B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

이 간단한 방법의 전반적인 목표는 소량의 혈액만 사용하여 불멸화 효율이 높은 B 림프모세포 세포주 또는 B-LCL을 확립하고 시작과 동결 보존 사이의 시간을 절약하는 것입니다. 이것은 적혈구를 용해하여 전혈에서 인간 B 세포를 불멸화하는 새로운 방법입니다. B-LCL은 다양한 연구를 수행하기 위한 귀중한 바이오 재료 공급원을 제공합니다.

이 방법의 주요 장점은 0.5ml의 혈액만으로도 불멸화 효율과 높은 세포 생존율을 가진 B-LCL을 얻기에 충분하다는 것입니다. 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)에 의한 B-LCL을 확립하고, 널리 사용되는 방법인 B 림프구를 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 별도의 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC로 변형시킵니다. 그러나 샘플이 적혈구 용해액의 1ml 미만인 경우 추가가 실패합니다.

우리는 밀도 구배 분리 방법을 사용하여 작은 적혈구에서 PBMC를 분리하는 것이 어렵다는 것을 알고 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. EBV를 준비하기 위해 첫째 날에는 B95-8 세포를 해동하고 10% FBS, L-글루타민 2밀리몰 및 항생제가 보충된 완전한 RPMI 1640 배지 6ml의 T25 배양 플라스크에서 배양하는 것으로 시작합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양물을 배양합니다.

둘째 날에는 현미경으로 세포 형태를 관찰합니다. 세포는 밝고 동그랗을 때 좋은 상태를 유지합니다. 10ml의 완전한 RPMI 1640 배지를 배양액에 첨가합니다.

4일차에 10ml의 새로운 배지를 추가하고 세포를 T75 배양 플라스크로 옮깁니다. 그런 다음 8일째에 배지 20ml를 더 추가하고 새로운 배지를 추가하지 않고 8일 동안 세포를 유지합니다. 16일째에는 현미경으로 세포를 확인합니다.

그런 다음 12ml의 세포를 15mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 다음으로, 섭씨 영하 80도에서 세포를 1시간 동안 동결 보존하고 섭씨 37도에서 배양물을 빠르게 해동합니다. 바이러스 입자가 세포에서 방출될 때까지 동결 해동을 세 번 더 반복합니다.

배양물을 240배의 g으로 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 0.22 미크론 필터를 통해 상등액을 필터링합니다. 튜브당 여과액 12ml를 분취하고 튜브를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

50ml 튜브에 EDTA K2에 의해 항응고된 전혈 0.5ml를 추가합니다. 적혈구 용해 완충액 1ml를 전혈에 넣고 잘 섞는다. 혼합물을 실온에서 4분 동안 배양합니다. 그런 다음 5-7 밀리리터의 1x PBS를 빠르게 첨가하여 용해 반응을 중단시킵니다.

혈액에 적혈구 용해 완충액을 첨가한 후에는 반드시 잘 섞어야 합니다. 반전은 반응이 적시에 종료되도록 합니다. 다음으로, 튜브를 실온에서 240회 g으로 5분 동안 원심분리합니다.

백혈구는 튜브 바닥에 침전됩니다. 상층액을 버리고 1640 Basic Medium을 7 밀리리터 첨가하여 침전물을 세척합니다. 그런 다음 세척을 반복하기 전에 용액을 원심 분리하십시오.

300 마이크로 리터의 형질 전환 배지로 세포 펠렛을 재현탁시킵니다. 그런 다음 EBV 감염을 수행하기 위해 Cyclosporin A의 밀리리터당 20마이크로그램 60마이크로리터를 세포 현탁액에 첨가합니다. 섭씨 37도에서 EBV 분취액을 급속 해동하고 240마이크로리터의 바이러스를 세포에 추가합니다.

현탁액을 완전히 혼합하고 웰당 200마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 플레이트를 배양합니다. EBV 감염 후 첫 달 동안은 일주일에 한 번 세포 배양에서 배지의 절반을 교체하십시오.

7일째에는 현미경으로 두꺼운 세포 조각층만 볼 수 있습니다. 감염 후 한 달이 지나면 두꺼운 세포 조각층 아래에서 림프모세포 세포 클러스터가 보입니다. 이 시점부터 현미경으로 세포 클러스터가 명확하게 보일 때까지 3일마다 배지의 절반을 교체합니다.

세포를 재현탁시킨 후 현탁액을 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 세포 성장 속도에 따라 배양 배지가 노랗게 변하면 전체 RPMI 1640 배지의 부피를 두 배로 늘립니다. 림프모세포 클러스터가 육안으로 보이면 배양물을 T25 배양 플라스크로 옮깁니다.

배양 배지가 노랗게 변하면 부피가 10-15밀리리터로 팽창할 때까지 배지의 부피를 두 배로 늘립니다. 얼리기 전에 24시간 전에 매체를 교체하십시오. 그런 다음 세포를 동결하려면 세포 현탁액을 원심 분리하고 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.

90%FBS와 10%DMSO를 함유한 냉동 원액을 사용하여 현탁액을 5-10 곱하기 10에서 밀리리터당 6번째 셀의 밀도로 조정합니다. 그런 다음 동결된 세포를 액체 질소로 직접 옮기기 전에 분당 섭씨 1도에서 섭씨 영하 80도의 속도로 현탁액을 동결합니다. 형질전환 과정에서 세포의 형태학적 변화는 광학 현미경으로 볼 수 있습니다.

감염 후 7일이 지나면 밀도 구배 분리 방법을 사용하여 작은 세포 클러스터를 명확하게 볼 수 있는 반면, 적혈구 용해 방법에서는 두꺼운 세포 조각층만 볼 수 있습니다.감염 후 30일이 지나면 두꺼운 세포 조각층 아래에서 림프모세포 세포 클러스터가 보입니다. 배지 변화가 더 잦을수록 세포 파편이 줄어들고 세포 클러스터가 명확하게 보이며 밀도 구배 분리에 의해 확립된 배양과 유사하게 보입니다.

마지막으로, MTT 분석을 사용하여 B-LCL의 생존 가능성을 평가했습니다. 여기에 표시된 결과는 적혈 용해법을 사용하여 배양된 B-LCL 세포가 밀도 구배 분리 방법을 사용하여 확립된 배양액보다 훨씬 더 생존력이 있음을 나타냅니다. 일단 숙달되면 EBV 바이러스 형질전환 과정을 적절하게 수행하면 30분 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이전에 림프구를 정제하지 않고 간단하고 시간을 절약하는 적혈구 용해 방법으로 B-LCL을 확립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후 이 기술은 EBV 관련 질병에 대한 유전체학, 전사체학 및 단백질체학 연구의 진행과 단핵 항체 생산에 대한 응용을 가속화했습니다. EBV와 같은 인간 병원체를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.