Name: 액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 액정 나노입자를 활용한 소수성 화물의 세포막 표적 전달 방법. 포유류 세포에서 세포독성을 최소화하며 효율적인 약물 전달을 구현하는 기술을 확인하세요.

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이 작품은 NRL 자료 기금 프로그램 (작업 단위 MA041-06-41-4943)에 의해 지원되었다. ON은 국가 연구위원회 박사후 연구 Associateship에 의해 지원됩니다.

DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을 1. 준비 <ol><li> 액정 성 디 아크릴 레이트 가교제 (DACTP11 45 mg)을 용해시키고, 3,3&#39;- dioctadecyloxacarbocyanine 퍼클로레이트 (DIO, 2 mg)을 클로로포름 2ml의 중합을위한 자유 라디칼 개시제 (아조 비스 이소 부티로 니트릴, 1 ㎎)을 얻었다. 아크릴 레이트 작용 계면 활성제의 수용액 (AC10COONa, 7 용액에 13 mg)을이를 추가합니다. </li><li> 물에 중합 성 계면 활성제에 의해 둘러싸 이는 유기 재료의 작은 방울로 구성된 미니 에멀젼을 제조하기 위해 5 분 동안 80 % 진폭에서 1 시간 동안 초음파 처리하고, 혼합물을 교반한다. </li><li> 오일 욕에서 64 ℃까지 혼합물을 가열 클로로포름 서서히 계면 활성제에 의해 안정화 된 DIO 함유 NP 현탁액을두고 증발 가교제 및 계면 활성제 양쪽의 중합을 개시한다. </li><li> 전혀 응집을 제거하기 위해 0.2 ㎛의 주사기 필터를 통해 NP 서스펜션 (3 회) 필터. 스토추가 사용까지 4 ° C에서 필터링 된 NP 솔루션 다시. </li><li> EDC의 결합을 통해 DIO-LCNP에 PEG-Chol을의 활용. <ol><li> Chol을-PEG-NH 2를 용해 · 25 mM의 HEPES 완충액 (pH 7.0)에 염산 (PEG-Chol을, 0.9 mm)이다. </li><li> N - 히드 록시 sulfosuccinimide 나트륨 염 (NHSS 40 mM)을 농축 모액으로부터 HEPES 완충액에 1- 에틸 -3- (3- (디메틸 아미노) 프로필) 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC, 400 mm)를 함유하는 작업 용액을 제조 하였다. </li><li> 즉시 HEPES 완충액 DIO-LCNP 1.0 ml의 NHSS / EDC의 새로 제조 된 작업 용액 20 μL를 추가로 5 분 동안 교반한다. </li><li> 이 혼합물에 Chol을-PEG-NH 2 · 염산의 원액 20 μl를 추가하고 2 시간 동안 교반한다. </li><li> 간단히 테이블 탑 미니 원심 분리기를 사용하여 평형화 PD-10 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼 (13)를 통해 뜨는을 전달하는 30 초 동안 최대 속도 (~ 2000 XG)에서 반응 혼합물을 원심 분리둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS, 0.1X). </li></ol></li></ol> DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을 2. 특성 <ol><li> 겔 전기 영동에 의해 DIO-LCNP 표면에 PEG-Chol을 성공적으로 공유 결합을 확인합니다. <ol><li> (89 mM 트리스 (산도 7.6), 89 mM의 붕산, 2 mM의 EDTA TBE) 버퍼 (50) 트리스 - 붕산 전기의 ㎖ (1 배)에서 아가로 오스 0.5 g을 녹여. 아가로 오스를 분해하는 전자 레인지의 용액을 가열한다. 이 솔루션은 약간 냉각 및 전기 상자에 젤 판에 내용을 부어 할 수 있습니다. 샘플 우물을 만들 겔 빗를 삽입합니다. </li><li> 겔이 고체화되면, 버퍼 챔버의 실행 TBE (챔버 내의 겔 잠길 정도로) 요구량을 추가한다. </li><li> DIO-LCNP 시료 35 μL를 추가 겔의 웰에 110 V.의 전압으로 20 분 동안 실행 (5 %가 V / V, 글리세롤 개정) </li><li> 이미지 겔 촬상 시스템 (WI)를 사용하여 젤일 여기 및 방출 필터는 각각 488 nm의 500-550 nm의,에. </li></ol></li><li> PBS에서 DIO-LCNP 용액 (~ 200 배 희석) (PH ~ 8 0.1X)을 희석하고, DLS 장비 (14) 상에 측정하여 동적 광산란 (DLS)에 의해 입도 분포를 평가한다. 적절한 제타 전위 측정 장치를 이용하여 DIO-LCNPs의 제타 전위를 측정한다. </li></ol> 배달 실험 및 이미징을위한 세포 배양 접시 3. 