Name: 전의 VIVO 방법 배양 된 쥐 장간막 미세 혈관 네트워크의 타임 랩스 영상에 대한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 배우세요 쥐 장간막 배양 모델을 활용한 혈관신생 연구 방법을 실시간 타임랩스 영상으로 미세혈관 네트워크 재형성 과정을 관찰하고 항혈관신생 약물 효과를 평가하는 기술입니다.

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이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 5-P20GM103629 to WLM과 Tulane Center for Aging의 지원을 받았습니다. 프로토콜 텍스트 편집에 도움을 주신 Matthew Nice에게 감사드립니다.

모든 동물 실험 및 절차는 튤 레인 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 수술 절차 설정 <ol><li> 오토 클레이브 기기, 수술 소모품 및 수술 이전에 문화 용품. 각각의 쥐에 대한 외과 용품은 다음과 같습니다 : 1 드레이프, 사전 절단 구멍 1 드레이프 (0.5 X 1.5) 중앙에, 거즈 패드, 1 흡수 underpad. 수술 도구는 다음과 같습니다 숫자 10 블레이드 1 메스, 핀셋 2 쌍, 미세 가위를. 1 드레이프, 핀셋 1 쌍, 폴리 카보네이트 필터를 6 웰 플레이트 삽입을 준비 : 문화 용품 등이 있습니다. </li><li> 플렉시 글라스 플랫폼 외과 단, 70 % 에탄올 외과 탁상 공간 소독. 멸균 그릇에 사용할 때까지 수술 단계를 유지합니다. <ol><li> 100 밀리미터 배양 접시의 중앙에 구멍에서 1 약 2 드릴링하여 수술 단계를 만듭니다. 다음, 부드럽게 사포를 사용어떤 날카로운 모서리 및 조직에 대한 제기 표면을 생성하기 위해 구멍의 가장자리에 실리콘 접착제의 레이어를 추가합니다. </li><li> 대안 적으로, CAD 소프트웨어를 사용하여 수술 단계를 설계 및 3-D 인쇄 (도 1)로 만든다. </li></ol></li><li> 아래로 멸균 흡수 underpad를 놓고 그 위에 플렉시 글라스 플랫폼을 배치합니다. 흡수성 underpad 옆에 가열 패드에, 미리 잘라 구멍없이 드레이프를 놓습니다. </li><li> 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 사전 따뜻한 매체 및 37 ℃로 식염수. 다음 수술 설치에 50 ML 원뿔 튜브 가열 패드와 장소 식염수 꼭대기 별도의 배양 접시에 장소 미디어와 PBS. </li><li> 모든 패키지는 모든 재료의 멸균 처리를 보장하기 위해 수술의 시작 이전에 개방되어 있는지 확인합니다. 이 절차에 사용되는 일반적인 도구의 전체 목록이 나열되어 특정 외과 재료 및 도구의 표. </li></ol> 2. Mesentery를 조직 수확 <ol><li> 사용 성인 남성의 Wistar 쥐 (350 ± 25g 6 - 생후 8 주). 다른 균주와 쥐의 나이는 대체 할 수 있습니다. </li><li> 케타민 (80 ㎎ / ㎏ 체중)과 자일 라진 (8 ㎎ / ㎏ 체중)의 근육 내 주사를 통해 쥐를 마취. 쥐가 반사 응답을 확인하기 위해 발가락 사이에 집어 마취하에 확인; 아무도이 없어야합니다. 이 단말기 절차에 대한 선제 진통제는 필요하지 않습니다. </li><li> 복부를 면도와 제모 크림을 사용하여 나머지 머리를 제거합니다. 포비돈 - 요오드 다음 70 % 이소 프로필 알코올로 두 번 복부 피부를 닦아주십시오. 와이프를 들어 외과 수술 부위의 중심에서 시작해야하며, 이전에 멸균 거즈 또는 멸균 면봉 동일한 조각으로 세정 된 영역이 겹치지로서 원형 방식으로 제조 된 영역의 외부로 이동한다. 그런 다음 무균 수술 설정에 동물을 전송하고 플렉시 글라스 작은지면 위에 배치형태. </li><li> 흉골 아래에서 일을 시작 장내에서 1.25 절개에 - 메스 블레이드를 사용하여, 0.75에서합니다. 창자 또는 장간막 (피부 1 층, 결합 조직의 1 층 및 근육의 1 층)에 구멍 않도록주의하십시오. </li><li> 절개를 통해 사전 컷 구멍이있는 드레이프를 놓고 드레이프 위에 무균 수술 단계를 배치합니다. 절개와 열 정렬합니다 확인하십시오. 찾아 수술 단계의 개구부를 통해 회장을 끌어 멸균 면봉 어플리케이터를 사용합니다. </li><li> 면봉 어플리케이터를 사용하여 스테이지를 통해 8 장간막 창 및 창 (그림 1)을 만지지 않도록주의 - 6 당깁니다. 조직은 일반적으로 맹장 근처부터 소장 회장 영역으로부터 수확된다. 솔루션을 물방울에 멸균 주사기를 사용하여 필요에 따라 가온 멸균 생리 식염수와 습기에 노출 조직을 유지합니다. </li><li> 펜토 바르 비탈 나트륨의 심장 내 주사를 통해 쥐 (쥐 당 0.2 ml)에 안락사. 저를 제거하기 전에senteric 창, 쥐가 마음을 palpating에 의해 안락사되어 있는지 확인합니다; 맥박이 없어야합니다. </li><li> 창을 절단하는 지방 패드 및 미세 가위를 잡기 위해 핀셋을 사용하여 원하는 장간막 조직을 제거합니다. 