Name: 작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 학습하세요 형광 기반 림프구 분석법을 이용한 소분자 면역조절제 고처리량 스크리닝 방법을. Nurr77 GFP 형질전환 마우스에서 T세포 및 B세포를 분리하고 활성화하여 면역학 연구와 신약 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 몬트리올 대학교에서 제공하는 머크 Frosst 시동 기금에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 토론, 의견과 피드백을위한 면역학 및 암 연구를위한 연구소의 높은 처리량 플랫폼에서 박사 진 Duchaine와 도미닉 Salois에게 감사의 말씀을 전합니다. Moutih Rafei는 퐁 드 라 공들인 엉 상테 뒤 퀘벡 주니어 1 상을 보유하고있다.

모든 동물 프로토콜은 몬트리올 대학교의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 마우스가 더 활력 징후는 자궁 경부 전위 다음에하지 관찰 될 때까지 CO 2의 점진적 흡입에 의해 안락사시켰다. 절차는 동물이 인도적인 방법으로 안락사와 동물 관리에 캐나다위원회의 권고에 따라되었는지 확인하기 위해 인증 된 사람에 의해 수행되었다. 비장 매체와 흐름 - 세포 계측법 버퍼 1. 준비 <ol><li> 70 % 에탄올 세정 생물 후드 아래의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 미리 예열 로스웰 파크 메모리얼 연구소의 70 ㎖ (RPMI) 멸균 튜브 (시판 여과 500ml의 볼륨 살균 병 제공) 및 장소 1640 1X 매체를 제거합니다. 제거 된 매체는 프로토콜의 뒷부분에 사용됩니다. </li><li> 50ml의 비활성화 소 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 RPMI 나머지 430 mL의 1640 1X 보충용액 HEPES, 5 ㎖의 비 필수 아미노산, 5 ㎖ 피루브산 나트륨, 여과 0.05 ㎖ (1M) 2- 머 캅토 에탄올. 주 : 열 충격을 피하기 위해 세포를 37 ºC로 설정 한 수욕을 사용 전 따뜻한 비장 매체. 이 세포 사멸 유도를 방지하는 것이 중요하다. </li><li> , 유동 세포 계측법 버퍼를 준비하는 98 ml의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 FBS의 2 mL를 넣어 사용까지 (바람직하게는 내 삼일) 냉장 보관합니다. </li></ol> Nur77 GFP 마우스 비장의 비장 세포 현탁액의 2 세대 <ol><li> A는 septically 6 ~ 8 주 된 여성 Nur77 GFP 마우스에서 비장을 격리 할 것. <ol><li> 이를 달성하기 위해, 무균 후드하에 작동한다. 70 % 에탄올에 희생 마우스 모피, 가위와 집게를 만끽 해보세요. </li><li> 그 오른쪽에 마우스를 놓고 왼쪽 상단 복부 사분면의 피부와 근육을 잘라. 눈에 띄게 후 비장을 찾아 그것을 잘라하는 절개 영역을 검사합니다. 비장 유지전까지 얼음 비장 세포 배지에서 다음 단계를 수행한다. </li></ol></li><li> 예열 된 비장 세포 배지 5ml를 함유하는 10cm이 세포 배양 용 배양 접시에 비장 (들)을 놓는다. </li><li> 용액이 혼탁해질 때까지 멸균 주사기의 플런저를 사용하여 비장을 매쉬. 