준비 주 : DIO-LCNP 라벨링 나란히 네 바와 같이 배양 된 HEK 293T (통로 5 ~ 15) / (17), 인간 배아 신장 세포에서 수행된다. 전달 실험과 후술하는 바와 같이 후속 세포 이미징을 수행한다. <ol><li> 20 μg의 농도로 ~ 소 피브로넥틴 (로 코팅하여 100 μl를 (14mm 1 위의 coverglass 삽입 장착) 35mm 직경의 조직 문화 요리를 준비37 ° C에서 2 시간 동안의 DPBS / ㎖). </li><li> 배양 접시에서 피브로넥틴 코팅 용액을 제거한다. 수확 HEK 먼저 세정하여 T-25 플라스크에서 293 T1 / 7 세포 DPBS 3 ㎖로 한 후 트립신 EDTA (0.5 % 트립신, 0.25 % EDTA) 2 ㎖를 첨가하여 세포 단층. </li><li> ~ 3 분 동안 37 ° C에서 플라스크를 품어. 트립신 - EDTA를 제거하고 인큐베이터에 플라스크를 반환합니다. 세포를 플라스크에서 분리되면, 완전 배지 4㎖를 첨가함으로써 트립신을 중성화 플라스크에 (; DMEM 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 소 태아 혈청, 5 % 소듐 피루 베이트, 5 % 항생제 / 항진균제를 포함하도록 수정) . 셀 카운터들을 계산하여 상기 현탁액의 세포 농도를 결정한다. </li><li> 성장 배지 ~ 8 × 104 세포 / ml의 세포 농도를 조정한다. 하룻밤 인큐베이터에있는 접시와 문화에 세포 현탁액 3 ML을 추가 다음 날, 세포 ~ 70 % 포화 상태에 있어야하고 사용할 준비해야한다. 알맞은세포 밀도는 세포의 높은 비율의 강력하고 효과적인 라벨 중요하다. </li></ol> 4. 휴대 DIO 및 DIO-LCNPs 납품 및 고정 세포의 이미징 <ol><li> 전달 매체에 DIO, DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을 1 ml의 솔루션을 준비합니다 (HEPES-DMEM, DMEM 25 mM의 HEPES를 포함) DIO 무료 DIO-LCNPs의 원액을 희석하여; 세포 배양에 적합한 DIO 농도는 (DIO DIO-LCNP의 형태로 무료 또는 DIO의 농도 중 하나로 표시) ~ 1-10 μM 될 것입니다. </li><li> 혈청 학적 피펫을 사용하여 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 세포 단층을 세척 HEPES-DMEM (2 ㎖ 각각 세척)로 2 회 (단계 3). 부드럽게 추가하고 요리의 가장자리로 / 피펫을 사용하여 HEPES-DMEM를 제거하여 세척을 수행합니다. </li><li> 배양 접시의 중심에 준비된 DIO 무료 또는 DIO-LCNP 전달 솔루션의 0.2 ML을 추가하고 난에 요리를 반환ncubator 적절한 기간 (실험의 필요에 따라 일반적으로 15 ~ 30 분)합니다. 긴 배양 시간이 아닌 멤브레인 영역의 더 특이 세포 라벨 (예를 들어, 세포질)에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 잠복기 후, 혈청 학적 피펫을 사용하여 전송 솔루션을 제거합니다. DPBS (2 씩으로 세척)과 세포 단층을 두 번 씻으십시오. 부드럽게 접시의 가장자리로부터 /로 DPBS를 추가하고 제거하여 세척을 수행한다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 (DPBS 제조) 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 세포 단층을 고정한다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 가연성, 호흡기 자극 및 발암 물질로 의심. </li><li> 피펫을 사용하여 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 부드럽게 추가하고 요리의 가장자리로 / 피펫을 사용하여 DPBS를 제거하여 세포를 DPBS 1 시간 (2 ml)에 씻는다. </li><li> 고정 세포를 공 초점 레이저 주사를 사용하여 멤브레인 형광 신호의 존재 여부, 촬영 준비현미경 (CLSM). 즉시 이미징을 수행하거나, 또는 NaN이 3 0.05 %를 포함 DPBS와 매체를 교체하고 4 ℃에서 요리를 저장합니다. 주의 : NaN의 3 독성; NaN의 3 사용할 때 극도의주의를 기울여야. 참고 :이 방식으로 저장 수정 된 샘플은 최적의 결과를 위해 48 시간 내에 몇 군데해야합니다. </li></ol> 라이브 세포 DIO 및 DIO-LCNPs과 FRET 이미징 5. 