창 주위에 지방 (2mm)의 테두리를 남겨주세요. 미디어에 한 번 따뜻하게 멸균 PBS에 한 번 조직을 씻으십시오. </li><li> 복강에 표면화 회장을 돌아 제도적 지침에 따라 동물 폐기하십시오. </li></ol> 타임 랩스 연구 3. 장간막 조직 문화 <ol><li> 멸균 층류 후드로 전송 멸균 문화 용품 (1.1 절 참조) 조직. </li><li> 폴리 카보네이트 필터 멤브레인 위에 각 조직을 전송하는 핀셋을 사용합니다. 지방 패드로 잡아 조직은 혈관의 손상을 방지합니다. </li><li> 빠르게 창을 만지지 않도록 조심하면서, 지방 패드를 사용하여 조직을 확산. 6 웰 플레이트의 바닥에 티슈로 삽입 전환과 미디어의 3 ㎖ (그림 1 커버 </st룽&gt;). 이 절차에 사용되는 일반 용지 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 (PenStrep) 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 가진 최소 필수 매체 (MEM)를 포함한다. 미디어 혈관 형성을 자극하는 다른 혈청 및 / 또는 성장 인자를 보충 할 수있다. </li><li> 최대 5 일 동안 표준 보육 환경의 각 조직과 문화 (5 % CO 2, 37 ° C) 3.3 - 반복 3.2 단계를 반복합니다. </li></ol> 장간막 조직 4. 타임 랩스 영상 <ol><li> 촬상 당일 공액 BSI 렉틴과 각 웰에 용지를 보충하고, 30 분 동안 표준 배양 조건 하에서 배양한다. 렉틴이없는 미디어로 두 번 조직을 씻으십시오. BSI-렉틴의 얼룩은 문화에서 최대 3 일 동안 장간막 조직에 계속 표시됩니다. </li><li> 현미경 스테이지에 접시를 전송합니다. 자신의 형태와 네트워크 구조를 기반으로 혈액과 림프 혈관을 확인합니다. </li><li> 각 조직에서 원하는 네트워크 영역을 찾아 이미지를 가져 가라. 이미징에주의하십시오같은 지역을 보장하기 위해 위치 이후의 이미지 캡처됩니다. 전동 무대를 사용하는 경우, 좌표를 문서화합니다. </li><li> 인큐베이터에 조직을 돌려 원하는 끝 지점까지 문화를 계속합니다. 반복 4.1 단계 - 4.3 원하는 실험 시점에 따라 필요. </li></ol> 5. 조직 Immunolabeling <ol><li> BSI-렉틴 라벨 <ol><li> 미디어 두 린스 다음 미디어 1시 40분 FITC - 복합 렉틴 (6 웰 플레이트에 웰 당 2.5 mL의 항체 용액) 37 ° C에서 30 분 동안 조직을 품어. 린스를 들어, 미디어를 추가 한 다음 즉시 교체하십시오. </li></ol></li><li> 라이브 / 죽은 라벨링 <ol><li> 1 37 ° C에서 10 분 동안 조직을 품어 : 500 2 MM의 에티 디움 호모 다이머-1 및 1 : 미디어 두 린스 다음 미디어 500 1 ㎜의 칼 세인의 AM (6 웰 플레이트에 웰 당 2.5 mL의 항체 용액). </li></ol></li><li> BSI-렉틴 / NG2 라벨 <ol><li> 현미경에 확산 조직 하락전자 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다. </li><li> -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오. </li><li> 100 토끼 폴리 클로 날 항체 NG2 5 % 정상 염소 혈청 (NGS) 일차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직을 배양한다. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오. </li><li> 이차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : 100 염소 항 - 토끼 항체 CY2 공역 (GAR-CY2) 5 %를 NGS. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오. </li><li> PBS로 두 린스 다음 PBS에서 1시 40분 FITC - 복합 렉틴과 실온에서 30 분 동안 조직을 품어. 린스를 들어, PBS를 추가 한 다음 즉시 교체하십시오. </li><li> 슬라이드를 마운트하려면, 위에 50:50 PBS와 조직과 글리세롤 솔루션 및 장소 coverslip에 커버. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다. </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAM 라벨<ol><li> 현미경 슬라이드에 조직을 확산 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다. </li><li> -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오. </li><li> 200 마우스 모노클 비오틴 CD31 항체와 1 : 일차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 (100) 토끼 폴리 클로 날 LYVE-1 