비장 콜라겐 매트릭스 절차의 종료에 의해 유지한다. </li><li> 비장 매체의 광범위한 숙성 후, 세포 현탁액을 수집하고 필터링 아웃하는 이물질이나 혈전을 50 mL의 관에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. </li><li> 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 상청액을 폐기 한 후 자체 제작 또는 상업적 적혈구 용해 완충액 2-3 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 다음 피펫 (2-3 시간) 20 ~ 30 초 동안 정지 휴식을 할 수 있습니다. </li><li> g 다음 X 500에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기 5 PBS의 용액 또는 선택의 적절한 버퍼를 추가합니다. </li><li> 붉은 색이어야한다 (상층 액을 제거 빨간색 B를 용해 포함로들 (100d) 세포) 및 재 정지 비장 세포 배지 2 ㎖의 세포 펠릿. </li><li> 혈구를 사용하여 라이브와 죽은 (괴사) 세포를 구분하는 트리 판 블루로 염색 된 세포의 수를 계산합니다. </li></ol> 비장 세포 현탁액 3. T 세포 분리 <ol><li> g X 500에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. 10 × 106 세포 / ㎖의 세포 농도를 얻기 위해, 무 혈청 RPMI 배지에서 세포 (단계 1.3 내지 50 ml)에 다시 대기. </li><li> 5 mL의 폴리스티렌 튜브에 세포 이동 및 정제 공정의 마지막에 별도로 순도 평가 / 비교 비장의 100 μL 분취를 설정한다. </li><li> T 세포 격리 항체 칵테일 (50 μL / mL)에 이어 50 μL / mL로의 세포 현탁액에 정상 쥐의 혈청을 추가합니다. </li><li> 세포 현탁액을 혼합하고 10 분 동안 휴식을 할 수 있습니다. 이 단계는 항체 칵테일 모든 원치 않는 세포를 결합 할 수 있습니다. </li><li> 스트렙 타비 딘 빠른 분야 추가 (자석2.5 분 동안 IC 비드) 다음 무 혈청 배지를 사용하여 2.5 mL의 부피를 가져온다. </li><li> 3 분에 대한 세포 분리 자석에 튜브를 놓습니다. </li><li> 자석을 잡고 하나의 움직임에 용액을 주입하여 새로운 폴리스티렌 튜브에 T 세포 현탁액을 전송합니다. 참고 : 격리 된 서스펜션은 정제 된 T 세포가 포함되어 있습니다. 모든 원하지 않는 세포는 자기 스트렙 타비 딘 비드에 결합 튜브 측에 유지된다. </li><li> 트립 판 블루 및 혈구를 사용하여 격리 된 T 세포를 카운트. 주 :이 단계에서 분리 된 T 세포의 순도 전에 유동 세포 계측법에 의한 T 세포의 분리 후 CD3 + 사건의 비율을 분석함으로써 (선택 사항) 검증 될 수있다. (13) <ol><li> 간단히, 원심 분리기 500 X g에서 비장 세포 현탁액 1 ㎖. 상층 액을 제거하고 1 × 106 세포 / ㎖의 농도로 유동 세포 계측법 버퍼 셀을 정지. </li><li> 형광 표지 된 항 MOUS 추가100 : 1의 농도로 전자 CD3 항체. 30 분 동안 4 ° C에서 품어. 한 번 세척, 원심 분리기 및 유동 세포 계측법에 의한 분석에 대한 흐름 세포 계측법 버퍼 (400 μL)에 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li></ol> 비장 세포 현탁액 4. B 세포 분리 <ol><li> T 세포 (3.1-3.8 단계) 그러나 B 세포 분리 키트를 사용하여 설명한 것과 동일한 프로토콜을 따른다. 순도 평가를 들어, 대신 CD3 항체의 CD19 항체를 사용합니다. (13) <ol><li> (선택 사항) 순도 평가를 들어, CD3 항체 대신 CD19 항체를 사용합니다. 500 X g에서 비장 세포 현탁액의 원심 분리기 1 mL를. 상층 액을 제거하고 1 × 106 세포 / ml의 농도로 유동 세포 계측법 버퍼 셀을 정지. </li><li> 추가 형광등 (1)의 농도로 항 - 마우스 CD19 항체에 태그 : 100, 30 분 동안 4 ℃에서 배양한다. 