠르고 비용이 저렴하며 습득하기 쉽다는 점입니다.또한, 다양한 생물학적 과정을 표적으로 하는 매우 다양한 프로브를 사용할 수 있습니다. 류마티스 관절염 유도를 위해, 먼저 마이크로미터를 사용하여 각 동물의 모든 발목 직경을 측정하십시오. 그런 다음, 첫 번째 마우스의 꼬리를 살짝 들어 올려 glucose six phosphate isomerase 또는 GPI에 대한 항체가 포함된 희석된 KBN 마우스 혈청 200 µL를 복강 내로 주입하십시오.그 후 동물을 케이지에 다시 넣고 6일까지 매일 발목 부종을 측정합니다. 접촉 과민성 감작의 경우, 마취된 마우스의 복부에서 2x2 cm 영역을 소형 동물용 바리캉으로 조심스럽게 삭모하고, 100 µL 피펫을 사용하여 갓 제조한 5% TNCB 용액 80 µL를 노출된 피부에 도포합니다. 시술 과정 중 어느 단계에서도 피부에 상처를 입히지 않는 것이 매우 중요한데, 이는 동물 내에서 비특이적인 형광 신호를 유발하여 연구 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.회복 단계 동안 체온이 낮아지지 않도록 주의하며 동물을 조심스럽게 케이지에 다시 넣습니다. 6일 후, 피펫을 사용하여 오른쪽 귀의 양면에 1% TNCB 용액 20 µL를 도포하고, 이후 최대 10일 동안 이틀마다 1% TNCB 100 µL를 도포하며 매일 귀 두께를 측정합니다. in vivo MMP 활성을 측정하려면, 먼저 활성화 가능 광학 이미징 염료를 가볍게 볼텍싱한 후, 마우스 한 마리당 2 nM의 염료가 포함된 0.5 mL 인슐린 주사기를 준비합니다.그다음 폴리에틸렌 카테터가 부착된 30 gauge 바늘을 장착한 다른 주사기를 준비하고, 첫 번째 마우스의 꼬리를 따뜻한 물에 담급니다. 혈관이 확장되면, 바늘의 절단된 끝부분이 20도 각도가 되도록 꼬리 말단 부위의 확장된 꼬리 정맥에 카테터를 삽입하고, 주사기를 다시 연결하여 카테터가 정확하게 배치되었는지 확인합니다. 카테터가 적절하게 위치했다면, 주사기를 교체하여 2 nanomolar의 프로브를 주입합니다.그 후 광학 이미징 프로브 주사기를 0.9% saline solution이 담긴 주사기로 교체하고, 폴리에틸렌 튜브의 데드 볼륨을 완전히 제거하기 위해 tail vein에 saline 25 microliters를 주입합니다. 다음으로, 광학 이미징 스캐너의 이미징 스캐너 박스를 37 degrees celsius로 설정하고, 최대 5마리의 마우스를 시야 중심의 스캐너 박스 안에 배치합니다. 주입 24시간 후에 이미징 소프트웨어를 실행하고 시스템을 초기화하여 CCD 카메라가 작동 온도까지 냉각되도록 합니다.시스템이 준비되면, 이미징 프로브의 형광 특성에 맞춰 적절한 파장과 이미징 파라미터를 설정하십시오. in vivo 이미징 시스템의 획득 제어 패널이 나타납니다. 그런 다음, 측정(acquire sequence)을 클릭하여 측정을 시작하십시오.획득한 이미지를 저장하려면 원하는 저장 위치를 선택하십시오. 또한, 이미지 라벨 편집 창에서 더 많은 정보를 추가할 수 있습니다. 여기서는 대조군 동물에서 관찰된 최소한의 신호와 비교하여, 질환 유도 6일 차 류마티스 관절염 마우스의 앞발과 발목에서 확연히 강화된 형광 신호를 관찰할 수 있습니다.실험군 및 대조군 동물의 장기 내 MMP 활성에 대한 생체 내 분포 분석 결과, 류마티스 관절염 마우스의 관절, 특히 발목과 앞발에서만 신호가 강력하게 증가한 것이 확인되었습니다. 흥미롭게도 류마티스 관절염 마우스의 양측 신장에서도 MMP 신호의 증가가 관찰된 반면, 간과 장에서는 류마티스 관절염 발생 여부와 관계없이 강력한 MMP 신호가 나타났습니다. 오른쪽 귀에 TNCB를 5회 처리하여 유도한 만성 접촉 과민 반응 동안, 오른쪽 염증성 귀는 왼쪽의 건강한 대조군 귀에 비해 MMP 활성이 매우 높게 나타났습니다.관절염이 있는 발목 또는 발과 건강한 발목 또는 발의 신호 강도를 반정량적으로 분석한 결과, 관절염이 있는 발목에서는 MMP 신호 강도가 7배 증가하였으며, 앞발에서는 건강한 동물에 비해 3배 더 높은 MMP 신호 강도가 검출되었습니다. 급성 및 만성 접촉성 과민 반응이 일어난 귀에서도 단 한 번의 유발 시험 후 MMP 신호가 유의미하게 증가하였으며, 이러한 증가 상태는 다섯 번째 유발 시험까지 지속되었습니다. 이 방법은 다양한 실험 동물 모델에 쉽게 적용할 수 있으며, 생체 내(in vivo)에서 기저 생물학적 과정 및 치료법에 대한 장기적인 추적 관찰을 가능하게 합니다.이 절차를 수행할 때, 각 광학 이미징 프로브마다 주입 절차와 흡수 시간이 다르다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 새로운 형광 염료 및 광학 이미징 프로브를 사용할 때마다 종단적 연구를 수행해야 합니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면, 10분 이내에 최대 5마리의 동물까지 처리를 완료할 수 있습니다.이 방법은 염증의 인 비보(in vivo) 메커니즘에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 암이나 신경퇴행성 질환과 같은 다른 질병을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 염증성 질환 모델에서 활성화 가능한 이미징 프로브를 이용한 인 비보 광학 이미징 사용법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