세포 배달 참고 :이 방법에서는, 세포를 6 μM (DIO는 FRET 기증자입니다) 각 DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 1,1&#39;- 디 옥타 데실 3,3,3- &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine 과염소산 염 (DII와 colabeled된다 무료 DII)는 FRET 수용체이다. 세포막에 DIO-LCNP-PEG-Chol을 그 법인에서 DIO의 자료는 DII 수용체에 DIO 기증자에서 에너지 전달에서 관찰 된 증가에 의해 확인된다. <ol><li> DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 DII FRE 순차적 라벨 세포E 단계 4에 기재된 방법을 사용. </li><li> 염색 후, 세포를 DPBS 1 시간 (2 ㎖) 혈청 학적 피펫을 사용하여 세척 및 생균 촬상 용액 2 ㎖ (LCIS)로 세척 버퍼를 교체한다. </li><li> 가열 배양 챔버, 화상 전체 방출 488 nm에서 흥미로운 DIO 공여체에 의해 4 시간 동안 30 분 간격으로 FRET 이미징 구성의 공 초점 레이저 주사 현미경 (60X 대물 렌즈)를 사용하여 수집 생균 샘플 장착 된 현미경 스테이지 Remote 페이지 공여체 및 32 채널 스펙트럼 검출기 490-700 나노 미터에서 DII 수용체 모두 스펙트럼. </li><li> 참고 : FRET 영상에 대한 자세한 내용은 15를 참조 참조하시기 바랍니다. </li><li> DIO 기증자 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 DII으로 염색 된 세포에서 DII 수용체 모두의 시간 해결 발광 강도를 결정합니다. 시간 해결 수용체 / 기증자가 꾸준히 증가 비율 이미지 (DII EMI / DIO EMI), 결국 판을 FRET 계산AU 막에 분배 DIO 공여체의 양 일단 최대 16 도달했다. </li></ol> 6. DIO의 세포 독성 분석 및 DIO-LCNPs HEK 293T / 17 셀에 주 : DIO-LCNP 물질의 세포 독성은 테트라 졸륨 염료 계 증식 분석 17 사용하여 평가된다. 세포 전달 / 라벨링을 에뮬레이트 조건 하에서 물질의 다양한 농도의 존재 하에서 멀티 웰 플레이트에서 배양 하였다. 세포는 증식을 허용하도록 72 시간 동안 배양한다. 염료 (MTS는, (3- (4,5- 디메틸이 -2- 일) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4- 술포 페닐) -2H- 테트라 졸륨)을 웰에 첨가하고, 대사 적으로 활성되고 세포 청색 포르 마잔 생성물로 전환 염료. 색 형성 량은 생세포 수에 정비례한다. <ol><li> 수확 HEK 단계 3.2.Seed에 설명 된 절차를 수행하여 T-25 플라스크에서 293 T1 / 7 세포24 시간 동안 96 웰 조직 문화 처리 플레이트와 문화의 우물에 HEK 293T / 17 세포 (/ 100 μL / 잘 5,000 세포). </li><li> 완전 무료 DIO를 포함하는 HEPES-DMEM 50 μl를 마이크로 피펫을 사용하여 우물에서 배양 배지를 제거하고 추가, 우물을 복제하기 위해 농도를 증가에서 DIO-LCNPs, 또는 DIO-LCNP-PEG-Chol을. 30 분 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 참고 : 일반적으로, 세중 또는 4 번씩 수행 복제합니다 통계적으로 신뢰할 수있는 데이터를 산출하기에 충분하다. <ol><li> 배양 후, 마이크로 피펫을 사용하여 물질을 함유하는 공급 배지를 제거하고 배양 배지 100 ㎕로 교체. 문화 72 시간 동안 세포. </li></ol></li><li> 물론 각각에 테트라 졸륨 기판의 20 μl를 추가 인큐베이터에 접시를 반환하고 색상 형성이 4 시간 동안 37 ° C에서 진행 할 수 있습니다. 570 nm의 (이 스투에 사용되는 DIO-LCNPs에 대한 흡수 극소의 포르 마잔 제품의 흡광도 (ABS)를 읽고DY) 및 비특이적 백그라운드 흡광도 650 nm의 감산 () 미세 적정 플레이트 판독기를 사용. </li><li> 차동 흡광도 값 (ABS 570 - ABS 650) 플롯 물질 농도 대를 제어 세포 증식 (세포 배양 배지에서만 세포의 증식 정도)의 비율로 결과를보고한다. </li></ol> 7. 데이터 분석 <ol><li> 통계적 분산의 변량 분석 (ANOVA)를 사용하여 데이터를 분석한다. 다중 비교를 들어, 페로 니의 사후 테스트를 적용합니다. 평균의 ± 표준 오차 달리 언급하지 않는 한 (SEM) 모든 평균 값을 제공합니다. 참고 : 중요성에 대한 허용 확률은 P &lt;0.05이었다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

