Name: Targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo Cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle Carrier Liquid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri come utilizzare nanoparticelle a cristalli liquidi per la consegna mirata di carichi idrofobi alla membrana plasmatica di cellule mammifere viventi, riducendo la citotossicità e migliorando l'efficienza del rilascio farmacologico.

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Questo lavoro è stato supportato dal NRL base di finanziamento del programma (unità di lavoro MA041-06-41-4943). ON è supportata da un Postdoctoral Research Associateship Consiglio Nazionale delle Ricerche.

1. Preparazione di Dio-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol <ol><li> Sciogliere liquido diacrilato cristallina agente reticolante (DACTP11, 45 mg), 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO, 2 mg), e un iniziatore radicale libero (azobisisobutirronitrile, 1 mg) per la polimerizzazione in 2 ml di cloroformio. Aggiungere questo ad una soluzione acquosa di tensioattivo acrilato-funzionalizzato (AC10COONa, 13 mg in 7 ml). </li><li> Mescolare la miscela per 1 ora e sonicare all&#39;80% ampiezza per 5 minuti per produrre una miniemulsion composto di piccole goccioline di materiale organico circondato da tensioattivo polimerizzabile in acqua. </li><li> Riscaldare la miscela a 64 ° C in un bagno d&#39;olio di avviare la polimerizzazione sia l&#39;agente tensioattivo e reticolazione come cloroformio evapora lentamente, lasciando una sospensione NP DiO contenente che viene stabilizzato dal tensioattivo. </li><li> Filtrare la sospensione NP (3 volte) attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron per rimuovere eventuali aggregazione. Store la soluzione NP filtrata a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Coniugazione del PEG-Chol a DIO-LCNP tramite accoppiamento EDC. <ol><li> Sciogliere Chol-PEG-NH 2 · HCl (PEG-Chol, 0.9 mM) in 25 mM tampone HEPES (pH 7,0). </li><li> Preparare una soluzione di lavoro contenente N-idrossi-sulfosuccinimide sale sodico (NHSs, 40 mm) e 1-etil-3- (3- (dimetilammino) propil) carbodiimmide cloridrato (EDC, 400 mm) in tampone HEPES da soluzioni di riserva concentrate. </li><li> Aggiungere immediatamente 20 ml di soluzione di lavoro preparata al momento di NHSs / EDC a 1,0 ml di Dio-LCNP in tampone HEPES e mescolare per 5 min. </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione madre di Chol-PEG-NH 2 · HCl a questa miscela e mescolare per 2 ore. </li><li> Centrifugare brevemente la miscela di reazione alla massima velocità (~ 2.000 xg) per 30 secondi usando un mini centrifuga da tavolo e passare il surnatante con una PD-10 dimensione di colonna cromatografia di esclusione 13 equilibrata conPBS Dulbecco (DPBS, 0.1x). </li></ol></li></ol> 2. Caratterizzazione di Dio-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol <ol><li> Confermare il covalente coniugazione di successo di PEG-Chol alla superficie DIO-LCNP mediante elettroforesi su gel. <ol><li> Sciogliere 0.5 g di agarosio in 50 ml (1x) di tris-borato elettroforesi (TBE, 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM di acido borico, e 2 mM EDTA) buffer. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde per sciogliere l&#39;agarosio. Lasciare che la soluzione per raffreddare leggermente e versare il contenuto in una piastra di gel nella casella di elettroforesi. Inserire un pettine gel per creare pozzetti dei campioni. </li><li> Una volta che il gel è solidificato, aggiungere la quantità necessaria (basta immergere il gel nella camera) di TBE tampone di corsa alla camera. </li><li> Aggiungere 35 ml di campione DiO-LCNP (modificato con glicerolo, 5% v / v) ai pozzetti del gel e correre per 20 minuti a una tensione di 110 V. </li><li> Immagine il gel utilizzando una connessione Wi sistema di imaging geleccitazione ed emissione filtri th a 488 nm e 500-550 nm, rispettivamente. </li></ol></li><li> Valutare la dimensione delle particelle e la distribuzione dalla dispersione della luce dinamica (DLS) diluendo la soluzione di Dio-LCNP (diluizione ~ 200 volte) in PBS (pH ~ 8, 0.1x) e misurare su uno strumento DLS 14. Misurare la zeta-potenziale del Dio-LCNPs utilizzando un potenziale strumento di misura zeta adeguato. </li></ol> 3. Preparazione di colture cellulari piatti per gli esperimenti di consegna e imaging NOTA: etichettatura DIO-LCNP viene eseguita su HEK 293T / 17 cellule renali di embrioni umani (tra i passaggi 5 e 15), che sono coltivate come descritto in precedenza 4. Eseguire gli esperimenti di consegna e l&#39;imaging cellulare successiva come descritto di seguito. <ol><li> Preparare 35 mm piastre di coltura tissutale diametro (dotati di inserti No. 1 vetrose 14 mm) mediante rivestimento con fibronectina bovina (~ 100 microlitri ad una concentrazione di 20 ug/ Ml) in DPBS per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione di rivestimento fibronectina dal piatto cultura. Harvest HEK 293 T1 / 7 cellule dal matraccio T-25 di primo lavaggio il monostrato cellulare con 3 ml di DPBS e poi aggiungendo 2 ml di tripsina-EDTA (0,5% tripsina-EDTA 0,25%). </li><li> Incubare la beuta a 37 ° C per ~ 3 min. Rimuovere la tripsina-EDTA e riportare il pallone al incubatore. Una volta che le cellule vengono staccate dal pallone, neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 ml di mezzo completo (Dulbecco Modified Eagle Medium; DMEM, modificato per contenere il 10% di siero fetale bovino, 5% sodio piruvato, e 5% di antibiotico / antimicotico) al pallone . Determinare la concentrazione cellulare nella sospensione da essi contando in un contaglobuli. </li><li> Regolare la concentrazione cellulare a ~ 8 x 10 4 cellule / ml con terreno di coltura. Aggiungere 3 ml di sospensione cellulare al piatto e alla cultura in incubatrice durante la notte; Il giorno successivo, le cellule devono essere a ~ 70% di confluenza e dovrebbe essere pronto per l&#39;uso. Adeguatodensità delle cellule è critico per l&#39;etichettatura robusto ed efficiente di una elevata percentuale di cellule. </li></ol> 4. Consegna cellulare della DIO e DIO-LCNPs e imaging di cellule fissate <ol><li> Preparare 1 ml di soluzioni della DIO, DIO-LCNP, e Dio-LCNP-PEG-Chol a mezzo di consegna (HEPES-DMEM; DMEM contenente 25 mM HEPES) diluendo soluzioni di riserva della DIO gratuito e DIO-LCNPs; adeguate concentrazioni di DIO per l&#39;incubazione di cellule saranno ~ 1-10 micron (espresso come sia la concentrazione di DiO libero o DiO in forma di Dio-LCNP). </li><li> Rimuovere il terreno di crescita dalle piastre di coltura con una pipetta sierologica e lavare i monostrati cellulari (vedi punto 3) due volte con HEPES-DMEM (2 ml ogni lavaggio). Eseguire i lavaggi aggiungendo delicatamente e rimuovere HEPES-DMEM con una pipetta a / da bordo dei piatti. </li><li> Aggiungere 0,2 ml delle soluzioni preparate la consegna gratuita o DIO-LCNP DIO al centro dei piatti della cultura e restituire i piatti per l&#39;incubator per un congruo periodo di tempo (tipicamente 15 o 30 minuti, a seconda delle esigenze dell&#39;esperimento). Tempi di incubazione più lunghi aggiungono all&#39;etichettatura cellulare più non specifico di aree non membranose (ad esempio, citoplasma). </li><li> Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le soluzioni di consegna con una pipetta sierologica. Lavare i monostrati cellulari due volte con DPBS (2 ml ogni lavaggio). Eseguire i lavaggi aggiungendo delicatamente