non-invasive-vivo-fluorescence-optical-imaging-inflammatory-mmp

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 형광 매개 단층촬영(FMT)을 사용하여 쥐 대장염 모델에서 장 대식세포 침투를 평가하는 기술을 보여줍니다. 덱스트란 황산나트륨(DSS)을 통해 마우스에 대장염을 유발하면 대장에 침투한 대식세포의 F4/80 당단백질 마커를 인식하는 항체를 동물에게 주입합니다. 그런 다음 FMT 장치에서 마우스를 이미지화하여 형광 및 반사 신호를 3차원 이미지로 재구성하여 형광의 공간 분포와 강도를 결정합니다.

쥐 장 염증을 평가하기 위한 형광 매개 단층 촬영(Fluorescence-Mediated Tomography) 사용

우리는 염증 단계를 구별하기위한 비 침습 이미징 방법을 설명합니다. 루미놀의 전신 배달 호중구의 MPO 활동에 의존 급성 염증의 영역을 보여준다. 대조적으로, lucigenin의 주입은 대 식세포에서 Phox 활동에 의존 만성 염증으로 시각화 할 수 있습니다.

생체 내 이미징 방법에 급성 및 만성 염증을 구별하는

우리는 멀티 앵글 회전 광학 영상 사포 신의 C (SAPC) dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles에 의해 전달 형광 마커의 생체 정량 (MAROI) 시스템을 설명합니다. 암 및 관절염 마우스 모델을 이용한 제외한 MAROI 신호 곡선 분석은 정확한 매핑 및 질병 프로세스의 생물학적 특성 규명을 위해 사용될 수 있는지 보여준다.

형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

생체 내 이미징을 위한 형광단의 사용은 옵소니화, 빠른 제거, 낮은 검출 감도 및 숙주에 대한 세포 독성 효과로 인해 크게 제한될 수 있습니다. 필름 수화 및 압출에 의한 리포솜 내 형광단의 캡슐화는 형광 소멸 및 보호로 이어져 높은 검출 감도로 in vivo 이미징을 가능하게 합니다.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질 생체 광학 이미징

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

우리는 생체 살아있는 생물 발광 및 근적외선 SJL / J 마우스에서 다발성 경화증에 대한 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 시신경염과 뇌염의 이미징 기술을 보여준다.

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

형태학적 변화는 활성화 다음 면역 반응 섬유 아세포 세포에서 발생하고 세포 모집에 변경을 촉진. 유전자 조작섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP1)-cre와 함께 2광자 이미징을 활용; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) 마우스 라인과 녹색 형광 태그 lipopolysaccharide-FITC, 우리는 진피 섬유아세포와 생체 내 형태학적 변화에 있는 lipopolysaccharide의 고도로 특정 한 섭취를 설명할 수 있습니다.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

배우세요 비침습적 형광 광학 이미징을 사용하여 염증성 질환에서 MMP 활성을 실시간으로 시각화하는 방법을. 활성화 가능한 형광 프로브를 이용한 이 기술은 빠르고 경제적이며 다양한 생물학적 과정 연구에 활용됩니다.

비 침습적

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