NMDD의 지속적인 목표는 동시 개선 된 약효와 결합 된 제어 및 표적 세포 및 조직에 약물 전달 제제이다. 이 중요한 문제를 제기했다있는 약물 분자의 하나의 특정 클래스는 수성 매질에 더 용해도에 드물게이 소수성 약물 / 이미징 에이전트입니다. 이 문제는 임상에 체외 세포 배양 시스템에서 강력한 약물의 전환을 괴롭혀하고 &quot;보류&quot;되는 유망한 약물 분자의 수 결과 또는 포기하고 임상 환경에서 더 추구하지 않았습니다. 워트 마닌 (Wtmn)는, 예를 들면, 포스파티딜 -3 &#39;키나제 및 포스파티딜 -3&#39;키나제 - 관련 키나제의 강력한 억제제이며, 항암제로서 큰 잠재력을 가지고 있지만, 수용성이 부족은 임상 시험의 진행을 방해하고있다. 최근 Karve 등. 보여 주었다 개선 물 졸Wtmn의 ubility 때 지질 중합체 NP 조립체 (19)로서 제형. 크게 NP...

살아있는 세포를 (적어도 하나의 차원에서 재료 ≤100 ㎚) 나노 인터페이싱의 출현 이후 지속적인 목표는 다양한 애플리케이션을위한 나노 입자 NPS ()의 고유 사이즈 - 의존 특성을 활용할 수있다. 이러한 응용 프로그램은 세포와 조직 라벨 / 영상 (생체 외 및 생체 내에서 모두), 실시간 감지, 약물 및 기타화물 1의 제어 전달을 포함한다. 이러한 관련 NP 속성의 예는 반도체 나노 결정의 크기에 의존 방출 (양자점, 양자점)를 포함; 금 나노 입자의 광열 특성; 리포좀의 수성 코어의 큰 적재량; 이러한 단층 카본 나노 튜브와 그래 핀 등의 탄소 동소체의 전도도 및 탄도. 최근에 상당한 관심 콘트라스트 / 영상 A와 약물 및 다른화물의 제어 NP에 대한 변조의 사용이 생겨났다남자용 화장실. 여기서의 이론적 근거는 크게 / 강화에서 NP 제형으로 제공함으로써 약물화물의 전체 용해도 전달 용량 순환 시간 및 최종 허가를 최적화하는 것이다. 이 NP-매개 약물 전달 (NMDD)로 알려지게하고 있으며, 다양한 암 임상 시험의 다양한 단계에서 더 많은 수백을 치료하는 병원에서 사용하기위한 일곱 FDA 승인 NP 약물 제형은 현재이 있습니다. &quot;적은 비용으로 더 많은 달성;&quot;본질적으로, 목표는 것입니다 즉, 넓은 표면적을 이용하여 적은 투여 투여보다 약을 전달하기위한 골격으로 NP를 사용하려면 부피 (예를 들어, 이러한 양자점 및 금속 산화물 등의 경질 입자) NP에 또는 로딩 그들의 큰 내부 체적 대형화물 페이로드 (예를 들어, 리포좀 또는 미셀). 여기서의 목적은 수성 안정성 및 향상된 순환을 촉진하는 동시에, 특히 대한 여러 전신적 전달 투여 요법에 대한 필요성을 감소시키는매우 효과적인 반면, 수성 매질에 난용이며, 도전 소수성 약물화물. 따라서, 본원에 기술 된 작업의 목적은 친 지성 세포막 이중층 소수성화물의 특정 제어 및 전달을위한 신규 NP 지지체의 사용 가능성을 확인 하였다. 일에 대한 의욕은 수성 미디어에서 세포에 소수성 분자의 전달에 고유 제한 용해도 어려움이었다. 전형적으로, 이러한 소수성 분자의 전달은 내부 부하를 제한 할 수 독성 손상 세포 및 조직 생존 2 또는 미셀 담체 수있는 유기 용매 (예를 들어, DMSO) 또는 양쪽 성 계면 활성제 (예, 폴록 사머)의 사용을 필요 용량. 여기에 선택된 NP 캐리어는 이전에 3를 개발 한 새로운 액정 NP (LCNP) 배합이었고, 그건 ~ 40 배를 달성하기 위해 이전에 표시했다<html> 배양 된 세포를 4 항암제 독소루비신의 효능 향상. 여기에 기술 된 연구에서, 선택된 대표화물은 전위차 막 염료, 3,3&#39;- dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산 (DIO)을했다. DIO 거실 고정 신경 세포막 전위 측정에 선행 성 역행 추적을 위해 사용 된 수 불용성 염료 및 일반 멤브레인 라벨링 5, 6, 7, 8, 9. 인해 소수성 특성, DIO는 일반적으로 결정질 형태 (10)에 단층 세포 나 조직에 직접 첨가하거나, 매우 높은 농도로 인큐베이션 농도 원액 (11), (12)에서 희석 후 (~ 1-20 μM). 내용의 &quot;LCNP 플랫폼&gt; 여기서, 접근 방식이었다 사용은 DIO. DIO에 대한 배달 차량으로 그 내부 코어를 완전히 소수성 및 표면이 동시에 친수성 및 바이오 콘쥬 게이션 의무가있는 다기능 NP는, 합성시 LCNP 코어에 통합 및 NP 표면이어서 세포막에 DIO-LCNP 앙상블 결합 멤브레인을 촉진하는 PEG 화 콜레스테롤 잔기로 기능화된다.이 접근법은 큰 충실도 멤브레인 레지던스 원형질막으로 DIO 분할 전달 시스템 초래 DIO의 유리 형태는 벌크 용액으로부터 전달보다 시간 (DIO 무료). 또한,이 방법은 DIO의 LCNP 매개 전달이 실질적으로 변조하고 친 유성 세포막 이중층으로 염료의 특정 파티션의 속도를 구동하는 것을 보여 주었다.입니다 부수적 LCNP 제제로 제공하여 40 % ~하여 유리 약물의 독성을 감소시키는 동안 달성했다.