한 번 세척, 원심 분리기 및 유동 세포 계측법 버퍼 (400 μL) FO에서 다시 일시 중지유동 세포 계측법에 의해 연구 분석. </li></ol></li></ol> 5. T 세포 활성화 및 GFP 발현의 유도 <ol><li> / 웰 2.5 × 105 세포의 농도로, 둥근 바닥 96 웰 플레이트에, 서스펜션에서, T 세포를 시드. </li><li> 2 NG / mL의 CD3 / CD28 자석 구슬 (25 μL / 10 6 세포)에서 재조합 인터루킨 (IL)를 -7 추가합니다. 비 - 활성화 T 세포를 나타내는 이상 측정을위한 대조군으로 사용할 구슬 미처리 T 세포의 일부를 유지한다. </li><li> 12 시간 후, 부드럽게 각 세포 현탁액을 피펫 아니라 상하 어느 비드 세포 복합체 / 집계 침입하여 96- 웰 플레이트에서 T 세포를 수확. 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 모든 우물에서 정지를 수집합니다. </li><li> T 또는 B 세포의 정제를 위해 이전에 사용 된 동일한 세포 격리 자석 내부의 현탁액을 함유하는 튜브를 배치하고 5 분 동안 휴식을 허용한다. </li><li> T 세포 현탁액 INT 전송자석을 잡고 하나의 움직임에 용액을 주입하여 OA 새로운 폴리스티렌 튜브. </li><li> 5 분 동안 500 XG에 세포를 원심 분리기. 다시 중단 2 × 106 세포 / ml의 농도를 얻기 위해 새로운 비장 세포 배지에서 세포. </li><li> 비 - 활성화 T 세포와 비교하여 12 내지 24 시간 이후에 자극 (품질 관리 옵션) 유동 세포 계측법에 의한 GFP 발현 강도를 평가한다. (12) 주 : GFP 형광이 Nur77 GFP T 세포에 내재하고 TCR의 성공적인 활성화시에 발현된다. (12) </li><li> 현미경으로 생존 및 활성화 (선택 사항)의 평가를 들어, 0.2 μg의 / ㎖의 농도로 훽스트 30 분 전에 분석과 활성화 된 세포를 얼룩. 커버 슬라이드 또는 평저 블랙 양면 384- 웰 플레이트의 웰에 세포 현탁액의 적절한 양을 첨가하고 살아있는 세포를 평가하기 위해 형광 현미경으로 조사한다. 죽은 세포는 핵을 보유하지 않습니다더럽히는 것. (14) </li></ol> 6. B 세포 활성화 및 GFP 발현의 유도 <ol><li> 은 T-25 배양 플라스크를 사용하여, 1 × 106 세포 / ㎖에서 단리 된 B 세포를 다시 일시. </li><li> 200 NG / ml의 농도에서 10 μL / mL의에서 항 - 마우스 IgG / IgM의 (H + 1) 및 재조합 CD40L를 추가합니다. (비 - 활성화 된 B 세포를 나타냄) 후에 측정 대조군 역할을 미처리 상기 B 세포의 일부를 유지한다. </li><li> 비 - 활성화 된 B 세포와 비교하여 12 또는 24 시간 후 자극의 유동 세포 계측법에 의한 GFP 발현 강도를 평가한다. 참고 : GFP의 형광이 Nur77 GFP B 세포에 내재하고 BCR의 성공적인 활성화에 명시되어있다. (12) </li><li> 현미경으로 생존 및 활성화 (선택 사항)의 평가를 들어, 0.2 μg의 / ㎖의 농도로 훽스트 30 분 전에 분석과 활성화 된 세포를 얼룩. 세포 현탁액의에 적절한 볼륨을 추가형광 현미경 커버 슬라이드 또는 평면 바닥 검은 색면 384 웰 플레이트의 우물에와 검사는 살아있는 세포를 평가합니다. 죽은 세포는 핵 염색을 유지하지 않습니다. (14) </li></ol> 작은 분자 7. 높은 처리량 검열 <ol><li> 2 × 10 6 세포 / 활성화 된 T 또는 B 세포의 ㎖ (자석 구슬 또는 항체 / CD40L) 또는 비 활성화 그룹에서 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 플레이트 75,000 세포 / 웰의 384 웰 플레이트 (40 μL 볼륨). 평평한 바닥 검은 색면 384 웰 플레이트 또는 훽스트 얼룩을 사용하여 형광 현미경 (이전 HTS에 대한 선택적 품질 관리 단계)에 의해 생존 및 활성화 평가를위한 현미경 커버 슬라이드를 사용하여 (단계 5.8 및 자세한 내용은 6.4 참조). (14) </li><li> 수동 또는 자동화 된 시스템을 사용하여, 잘 각각 (0.5 % DMSO에 용해) 선택의 약물을 추가 할 수 있습니다. </li><li> (활성화) 양성 및 음성 (비 ACTI에 차량 (DMSO)를 추가비활) 제어 우물. 0.5 %의 최대 DMSO 농도를 조정한다. </li><li> 24 시간 (또는 배양 선택의 시간) 37 ºC에서 5 % CO 2의 접시를 품어. </li><li> (. 