Name: B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 배우세요 B 임파구 세포주를 적혈구 용해 방법으로 설립하는 기술을. Epstein-Barr 바이러스를 이용해 0.5mL 소량 혈액으로 고효율 불멸화를 달성하며, 밀도 구분 원심분리법보다 시간을 단축하고 세포 생존율을 높입니다.

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이 작업은 중국과학원(CZBZX-1)의 전략적 생물 자원 기술 지원 시스템인 중국과학원(KFZD-SW-205)의 주요 프로젝트의 지원을 받았습니다.

이 연구는 유전학과 발달 생물학 연구소의 윤리위원회의 승인을하고, 프로토콜은 인간의 복지를위한 제도적 지침을 따른다. EB 바이러스의 제조 1 <ol><li> 1 일에, 6 mL의 B95-8 세포 배양 해동 완전 RPMI 1640 매체, 10 % 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민, 항생제 (100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 U / ㎖ 페니실린)이 보충 T25 문화 플라스크. 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 배양 플라스크를 놓습니다. </li><li> 제 2 일에, 현미경으로 세포의 형태를 관찰한다. 그들은 밝고 라운드 때 세포는 좋은 상태를 유지하고 있습니다. 10 mL의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다. </li><li> 하루에 4 일, 10 mL의 신선한 완전한 RPMI 1640 배지를 추가 한 다음 T75 문화 플라스크에 전송할 수 있습니다. </li><li> 하루 8 일, 20 mL의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다. </li><li> 즉, 새로운 배지, 기아를 추가하지 않고 팔일의 세포를 유지한다. </li><li> 날 16 일, 세포를 관찰현미경으로 관찰 하였다. 15 mL의 원심 분리 튜브, 12 ㎖ / 튜브에 세포를 수집한다. </li><li> 1 시간 동안 -80 ℃에서 냉동 보존은-하고 빠르게 37 ℃에서 해동. 바이러스 입자가 세포로부터 해제 될 때까지 3 번 반복합니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 240 × g으로 원심 분리기. </li><li> -80 ° C에서 0.22 μm의 필터, 나누어지는 12 ㎖ / 튜브 및 저장소를 통해 뜨는을 필터링합니다. </li></ol> 적혈구 용해 버퍼와 전혈 2. 치료 <ol><li> 15 ㎖의 튜브에 EDTA · K 2 항 응고 0.5 mL의 전혈을 추가합니다. </li><li> 전혈에 (사용 전 0.22 μm의 필터로 여과하고, 실온에서 해동 된) 1 mL의 적혈구 용해 완충액을 넣어 잘 섞는다. 4 분 동안 실온에서 혼합물을 놓는다. 정지 반응에 신속 7 ㎖의 1X PBS - 그럼 5를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 240 × g으로 원심 분리기. 백혈구는 튜브의 바닥에 침전된다. </li><li> 상층 액을 버리고, 7 mL의 1640 기본 배지를 추가하여 침전을 씻는다. 실온에서 240 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. 두 번 반복합니다. </li><li> (20 % 소 태아 혈청 및 10 μg의 / ㎖의 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA)를 함유하는 RPMI 1640 배지) 300 μL 변환 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 3. EBV 감염 <ol><li> 세포 현탁액에 20 μg의 / ML의 시클로 스포린 A의 60 μL (CSA)를 추가합니다. </li><li> 빠르게 37 ° C에서 EBV의 나누어지는을 녹여. 