항체를 PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) + 5 % NGS . PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오. </li><li> 500 CY3 접합 스트렙 타비 딘 항체 및 1 : PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100-GAR CY2 차 항체의 표지의 경우, 1 일 실온에서 시간 동안 조직을 배양한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오. </li><li> 50:50 PBS와 글리세롤 솔루션 슬라이드, 커버 조직을 탑재하고 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다. </li></ol></li><li> BrdU의 / BSI-렉틴 라벨링 <ol><li> 미디어에 1 ㎎ / ㎖ BrdU의 추가 및 BrdU의 솔루션으로 조직 미디어를 교체합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 품어. </li><li> 현미경 슬라이드에 조직을 확산 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다. </li><li> -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오. </li><li> 37 ° C에서 1 시간 동안 2 M 염산으로 조직 DNA 변성. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)에 조직을 씻으십시오. </li><li> PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100 모노클로 날 마우스 항 BrdU의 : 차 항체의 표지의 경우, (1)과 실온에서 1 시간 동안 조직을 배양한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오. </li><li> 이차 항체 라벨링 1 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : 100 염소 항 - 마우스 Cy3가 접합 된 항체를 PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS의 (GAM-Cy3에 참조). PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오. </li><l난&gt; PBS로 두 린스 다음 PBS에서 1시 40분 FITC - 복합 렉틴과 실온에서 30 분 동안 조직을 품어. </li><li> 상단에 슬라이드, 커버 조직 50:50 PBS와 글리세롤 솔루션 및 장소 coverslip에 마운트합니다. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다. </li></ol></li><li> BSI-렉틴 / CD11b를 라벨링 <ol><li> 현미경 슬라이드에 조직을 확산 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다. </li><li> -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오. </li><li> 일차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100 마우스 항 래트는 CD11b. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오. </li><li> 이차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100 GAM-Cy3에. PBS로 조직을 씻으십시오+ 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분). </li><li> PBS로 두 린스 다음 PBS에서 1시 40분 FITC - 복합 렉틴과 실온에서 30 분 동안 조직을 품어. </li><li> 상단에 슬라이드, 커버 조직 50:50 PBS와 글리세롤 솔루션 및 장소 coverslip에 마운트합니다. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 미세 혈관 망 성장 저속 촬상 용 생체 도구 래트 장간막 배양 모델을 사용하는 방법을 설명합니다. 우리 실험실에서 이전 작업은 1 우리의 모델) 혈관 신생 (8), 2) 림프관 8, 3) 주연 세포 - 내피 세포 상호 작용 8, 4) 항 혈관 약물 검사 (9)의 사용을 설립했다. 여러 시점에서 배양 된 쥐 장간막 조직을 이미징 능력은 조직 - 특이 적 성장 반응과 여러 가지 혈관 신생 자극 중에 세포 - 세포 상호 작용의 추적을 평가하기위한 정량적 인 분석을 제공한다. 혈관 신생 동안에 내피 세포의 증가 된 증식 및 혈관 주위 세포의 존재는 이전 연구와 일치 8 배양 래트 장간막 조직에서 혈관 신생 동안 여러 종류의 세포들 사이의 동적 상호 작용을 확인. <p c성장은 그대로, ...

