작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

이 형광 기반 림프구 분석의 전반적인 목표는 새로운 저분자 면역 조절제를 식별하는 것입니다. 이 방법은 림프구 활성화 및 억제 메커니즘에 관한 면역학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이러한 표현형 기능 분석의 주요 장점은 약물 발견 연구에 적용 가능하다는 점입니다.

시연은 저희 실험실의 대학원생인 Ahmed Fouda가 진행하겠습니다. 멸균 작업대 아래에서, 6~8주령의 암컷 Nurr77 GFP 마우스의 털을 70% ethanol로 소독한 후, 동물을 오른쪽으로 눕힙니다. 다음으로, 왼쪽 상복부의 피부와 근육을 절개하여 비장을 찾아 제거한 뒤, 해당 조직을 얼음 위에 놓인 비장세포 배지에 넣습니다.

모든 비장을 수집한 후, 조직을 5 mL의预열된 비장세포 배지가 들어 있는 10 cm² 세포 배양 접시로 옮기고, 멸균된 주사기 밀대를 사용하여 용액이 탁해질 때까지 조직을 으깹니다. 비장세포 배지에서 충분히 으깬 후, 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 튜브에 걸러 부유물을 제거하고, 생성된 단일 세포 현탁액을 원심분리합니다. 펠렛을 2~3 mL의 적혈구 용혈 버퍼에 재현탁하고, 20~30초 후에 5 mL의 RPMI 또는 다른 적절한 버퍼를 사용하여 반응을 중단시킵니다.

그런 다음 다시 한번 원심분리를 하여 세포를 수집하고, 세포 수 측정을 위해 펠렛을 2 mL의 비장세포 배지에 재현탁합니다. T 세포를 분리하기 위해 세포를 다시 원심분리하고, 펠렛을 1 × 10⁷ cells/mL 농도의 무혈청 RPMI 배지에 재현탁합니다. 세포를 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 나중에 순도 평가에 사용할 비장세포 100 µL 분주액을 따로 보관해 둡니다.

다음으로, 세포에 mL당 50 µL의 정상 쥐 혈청을 첨가한 후, T 세포 분리 항체 칵테일을 mL당 50 µL 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 10분 후, streptavidin이 결합된 자기 비드와 함께 세포를 2분 30초 동안 배양합니다. 그 다음, 최종 부피가 2.5 mL가 되도록 세포에 무혈청 배지를 첨가하고, 튜브를 세포 분리 자석에 3분 동안 둡니다.

배양 기간이 끝나면, 튜브를 자석에 고정한 상태에서 상층액을 새로운 폴리스티렌 튜브에 한 번에 붓습니다. 그런 다음 T 세포의 수를 측정할 수 있습니다. T 세포를 웰당 200 µL의 신선한 비장세포 배지가 포함된 라운드 바텀 96-웰 플레이트에 웰당 2.5 × 10⁵ cells 농도로 분주합니다.

적절한 웰에 재조합 interleukin 7과 CD3/CD28 자기 비드를 넣고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 12시간 후, 각 웰의 세포 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하여 비드-세포 응집체를 분쇄합니다. 그런 다음 각 웰의 세포 현탁액을 개별 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.

모든 세포의 수집이 완료되면, 각 세포 튜브를 분리 자석에 넣고 한 번에 5분 동안 유지하며, 배양이 끝날 때마다 튜브를 자석에 둔 상태에서 상층액을 새로운 폴리스티렌 튜브로 옮겨 담습니다. 그런 다음 원심분리를 통해 세포를 수집하고, 펠렛을 2 × 10⁶ cells/mL 농도의 신선한 비장세포 배지에 재현탁합니다. 소분자 고속 대량 스크리닝의 경우, 384-웰 플레이트의 각 웰에 40 µL의 세포를 분주하고, 세포 배양 인큐베이터에서 원하는 처리 기간 동안 해당 웰에 선택한 약물 또는 용매(vehicle)를 처리합니다.

GFP 분석 30분 전에 적절한 농도의 Hoechst 용액으로 세포를 염색하고, 부드럽게 피펫팅하여 염색액이 골고루 퍼지도록 합니다. 모든 웰의 염색이 완료되면, 플레이트를 원심 분리하여 세포를 웰 바닥에 모으고, 상온에서 15분 동안 세포를 방치합니다. 제조사의 지침에 따라 플레이트를 로딩합니다.

그다음, 대물렌즈를 40X 이상으로 설정합니다. 4번 카메라는 UV 램프에, 1번 카메라는 488 레이저에 설정하십시오. 플레이트를 하이 컨텐트 스크리닝(high content screening) 시스템에 로드합니다.

다음으로, 자동화 공초점 고함량 스크리닝 시스템을 설정하여 웰당 6~10개의 시야를 읽도록 하고, 각 시야당 488 nanometers 및 UV light에서 두 번의 순차적 판독을 수행합니다. CD3 양성 T 세포는 주어진 마우스 비장의 약 30%를 차지하며, 10%의 기저 GFP 발현을 나타냅니다. CD3/CD28 T 세포 수용체 비드 자극 후에는 GFP 발현 비율이 5~6배 증가하는 것이 관찰됩니다.

마찬가지로, CD19 양성 B 세포는 전체 비장세포의 50에서 55%를 차지하며, 기저 GFP 발현은 활성화되지 않은 T 세포와 유사합니다. 흥미롭게도, anti-mouse IgG, IgM 및 재조합 CD40L을 이용한 B 세포 수용체 자극은 GFP 발현의 아주 미미한 증가만을 유발합니다. 앞서 보여드린 것과 같이 자기 비드 분리를 거친 후에도, 분리된 CD3 양성 T 세포는 여전히 10%의 기저 GFP 발현을 보입니다.

하지만 CD3/CD28 비드 자극은 GFP 반응의 상당한 상향 조절을 유도합니다. 마찬가지로, B 세포 자기 비드 분리 후, 정제된 활성화 B 세포는 비장 세포 내의 활성화 B 세포와 비교하여 더 높은 GFP 발현을 보입니다. 이 대표 실험에서 4398개 화합물에 대한 1차 고속 대량 스크리닝을 통해 T 세포 활성제의 여러 활성제와 억제제가 밝혀졌습니다.

하지만 자극된 T 세포에서 관찰된 GFP 발현은 비자극 T 세포에서 측정된 값보다 20배 더 높았습니다. 이를 통해 GFP 억제 화합물을 쉽게 검출할 수 있는 작용 영역(window of action zone)을 생성할 수 있었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 36~48시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 각 단계 후에 세포 수를 세는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 절차 이후에 ELISA 또는 western blotting과 같은 다른 방법을 통해 추가적인 질문들에 대한 답을 구할 수 있습니다. 이 기술은 설치류의 면역 조절 약물 발견을 위한 토대를 마련할 것입니다.

이 영상을 시청한 후에는 Nurr77 GFP 마우스 플레이트에서 유래한 T 세포 또는 B 세포를 분리하고 활성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.