액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

본 실험 절차의 전반적인 목표는 액정 기반 나노입자를 전달 플랫폼으로 사용하여, 살아있는 포유류 세포의 형질막 내 지질 친화성 부위로 소수성 화물을 조절하여 전달하는 것입니다. 이 방법은 수용성이 낮은 소수성 화물의 효율적인 전달 및 세포 내 흡수를 가능하게 하는 방법과 같은 약물 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포독성을 줄이면서, 막 표적 소수성 화물을 형질막에 더욱 특이적으로 전달할 수 있다는 점입니다.

본 절차의 시연은 본 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Okhil Nag가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 DiO 액정 나노입자를 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 그 다음, HEPES 버퍼에 분산된 1.0 millileters의 DiO 액정 나노입자에 갓 준비한 NHSS/EDC 작업 용액 20 microliters를 첨가하십시오.

그리고 5분 동안 교반합니다. 다음으로, cholesterol PEG amine 스톡 솔루션 20 µL를 이 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 교반합니다. 2시간 후, 테이블탑 미니 원심분리기를 사용하여 최대 속도로 30초 동안 반응 혼합물을 짧게 원심분리합니다.

그 다음 상층액을 Dulbecco's phosphate buffered saline으로 평형화한 PD 10 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 통과시킵니다. 겔 전기영동을 통해 DiO 액정 나노입자 표면에 PEG 콜레스테롤이 성공적으로 공유 결합되었는지 확인하기 위해, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 아가로스 겔을 준비합니다. 겔이 응고되면, 챔버 내의 겔이 잠길 정도로 충분한 양의 TBE 러닝 버퍼를 추가합니다.

그런 다음, 겔의 웰에 35 µL의 DiO 액정 나노입자 샘플을 첨가하고 110 V 전압에서 20분 동안 전기영동을 수행합니다. 488 nm의 여기 필터와 500~550 nm의 방출 필터가 장착된 겔 이미지 시스템을 사용하여 겔을 촬영합니다. 14 mm 1번 커버 글라스 인서트가 장착된 35 mm 직경의 조직 배양 접시를 DPBS 내의 소 fibronectin으로 37 °C에서 2시간 동안 코팅하여 준비합니다.

2시간 후, 배양 접시에서 피브로넥틴 코팅 용액을 제거합니다. 먼저 DPBS 3 mL로 세포 단층을 세척한 다음, trypsin EDTA 2 mL를 첨가하여 T25 플라스크에서 HEK 293 T17 세포를 수확합니다. 플라스크를 37 °C에서 약 3분 동안 배양합니다.

플라스크에서 세포가 분리되면, 4 mL의 완전 배지를 플라스크에 첨가하여 트립신을 중화합니다. 세포 계수기를 사용하여 현탁액 내의 세포 농도를 측정합니다. 그런 다음 성장 배지를 사용하여 세포 농도를 mL당 약 80,000 cells로 조정합니다.

세포 현탁액 3 mL를 디시에 넣고, 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 세포는 약 70%의 합류도(confluency)에 도달하여 사용할 준비가 되어야 합니다. 높은 비율의 세포를 강력하고 효율적으로 라벨링하기 위해서는 적절한 세포 밀도가 매우 중요합니다.

해당 스톡 솔루션을 희석하여 DiO, DiO 액정 나노입자 및 DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤의 1mL 용액을 전달 배지(delivery medium)로 준비합니다. 세롤로지컬 피펫을 사용하여 배양 접시에서 성장 배지를 제거하고, 세포 단층을 HEPES DMEM으로 2회 세척합니다. 피펫을 사용하여 HEPES DMEM을 접시 가장자리에 조심스럽게 가한 후 이를 제거하는 방식으로 세척을 수행합니다.

준비된 DiO free 또는 DiO 액정 나노입자 전달 용액 0.2 milliliters를 배양 접시 중앙에 첨가합니다. 그런 다음 접시를 배양기로 옮겨 적절한 시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 길어지면 비막성 영역에 비특이적 세포 라벨링이 발생할 수 있습니다.