1 : 3333; 예를 들어, 50 μL에 총 부피를 생성하기 위해 384- 웰 플레이트에서 세포에 10 μL를 추가) 스크리닝의 날, 훽스트 33342 염색 액을 희석한다. 0.2 μg의 / ml의 농도를 달성하기 훽스트 용액을 첨가하여 GFP 분석 전에 30 분 얼룩. </li><li> 부드럽게 웰 각각에서 균일 한 분포를 얻기 위해 상하 세포를 피펫. 주 :이 단계는 세포의 반대 흐름 방향으로 상기 웰의 일측에 축적되는 경향으로 자동화 된 시스템을 사용하여 약물 (단계 7.3)를 송출하는 경우에 중요하다. </li><li> 실온에서 3 분 동안 45 XG에 플레이트 스핀. </li><li> 실온에서 15 분 동안 나머지 판을 떠난다. </li><li> 자동화 된 공 초점 높은 콘텐츠 scre를 사용하여, 플레이트 (들) 읽기 아웃을 수행, 체결 (HCS) 시스템. (15) 기계에 플레이트를 넣습니다. 40X 이상 배율로 목표를 설정합니다. 훽스트 (UV 램프) 및 GFP를위한 카메라 # 1 (레이저 488)에 대한 카메라 # 4를 사용합니다. 물론 당 6-10 필드를 읽을 수있는 기계를 설정합니다. 488 nm의 (GFP를 읽을) 및 자외선 (훽스트을 읽을)에서 필드 당이 순차적으로 판독을 수행하는 기계를 조정합니다. 40X 이상 배율로 목표를 설정합니다. 주 : 시스템이 조정을 필요로하지 않는 컴퓨터 현미경입니다. 초점 거리, 입사광의 강도와 노출 시간은 시스템에 의해 자동으로 모두 설치된다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

여러 판독 방법은 민감하고 안정적인 HTS 분석의 개발에 이용되고있다. 이러한 색채, 발광 또는 형광 방법을 포함한다. 비색 방법은 설정이 간단하지만, 그들은 방해하거나 세포가 테스트되고 중단시킬 수있는 화학 물질의 다수의 추가가 필요합니다. 약리 효과는 특정 포인트에서 평가 된 바와 같이 (23) 또한, 이들은 생물학적 반응의 동적 평가를 허용하지 않는다. 자동화 된 HTS 사용하는 경우 또한,이 방법은 고가의 로봇 아암을 필요로 할 수있다. 이러한 요인으로 인해 자신의 성가신 요구 사항과 낮은 감도 HTS의 목적에 비색 읽기 아웃을 덜 호환. 발광은 비색 분석의 대안으로서 제안되어 있지만 (23)은 HTS 이러한 발광 테스트의 적용은 일반적으로 인한 세포 용해의 요구에 한정된다. 비록 다른 비 용해 프로토콜 드 것처럼이미 개발은 생물 발광 신호의 세기가 검출 생물 발광 신호 및 세포 활성의 실제의 변화 사이의 불일치를 일으키는 등 루시페린...

높은 처리량 스크리닝 (HTS)을 널리 새로운 치료 분자의 식별을 위해 또는 새로운 의료 적응증에 FDA 승인 약물의 재배치 채택 입증 된 전략이다. 하나는 지금까지 달성 HTS 성공은 이전에 발견 된 약물의 과다에 의해 측정 될 수있다. 예를 들어, 티로신 키나제 억제제 라파티닙 유방암, 시타 글 립틴의 치료에 사용; 디펩 티딜 펩 티다 제 -4 (DPP-4) 억제제 항 혈당 약물로 사용하고, 만성 골수성 백혈병의 치료에 사용되는 경구 체 Bcr-Abl의 티로신 키나제 억제제 프라이 셀은 원래 발견 승인 된 약물의 긴리스트의 몇 가지 예를 나타내는 HTS. 제약 업계의 생산성 최근 새로운 화학 실체의 발견의 부족으로 고생하고 있지만 2 성공적인 약물 발견 가능성은 전임상 칸디다 수의 증가를 통해 향상시킬 수있다조절 성 생물 / 생화학 적 특성을 표시 TES. 