미세 혈관 망의 성장 및 리모델링 조직 기능의 공통 분모, 상처 치유, 및 여러 병리이며 주요 공정은 기존의 1, 2에서 새로운 혈관의 성장으로 정의 혈관이다. 새로운 혈관을 엔지니어링 또는 혈관 신생에 관여하는 세포 역학의 중요성을 이해 혈관 기초 요법을 설계 조직 중요하다. 그러나이 프로세스는 복잡하다. 이것은 미세 혈관 망의 특정 위치에서 변화 여러 종류의 세포 (즉, 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 대식 세포, 줄기 세포) 및 여러 시스템 (림프 네트워크, 신경 네트워크)을 포함 할 수있다. 시험관 내 혈관 신생 모델 (3)에 관련된 다른 셀들 간의 관계를 검사에 엄청난 공헌하지만, 생리 학적 관련성 파묻혀 인해 훼손 될 수있다<html> 제한된 복잡하고 밀접 생체 시나리오를 반영하지 않는다는 사실을 r에. 이러한 한계의 3 차원 배양 시스템을 극복하기 위해 3, 생체 조직의 모델 (4), 마이크로 유체 시스템의 5, 6, 최근 개발되어 소개되었다 7 계산 모델. 그러나, 미세 혈관 손상 네트워크 생체의 혈관 신생을 조사하는 저속 기능이 모델에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 복잡성의 수준과 혈관 신생 연구를위한 새로운 시간 경과 모델의 설립은 혈관 신생을 조절하는 기본 메커니즘을 이해하는 귀중한 도구를 제공하고 치료법을 개선 할 수 있습니다. 손상되지 않은 미세 혈관 네트워크를 통해 혈관 신생의 생체 조사를 가능하게하는 잠재적 인 모델은 쥐 장간막 문화 모델&gt; 8. 최근 연구에서, 우리는 혈액과 림프 미세 혈관 네트워크는 문화 후 가능한 남아 있음을 증명하고있다. 더 중요한 것은, 래트 장간막 배양 모델은 기능적 주연 세포 - 내피 세포 상호 작용, 혈액 및 림프관 내피 세포 연결, 저속 촬상을 조사하는데 사용될 수있다. 본 연구의 목적은 시간 경과 영상 법을위한 우리의 프로토콜을 제공하는 것이다. 우리의 대표적인 결과는 혈청과 혈관의 자극 후 생존을 유지하고 조직 특이 적 혈관 반응뿐만 아니라 내피 세포 추적 연구를 정량화이 방법을 사용 예제를 제공하는 여러 세포 유형을 문서화합니다.