세포 현탁액 240 μL EBV를 추가합니다. </li><li> 잘 혼합하고 잘 당 96 웰 플레이트에 200 μL를 세포 현탁액을 배치합니다. 증발을 방지 96 웰 플레이트의 주위에 모든 웰에 200 μL 1X PBS를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol> B-LCLS 4. 확장 및 냉동 보존 <ol><li> EBV 감염 후 첫 달 동안 일주일에 한 번 매체의 절반을 변경합니다. 만 두꺼운 라예세포 조각의 r은 7 일 (그림 2)에서 현미경으로 볼 수 있습니다. EBV 감염 한 달 후에 임파 세포 클러스터는 현미경 (도 2)하에 세포 단편의 두꺼운 층 아래에 표시된다. </li><li> 셀 클러스터는 누가 뭐라고해도 현미경 (그림 2)에서 볼 수 있습니다 때까지 3 일마다 배지의 절반을 변경합니다. 일반적으로이 과정은 10 ~ 20 일이 소요됩니다. </li><li> 혼합 후, 세포를 피펫 팅하고 24 웰 플레이트에 옮긴다. 이 노란색으로 변하면서 완전한 RPMI 1640 배양액의 양을 두 배로. 이 과정은 세포의 성장 속도에 의존한다. </li><li> 이어서, T25 배양 용 플라스크에 세포를 옮긴다. 15ml의 - 매체의 부피가 10로 확장 전까지는 노랑색으로 배양액 부피를 두배. </li><li> 동결하기 전에 매체 24 시간을 변경합니다. 240 × g에서 5 분 동안 원심 분리기 세포 현탁액. FR 10 × 106 / ㎖ - (5)의 농도로 세포 계수기와 함께 동결 세포 개수90 % FBS와 10 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)를 함유하기 Ozen 원액. -80 ° C에 분당 1 ℃의 속도로 고정 후 액체 질소에 직접 전송합니다. </li></ol> 5. 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석 17 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지 1640와 B-LCLS 단일 세포 현탁액을 제조. 잘 위에 96 웰 플레이트 당 종자 3 × 104 세포, 잘 당 100 μL. </li><li> 16 시간 - 12 37 ° C에서 CO 2 배양기 5 %에서 접시를 놓습니다. </li><li> 세포가 성장하는 우물에 MTT (5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 37 ℃에서 4 시간 동안 빛에 가까이하지 말 것. </li><li> 168 × g으로 10 분 동안 원심 분리기 세포 판. </li><li> 상층 액을 제거하고 잘 당 100 μL DMSO를 추가합니다. 참고 :주의해야합니다. 바늘 모양의 염료 결정을 만지지 마십시오. </li><li> 완전 결정을 용해 저속으로 10 분 동안 플레이트를 흔들어. </li><li> 570 nm의에 의해에서 측정 흡수마이크로 플레이트 분광 광도계. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 적혈구 용균 전혈로부터 인간 B 세포를 불멸화하기위한 새로운 방법의 개발을보고하고, B-LCLS은 MTT 분석법으로 평가 하였다 설정된 그것의 세포 생존. 결과 적혈구의 용해 방법에 의해 확립 된 B-LCLS의 세포 생존율은 밀도 구배 분리 방법보다 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 적혈구 용해 방법의 주요 장점은 간단하고 높은 성공률과 높은 세포 생존과 영구 세포주를 확립하기위한 혈액 (0.5ml를 적게는) 소량을 필요로한다는 것이다. 오직 하나의 간단한 용해 공정 EBV 감염 전에 필요하다. 림프구의 이전 정제하지 않고, 세포 손실 및 세포 손상을 피할 수있다. 밀도 구배 분리 방법의 또 다른 장애물은 용혈이다. 어, 부적절한 온도에서 장기간 보관 후 혈액을 처리하고 운반시 진동은 용혈 될 수 있습니다무형 문화 유산은 크게 림프구의 분리에 영향을 미칠 것이다. 다른 연구는 적혈구 (RBC) 용해의 사용이 (18)와 림프구 아형은 대략 19...