따라서, 표현형 선별하도록 새로운 HTS 분석법의 개발은 신약 히트 발견 중요한 약리학 적 도구를 제공 할 수있는 가능성을 제공 할 수있다. 3, 4, 5, 6 더욱이, HTS 해주기 때문에 주문 설계된가요 로봇 설비, 신규 한 판독 기술 광범위한 소형화 포함한 최근의 상당한 기술적 변형으로 빠른 속도로 수행 될 수있다. 표현형 검사 (일명 앞으로 약리학)의 사용에 대한 관심이 증가에 기여하는 요인 중 2, 7은 기능적인 효과보다는 분자 표적 (목표 기반 검사 / 생화학 반응)에 대해 과도하게 단순화 환원 가정에 집중하는 것이 더 가능성이 있다는 인식이다 SHO하기<html> w 임상 효능. 따라서, 표현형 검사는 새로운 잠재적 치료 화합물 및 현재 치료가 질병의 분자 경로를 발견 할 수있는 약속을 보유하고있다. 이 제대로 주어진 분자 대상 또는 세포 기능에 대한 억제제 또는 활성제를 확인하려면, 매우 민감하고 신뢰할 수있는 분석은 선의의 히트와 오탐 (false positive)을 구별하기 위해 필요합니다. 그럼, 좋은 분석한다? 주어진 분석의 질은 제 (a 인자 Z를 통해 반사 된) 신호 대 잡음비에 의해 판단되어야한다. 여덟 번째로, 타겟 효과 나 화면의 목적은 명확 확립되어야한다. 특이 적으로 결합하는 리간드 - 수용체를 평가하도록 설계된 분석 반대로 예를 들면, 기능성 세포 기반 접근법 수용체 스크리닝 상당한 이점을 제공 할 수있다. 그 이유는 후자의 방법은 작용제 및 길항제 리간드를 구별 할 수 없다는 것이다.SS = &quot;외부 참조&quot;대조적&gt; 9 세포 - 기반 접근법은 수용체 기능 직접 생물학적 표현형에서 평가 될 수있는 더욱 효과적인 것으로 보인다 (증식, 세포주기 억류, 아폽토시스 및 / 또는 분화). 그러나, 그들 특정 대상 세포 침해 생화학 분석법 표현형 분석에 비해 상당한 이점을 제공 할 수 있음에 유의해야한다. 이후 행동의 약물 분자 메커니즘에 관한 조사를 단순화 잘 최적화 된 생화학 적 분석은 일반적으로 표현형 검사보다 적은 데이터 분산을해야합니다. 그러나, 타겟 기반 또는 생화학 적 분석의 주요 단점은 생물학적 시스템 (원래 생화학 적 분석에서 연구 된 특이성을 손실)에서 시험 할 때 비특이적 목표에 영향을 미칠 수있는 거짓 양성 히트의 속도를 증폭의 가능성이다. (10) 음성 및 양성 사이에 히트 노포 컷오프 포인트 위양성의 수를 최소화 할 수 있지만 난N 차 스크리닝은 이러한 손상 세포, 조직 전체의 전부 또는 동물로 네이티브 셀룰러 환경을 흉내 낸 생리 관련 시스템의 사용은 분석의 디자인 진자의 코어 남아있다. 따라서, 표현형 검사는 화합물의 활동이나 행동의 모드에 대한 사전 지식없이 어떤 확인 된 약물 표적과 질병에 대한 바람직한 / 생물학적 표현형 효과를 리드 발견 할 수 있습니다. (11) 시판되는 마우스 모델, 화학적 화합물의 클러스터 서브 가족 : 본원의 연구는 두 가지 중요한 구성 요소를 기반으로 최적의 재현성 표현형 선별 개발 및 테스트에 관한 것이다. 동물 모델에 대하여, 상기 분석은 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현 번째로 구동되는 마우스 스트레인 (Nur77 GFP) 카세트를 함유하는 세균 인공 염색체를 보유하는 유래의 림프구의 사용에 의존전자 Nur77 프로모터. (12)이 자극의 특징은 Nur77는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 B 세포 수용체 (BCR) 자극 다음 상향 조절 즉각적인 초기 유전자라는 사실에 기초한다. 스크리닝 방법 자체로서 12 접근법은 큰 화학 라이브러리 (&gt; 105 화합물)를 평가하는 데 필요한 시간을 최소화하면서 사소한 동족체의 선별을 방지하는 데 도움이되었다. 이를 위해 가상 스크리닝 도구를 사용하여 의약 화학자에 의해 선택된 화학적 화합물의 데이터베이스를 참조로 알려진 활성 종 구조를 사용하여 토폴로지와 유사한 화합물을 식별하는 데 이용 하였다. 이러한 접근 방식은 우리가 136,000 이상의 화학 실체의 전체 라이브러리를 나타내는 4398 화합물을 스크리닝 할 수있었습니다.

