작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구
2017년 3월 10일
우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.
이 형광 기반 림프구 분석의 전반적인 목표는 새로운 소분자 면역조절제를 식별하는 것입니다. 이 방법은 림프구 활성화 및 억제 메커니즘에 대한 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 표현형 기능 및 분석의 주요 장점은 약물 발견에 적용할 수 있다는 것입니다.
이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 대학원생인 Ahmed Fouda입니다. 멸균 작업 후드 아래에서 6-8주 된 암컷 Nurr77 GFP 마우스의 털을 70% 에탄올로 소독하고 동물을 오른쪽에 눕힙니다. 다음으로, 왼쪽 상부 복부 사분면의 피부와 근육을 절개하고 비장을 찾아 제거하여 조직을 얼음 위의 비장 세포 배지에 놓습니다.
모든 비장이 채취되면 5ml의 예열된 비장 세포 배지가 들어 있는 10cm 제곱의 세포 배양 접시에 조직을 옮기고 멸균 주사기 플런저를 사용하여 용액이 탁해질 때까지 조직을 으깨줍니다. 비장 세포 배지를 광범위하게 매싱한 후 70미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50ml 튜브로 여과하여 파편을 제거하고 생성된 단일 세포 현탁액을 원심분리합니다. 펠릿을 2-3 밀리리터의 적혈구 용해 완충액에 재현탁시키고, 20-30초 후에 5 밀리리터의 RPMI 또는 다른 적절한 완충액으로 반응을 흡수합니다.
그런 다음 다른 원심분리로 세포를 수집하고 세포 계수를 위해 펠릿을 twp 밀리리터의 비장 세포 배지에 재현탁합니다. T 세포를 분리하기 위해 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 무혈청 RPMI 배지에 10배에서 밀리리터당 7개 세포 농도로 재현탁합니다. 세포를 5ml 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 나중에 순도 평가에 사용할 100마이크로리터의 비장 세포 분취량을 따로 보관합니다.
다음으로, 일반 랫드 혈청 밀리리터당 50마이크로리터를 세포에 첨가한 다음, 부드러운 혼합과 함께 밀리리터당 50마이크로리터의 T 세포 분리 항체 칵테일을 첨가합니다. 10분 후, 2분 30초 동안 streptavidin conjugated magnetic beads로 세포를 배양합니다. 그런 다음 최종 부피가 2.5ml인 세포에 무혈청 배지를 추가하고 튜브를 세포 분리 자석에 3분 동안 놓습니다.
배양이 끝나면 튜브를 자석에 잡고 상등액을 한 번의 움직임으로 새 폴리스티렌 튜브에 붓습니다. 그런 다음 T 세포를 계수할 수 있습니다. T 세포를 웰당 200마이크로리터의 신선한 비장 세포 배지를 포함하는 웰당 5번째 세포에 2.5배 10의 농도로 둥근 바닥 96웰 플레이트에 시드합니다.
재조합 인터루킨 7 및 CD3/CD28 마그네틱 비드를 적절한 웰에 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.12시간 후, 각 웰의 세포 현탁액을 부드럽게 분쇄하여 비드 세포 응집체를 분해합니다. 그런 다음 각 웰의 세포 현탁액을 개별 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.
모든 세포가 수집되면 세포의 각 튜브를 한 번에 5분 동안 분리 자석에 넣고 튜브가 여전히 자석 내부에 있을 때 상등액을 각 배양이 끝날 때 새 폴리스티렌 튜브에 디캔팅합니다. 그런 다음 원심 분리로 세포를 수집하고 펠릿을 밀리리터 농도당 6번째 세포의 2배 10에서 6배로 신선한 비장 세포 배지에 재현탁합니다. 저분자 고처리량 스크리닝의 경우, 384웰 플레이트에 웰당 40마이크로리터의 세포를 플레이트화하고 세포 배양 인큐베이터에서 원하는 처리 기간 동안 선택한 약물 또는 비히클로 적절한 웰을 처리합니다.
GFP 분석 30분 전에 적절한 농도의 Hoechst 용액으로 세포를 염색하고 부드러운 피펫팅으로 염색을 철저히 분산시킵니다. 모든 웰이 염색되면 플레이트를 원심분리하여 웰 바닥에 있는 세포를 모으고 세포를 실온에서 15분 동안 휴지시킵니다. 제조업체의 지침에 따라 플레이트를 로드합니다.
그런 다음 목표를 40X 이상으로 설정합니다. UV 램프에 카메라 번호를 4로 설정한 다음 레이저 488에 대해 카메라 번호를 1로 설정합니다. 고함량 스크리닝 시스템에 플레이트를 로드합니다.
다음으로, 488나노미터와 자외선에서 필드당 2개의 순차적 판독값으로 웰당 6-10개의 필드를 판독하도록 자동화된 컨포칼 고함량 스크리닝 시스템을 설정합니다. CD3 양성 T 세포는 주어진 마우스 비장의 약 30%를 나타내며 10%의 기초 GFP 발현을 보여줍니다. CD3/CD28 T 세포 수용체 비드 자극 후 GFP 발현 비율이 5-6배 증가하는 것이 관찰됩니다.