휴지 B 세포는 in vitro에서 Epstein-Barr 바이러스(EBV)에 의해 활발하게 증식하는 B 림프구 세포주(B-LCL)로 형질전환될 수 있습니다. B-LCL은 분화 및 발달 과정에서 생식 세포와 유사하며, B-LCL의 체세포 돌연변이 비율은 0.3%1에 불과하여 유전적 및 표현형 변화는 무시할 수 있는 수준이었습니다. 따라서 말초혈액단핵세포(PBMC)의 대리물인 B-LCL은 EBV 관련 질병에 대한 유전체학, 전사체학 및 단백질체학 연구의 진행을 실질적으로 가속화했습니다2,3. 또한, B-LCL은 단클론 항체를 스크리닝하는 데에도 중요한 응용력을 가지고 있습니다4,5. 
EBV에 의한 B 림프구의 불멸화를 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 가장 일반적인 시술로는 B 림프구를 분리하고 B95-8 세포주를 사용하여 전염성 EBV를 생성하는 것입니다. 격리에서 변환에 이르기까지 이러한 방법은 세 가지 전략으로 나뉩니다. 림프구는 밀도 구배 원심분리와 EBV 형질전환에 의해 신선한 혈액에서 분리되며, 이 연구에서는 밀도 구배 분리 방법이라고 합니다6-8. 그러나 다른 기술은 신선한 혈액 운송의 어려움을 극복하고 정제된 림프구를 동결하고 후속 해동 및 EBV 감염9-11을 수행하는 절차를 사용합니다. 냉동 보존된 전혈은 B 림프구의 분리 및 형질전환에도 사용할 수 있습니다12,13. B 림프구를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 외에도 일부 연구자들은 자기 세포 분류기를 사용하여 B 림프구를 선택합니다12. 그러나 자기 분리는 비용이 많이 들고 복잡하며 시간이 많이 소요되는 과정입니다. 이러한 방법은 높은 성공률로 B 림프구를 불멸화하는 데 유용하지만, 많은 수의 임상 샘플을 처리해야 하고 혈액 양이 상대적으로 적기 때문에 영구적인 세포주를 확립하기 위한 더 간단한 방법이 필요합니다.
덜 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 EBV 감염 및 B-LCL 확립을 위한 핵 세포의 공급원으로 전혈을 사용하는 것입니다. 이러한 방법은 분리 절차를 생략하여 기술을 단순화합니다. 신선한 14 또는 냉동15,16의 소량의 전혈만이 세포주를 얻기에 충분합니다. 불행히도, 문서15,16 및 몇 가지 검증 테스트의 성공 여부에는 큰 차이가 있습니다. 더욱이, 변형된 군체는 큰 오염 불순물 때문에 현미경으로 거의 인식되지 않습니다. 따라서 보다 신뢰할 수 있는 변환 방법이 필요합니다.
위의 고려 사항을 바탕으로 당사는 림프구의 사전 정제 없이 B-LCL을 확립하는 새로운 방법을 개발했으며, 이를 적혈구 용해법이라고 명명했습니다. 이 방법은 편리하고 시간을 절약하며 많은 수의 샘플에 적용할 수 있습니다. 0.5mL의 전혈만으로도 B-LCL을 얻을 수 있었고, 이는 유아와 노인의 건강에 큰 해를 끼치지 않고 쉽게 얻을 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>원심분리기</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>원심분리</td></tr><tr><td>자동 세포 카운터&nbsp;</td><td>카운트스타</td><td>&nbsp; IC 1000&nbsp;</td><td>세포 계수용&nbsp;</td></tr><tr><td>Epoch Microplate 분광광도계</td><td>BioTek Instruments</td><td>SN263839</td><td>흡광도 96</td></tr><tr><td>웰 세포 배양 클러스터</td><td>측정을 위해 Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>폴리스티렌 플레이트</td></tr><tr><td>24 웰 세포 배양 클러스터</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>폴리스티렌 플레이트</td></tr><tr><td>25 cm2 세포 배양 플라스크</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>폴리스티렌& 주의;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>B-LCL 중간</td></tr><tr><td>RPMI 중간 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>B-LCL 중간</td></tr><tr><td>L-글루타민의 구성 요소&nbsp; &nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>B-LCLs 중간</td></tr><tr><td>100x 스트렙토마이신 페니실린 용액의 구성 요소 BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>B-LCLs 중간</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td> GE의 구성 요소<td>&nbsp; 헬스케어</td><td>17-1440-03</td><td>림프구 in vitro 분리를 위해</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>림프구 증식을 자극하기 위해</td></tr><tr><td>Cyclosporin A</td><td>Cayman&nbsp; 화학</td><td>물질 12088</td><td>T 세포의 세포 독성 효과를 억제하기 위해</td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>적혈구 용해 MTT</td></tr><tr><td></td><td>Amresco</td><td>0793</td><td>세포 생존 능력 검출 DMSO</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>동결 세포 용</td></tr></tbody></table>