<table><tbody><tr><td>1-에틸-3-(3-(디메틸아미노)-프로필)카르보디이미드 염산염(EDCA)</td><td>ThermoFisher</td><td>E2247</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292-20MG</td><td>위험한; DMSO</td></tr><tr><td>콜레스테롤 폴리(에틸렌 글리콜) 아민 염산염</td>에 원액을 만드십시오<td>.</td><td>PG2-AMCS-2k</td><td></td></tr><tr><td>백작 자동 세포 계수기</td><td>ThermoFisher</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Dioctadecyl-3,3,3&prime; &# 8288; , 3&prime; -tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>위험; DMSO</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>에서 원액을 만드십시오.<td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>37 °C에서 따뜻하게; C 사용 전</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14040182</td><td>37°C에서 따뜻하게 합니다. C 사용 전</td></tr><tr><td>동적 광 산란 기기</td><td>ZetaSizer NanoSeries(Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td><td>ThermoFisher</td><td>33010018</td><td>DPBS를 사용하여 원액 1mg/ml를 만듭니다. 20-30 &micro를 사용하십시오. MetTek 접시 코팅을 위한 g/ml, 37°C에서 2시간; C</td></tr><tr><td>포름알데히드(16%, W/V)</td><td>ThermoFisher</td><td>28906</td><td>위험; DPBS</td></tr><tr><td>인간 배아 신장 세포(HEK 293T/17)</td>를 사용하여 4%로 희석American <td>Type Culture Collection</td><td>ATCC&reg; CRL-11268&거래;</td><td></td></tr><tr><td>생세포 이미징 솔루션 (LCIS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전</td></tr><tr><td>MatTek 14mm # 1.0 커버 글라스 삽입 세포 배양 접시</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Modified Eagle Medium (DMEM) 함유 25 mM HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전</td></tr><tr><td>N-hydroxysulfosuccinimide 나트륨 염 (NHSS)</td><td>ThermoFisher</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1si 스펙트럼 컨포칼 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>는 세포를 세기 전에 세포 현탁액에 50%로 혼합합니다.</td></tr><tr><td>Zeta 전위 기기</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic Processor</td><td>Sonics and Materials Inc</td><td>GEX 600-5</td><td></td></tr><tr><td>Mini Cetntrifuge</td><td>Benchmark</td><td>Mini-fuge-04477</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Sephadex&trade; G-25 매체</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc XRS 이미징 시스템</td><td>Bio-RAD</td><td>76S/07434</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.25%), 페놀 레드</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

세포에 약물 / 조영제의 제어 전달은 치료제의 개발 및 세포 신호 전달 과정의 연구에 중요하다. 최근에는 나노 입자 (NPS는) 이러한 전달 시스템의 개발에 상당한 가능성을 보여 주었다. 여기서, 액정 NP (LCNP) 기반 전달 시스템은 플라즈마의 소수성 영역으로 NP 코어 내에서 수 불용성 염료, 3,3&#39;- dioctadecyloxacarbocyanine 퍼클로레이트 (DIO)의 제어 전달을 위해 사용되어왔다 막 이중층. 국민 연금의 합성 중에 색소를 효율적으로 다중 분광 분석에 의해 확인 된 바와 같이, 소수성 LCNP 코어에 통합 하였다. 만약 NP 표면 (DIO-LCNP-PEG-Chol을)에 PEG 화 콜레스테롤 유도체의 활용은 HEK 293T / 17 세포의 세포막에 염료 로딩 NP에 결합 할 수 있었다. 시분 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 및 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 이미징 통과를 확인LCNP 코어와 세포막 이중층에의 삽입에서 DIO의 유출을 필자. 마지막으로, LCNP-PEG-Chol을 같은 DIO의 전달은 DIO의 세포 독성을 약화; DIO의 NP 양식 디오 무료 벌크 용액으로부터 전달에 비해 ~ 30~40% 적은 독성을 나타냈다. 이 접근법은 소수성 분자화물의 막 - 특정 전송 및 변조를위한 효율적인 양상으로서 LCNP 플랫폼의 유용성을 보여준다.