<table><tbody><tr><td>드레이프</td><td>카디널 헬스</td><td>4012</td><td>12 "x 12" Bio-Shield 정기 살균 랩</td></tr><tr><td>메스 핸들</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-9843</td><td>메스 핸들, #3; 고체; 4" 길이</td></tr><tr><td>멸균 수술용 칼날</td><td>신시내티 외과</td><td>0110</td><td>스테인리스 스틸; 크기 10</td></tr><tr><td>배양 접시 (60mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>130181 10 / 슬리브</td></tr><tr><td>Graefe 집게 (곡선 핀셋)</td><td>Roboz 수술</td>기구 <td>RS-5135</td><td>마이크로 해부 집게; 톱니 모양의; 약간의 곡선; 0.8mm 팁 너비; 4" 길이</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (직선 핀셋)</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-5130</td><td>마이크로 해부 집게; 톱니 모양, 직선; 0.8mm 팁 너비; 4 "길이</td></tr><tr><td>Noyes 마이크로 가위</td><td>Roboz 수술</td>기구 <td>RS-5677</td><td>Noyes 마이크로 해부 스프링 가위; 곧고 날카롭고 뭉툭한 점; 13mm 절삭날; 0.25 mm 팁 너비, 4 1/2" 전체 길이</td></tr><tr><td>거즈 패드</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>비멸균 면 거즈 스폰지; 4" x 4" 12-Ply</td></tr><tr><td>면-팁 애플리케이터</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6" 길이; 나무로 되는 갱구; 일회용으로만</td></tr><tr><td>사용 가능한 6-웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>저증발 뚜껑이 있는 평평한 바닥; 폴리스 티 렌; 비발열성</td></tr><tr><td>멸균 주사기 5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok 팁</td></tr><tr><td>멸균 그릇</td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32온스 필 파우치; 파랑; 멸균 일회용</td></tr><tr><td>6웰 플레이트 인서트(CellCrown 인서트)</td><td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>6웰 플레이트 인서트; 비멸균</td></tr><tr><td>폴리카보네이트 필터 멤브레인</td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Isopore 멤브레인 필터; 폴 리 탄산염; 친수성; 5.0&nbsp; &마이크로; 남, 47&nbsp; mm, White Plain</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (MWI Veterinary Supply에서 주문)</td><td>MWI #: 011168</td><td>활성 성분: 100 mL당, 390 mg 펜토바르비탈 나트륨, 50 mg 페니토인 나트륨&nbsp;</td></tr><tr><td>케타민</td><td>포트 닷지 동물 건강 (MWI 수의학 공급에서 주문)</td><td>MWI # : 000680</td><td>Kateset 100 mg / mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (MWI 수의학 공급에서 주문)</td><td>MWI # : 000680</td><td>Anased 100 mg / mL</td></tr><tr><td>식염수</td><td>박스터</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>사포닌&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드</td><td>피연산자</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC-접합 Lectin</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 항체</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 항체</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy3-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 세럼&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2'-Deoxyuridine</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>단클론 마우스 항-브로모데옥시우리딘&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 클론 Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-랫 CD11b&nbsp;</td><td>AbD 세로텍</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; 전의 vivo</em&gt; 방법 배양 된 쥐 장간막 미세 혈관 네트워크의 타임 랩스 영상에 대한