b 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

엡스타인 바 바이러스에 의한 B 림프구를 in vitro에서 불멸의 세포주로 변형시키는 방법에는 여러 가지가 있습니다. B-LCL의 확립을 위한 강력하고 간단한 전략으로 적혈구 용해법인 새로운 방법을 개발했습니다. 이 방법은 적혈구 제거를 통한 PBMC 분리 절차를 단순화하고, 100%의 성공률로 비교적 짧은 시간 내에 많은 수의 세포로 증식할 수 있는 EBV 불멸 세포주를 확립하기 위해 최소 0.5mL의 전혈을 사용했습니다. 이 방법은 간단하고 신뢰할 수 있으며 시간을 절약하며 많은 수의 임상 샘플을 처리하는 데 적용할 수 있습니다.

변형 과정에서, 세포의 형태 학적 변화는 광학 현미경 (도 2)에 의해 가시화된다. 세포 파편의 두꺼운 층은 적혈구 세포 용해 방법에서 볼 수있는 반면 작은 셀 클러스터는 감염 후 7 일 후, 밀도 구배 분리법 명확하게 볼 수 있었다. 그러나, 임파 세포 클러스터는 30 일 게시물 감염 세포의 단편의 두꺼운 층 아래에 ​​표시된다. 더 자주 변화 매체로, 세포 파편 감소 셀 클러스터는 선명하게 보이는지 및 밀도 구배 분리법에 의해 설립 된 동일한 이미지를 제시한다. 세포주가 성공적으로 확립 된 경우, MTT 분석은 B-LCLS의 실행 가능성을 평가하기 위해 사용되었다. 문헌 17에 따르면, 다른 방법에 의해 확립 된 B-LCLS은 세포 생존 및 (16)을 검출하도록 선택되었다40 배지 블랭크 대조군으로 사용 하...

B-LCLS을 설정하기위한 간단한 적혈구 용해 방법은 소량의 혈액을 필요로하고 동결 보존 개시로부터 시간을 절약 불멸화 높은 효율로 발전되었다.

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

이 간단한 방법의 전반적인 목표는 소량의 혈액만을 사용하여 높은 불멸화 효율로 B 림프모구양 세포주(B-LCLs)를 구축하고, 개시부터 동결 보존까지의 시간을 단축하는 것입니다. 이는 적혈구를 용해함으로써 전혈로부터 인간 B 세포를 불멸화하는 새로운 방법입니다. B-LCLs는 다양한 연구를 수행하기 위한 귀중한 생물학적 재료 공급원이 됩니다.이 방법의 주요 장점은 단 0.5 milliliters의 혈액만으로도 불멸화 효율과 높은 세포 생존율을 가진 B-LCL을 얻기에 충분하다는 것입니다. Epstein-Barr virus(EBV)로 B 림프구를 변형시켜 B-LCL을 확립하기 위해 널리 사용되는 방법은 Ficoll 밀도 구배 원심분리를 통해 말초혈액 단핵구(PBMC)를 개별적으로 분리하는 것입니다. 하지만 적혈구 용해물 샘플이 1 milliliter 미만일 경우, 첨가가 실패하게 됩니다.우리는 밀도 구배 분리법을 사용하여 작은 적혈구로부터 PBMC를 분리하는 것이 어렵다는 점에 착안하여 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. EBV를 준비하기 위해, 1일 차에 B95-8 세포를 해동하고 10% FBS, 2 millimolar L-glutamine 및 항생제가 첨가된 6 mL의 완전 RPMI 1640 배지가 들어있는 T25 배양 플라스크에서 배양합니다. 배양물을 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 배양합니다.2일 차에 현미경으로 세포 형태를 관찰합니다. 세포가 밝고 둥근 모양이면 상태가 좋은 것입니다. 배양액에 complete RPMI 1640 Medium 10 milliliters를 첨가합니다.4일 차에 10 milliliters의 신선한 배지를 첨가하고 세포를 T75 배양 플라스크로 옮깁니다. 그 후 8일 차에 배지 20 milliliters를 추가로 넣고 신선한 배지 첨가 없이 8일 동안 세포를 유지합니다. 16일 차에 현미경으로 세포를 확인합니다.그런 다음 12 milliliters의 세포를 15 milliliter 원심분리 튜브에 수집합니다. 다음으로, 세포를 -80 degrees Celsius에서 한 시간 동안 냉동 보존한 후, 37 degrees Celsius에서 빠르게 해동합니다. 바이러스 입자가 세포에서 방출될 때까지 이 동결-해동 과정을 3회 더 반복합니다.배양액을 실온에서 240 ×g로 10분 동안 원심분리하십시오. 그다음, 상층액을 0.22 micron 필터로 여과하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