LCNPs이되는 NP의 소수성 코어가 소수성화물에 대한 효율적인 배달 차량으로 LCNP의 유용성을 입증하는 대표적인 막 표지 프로브로드 제조 하였다. 이를 위해, 선택된화물은 매우 불용성 전위차 막 - 표지 염료 DIO이었다. 도 1 내지 18에 도시 된 바와 같이, DIO로드 LCNPs (DIO-LCNPs)는 화학 성분 DACTP11, AC10COONa 및 DIO와 2 상 미니 에멀젼 기법을 이용하여 합성 하였다. 이러한 NP 시스템에있어서, 상기 결정 성 가교제 DACTP11의 공유 결합 중합체 네트워크는 디오 가교 결합 네트워크 내의 틈새 공간 내에 존재하는 안정한 소수성 코어를 제공한다. 또한 세포 표적 리간드의 결합을위한 관능기로서 &quot;핸들&quot;을 제공하면서 NP 표면상의 카복실 그룹은 수성 매질에서 입자 콜로이드 안정성을 제공한다(및 기타 생물학적 제제). 원형질막에 DIO-LCNPs 밧줄하기 위해, ...

액정 나노 입자 (LCNP) nanocarrier는 살아있는 세포의 세포막에 소수성화물의 제어 전달을위한 수단으로 이용된다.