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

혈관 신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장과 같이 정의, 내피 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 면역 세포 및 림프관 및 신경과 조정을 포함한다. 멀티 셀, 멀티 시스템의 상호 작용은 생리 학적으로 관련 환경에서 혈관 신생의 조사를 필요로한다. 시험관 내 세포 배양 모델의 사용은 기계적인 통계를 제공 한 상태 즉, 일반적인 비판은 미세 혈관 네트워크와 연관된 복잡성 요점을 되풀이하지 않는다는 것이다. 이 프로토콜의 목적은 전 배양 된 쥐 장간막 조직에서 혈관 신생을 자극 한 후 그대로 미세 혈관 망의 경과 비교를 할 수있는 능력을 입증하는 것이다. 배양 된 조직은 계층 구조를 유지하는 미세 혈관 네트워크를 포함한다. 면역 표지 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 혈관과 림프관의 존재를 확인한다. 안에ddition는 BSI-렉틴과 조직을 라벨은 이전과 증가 된 모세 혈관의 발아 및 혈관 밀도를 특징으로 혈청 성장 인자의 자극 후 로컬 네트워크 영역의 시간 경과 비교를 할 수 있습니다. 일반적인 세포 배양 모델에 비해,이 방법은 생리 학적으로 관련 미세 혈관 내피 세포 네트워크의 계통 연구 및 조직 특이 적 혈관 형성 약물 평가하는 툴을 제공한다.

문화 3 일 후, 조직은 쥐 장간막 문화 모델 (그림 2A)의 미세 혈관의 가능성을 입증하는 라이브 / 죽은 생존 / 세포 독성 키트와 함께 표시 하였다. 장간막에 존재하는 세포의 대부분은 미세 혈관 내피 세포에서 세그먼트의 위치에 기초하여 식별 된 배양 가능한 남았다. 내피 세포의 증식은 렉틴 / BrdU의 라벨링 (도 2D)에 의하여 확인 하였다. 따라서 혈관 평활근 세포와 주연 세포 존재 NG2 라벨링 (도 2B)로 확인되었다. LYVE1 및 PECAM에 대한 라벨링은 림프 및 혈액 미세 혈관 네트워크를 분기 파악하고 혈액 내피 세포 표현형 (그림 2C) 대 림프 유지 확인했다. 이 모델의 시간 경과 기능은 microv...

혈관 형성은 생리학적으로 관련된 환경에서 조사해야 하는 다세포, 다중 시스템 상호 작용을 포함합니다. 이 연구의 목적은 혈관 형성 중 온전한 미세혈관 네트워크의 타임 랩스 비교를 수행하는 쥐 장간막 배양 모델의 능력을 입증하는 것입니다.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 방법 배양 된 쥐 장간막 미세 혈관 네트워크의 타임 랩스 영상에 대한