에서 유전자의 구조와 기능 분석의 효율적인...

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

우리는 엡스타인 - 바 바이러스를 사용하여 변형 B 세포 라인을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 감염 후 삼일 빠르면 변환을 받다 운명 B 세포를 식별할 수있는 소설 분석을 설명합니다.

엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

이 비디오에서는 항원 코팅된 마이크로비드로 활성화된 B 림프구의 소기관 역학을 연구하는 방법을 설명합니다.

Organelle Dynamics in B Lymphocytes following Activation with Antigen-Coated Beads

이 비디오는 유형이 불가능한 헤모필루스 인플루엔자(NTHi)를 통해 림프구를 자극하고 면역 반응을 평가하는 체외 기술을 보여줍니다. NTHi와 함께 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 배양하면 박테리아 세포가 T 림프구를 자극하여 사이토카인 생성을 유도합니다. 사이토카인의 분비를 억제하면 면역형광 염색을 수행하여 자극된 T 림프구에 축적된 세포 내 사이토카인을 검출합니다.

병원성 박테리아를 통해 림프구를 자극하는 체외 기술

이 비디오는 화학요법제의 세포독성으로부터 림프종 세포를 보호하는 호중구 유사 세포의 역할을 조사하는 분석을 보여줍니다. 림프종과 호중구 유사 세포로 구성된 3D 공동 배양이 이루어지고 화학 요법 약물인 빈크리스틴에 노출됩니다. 호중구 유사 세포와 직접 접촉하면 림프종 세포에서 항세포사멸 단백질의 상향 조절을 유도하여 빈크리스틴이 있는 상태에서 생존을 촉진합니다.

Determining the Role of Neutrophil-like cells in Lymphoma cell: test drug (림프종에서 호중구 유사 세포의 역할: 시험 약물에 대한 민감성)

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

T-림프구 유사분열은 배반생성 변형을 동반하며, 이에 따라 세포 분열 전에 세포 부피가 커집니다. 여기에서는 세포 직경을 측정할 수 있는 기능이 있는 자동 세포 계수기를 사용하여 T 림프구의 모세포 형성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

면역 마약 식별을위한 T 림프구에서 미토 겐 유도 블라스의 신속한 정량

높은 효율, 적은 양의 주변 혈액 그리고 일리노이-2의 낮은 복용량 CAEBV 환자에서 NK, T 세포 클론을 얻기 위한 간단한 방법을 개발 되었다.

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

여기서 우리는 감염의 혈액 단계에서 Plasmodium 에 대한 세포 면역의 메커니즘을 밝히는 데 도움이되는 새로운 방법을 설명합니다. 이것은 세포 독성 림프구에 의한 감염된 적혈구 사멸을 측정하는 시험관 내 분석입니다.

체외 세포독성 림프구에 의한 변형체 감염 적혈구 사멸 분석

배우세요 B 임파구 세포주를 적혈구 용해 방법으로 설립하는 기술을. Epstein-Barr 바이러스를 이용해 0.5mL 소량 혈액으로 고효율 불멸화를 달성하며, 밀도 구분 원심분리법보다 시간을 단축하고 세포 생존율을 높입니다.

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

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