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 액정 기반 나노입자를 전달 플랫폼으로 사용하여, 살아있는 포유류 세포의 형질막 내 지질 친화성 부위로 소수성 화물을 조절하여 전달하는 것입니다. 이 방법은 수용성이 낮은 소수성 화물의 효율적인 전달 및 세포 내 흡수를 가능하게 하는 방법과 같은 약물 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포독성을 줄이면서, 막 표적 소수성 화물을 형질막에 더욱 특이적으로 전달할 수 있다는 점입니다.본 절차의 시연은 본 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Okhil Nag가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 DiO 액정 나노입자를 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 그 다음, HEPES 버퍼에 분산된 1.0 millileters의 DiO 액정 나노입자에 갓 준비한 NHSS/EDC 작업 용액 20 microliters를 첨가하십시오.그리고 5분 동안 교반합니다. 다음으로, cholesterol PEG amine 스톡 솔루션 20 µL를 이 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 교반합니다. 2시간 후, 테이블탑 미니 원심분리기를 사용하여 최대 속도로 30초 동안 반응 혼합물을 짧게 원심분리합니다.그 다음 상층액을 Dulbecco's phosphate buffered saline으로 평형화한 PD 10 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 통과시킵니다. 겔 전기영동을 통해 DiO 액정 나노입자 표면에 PEG 콜레스테롤이 성공적으로 공유 결합되었는지 확인하기 위해, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 아가로스 겔을 준비합니다. 겔이 응고되면, 챔버 내의 겔이 잠길 정도로 충분한 양의 TBE 러닝 버퍼를 추가합니다.그런 다음, 겔의 웰에 35 µL의 DiO 액정 나노입자 샘플을 첨가하고 110 V 전압에서 20분 동안 전기영동을 수행합니다. 488 nm의 여기 필터와 500~550 nm의 방출 필터가 장착된 겔 이미지 시스템을 사용하여 겔을 촬영합니다. 14 mm 1번 커버 글라스 인서트가 장착된 35 mm 직경의 조직 배양 접시를 DPBS 내의 소 fibronectin으로 37 °C에서 2시간 동안 코팅하여 준비합니다.2시간 후, 배양 접시에서 피브로넥틴 코팅 용액을 제거합니다. 먼저 DPBS 3 mL로 세포 단층을 세척한 다음, trypsin EDTA 2 mL를 첨가하여 T25 플라스크에서 HEK 293 T17 세포를 수확합니다. 플라스크를 37 °C에서 약 3분 동안 배양합니다.플라스크에서 세포가 분리되면, 4 mL의 완전 배지를 플라스크에 첨가하여 트립신을 중화합니다. 세포 계수기를 사용하여 현탁액 내의 세포 농도를 측정합니다. 그런 다음 성장 배지를 사용하여 세포 농도를 mL당 약 80,000 cells로 조정합니다.세포 현탁액 3 mL를 디시에 넣고, 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 세포는 약 70%의 합류도(confluency)에 도달하여 사용할 준비가 되어야 합니다. 높은 비율의 세포를 강력하고 효율적으로 라벨링하기 위해서는 적절한 세포 밀도가 매우 중요합니다.해당 스톡 솔루션을 희석하여 DiO, DiO 액정 나노입자 및 DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤의 1mL 용액을 전달 배지(delivery medium)로 준비합니다. 세롤로지컬 피펫을 사용하여 배양 접시에서 성장 배지를 제거하고, 세포 단층을 HEPES DMEM으로 2회 세척합니다. 피펫을 사용하여 HEPES DMEM을 접시 가장자리에 조심스럽게 가한 후 이를 제거하는 방식으로 세척을 수행합니다.준비된 DiO free 또는 DiO 액정 나노입자 전달 용액 0.2 milliliters를 배양 접시 중앙에 첨가합니다. 그런 다음 접시를 배양기로 옮겨 적절한 시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 길어지면 비막성 영역에 비특이적 세포 라벨링이 발생할 수 있습니다.배양 기간이 끝나면, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 전달 용액을 제거합니다. 각 세척당 2 mL의 DPBS를 사용하여 세포 단층을 두 번 세척합니다. 실온에서 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 세포 단층을 고정합니다.피펫을 사용하여 파라포름알데히드 용액을 제거하고, 2 mL의 DPBS로 세포를 한 번 가볍게 세척합니다. 이제 고정된 세포를 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 막 형광 신호의 존재 여부를 이미지화할 준비가 되었습니다. 가열 배양 챔버가 장착된 현미경 스테이지에서 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포 샘플을 이미지화하여 막 표지를 평가합니다.이미징을 즉시 수행하지 않을 경우, 배지를 0.05% sodium azide가 포함된 DPBS로 교체하고 디쉬를 4°C에서 보관하십시오. 이 방법에서는 세포를 FRET 공여체인 DiO와 FRET 수용체인 DiI로 공동 라벨링합니다. 이전과 같이 DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤과 DiI free를 사용하여 세포를 순차적으로 라벨링하십시오.염색 후, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 2 mL의 DPBS로 세포를 1회 세척하고 2 mL의 생세포 이미징 솔루션으로 교체합니다. 가열 배양 챔버가 장착된 현미경 스테이지에서 FRET 이미징 기능이 있는 공초점 현미경을 사용하여 생세포 샘플을 이미지화합니다. DiO 공여체를 488 nm에서 여기시키고, 32채널 스펙트럼 검출기를 사용하여 490 nm에서 700 nm까지 DiO 공여체와 DiI 수용체 모두의 전체 방출 스펙트럼을 수집함으로써 4시간 동안 30분 간격으로 실험을 구성합니다.그런 다음, DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤 및 DiI로 염색된 세포에서 DiO 공여체와 DiI 수용체의 시간 분해 방출 강도를 측정합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미지에 대한 시간 분해 수용체-공여체 FRET 비율을 계산합니다. 유리 DiO는 이중 표지 막 인지질로 대조 염색된 세포의 세포막보다는 세포 내부에 비특이적으로 축적됩니다.이는 병합된 이미지로 시각화할 수 있습니다. 반대로, DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤은 이중 표지된 막 인지질과의 공국소화(colocalization)를 통해 확인되는 바와 같이, 세포의 세포막만을 특이적으로 표지합니다. FRET은 DiO 공여체에서 DiI 수용체로의 에너지 전달 증가가 관찰됨으로써, 액정 나노입자로부터 막 지질 이중층으로 DiO가 분배됨을 입증합니다.DiO와 DiI 사이의 FRET 및 DiO와 DiI의 방출 변화는 시간에 따른 DiO에서 DiI로의 FRET 증가를 확인시켜 줍니다. DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤 나노입자는 생존율이 90%로 나타나 세포 독성이 최소화된 반면, 유리 DiO의 경우 생존율이 약 50%로 상당한 독성을 보였습니다. 이 영상을 시청하고 나면 화물을 적재한 액정 나노입자를 합성하고, 세포 표적화를 위해 이를 생체 기능화하며, 성공적인 세포 전달을 위해 화물이 적재된 세포를 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 수용액 상태의 DiO를 세포막으로 특이적으로 전달하는 과정이 매우 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우리는 항암제 doxorubicin의 세포 내 전달을 위해 액정 나노입자 플랫폼을 사용하며 이 약물의 세포 흡수 kinetics를 조절하는 능력을 확인한 후, 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 이 절차를 따르면, 수용성 매질에서 세포로의 전달에 특히 어려움이 있는 광범위한 소수성 화물의 세포 내 전달에 이 접근 방식을 적용할 수 있습니다.이 접근 방식은 뇌 영상화를 위한 전압 민감성 염료나 광자 보조 약물 치료를 위한 광역학 약물과 같이, 막 표적 약물 및 생성분 분자의 보다 효율적인 전달을 달성하는 데 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

세포의 빠른 기계적인 변형은 고분자 나노 물질의 세포 내 전달을위한 약속, 벡터없는 방법으로 떠오르고있다. 이 프로토콜은 다양한 애플리케이션을 위해 시스템을 사용하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공.