e rimuovere DPBS al / dal bordo del piatto. </li><li> Fissare i monostrati cellulari utilizzando 4% paraformaldeide (preparato in DPBS) per 15 min a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Paraformaldeide è infiammabile, irritante delle vie respiratorie, e un sospetto cancerogeno. </li><li> Rimuovere la soluzione paraformaldeide con una pipetta e lavare delicatamente le cellule 1 volta con DPBS (2 ml) con l&#39;aggiunta e la rimozione di DPBS usando pipetta da / per il bordo dei piatti. </li><li> Le cellule fissate sono pronte per essere ripreso per la presenza di un segnale di fluorescenza membranosa usando scansione laser confocalemicroscopia (CLSM). Eseguire imaging immediatamente o, in alternativa, sostituire il mezzo con DPBS contenente 0,05% NaN 3 e memorizzare i piatti a 4 ° C. ATTENZIONE: NaN 3 è tossico; prestare la massima attenzione quando si usano NaN 3. NOTA: fisso campioni conservati in questo modo devono essere esposte entro 48 ore per ottenere risultati ottimali. </li></ol> 5. Consegna cellulare della DIO e DIO-LCNPs e FRET imaging in cellule vive NOTA: In questo metodo, le cellule sono colabeled con 6 micron ogni Dio-LCNP-PEG-Chol (dove DiO è un donatore FRET) e 1,1&#39;-diottadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-perclorato tetramethylindocarbocyanine (DII libero, dove DII è un accettore FRET). Il rilascio della DIO da Dio-LCNP-PEG-Chol e la sua integrazione nella membrana plasmatica è confermata da un incremento osservato nel trasferimento di energia dal donatore DiO al accettore DII. <ol><li> Cellule Label sequenzialmente con Dio-LCNP-PEG-Chol e DII free con il metodo descritto al punto 4. </li><li> Dopo la colorazione, lavare le cellule 1 volta con DPBS (2 ml) con una pipetta sierologica e sostituire il tampone di lavaggio con 2 ml di soluzione di imaging cellulare dal vivo (LCI). </li><li> Su un palco microscopio dotato di una camera di incubazione riscaldata, immagine campione cellulare diretta utilizzando un microscopio confocale (obiettivo 60X) con una configurazione di imaging FRET ad intervalli di 30 min per un periodo di 4 ore eccitando donatore DiO a 488 nm e la raccolta di emissione completa spettri del donatore DiO e l&#39;accettore DII dal 490-700 nm con un rivelatore spettrale a 32 canali. </li><li> NOTA: Per ulteriori informazioni sulle immagini FRET, vedere riferimento 15. </li><li> Determinare l&#39;intensità di emissione risolta in tempo del donatore DiO e l&#39;accettore DII da cellule colorate con Dio-LCNP-PEG-Chol e DII. Calcolare il tempo-risolta accettore / donatore FRET rapporto (DII emi / DIO EMI) per le immagini, che sarà in costante aumento e, infine, piattoau volta la quantità di DiO donatore partizionato nella membrana ha raggiunto un massimo 16. </li></ol> 6. citotossicità Assay della DIO e DIO-LCNPs alle HEK 293T / 17 celle NOTA: la citotossicità dei materiali Dio-LCNP è valutato attraverso un saggio di proliferazione a base dye tetrazolio 17. Le cellule sono coltivate in una piastra multipozzetto in presenza di concentrazioni variabili di materiali in condizioni che emulano consegna / etichettatura. Le cellule vengono quindi coltivate per 72 ore per permettere la proliferazione. Un colorante (MTS, (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-solfofenil) -2H-tetrazolio) viene poi aggiunto ai pozzetti e metabolicamente attiva cellule convertono il colorante in un prodotto formazano blu. la quantità di formazione di colore è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali. <ol><li> Harvest HEK 293 T1 / 7 cellule dal pallone T-25 seguendo la procedura descritta nella fase 3.2.SeedHEK 293T / 17 celle (5.000 cellule / 100 pl / pozzetto) ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti tessuto