배양 기간이 끝나면, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 전달 용액을 제거합니다. 각 세척당 2 mL의 DPBS를 사용하여 세포 단층을 두 번 세척합니다. 실온에서 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 세포 단층을 고정합니다.

피펫을 사용하여 파라포름알데히드 용액을 제거하고, 2 mL의 DPBS로 세포를 한 번 가볍게 세척합니다. 이제 고정된 세포를 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 막 형광 신호의 존재 여부를 이미지화할 준비가 되었습니다. 가열 배양 챔버가 장착된 현미경 스테이지에서 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포 샘플을 이미지화하여 막 표지를 평가합니다.

이미징을 즉시 수행하지 않을 경우, 배지를 0.05% sodium azide가 포함된 DPBS로 교체하고 디쉬를 4°C에서 보관하십시오. 이 방법에서는 세포를 FRET 공여체인 DiO와 FRET 수용체인 DiI로 공동 라벨링합니다. 이전과 같이 DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤과 DiI free를 사용하여 세포를 순차적으로 라벨링하십시오.

염색 후, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 2 mL의 DPBS로 세포를 1회 세척하고 2 mL의 생세포 이미징 솔루션으로 교체합니다. 가열 배양 챔버가 장착된 현미경 스테이지에서 FRET 이미징 기능이 있는 공초점 현미경을 사용하여 생세포 샘플을 이미지화합니다. DiO 공여체를 488 nm에서 여기시키고, 32채널 스펙트럼 검출기를 사용하여 490 nm에서 700 nm까지 DiO 공여체와 DiI 수용체 모두의 전체 방출 스펙트럼을 수집함으로써 4시간 동안 30분 간격으로 실험을 구성합니다.

그런 다음, DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤 및 DiI로 염색된 세포에서 DiO 공여체와 DiI 수용체의 시간 분해 방출 강도를 측정합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미지에 대한 시간 분해 수용체-공여체 FRET 비율을 계산합니다. 유리 DiO는 이중 표지 막 인지질로 대조 염색된 세포의 세포막보다는 세포 내부에 비특이적으로 축적됩니다.

이는 병합된 이미지로 시각화할 수 있습니다. 반대로, DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤은 이중 표지된 막 인지질과의 공국소화(colocalization)를 통해 확인되는 바와 같이, 세포의 세포막만을 특이적으로 표지합니다. FRET은 DiO 공여체에서 DiI 수용체로의 에너지 전달 증가가 관찰됨으로써, 액정 나노입자로부터 막 지질 이중층으로 DiO가 분배됨을 입증합니다.

DiO와 DiI 사이의 FRET 및 DiO와 DiI의 방출 변화는 시간에 따른 DiO에서 DiI로의 FRET 증가를 확인시켜 줍니다. DiO 액정 나노입자 PEG 콜레스테롤 나노입자는 생존율이 90%로 나타나 세포 독성이 최소화된 반면, 유리 DiO의 경우 생존율이 약 50%로 상당한 독성을 보였습니다. 이 영상을 시청하고 나면 화물을 적재한 액정 나노입자를 합성하고, 세포 표적화를 위해 이를 생체 기능화하며, 성공적인 세포 전달을 위해 화물이 적재된 세포를 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 수용액 상태의 DiO를 세포막으로 특이적으로 전달하는 과정이 매우 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우리는 항암제 doxorubicin의 세포 내 전달을 위해 액정 나노입자 플랫폼을 사용하며 이 약물의 세포 흡수 kinetics를 조절하는 능력을 확인한 후, 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 이 절차를 따르면, 수용성 매질에서 세포로의 전달에 특히 어려움이 있는 광범위한 소수성 화물의 세포 내 전달에 이 접근 방식을 적용할 수 있습니다.

이 접근 방식은 뇌 영상화를 위한 전압 민감성 염료나 광자 보조 약물 치료를 위한 광역학 약물과 같이, 막 표적 약물 및 생성분 분자의 보다 효율적인 전달을 달성하는 데 활용될 수 있습니다.