심장 수술 후 혈청 샘플의 영향을 건강한 자원 봉사자와 그들의 철새 잠재력에서 내피 전구 세포의 분리

이 세포 분리 절차 및 이동 프로토콜의 전반적인 목표는 심장 수술 환자의 혈청 샘플로 내피 전구 세포와 이동 가능성을 분리하는 신뢰할 수 있는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 허혈 및 재관류 관련 부상으로 인해 심장 수술 후 필요한 내피 내막 및 혈관 재생에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 CD-34 양성 세포의 사전 분리를 포함하여 전구 세포를 비교적 간단하게 분리하는 방법입니다.

사망 외에도 심장 수술의 주요 합병증은 여전히 너무 흔합니다. 심장 수술 중 넥타이 위험과 보호 메커니즘을 식별해야 할 필요성을 강조합니다. 내피 전구 세포는 허혈 조직의 신생혈관화에 결정적으로 관여하며 심장 보호 특성을 제공하는 것으로 알려져 있습니다.

실험을 시작하려면 혈액을 칼슘이 없는 PBS와 마그네슘이 없는 PBS와 일대일로 혼합하십시오. 50ml 튜브에 15ml의 밀도 구배 용액을 추가합니다. 그리고 밀도 구배 용액 위에 희석된 혈액을 천천히 겹쳐 놓습니다.

다음으로 샘플을 원심분리합니다. 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 모든 튜브의 버피 코트 층을 조심스럽게 수집하고 밀도 구배 용액을 피하면서 다른 튜브에 넣습니다. 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC 분획을 최소 3부피의 PBS로 희석하고 피펫팅으로 용액을 혼합합니다.

혼합물을 실온에서 200 회 G.에서 15 분 동안 원심 분리 한 다음 상층액을 흡인하고 세포 펠렛을 5 밀리리터의 내피 세포 성장 배지 MV-2에 재현탁시킵니다. 세포를 재현탁시킨 후 사용한 버피 코트 당 100마이크로리터의 인간 CD-34 항체를 추가하고 세포를 회전시킵니다. 사용된 버피 코트당 50마이크로리터의 덱스트란 코팅된 마그네틱 비드를 추가하고 세포를 회전시킵니다.

배양 후 각 튜브에 최대 3ml의 현탁액을 팩스 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 팩스 튜브를 자석에 삽입하고 5분 동안 기다립니다. 자석에서 팩스 튜브를 당기지 않고 과신호 물질을 폐기하십시오.

그런 다음 자석 바깥쪽에서 각 팩스 튜브의 셀을 3ml의 MV-2 매체로 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 사전 코팅된 T-75 플라스크로 옮깁니다. 각 플라스크에 17ml의 MV-2 배지를 추가합니다.

이동 분석을 준비하려면 피펫을 사용하여 T-75 플라스크의 내피 전구 세포 또는 EPC에서 배지를 제거합니다. 5ml의 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 세포를 세척하고 플라스크를 조심스럽게 흔듭니다. 다음으로, PBS를 제거하고 5ml의 상용 세포 분리 용액을 추가합니다.

그런 다음 광학 현미경으로 세포가 분리될 때까지 기다립니다. 플라스크 바닥을 조심스럽게 두드려 분리를 가속화합니다. 세포가 분리되면 MV-2 완전 배지 5ml를 빠르게 추가하고 세포 현탁액을 다른 튜브로 옮깁니다.

2, 000 x G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 세포를 펠릿화한 후 5-10밀리리터의 PBS에 재현탁시킵니다. 그리고 다시 원심분리하십시오.

PBS 5-10밀리리터에 세포를 다시 부유시키고 원심분리를 진행합니다. MV-2 고갈된 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로, 혈청 샘플을 MV-2 굶주린 배지에서 1 내지 5로 희석합니다.

235마이크로리터의 혈청 샘플을 하부 챔버에 추가하여 마이그레이션 플레이트를 준비합니다. 셀 용액을 추가하기 직전에 삽입물을 추가합니다. 그런 다음 75마이크로리터의 셀 용액을 상부 챔버에 추가합니다.

EPC가 마이그레이션되도록 허용합니다. 이동하지 않은 모든 세포를 포함하는 상부 챔버를 제거합니다. 1에서 1, 000에 묽게 된 hoechst 염료를 포함하여 3.6% 파라포름알데히드 해결책의 75 마이크로리터를 추가하십시오.

플레이트를 곧 원심분리하여 모든 세포를 1-2분 동안 2, 000 x G의 동일한 초점면으로 가져옵니다. 혈청 자동 형광 아티팩트를 방지하려면 현미경으로 100배 배율로 웰당 5장의 사진을 촬영하여 마이그레이션된 세포를 정량화합니다. 마지막으로, 반자동 소프트웨어를 사용하여 마이그레이션된 세포를 계산합니다.

EPC의 팩스 분석은 acLDL의 흡수와 분리된 세포 집단의 표면에서 CD-31의 발현을 확인합니다. acLDL 및 CD-31의 분석을 분리하면 각 마커의 균질한 분포를 확인할 수 있습니다. Elyso는 심근 재관류 손상 후 심장 수술이 MIF, CXCL12, CXCL8 및 VEGF의 순환 혈청 농도 농도에 미치는 영향을 확인합니다.

혈청 샘플은 수술 전 및 수술 중에 채취했습니다. MIF, CXCL12 및 CXCL8의 혈청 수치는 기준선 수치에 비해 수술 중 유의한 증가를 보였다. 대조적으로, VEGF 농도는 유의한 변화를 보이지 않았다.

건강한 지원자로부터 분리한 EPC를 사용하여 수술 전과 수술 중에 채취한 혈청 샘플을 사용하는 생체 외 이동 분석법을 시행한 결과, 수술 중 채취한 샘플로의 이동률이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 이 기술을 따르면 말초 혈액 단핵 세포를 쉽게 분리하여 추가적인 염증 관련 질문에 답할 수 있습니다.