<table><tbody><tr><td>Nur77GFP 마우스</td><td>잭슨 실험실</td><td>마우스 균주 No. 016617</td><td>우리의 동물 시설에 집 내 식민지가 설립되었습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>96 wells-U 배양 플레이트, 멸균</td><td>VWR International</td><td>10062-902</td> 마그네틱 비드 70 &micro<td>를 사용한 T 세포 활성화</td></tr><tr><td>; M 세포 여과기, 멸균</td><td>Corning Inc.</td><td>352350</td><td>비장 세포 세포 현탁액</td></tr><tr><td>생성 5ml 폴리스티렌 원형 바닥 튜브, 멸균</td><td>Corning Inc.</td><td>352058</td><td>비장 세포 세포 현탁액 50</td></tr><tr><td>ml 폴리프로필렌 원뿔형 바닥 튜브의 생성, 멸균</td><td>VWR International</td><td>89039-656&nbsp;</td><td>비장세포 세포 현탁액의 생성</td></tr><tr><td>바늘이 없는 10ml 주사기, 멸균</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305482</td><td>비장</td></tr><tr><td>T-25 배양 플라스크</td>를 으깨기 위해 <td>Greiner Bio-One</td><td>690 175</td><td>활성화 중 B 세포를 incudabte 5ml</td></tr><tr><td>세포 배양 접시, 멸균</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627 160</td><td>비장을 으깨기 위해</td></tr><tr><td>페니실린- 스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>WISENT Inc.</td><td>450-200-엘&nbsp; &nbsp;</td><td>비장세포 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>RPMI 1600 중탄산나트륨 및 L-글루타민</td><td>WISENT Inc.</td><td>350-002-CL&nbsp;</td><td>비장세포 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>WISENT Inc.</td><td>321-010-엘&nbsp;</td><td>비장세포 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>HEPES 유리 산 1M</td><td>WISENT Inc.</td><td>330-050-엘&nbsp;</td><td>비장세포 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>피루브산나트륨 용액 (100mM)</td><td>WISENT Inc.</td><td>600-110-엘&nbsp;</td><td>비장세포 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>소 태아 세럼 (FBS)&nbsp;</td><td>(주)위센트</td><td>080-910&nbsp;</td><td>비장세포 배지 및 유세포 분석 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>311-010-CL</td><td>유세포 분석 완충액</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올 (55 mM)</td>의 구성 요소<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td>비장 세포</td></tr><tr><td>배지 T-세포 분리 키트</td>의 구성 <td>요소 Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td>T 세포 B</td></tr><tr><td>-세포 분리 키트</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>B 세포 분리</td></tr><tr><td>마우스 T-Activator CD3/CD28 초상자성 비즈</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11452D</td><td>T 세포 활성화&nbsp;</td></tr><tr><td>세포 분리 자석</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td>T 세포를 분리하고 자성 비드를 제거하려면&nbsp;</td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 