준비 및 평가 ^99m Bioorthogonal 화학을 사용하여 사전이 타겟팅에 대한 세자리 킬레이트를 Tc를 표지

이 절차의 전반적인 목표는 트랜스 사이클로옥텐 변형 생체 분자를 표적 벡터로 사용하는 생물직교 화학을 사용하여 사전 표적 이미징을 위한 테크네튬-99m 표지 테트라진을 생산하는 것입니다. 이 방법은 새로운 전파 의약품 개발을 위한 중요한 새로운 플랫폼을 제공합니다. 사전 표적화를 통해 여기에 설명된 테크네튬 복합체는 다양한 장기, 조직 및 바이오 마커를 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

이 기술은 진단 의학에서 가장 널리 사용되는 의료용 동위원소인 테크네튬-99m으로 무선 표지된 테트라진을 생산할 수 있는 강력한 단계별 방법을 제공하기 때문에 유리합니다. 이 기술은 소분자 및 항체를 포함한 다양한 표적 벡터와 함께 사용할 수 있습니다. 또한 테크네튬을 레늄의 베타 방출 동위원소와 교환하여 방사선 치료에 사용할 수도 있습니다.

동물 절차의 일부를 시연하는 것은 우리 실험실의 생물학 기술자인 Nancy Janzen이 될 것입니다. 방사선 라벨링 절차를 시작하려면 마이크로파 바이알에 보라노카보네이트 칼륨 8mg, 탄산나트륨 15mg, 사붕산나트륨 12수화물 20mg, 주석산나트륨 칼륨 25mg을 결합합니다. 아르곤 가스로 바이알을 10분 동안 퍼지합니다.

그런 다음 1, 110 메가베크렐의 활성으로 0.9% 식염수에 4ml의 테크네튬-99m 퍼테크네테이트를 첨가합니다. 반응 혼합물을 마이크로파 반응기에 넣고 10초 동안 저어줍니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 110도에서 3.5분 동안 가열하여 트리아쿠아 트리카르보닐 테크네튬-99m 양이온을 얻습니다.

용액 pH를 3.5에서 4로 조정하기 위해 약 400 마이크로 리터의 1 몰 염산을 첨가하십시오. 다음으로, 각 테트라진 리간드에 대해 2mg의 리간드를 250마이크로리터의 메탄올에 용해시킵니다. 각 리간드 용액에 74메가베크렐의 활성을 가진 250마이크로리터의 테크네튬-99m 복합체를 추가합니다.

마이크로파 반응기에서 섭씨 60도의 반응기에서 20분 동안 가열합니다. t-부틸 보호기가 있는 테트라진 리간드의 경우, 마이크로파 바이알에서 20ml 섬광 바이알로 용액을 옮긴 다음 용매를 증발시키고 각 복합체를 1밀리리터의 디클로로메탄과 트리플루오로아세트산의 일대일 부피 용액에 재용해합니다. 그런 다음 용액을 마이크로파 바이알로 옮기고 마이크로파 반응기에서 섭씨 60도의 마이크로파 반응기에서 해당 복합체를 6-10분 동안 가열하여 리간드의 보호를 해제합니다.

복합체를 실온으로 냉각시킨 다음 용매를 증발시킵니다. HPLC 정제를 진행하기 전에 아세토니트릴 또는 메탄올과 물의 일대일 수용액 500마이크로리터에 잔류물을 재용해합니다. C18 역상 HPLC를 사용하여 용리액 전체에 0.1%트리플루오로아세트산이 존재하는 상태에서 20분 동안 용출 구배가 30 - 70 - 40 - 60 아세토니트릴인 각 방사성 표지 테트라진 복합체를 정제합니다.

감마 트레이스에서 회피하는 것으로 보일 때 정제된 생성물을 수집합니다. 그런 다음, 라벨링된 각 복합체를 물 중 20% 메탄올에 0.125mg의 해당 라듐-테트라진 복합체 용액과 함께 동시 주입합니다. UV 트레이스에서 레늄 복합체 피크의 머무름 시간과 감마 트레이스에서 테크네튬 복합체 피크의 머무름 시간을 비교하여 감마 피크의 정체를 확인합니다.

각 정제된 테크네튬-테트라진 복합체에서 용매를 제거합니다. 각 복합체를 0.5% 소 혈청 알부민 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 함유한 인산염 완충 식염수에서 마이크로리터당 7.4킬로베크렐의 농도로 제형화합니다. 각 마우스 피험자에 대해 식염수 내 TCOPB 유도체의 마이크로리터당 5마이크로그램 용액 100마이크로리터를 주사기에 주입하여 킬로그램당 20밀리그램 용량을 준비합니다.

투여 주사기에 30게이지 바늘을 연결합니다. 마우스 피험자를 물리적 구속 장치에 넣습니다. 꼬리 끝에서 약 2cm 떨어진 꼬리 측면 표면의 정맥을 확인하고 알코올 면봉으로 해당 부위를 닦습니다.

주사기 바늘을 정맥과 평행한 얕은 각도로 삽입합니다. TCOBP 파생물을 천천히 주입합니다. 바늘을 제거하고 깨끗한 거즈 스펀지를 주사 부위에 출혈이 멈출 때까지 약간의 압력으로 바릅니다.