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

본 실험의 전반적인 목표는 기생충과 내피세포의 상호작용, 혈관-림프관 내피세포 연결 또는 항혈관신생 약물의 효과를 평가하기 위해, 엑스 비보(ex vivo) 미세혈관 네트워크 리모델링을 타임랩스로 조사하는 쥐 장간막 배양 모델의 활용법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 미세혈관이 어디로 성장해야 하는지를 어떻게 인지하는지, 그리고 내피세포 분절의 운명은 어떻게 되는지를 포함하여 미세혈관 리모델링 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실제 온전한 미세혈관 네트워크를 엑스 비보 성장 전후로 이미지화할 수 있다는 점입니다.해당 방법을 개발한 저희 실험실의 대학원생 Sadegh Azimi가 절차를 시연하겠습니다. 먼저 멸균 흡수 패드 위에 에탄올로 멸균한 플렉시글래스 플랫폼을 놓고, 그 위에 마취된 성체 수컷 랫드를 올립니다. 70% isopropyl alcohol 솜 두 개로 랫드의 제모된 복부 영역을 소독한 후, povidone-iodine으로 소독합니다.흉골 아래 1인치 지점에서 시작하여, 메스를 사용하여 피부, 결합 조직 및 근육을 통해 장 부위에 0.75~1.25인치 길이의 절개를 가합니다. 그런 다음, 미리 구멍이 뚫린 드레이프를 동물 위에 덮고 드레이프 위에 수술용 스테이지를 배치하며, 두 재료의 개구부가 절개 부위와 일치하도록 주의합니다. 멸균된 면봉을 사용하여 6~8개의 장간막 창과 함께 회장을 수술용 스테이지 개구부를 통해 끌어냅니다.멸균 주사기를 사용하여 필요에 따라 노출된 조직에 37 °C의 멸균 생리식염수를 떨어뜨립니다. 모든 윈도우(window)가 외부로 노출되면, 핀셋으로 지방 패드를 잡고 가위를 사용하여 각 장간막 조직 주변에 2 mm의 지방 경계를 남긴 채 윈도우를 채취합니다. 이때 핀셋이 주변 지방 경계만을 잡도록 하여 장간막 윈도우에 닿지 않도록 주의하십시오.각 윈도우를 37 °C PBS로 한 번, 그리고 수집된 37 °C 배지로 한 번 세척합니다. 모든 윈도우가 분리된 후 회장을 복강으로 되돌려 놓습니다. 멸균 라미나 플로우 후드 내에서 핀셋을 사용하여 각 장간막 조직을 지방 경계 부위로 잡아 세포 배양 플레이트 인서트의 폴리카보네이트 필터 막 위로 옮깁니다.지방패드를 사용하여 조직 샘플을 빠르게 펼치되, 윈도우 부분을 건드리지 않도록 주의하십시오. 그런 다음, 인서트를 뒤집어 6-웰 플레이트의 한 웰에 넣어 조직이 웰 바닥에 평평하게 놓이도록 합니다. 조직이 3mm 두께의 배지로 덮이도록 붓고, 나머지 윈도우들도 동일한 방식으로 플레이트로 옮깁니다.그런 다음, 표준 조직 배양 인큐베이터 조건에서 장간막 윈도우를 최대 5일 동안 배양합니다. 이미징 당일에 접합된 BSI lectin을 배양액에 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 30분 후, lectin이 포함되지 않은 배지로 샘플을 2회 세척하고 플레이트를 형광 현미경 스테이지로 옮깁니다.형태와 네트워크 구조를 기반으로 혈관 및 림프관을 식별하십시오. 그 다음, 각 조직에서 이미지를 얻기 위한 네트워크 관심 영역을 설정하고, 이후의 이미지 촬영 시 동일한 영역이 캡처될 수 있도록 위치를 기록하십시오. 모든 이미지 획득이 완료되면, 다음 이미지 촬영 세션 또는 적절한 실험 종료 시점까지 샘플을 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오.3일간의 배양 후, 장간막에 존재하는 대부분의 세포는 생존해 있으며, 미세혈관 분절 내의 위치를 통해 내피세포의 존재가 확인됩니다. 내피세포의 증식은 lectin/BrdU 표지로 확인할 수 있으며, 혈관을 따라 분포하는 평활근 세포와 기생충의 존재는 NG2 표지로 확인할 수 있습니다. 분지된 림프관 및 혈액 미세혈관 네트워크 표지를 통해 배양된 조직 내에서 림프관 세포 표현형이 유지됨을 추가로 확인할 수 있습니다.장간막 윈도우 조직 배양 배지에 10% serum을 추가하여 3일간 보충하면 강력한 혈관 형성 반응이 유도되며, 자극 후 5일이 지나면 새로운 혈관 분절과 모세혈관 싹이 확인됩니다. 타임랩스 이미징을 통해 조직당 하나의 4배율 이미지로부터 혈관 영역당 혈관 수와 혈관 영역당 모세혈관 싹의 수를 정량화할 수 있습니다. 또한 네트워크 영역의 타임랩스 비교를 통해 혈관 내피세포 분절을 추적하고 혈관 및 림프관의 패턴 형성 오류를 식별할 수 있습니다.또한, 렉틴(lectin)과 Cd11b 표지는 리모델링 네트워크 내의 간질성 상주 대식세포의 존재를 추가적으로 확인해 줍니다. 숙련된다면, 이 기술은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 쥐의 장간막 조직을 채취하고, 배양하며, 타임랩스 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

엑기스의 관찰을위한 새로운 다양한 방법을 제시합니다. 이것은 장기 관찰에 적합 간주하고, pharmacophysiological 또는 분자 생물 학적 중재와 함께입니다.