cultura coltura trattata e per 24 ore. </li><li> Rimuovere completamente il terreno di coltura dai pozzi usando una micropipetta e aggiungere 50 ml di HEPES-DMEM contenenti DiO libera, Dio-LCNPs, o Dio-LCNP-PEG-Chol a concentrazioni crescenti di replicare i pozzi. Incubare le cellule a 37 ° C per 30 min. NOTA: in genere, di repliche fatto in triplice copia o quadruplicato sono sufficienti per produrre dati statisticamente attendibili. <ol><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere il terreno consegna contenente i materiali utilizzando una micropipetta e sostituirlo con 100 ml di mezzo di crescita. Coltivare le cellule per 72 ore. </li></ol></li><li> Aggiungere 20 ml di substrato tetrazolio in ogni pozzetto, riportare la piastra per l&#39;incubatore e consentire la formazione di colore di procedere a 37 ° C per 4 ore. Leggere l&#39;assorbanza (ABS) del prodotto formazano a 570 nm (minimi assorbimento per la DIO-LCNPs utilizzati in questo study) e 650 nm (per sottrazione di fondo non specifica assorbanza) utilizzando un lettore di micropiastre. </li><li> Tracciare il valore della differenza di assorbanza (ass 570 - abs 650) in funzione della concentrazione di materiale e riferire i risultati come percentuale della proliferazione delle cellule di controllo (grado di proliferazione delle cellule in terreno di coltura cellulare solo). </li></ol> Analisi 7. I dati <ol><li> Statisticamente analizzare i dati con un&#39;analisi univariata della varianza (ANOVA). Per confronti multipli, applicare prova hoc posto del Bonferroni. Fornire tutti i valori medi ± errore standard della media (SEM), se non diversamente indicato. NOTA: La probabilità accettabile per significato era p &lt;0.05. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Un obiettivo costante di NMDD è il targeting e l&#39;erogazione controllata di formulazioni di farmaci a cellule e tessuti, in combinazione con contestuale miglioramento della efficacia del farmaco. Una specifica classe di molecole di farmaco per il quale questa ha posto una sfida significativa è idrofobe agenti farmaci / imaging che hanno parsimonia per non solubilità in mezzi acquosi. Questo problema ha afflitto la transizione di potenti farmaci da sistemi di coltura cellulare in vitro per l&#39;impo...

Dal momento che l&#39;avvento di interfacciarsi nanomateriali (materiali ≤100 nm in almeno una dimensione) con cellule viventi, un obiettivo costante è stato quello di sfruttare le proprietà uniche dipendenti dalle dimensioni delle nanoparticelle (NPS) per varie applicazioni. Queste applicazioni comprendono cellule e tessuti etichettatura / immagini (sia in vitro che in vivo), rilevamento in tempo reale, e l&#39;erogazione controllata di farmaci e altri carichi 1. Esempi di tali importanti proprietà NP includono l&#39;emissione dipendente dalle dimensioni dei nanocristalli semiconduttori (punti quantici, QD); le proprietà fototermiche di nanoparticelle d&#39;oro; la grande capacità di carico del nucleo acquosa di liposomi; e la conduttività balistica allotropi di carbonio, come nanotubi di carbonio a parete singola e grafene. Più recentemente, notevole interesse è sorto nell&#39;uso delle NP per la modulazione controllato di farmaci e altri carichi, come contrasto / dell&#39;imaging unsignori. Qui, la logica è quella di migliorare in modo significativo / ottimizzare la solubilità generale, la dose erogata, tempo di circolazione, e la clearance eventuale del carico di droga consegnandola come una formulazione NP. Questo è venuto per essere conosciuta come la somministrazione di farmaci NP-mediata (NMDD), e ci sono attualmente sette approvati dalla FDA NP formulazioni farmaceutiche per l&#39;uso in clinica per il trattamento di vari tipi di cancro