TCOBP 유도체 주사 1시간 후, 꼬리 정맥 주사로 약 0.74메가베크렐의 활성으로 원하는 테크네튬-99m 테트라진 복합체를 100마이크로리터 용량으로 투여합니다. 용량 교정기를 사용하여 주입 시 테크네튬 복합체의 100마이크로리터 테스트 샘플의 활성을 측정합니다. 나중에 측정할 수 있도록 테스트 샘플을 저장합니다.

주입 6시간 후 3%의 이소플루란과 2%의 산소 가스 혼합물로 마우스를 마취합니다. 지속적인 마취를 위해 코를 콧방울에 넣고 마우스를 등을 대고 눕히고 xiphoid 과정을 찾습니다. 헤파린으로 사전 처리된 주사기에 25게이지 바늘을 연결합니다.

바늘을 xiphoid 프로세스 아래에서 정중선의 약간 왼쪽에 20도 각도로 삽입합니다. 바늘이 완전히 삽입되면 플런저를 천천히 빼서 바늘 허브에 혈액이 있는지 확인하여 성공적인 심장 천자를 확인합니다. 필요에 따라 바늘을 다시 조정하십시오.

심장에 구멍이 뚫리면 주사기에 1ml의 혈액을 천천히 뽑습니다. 혈액 샘플을 미리 계량된 계수 튜브로 옮깁니다. 마취 상태에서 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.

안락사된 동물을 비닐 봉지에 넣고 용량 검사기로 전신 활동을 측정합니다. 그런 다음 무릎과 어깨 뼈, 담낭, 신장, 간, 갑상선 및 기관, 꼬리를 수집합니다. 내용물과 함께 위, 소장, 대장과 맹장, 방광을 모으십시오.

담즙과 방광을 제외한 수집된 모든 조직의 혈액을 인산염 완충 식염수로 헹굽니다. 조직을 닦아내고 건조시킨 다음 각 조직을 미리 계량된 계수 튜브에 넣습니다. 사체의 잔류 활동을 측정합니다.

각 조직 샘플의 무게를 측정하고 조직의 질량만 계산합니다. 다중 검출기 감마 계수기를 사용하여 테크네튬 복합체 테스트 샘플의 5마이크로리터 부분 표본의 활성을 측정합니다. counts per minute에서 얻은 값과 주입 시간에 측정된 활성을 사용하여 변환 계수를 계산합니다.

감마 검출기로 각 조직 및 유체 샘플의 활성을 측정합니다. 값을 마이크로큐리로 변환하고 각 값을 장기 무게로 정규화하여 조직 1g당 주입된 백분율을 결정합니다. TCOPB 유도체를 negative control series로 주입하지 않고 추가 마우스로 이 과정을 반복합니다.

이 방법을 사용하여 링커와 키-리더 조합이 다른 5개의 테트라진 복합체를 테크네튬-99m으로 라벨링했습니다. 뼈에서 칼슘 회전율이 높은 부위에 국한하는 TCOPB 유도체를 사용하여 마우스의 어깨와 무릎 관절을 사전 표적화했습니다. 혈액에 대한 뼈의 조직 1g당 주입 용량의 비율은 각 테트라진 화합물에 대해 계산되었습니다.

5가지 화합물 모두 혈액을 빠르게 제거하고 뼈를 표적으로 삼았으며, 이는 테트라진 화합물과 TCOBP 유도체 사이의 선택적 생체 직교 결합 반응이 생체 내에서 발생했음을 나타냅니다. 화합물 3은 혈액 표적화와 제거의 최상의 조합을 보여주었습니다. 음성 대조군 실험에서는 방사선 표지된 테트라진 복합체가 TCOBP 유도체가 없는 경우 뼈에 유의하게 국한되지 않는 것으로 나타났습니다.

예를 들어, TCOBP 유도체를 투여하지 않았을 때 화합물 2는 담낭과 장에서 수치가 높았지만 뼈에서는 매우 적었습니다. 테스트된 5가지 화합물 중 TCOBP 유도체를 투여받은 마우스의 조직 국소화에서 큰 차이가 관찰되었습니다. 예를 들어, 화합물 3은 다른 복합체에 비해 대장, 간 또는 소변 및 방광에서 거의 관찰되지 않은 반면, 화합물 3은 뼈에서 훨씬 더 많이 관찰되었습니다.

일단 숙달되면 여기에 설명된 라벨링 기술을 올바르게 수행하면 처음부터 끝까지 2시간 이내에 수행할 수 있습니다. 이 기술을 시도하는 동안 모든 시약의 무게를 정확하게 측정하고 테크네튬 용액에 첨가하기 전에 아르곤으로 염을 퍼지하는 것이 중요합니다. 또한 테트라진 리간드를 첨가하기 전에 테크네튬 용액의 pH를 3.5에서 4로 조정하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 테크네튬 표지 테트라진을 준비하고 정제하는 방법과 사전 표적화 및 생물 직교 화학을 사용하여 새로운 방사성 의약품을 만드는 데 사용할 수 있는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 방사능을 다룰 때는 방출되는 방사선의 종류를 파악하고 시료를 가장 잘 차폐하고 취급하는 방법을 파악하는 등 적절한 예방 조치를 취하는 것을 잊지 마십시오.