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

이 연구에서는 생체 적합성 나노 입자의 초소형 집단을 합성하는 방법과 세포 상호 작용을 평가하기 위한 몇 가지 시험관 내 방법을 설명했습니다.

고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

나노 지질 담체 (NLC)의 합성을위한 가장 보편적으로 사용되는 방법은 수 중유 에멀젼, 균질화 및 응고를 포함한다. 이것은 다카르 바진 전달을위한 잠재적 인 담체로서 바람직한 크기, 향상된 약물 봉입 약물 적재 효율이 NLC을 달성하기 위해, 응고 후의 고 전단 분산함으로써 여기 개질 하였다.

나노 구조 지질 캐리어를 사용하여 암 치료제 다카 바진의 캡슐화

이 프로토콜의 목표는 신경 표적 펩타이드가 있는 양이온성/음이온성 리포좀을 CNS 전달 시스템으로 사용하여 siRNA가 BBB를 통과할 수 있도록 하는 것입니다.  siRNA와 같은 치료를 위한 전달 시스템의 최적화는 프리온 및 기타 신경 퇴행성 질환에 대한 더 많은 치료 옵션을 가능하게 할 것입니다.

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

나노 입자는 표시의 광범위한 유망 약물 전달 시스템이 등장하고있다. 여기, 우리는 역 설계 누에 나방 실크를 사용하여 실크 나노 입자를 제조 할 수있는 간단하면서도 강력한 방법을 설명합니다. 이들은 실크 나노 용이 치료 페이로드이어서 약물 전달 애플리케이션을 위해 탐색 될 수있다.

실크 나노 입자의 제조 및 약물 전달 응용 프로그램

나노 소재 기초 과학 및 변환 응용 프로그램에 대 한 제어 치료 납품의 다양 한 메커니즘을 제공 하지만 그들의 제조를 종종 가장 생물 의학 연구소에서 제공 하는 전문. 여기, 우리가 현재 확장 가능한 제조 및 플래시 nanoprecipitation를 사용 하 여 다양 한 자기 조립된 nanocarriers의 치료 로드에 대 한 프로토콜.

급속 하 고, 확장 가능한 어셈블리 및 플래시 Nanoprecipitation 통해 다양 한 합성 Nanocarriers에 생리 활성 단백질의 Immunostimulants 로드

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

이 문서에서는 falcarindiol 지질 코팅 74 nm 나노 입자에 캡슐화를 설명합니다. 인간 줄기 세포 지질 작은 물방울에 의해 나노 입자의 세포질 통풍 관 그리고 confocal 형광 이미징에 의해 모니터링 됩니다. 나노 입자 용 매 변화, 급속 한 주입 방법으로 조작 하 고 그들의 크기는 동적 산란 기법으로 측정 된다.

Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

화학적 성질을 준비 및 특성화 하는 방법 및 중성 충전 된, pH 반응 siRNA 나노 입자의 생물 활성이 제시 된다. 성공적인 siRNA에 대 한 기준은 크기, 형태학, 표면 전 하, siRNA 하 중 및 유전자 침묵과 같은 나노 의약품에 대해 논의 된다.

사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

본 연구는 나노리포솜 제제에 대한 얇은 지질 막 방법을 이용한 고전적인 수분 공급에 대해 설명하고 나노입자 특성화에 이어. 47 kDa-친수성 및 구형 단백질인 타린(tarin)은 안정성을 개선하고, 빠른 클리어런스를 피하며, 통제된 방출을 촉진하는 전략으로 성공적으로 캡슐화되었습니다. 이 방법은 소수성 분자 캡슐화에 적응될 수 있다.

생리 활성 친수성 구형 단백질의 함정에 대한 나노 리포좀의 준비 및 특성화

지질 나노 입자는 mRNA 및 DNA 캡슐화를 위한 미세유체 혼합 플랫폼 접근 방식을 사용하여 개발됩니다.

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

배우세요 액정 나노입자를 활용한 소수성 화물의 세포막 표적 전달 방법. 포유류 세포에서 세포독성을 최소화하며 효율적인 약물 전달을 구현하는 기술을 확인하세요.

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

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