마찬가지로, CD19 양성 B 세포는 총 비장 세포의 50-55%를 나타내며 기저 GFP 발현은 비활성화 T 세포와 유사합니다. 흥미롭게도, 항 마우스 IgG, IgM 및 재조합 CD40L을 사용한 B 세포 수용체 자극은 GFP 발현의 사소한 증가만 유발합니다. 방금 설명한 바와 같이 자기 비드 분리 후에도 분리된 CD3 양성 T 세포는 여전히 10%의 basal GFP 발현을 나타냅니다.
그러나 CD3/CD28 비드 자극은 GFP 반응의 상당한 상향 조절을 유도합니다. 마찬가지로, B cell magnetic bead 분리 후, 정제된 활성화된 B cell은 비장 세포에서 활성화된 B cell에 비해 더 높은 GFP 발현을 나타냅니다. 이 대표적인 실험에서 4398 화합물에 대한 1차 고처리량 스크리닝을 통해 T 세포 활성화의 여러 활성제와 억제제가 밝혀졌습니다.
그러나 자극된 T 세포의 관찰된 GFP 발현은 자극되지 않은 T 세포에 대해 측정된 것보다 20배 더 높았습니다. GFP 억제 화합물을 쉽게 검출할 수 있는 작용 영역의 창을 생성할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 36-48시간 안에 완료할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 각 단계 후에 셀 수를 계산하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 ELISA 또는 웨스턴 블로팅과 같은 다른 방법을 수행하여 다른 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 설치류에서 약물 발견 면역 조절을 위한 길을 열 것입니다.
이 동영상을 시청한 후에는 Nurr77 GFP 마우스 플레이트에서 유래한 T 또는 B 세포를 분리하고 활성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 연구는 형질전환 마우스의 림프구를 이용한 새로운 형광 기반 분석법을 제시하고, 이를 림프구 활성화를 조절할 수 있는 소분자의 고속 스크리닝에 적용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 신약 발견
- 세포 생물학
배경
- 이 분석법은 소분자 면역조절제를 식별하는 데 중점을 둡니다.
- 림프구 활성화 메커니즘에 대한 주요 질문을 다룹니다.
- 이 방법은 신약 발견 응용 프로그램에 적용할 수 있습니다.
- 절차 시연은 대학원생이 수행합니다.
연구 목적
- 면역조절제를 위한 고속 스크리닝 방법을 개발합니다.
- 림프구 활성화 및 억제에 대한 이해를 향상합니다.
- 향후 신약 발견 노력을 위한 플랫폼을 제공합니다.
사용된 방법
- 형광 기반 분석법 개발.
- Nurr77 GFP 형질전환 마우스로부터 림프구 분리.
- 소분자의 고속 스크리닝.
- 림프구 활성화의 시험관 내 분석.
주요 결과
- 림프구 기능을 조절하는 소분자의 성공적인 식별.
- 약물 발견을 위한 분석법의 적용 가능성을 입증했습니다.
- 림프구 활성화 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했습니다.
- 향후 면역학 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 확립했습니다.
결론
- 형광 기반 분석법은 면역학 연구를 위한 유망한 도구입니다.
- 새로운 면역조절 약물의 발견을 촉진할 수 있습니다.
- 이 연구는 림프구 생물학에 대한 더 깊은 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
High-throughput phenotypic screening of lymphocyte activation using a fluorescence-based assay enables rapid identification of immunomodulatory small molecules without a predefined target hypothesis. This platform supports early-stage drug discovery in immunology and transplantation by providing quantitative, scalable readouts of T and B cell responses. The assay's adaptability and throughput position it as a critical tool for portfolio triage and mechanistic de-risking in immunomodulator pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immunomodulatory hypotheses in primary lymphocytes using functional readouts.
- Supports biological de-risking by quantifying activation and inhibition across diverse compound libraries.
- Facilitates predictive confidence in target-agnostic screening for novel immune modulators.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative GFP-based outputs for high-throughput compound evaluation.
- Ensures reproducibility and scalability through automated confocal imaging and multi-well formats.
- Prepares validated cellular systems for downstream mechanistic or secondary assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant immune pathways by modeling T and B cell activation in vitro.
- Provides continuity from phenotypic screening to in vivo validation of immunomodulatory hits.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates based on functional immune modulation profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based lymphocyte assay integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging phenotypic screening with mechanistic follow-up and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-free screening and pathway clarification in immune cell activation.
- Screening: Offers robust, quantitative readouts for high-throughput evaluation of thousands of compounds.
- Analytics: Provides GFP intensity measurements to compare activation states and identify modulators.
- Translational Research: Facilitates selection of candidates for further in vitro and in vivo immunological studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various immune cell types and compound libraries for broad portfolio application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunomodulator discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with scalable, reproducible outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early functional triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunomodulatory candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary lymphocyte isolation and high-content fluorescence imaging.
- Needs access to automated confocal screening platforms and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell preparation and assay conditions.
- Adaptable to different immune cell subtypes and compound libraries with protocol optimization.
- Dependent on robust cell viability and activation controls for reliable data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Generation of Splenocyte Cell Suspension from Nur77GFP Mouse Spleens
2:07
T Cell Isolation from the Splenocyte Cell Suspension
3:26
T-cell Activation and the Induction of GFP Expression
4:42
High Throughput Screening of Small Molecule
6:05
Results: T and B Cell Receptors Activation Flowcytometry Results and a Representative T Cell HTS of Smal Molecules
7:56
Conclusion