내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

physiologic angiogenesis 그 부족 일반 성인 vascularized 포유류의 조직은 학습하는 데 사용됩니다 수술 개입에 노출되지 않았습니다 (I) 개시 및 시험 요원의 intraperitoneal 관리 다음 angiogenesis의 개발, 그리고 체계적인 관리 아래와 angiogenesis의 (2) 수정 테스트 에이전트를 선택했습니다.

쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

이 문서에서는 쥐의 장간막에 angiogenesis을 자극하기위한 간단한 모델을 설명합니다. 모델은 아래로 단일 세포 수준까지 전체 microvascular 네트워크의 얼굴 시각화 중이다있게 조직에서 비교적 짧은 시간 코스 이상의 모세관 돋아, 혈관 영역과 혈관 밀도의 극적인 증가를 생성합니다.

쥐의 장간막의 Exteriorization : Angiogenesis에 관련된 세포 역학을 조사하기위한 모델

혈관 세포 기능은 세포 내 메신저의 활성에 따라 달라집니다.  여기에 설명된 것은 고립된 대동맥의 개별 내피 및 평활근 세포에서 생리학적 및 약리학적 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 및 산화질소 수준을 측정할 수 있는 생체 외 이광자 이미징 방법입니다.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

modified Landis 기법은 미세관류 기법을 사용하여 통제 및 테스트 조건에서 정상 및 유전자 변형 쥐의 장간막에서 개별 미세혈관의 수압 전도도를 쌍으로 측정할 수 있습니다. 생리학적 조건에서 미세혈관 투과성과 경혈관 교환을 조절하는 메커니즘을 평가하는 편리한 방법을 제공합니다.

Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

이 원고는 쥐 대뇌 저항 동맥 혈관 기능을 평가 하기 위한 비디오 현미경 검사 법 프로토콜을 체 외에 설명 합니다. 원고는 또한 레이저 도플러 Flowmetry를 사용 하 여 붙일 레이블된 lectin과 조직 관류와 microvessel 밀도 평가 하기 위한 기법을 설명 합니다.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

여기에 제시된 것은 혈관 동맥이 수납 및 가압되기 때문에, 모세관 침대 및 백혈구를 포함하는 혈관 나무 구성 요소뿐만 아니라 압력을 유지하는 동맥 관류 압력 및 흐름의 전 생체 모니터링에 의해 살아있는 뮤린 심장 조직에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 프로토콜이다.

마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

본 프로토콜에서, 턱밑샘(SMG)의 내피 장벽 기능은 이광자 레이저 스캐닝 현미경 하에 생체 내에서 시험 동물 모델의 각 정맥에 상이한 분자 가중 형광 추적자를 주입함으로써 평가되었다.

생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출

이 프로토콜은 장간막 허혈-재관류 손상을 유도하고 생체 내 현미경을 사용하여 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(NET)을 시각화하는 방법을 제시합니다. 상장간막동맥의 혈류를 1시간 동안 제한한 후 재관류를 수행하여 백혈구 유착 및 NETosis를 직접 정량화할 수 있었습니다.

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules after Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy(생체 내 현미경을 통한 장간막 허혈-재관류 손상 후 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after Mesenteric Ischemia-reperfusion injury)

배우세요 쥐 장간막 배양 모델을 활용한 혈관신생 연구 방법을 실시간 타임랩스 영상으로 미세혈관 네트워크 재형성 과정을 관찰하고 항혈관신생 약물 효과를 평가하는 기술입니다.

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