e di altre centinaia in varie fasi di sperimentazione clinica. In sostanza, l&#39;obiettivo è quello di &quot;ottenere di più con meno;&quot; cioè, di utilizzare la NP come impalcatura per fornire più farmaci con minori amministrazioni dosaggio sfruttando la grande superficie: volume (per esempio, particelle dure, come QD e ossidi metallici) di NP o loro grande volume interno di carico grandi payload carico (ad esempio, liposomi o micelle). Lo scopo è quello di ridurre la necessità di diversi regimi di dosaggio sistemicamente consegnati mentre allo stesso tempo promuovere stabilità acquosa e una maggiore circolazione, in particolare perimpegnativi carichi di droga idrofobiche che, pur altamente efficace, sono moderatamente solubile in ambiente acquoso. Pertanto, l&#39;obiettivo del lavoro qui descritto era di determinare la possibilità di utilizzare un nuovo NP scaffold per l&#39;erogazione specifica e controllata di carichi idrofobi al doppio strato membrana plasmatica lipofilo. La motivazione per il lavoro era la limitata solubilità intrinseca e difficoltà nella consegna di molecole idrofobe alle cellule da mezzi acquosi. Tipicamente, la consegna di tali molecole idrofobe richiede l&#39;uso di solventi organici (ad esempio, DMSO) o tensioattivi anfifilici (ad esempio, poloxamers), che possono essere di cellule e tessuti redditività tossici e di compromesso 2, o portatori di micella, che può hanno limitato carico interno capacità. Il vettore NP scelta qui è stato un cristallo liquido NP (LCNP) formulazione romanzo sviluppato in precedenza 3 e che era stato mostrato in precedenza per ottenere un ~ 40 volte<html> miglioramento nell&#39;efficacia della antitumorale doxorubicina farmaco in cellule coltivate 4. Nel lavoro qui descritto, il carico rappresentante scelto era il colorante membrana potenziometrico, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO è un colorante insolubile in acqua che è stata utilizzata per anterograda e tracciatura retrograda nel potenziale di membrana misurazioni neuroni fissi vita e, e per membrane generale etichettatura 5, 6, 7, 8, 9. Grazie alla sua natura idrofoba, DiO è tipicamente aggiunto direttamente monostrati di cellule o tessuti in una forma cristallina 10, oppure viene incubata a concentrazioni molto elevate (~ 1-20 micron) dopo la diluizione da una soluzione di concentrazione magazzino 11, 12. content &quot;&gt; uso Qui, l&#39;approccio è stato alla piattaforma LCNP, un NP multifunzionale il cui nucleo interno è completamente idrofobico e la cui superficie è simultaneamente idrofila e suscettibili di bioconjugation, come veicolo di consegna per DiO. DiO è incorporato nel nucleo LCNP durante la sintesi , e la superficie NP viene funzionalizzato con un colesterolo frazione PEGylated promuovere la membrana vincolante dell&#39;insieme DiO-LCNP alla membrana plasmatica. Questo approccio ha portato a un sistema di erogazione che partizionato DIO nella membrana plasmatica con maggiore fedeltà e residenza membrana volta che la forma libera della DIO consegnato dalla soluzione di massa (DIO gratuito). Inoltre, questo metodo ha dimostrato che la consegna LCNP-mediata della DIO modula in modo sostanziale e spinge il tasso di specifica partizionamento del colorante nel doppio strato membrana plasmatica lipofila. questo è raggiunto mentre contemporaneamente riducendo la citotossicità del farmaco libero da ~ 40% consegnandola come una formulazione LCNP. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Si prevede che la metodologia qui descritta sarà una potente tecnica che consente ai ricercatori il cui lavoro comporta o richiede la consegna cellulare di carichi altamente idrofobici che sono poco solubili o insolubili completamente in soluzione acquosa.