단편 염소 안티 마우스 IgG + IgM(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>115-006-068</td><td>B 세포를 자극하기 위해</td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17&nbsp;</td><td>활성화 중 T 세포 생존을 지원하기 위해</td></tr><tr><td>재조합 CD40L</td><td>R& D Systems</td><td>8230-CL/CF</td><td>B 세포 자극</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD3 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>561799</td><td>유세포 분석을 위해 T 세포</td></tr><tr><td>염색 안티 마우스 CD19 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td>유세포 분석을 위해 B 세포 염색</td></tr><tr><td>Biomek FXp</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>A31842</td>: <td>24시간 배양 후 세포 재부유,</td></tr><tr><td>Opera Phoenix High Content Screening System</td>, <td>PerkinElmer, Inc.</td><td>HH14000000</td><td>GFP/Hoechst 신호를 분석하려면</td></tr></tbody></table>

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

높은 처리량 스크리닝 (HTS)는 현재 생화학 반응 또는 세포 과정을 조절할 수있는 화학 엔티티의 식별을위한 대들보이다. 바이오 기술의 진보 및 작은 분자의 병진 높은 전위, 신약 혁신적인 접근 방법은 HTS의 사용에 관심을 부활 설명하는 진화 해왔다. 종양학 필드는 현재 이식 관련 합병증 또는자가 면역 질환을 대상으로 새로운 면역 조절 화합물의 식별을 위해 만든 더 큰 혁신과 약물 검사에 대한 가장 활발한 연구 분야이다. 여기서는 관내 뮤린 형광 계 분석에서 림프구 신규 쉽게 새로운 면역 조절 화합물을 동정하도록 제안한다. 상기 분석은 Nur77 프로모터 T- 또는 B 세포 수용체 자극에 GFP 발현을 구동하는 트랜스 제닉 마우스로부터 유도 된 T 세포 또는 B를 사용한다. GFP의 강도가 반영하는 바와 같이,표적 세포의 활성화 / 전사 활성은, 우리의 분석은 셀룰러 / 생물학적 반응에 대한 특정 화합물 (들)의 효과를 연구하기위한 신규 도구를 정의한다. 예를 들어, 차 스크리닝은 면역 활동 전위를 디스플레이 (160)의 히트 식별되었다 「타겟 가설 &quot;의 부재 하에서 4,398 화합물을 사용하여 수행 하였다. 따라서, 이러한 분석의 사용은 시험 관내 / 생체 내 유효성 연구를 촉진하기 전에 큰 화학 라이브러리를 탐색 신약 프로그램에 적합하다.

고온 초전도 분석의 디자인 본원 형광 분석법을 설계 할 때 중요한 두 가지 요인을 고려 하였다. 먼저, T- 또는 B 세포 활성화는 질병 (예를 들어, 이식편 대 숙주 병)을 나타내는 것이되는 생리 학적 상태를 재현 할 필요가 있었다. 둘째, 세포 활성에 대한 평가가 민감하고 정량적 인 방법을 이용하여 수행되어야한다. 그것은 이러한 요구에 대응으로 형광 요즘 HTS 읽기 아웃에 대한 기본 선택 중 하나입니다. 10, 16 강력한 GFP 판독이 Nur77 GFP에 따라 얻을 수있는 바와 같이, 시험 관내 또는 생체 내에서 모두 T ...

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

이 형광 기반 림프구 분석의 전반적인 목표는 새로운 저분자 면역 조절제를 식별하는 것입니다. 이 방법은 림프구 활성화 및 억제 메커니즘에 관한 면역학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이러한 표현형 기능 분석의 주요 장점은 약물 발견 연구에 적용 가능하다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 대학원생인 Ahmed Fouda가 진행하겠습니다. 멸균 작업대 아래에서, 6~8주령의 암컷 Nurr77 GFP 마우스의 털을 70% ethanol로 소독한 후, 동물을 오른쪽으로 눕힙니다. 다음으로, 왼쪽 상복부의 피부와 근육을 절개하여 비장을 찾아 제거한 뒤, 해당 조직을 얼음 위에 놓인 비장세포 배지에 넣습니다.모든 비장을 수집한 후, 조직을 5 mL의预열된 비장세포 배지가 들어 있는 10 cm² 세포 배양 접시로 옮기고, 멸균된 주사기 밀대를 사용하여 용액이 탁해질 때까지 조직을 으깹니다. 