<table><tbody><tr><td>1-etil-3-(3-(dimetilammino)-propil)carbodiimmide cloridrato (EDCA)</td><td>ThermoFisher</td><td>E2247</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-dioctadecyloxacarbocianina perclorato (DiO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292-20MG</td><td>Pericoloso; fare la soluzione madre in DMSO</td></tr><tr><td>Colesterolo poli(glicole etilenico) ammina cloridrato</td><td>Nanocs, Inc.</td><td>PG2-AMCS-2k</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Countess</td><td>ThermoFisher</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Dioctadecyl-3,3,3&prime; &#8288;,3&prime;-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Pericoloso; fare la soluzione madre in DMSO</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Caldo in 37 &deg; C prima</td></tr><tr><td>dell'uso Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14040182</td><td>Warm in 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Strumento di diffusione dinamica della luce</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Regno Unito)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteina Bovina, Plasma</td><td>ThermoFisher</td><td>33010018</td><td>Preparare la soluzione madre 1 mg/ml utilizzando DPBS. Utilizzare 20-30 &micro; g/ml per il rivestimento di piatti MetTek, 2 ore a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Formaldeide (16%, W/V)</td><td>ThermoFisher</td><td>28906</td><td>Pericoloso; diluire al 4% utilizzando DPBS</td></tr><tr><td>Cellule renali embrionali umane (HEK 293T/17)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC&reg; CRL-11268&commercio;</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per l'imaging di cellule vive (LCIS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>Warm in 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert piatto per coltura cellulare</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 25 mM</td><td>HEPES ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Warm in 37 &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>N-idrossisulfosuccinimide sale sodico (NHSS)</td><td>ThermoFisher</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1si microscopio confocale spettrale</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>miscelare al 50% alla sospensione cellulare prima di contare le cellule</td></tr><tr><td>Strumento di potenziale</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Regno Unito)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Processore a ultrasuoni</td><td>Sonics and Materials Inc</td><td>GEX 600-5</td><td></td></tr><tr><td>Mini Cetntrifuge</td><td>Benchmark</td><td>Mini-fuge-04477</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Sephadex&commercio; G-25 Medium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc XRS Sistema di imaging</td><td>Bio-RAD</td><td>76S/07434</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle carrier liquid

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

L&#39;erogazione controllata di agenti droga / imaging per cellule è critico per lo sviluppo di terapie e per lo studio dei processi di segnalazione cellulare. Recentemente, le nanoparticelle (NP) hanno mostrato significativa promessa per lo sviluppo di tali sistemi di consegna. Qui, un cristallo liquido NP (LCNP) sistema di erogazione sede è stato impiegato per l&#39;erogazione controllata di un colorante insolubile in acqua, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), all&#39;interno del nucleo NP alla regione idrofobica di un plasma doppio strato di membrana. Durante la sintesi delle nanoparticelle, il colorante è stato efficacemente incorporato nel nucleo LCNP idrofobico, come confermato da analisi spettroscopica multiple. Coniugazione di un colesterolo derivato PEGylated alla superficie NP (Dio-LCNP-PEG-Chol) ha consentito il legame delle NP dye-caricato alla membrana plasmatica in HEK 293T / 17 cellule. Risolta in tempo scansione laser confocale microscopia e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) di imaging ha confermato il passaggioive efflusso di DiO dal nucleo LCNP e il suo inserimento nel doppio strato membrana plasmatica. Infine, la consegna della DIO come LCNP-PEG-Chol attenuato la citotossicità della DIO; la forma NP della DIO esposto ~ 30-40% in meno tossicità rispetto al DiO gratuito consegnato dalla soluzione di massa. Questo approccio dimostra l&#39;utilità della piattaforma LCNP come una modalità efficace per la fornitura specifica membrana e modulazione dei carichi molecolari idrofobiche.

LCNPs sono stati preparati in cui il nucleo idrofobico del NP è stato caricato con una sonda membrana etichettatura rappresentante per dimostrare l&#39;utilità del LCNP come veicolo consegna efficiente per carichi idrofobiche. A questo scopo, il carico scelto è stato il potenziometrica colorante membrana etichettatura altamente insolubile in acqua, DiO. LCNPs DiO-caricati (DIO-LCNPs) sono stati sintetizzati utilizzando una tecnica mini-emulsione a due fasi con i componenti chimici DACTP11, AC10COONa e DiO, come mostrato...

Un cristallo liquido nanoparticella (LCNP) nanocarrier viene sfruttato come veicolo per l&#39;erogazione controllata di un carico idrofoba sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.

Targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo Cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle Carrier Liquid

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è utilizzare una nanoparticella a base di cristalli liquidi come piattaforma di somministrazione per il rilascio controllato di un di-carico idrofobo alla porzione lipofilica della membrana plasmatica di cellule mammifere vive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della somministrazione di farmaci, come ad esempio come consentire in modo efficiente il rilascio e l'assorbimento cellulare di carichi idrofobi scarsamente solubili in acqua. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette una somministrazione più specifica di carichi idrofobi mirati alla membrana, direttamente alla membrana plasmatica, riducendone al contempo la citotossicità.La procedura sarà dimostrata dal dottor Okhil Nag, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Iniziare questa procedura preparando il nanoparticella di cristallo liquido DiO come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di soluzione lavorativa appena preparata di NHSS/EDC a 1,0 millilitro della nanoparticella di cristallo liquido DiO in tampone HEPES.E agitare per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di una soluzione madre di colesterolo PEG ammina a questa miscela e agitare per due ore. Dopo due ore, centrifugare brevemente il miscuglio di reazione alla velocità massima per 30 secondi utilizzando una mini centrifuga da banco.Quindi far passare il sopranatante attraverso una colonna di cromatografia a esclusione molecolare PD 10 equilibrata con soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco. Per confermare la coniugazione covalente riuscita del colesterolo PEG alla superficie delle nanoparticelle di cristallo liquido DiO mediante elettroforesi su gel, preparare un gel di agarosio come descritto nel protocollo testuale. Una volta che il gel si è solidificato, aggiungere una quantità sufficiente di tampone di corsa TBE per immergere completamente il gel nella camera.Quindi, aggiungere 35 microlitri del campione di nanoparticelle cristalline liquide DiO alle pozzette del gel ed eseguire l'elettroforesi per 20 minuti a una tensione di 110 volt. Acquisire l'immagine del gel utilizzando un sistema di imaging per gel con un filtro di eccitazione a 488 nanometri e filtri di emissione compresi tra 500 e 550 nanometri. Preparare piastre per colture cellulari con diametro di 35 millimetri, dotate di inserti in vetrino numero uno di 14 millimetri, rivestendole con fibronectina bovina in DPBS per due ore a 37 gradi Celsius.Dopo due ore, rimuovere la soluzione di rivestimento con fibronectina dalla piastra di coltura. Raccogliere le cellule HEK 293 T17 dalla fiasca T25 lavando prima il monostrato cellulare con tre millilitri di DPBS, quindi aggiungendo due millilitri di tripsina EDTA. Incubare la fiasca a 37 gradi Celsius per circa tre minuti.Una volta che le cellule si sono staccate dalla fiasca, neutralizzare la tripsina aggiungendo quattro millilitri di mezzo completo alla fiasca. Determinare la concentrazione cellulare nella sospensione contando le cellule con un contatore cellulare. Quindi regolare la concentrazione cellulare a circa 80.000 cellule per millilitro con mezzo di crescita.Aggiungere tre millilitri della sospensione cellulare alla piastra e coltivare durante la notte nell'incubatore. Il giorno successivo, le cellule dovrebbero raggiungere una confluenza di circa il 70 percento ed essere pronte per l'uso. Una densità cellulare adeguata è fondamentale per un'etichettatura robusta ed efficiente di un'alta percentuale di cellule.Preparare soluzioni da un millilitro di DiO, nanoparticelle di cristallo liquido DiO e nanoparticelle di cristallo liquido DiO PEG colesterolo nel mezzo di somministrazione diluendo le rispettive soluzioni madri. Rimuovere il mezzo di crescita dalle piastre di coltura utilizzando una pipetta serologica e lavare i monociti cellulari due volte con HEPES DMEM. Eseguire i lavaggi aggiungendo delicatamente con una pipetta l'HEPES DMEM lungo il bordo delle piastre e quindi rimuovendolo.Aggiungere 0,2 millilitri delle soluzioni preparate di DiO libero o di nanoparticelle cristalline liquide di DiO al centro delle piastre di coltura. Successivamente, reinserire le piastre nell'incubatore per un periodo di tempo appropriato. Tempi di incubazione più lunghi portano a un'etichettatura cellulare non specifica di aree non membranose.Trascorso il periodo di incubazione, rimuovere le soluzioni di somministrazione utilizzando una pipetta sierologica. Lavare i monociti cellulari due volte con DPBS utilizzando due millilitri per ogni lavaggio. Fissare i monociti cellulari utilizzando paraformaldeide al quattro percento per 15 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere la soluzione di paraformaldeide utilizzando una pipetta e lavare delicatamente le cellule una volta con due millilitri di DPBS. A questo punto, le cellule fissate sono pronte per essere analizzate alla ricerca di un segnale fluorescente membranoso, mediante microscopia confocale a scansione laser. Su un palco del microscopio dotato di una camera di incubazione riscaldata, acquisire l'immagine del campione di cellule vive utilizzando un microscopio confocale per valutare l'etichettatura della membrana.Se l'acquisizione delle immagini non viene eseguita immediatamente, sostituire il mezzo con DPBS contenente lo 0,05 percento di azide di sodio e conservare le piastre a quattro gradi Celsius. In questo metodo, le cellule vengono marcate contemporaneamente con DiO come donatore FRET e con DiI come accettore FRET. Etichettare le cellule in sequenza con nanoparticelle cristalline liquide di DiO, PEG colesterolo e con DiI libero come in precedenza.Dopo la colorazione, lavare le cellule una volta con due millilitri di DPBS utilizzando una pipetta serologica e sostituire con due millilitri di soluzione per l'immagine delle cellule vive. Su un microscopio dotato di camera di incubazione riscaldata, acquisire l'immagine del campione di cellule vive mediante un microscopio confocale con imaging FRET. Impostare l'esperimento con intervalli di 30 minuti per un periodo di quattro ore, eccitando il donatore DiO a 488 nanometri e raccogliendo gli spettri di emissione completi sia del donatore DiO che dell'accettore DiI da 490 a 700 nanometri, mediante un rilevatore spettrale a 32 canali.Quindi, determinare l'intensità di emissione risolta nel tempo sia del donatore DiO che dell'accettore DiI da cellule colorate con nanoparticelle lipidiche liquide DiO-PEG colesterolo e DiI. Infine, calcolare il rapporto FRET tempo-risolto accettore-donatore per le immagini come descritto nel protocollo testuale. Il DiO libero si accumula in modo non specifico all'interno della cellula, piuttosto che nelle membrane plasmatiche delle cellule che sono state controcolorate con un fosfolipide di membrana marcato con Dil.Questo può essere visualizzato con le immagini sovrapposte. Al contrario, il nanoparticella di cristallo liquido DiO con colesterolo PEG etichetta specificamente solo la membrana plasmatica della cellula, come mostrato dalla colocalizzazione con il fosfolipide di membrana marcato con dil. Il FRET conferma il partizionamento del DiO dalla nanoparticella di cristallo liquido nel doppio strato lipidico della membrana, attraverso un aumento osservato nel trasferimento di energia dal donatore DiO all'accettore DiI.Il trasferimento di energia per risonanza (FRET) tra DiO e DiI, così come le variazioni di emissione di DiO e DiI, confermano un aumento del FRET da DiO a DiI in funzione del tempo. Le nanoparticelle di cristallo liquido DiO contenenti PEG colesterolo mostrano una citotossicità minima con una vitalità del 90 percento, rispetto a una tossicità significativa di DiO libero con una vitalità di circa il 50 percento. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare nanoparticelle di cristallo liquido caricate con un cargo, biofunzionalizzarle per il targeting cellulare e ottenere immagini delle cellule caricate per verificare un efficace rilascio cellulare.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà poiché il rilascio specifico del DiO dalla soluzione acquosa alla membrana plasmatica rappresenta una sfida significativa. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo dopo aver utilizzato la piattaforma di nanoparticelle a cristalli liquidi per il rilascio cellulare del farmaco antitumorale doxorubicina, osservandone la capacità di modulare la cinetica di assorbimento cellulare del farmaco. Seguendo questa procedura, questo approccio può essere applicato al rilascio cellulare di una vasta gamma di carichi idrofobi che presentano una particolare difficoltà per quanto riguarda il loro rilascio alle cellule da mezzi acquosi.Questo approccio può essere utilizzato per ottenere una somministrazione più efficiente di farmaci mirati alla membrana e di molecole bioattive, come coloranti sensibili al voltaggio per l'immagine del cervello o farmaci fotodinamici per la terapia farmacologica assistita da fotoni.

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