비장세포 배지에서 충분히 으깬 후, 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 튜브에 걸러 부유물을 제거하고, 생성된 단일 세포 현탁액을 원심분리합니다. 펠렛을 2~3 mL의 적혈구 용혈 버퍼에 재현탁하고, 20~30초 후에 5 mL의 RPMI 또는 다른 적절한 버퍼를 사용하여 반응을 중단시킵니다.그런 다음 다시 한번 원심분리를 하여 세포를 수집하고, 세포 수 측정을 위해 펠렛을 2 mL의 비장세포 배지에 재현탁합니다. T 세포를 분리하기 위해 세포를 다시 원심분리하고, 펠렛을 1 × 10⁷ cells/mL 농도의 무혈청 RPMI 배지에 재현탁합니다. 세포를 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 나중에 순도 평가에 사용할 비장세포 100 µL 분주액을 따로 보관해 둡니다.다음으로, 세포에 mL당 50 µL의 정상 쥐 혈청을 첨가한 후, T 세포 분리 항체 칵테일을 mL당 50 µL 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 10분 후, streptavidin이 결합된 자기 비드와 함께 세포를 2분 30초 동안 배양합니다. 그 다음, 최종 부피가 2.5 mL가 되도록 세포에 무혈청 배지를 첨가하고, 튜브를 세포 분리 자석에 3분 동안 둡니다.배양 기간이 끝나면, 튜브를 자석에 고정한 상태에서 상층액을 새로운 폴리스티렌 튜브에 한 번에 붓습니다. 그런 다음 T 세포의 수를 측정할 수 있습니다. T 세포를 웰당 200 µL의 신선한 비장세포 배지가 포함된 라운드 바텀 96-웰 플레이트에 웰당 2.5 × 10⁵ cells 농도로 분주합니다.적절한 웰에 재조합 interleukin 7과 CD3/CD28 자기 비드를 넣고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 12시간 후, 각 웰의 세포 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하여 비드-세포 응집체를 분쇄합니다. 그런 다음 각 웰의 세포 현탁액을 개별 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.모든 세포의 수집이 완료되면, 각 세포 튜브를 분리 자석에 넣고 한 번에 5분 동안 유지하며, 배양이 끝날 때마다 튜브를 자석에 둔 상태에서 상층액을 새로운 폴리스티렌 튜브로 옮겨 담습니다. 그런 다음 원심분리를 통해 세포를 수집하고, 펠렛을 2 × 10⁶ cells/mL 농도의 신선한 비장세포 배지에 재현탁합니다. 소분자 고속 대량 스크리닝의 경우, 384-웰 플레이트의 각 웰에 40 µL의 세포를 분주하고, 세포 배양 인큐베이터에서 원하는 처리 기간 동안 해당 웰에 선택한 약물 또는 용매(vehicle)를 처리합니다.GFP 분석 30분 전에 적절한 농도의 Hoechst 용액으로 세포를 염색하고, 부드럽게 피펫팅하여 염색액이 골고루 퍼지도록 합니다. 모든 웰의 염색이 완료되면, 플레이트를 원심 분리하여 세포를 웰 바닥에 모으고, 상온에서 15분 동안 세포를 방치합니다. 제조사의 지침에 따라 플레이트를 로딩합니다.그다음, 대물렌즈를 40X 이상으로 설정합니다. 4번 카메라는 UV 램프에, 1번 카메라는 488 레이저에 설정하십시오. 플레이트를 하이 컨텐트 스크리닝(high content screening) 시스템에 로드합니다.다음으로, 자동화 공초점 고함량 스크리닝 시스템을 설정하여 웰당 6~10개의 시야를 읽도록 하고, 각 시야당 488 nanometers 및 UV light에서 두 번의 순차적 판독을 수행합니다. CD3 양성 T 세포는 주어진 마우스 비장의 약 30%를 차지하며, 10%의 기저 GFP 발현을 나타냅니다. CD3/CD28 T 세포 수용체 비드 자극 후에는 GFP 발현 비율이 5~6배 증가하는 것이 관찰됩니다.마찬가지로, CD19 양성 B 세포는 전체 비장세포의 50에서 55%를 차지하며, 기저 GFP 발현은 활성화되지 않은 T 세포와 유사합니다. 흥미롭게도, anti-mouse IgG, IgM 및 재조합 CD40L을 이용한 B 세포 수용체 자극은 GFP 발현의 아주 미미한 증가만을 유발합니다. 앞서 보여드린 것과 같이 자기 비드 분리를 거친 후에도, 분리된 CD3 양성 T 세포는 여전히 10%의 기저 GFP 발현을 보입니다.하지만 CD3/CD28 비드 자극은 GFP 반응의 상당한 상향 조절을 유도합니다. 마찬가지로, B 세포 자기 비드 분리 후, 정제된 활성화 B 세포는 비장 세포 내의 활성화 B 세포와 비교하여 더 높은 GFP 발현을 보입니다. 이 대표 실험에서 4398개 화합물에 대한 1차 고속 대량 스크리닝을 통해 T 세포 활성제의 여러 활성제와 억제제가 밝혀졌습니다.하지만 자극된 T 세포에서 관찰된 GFP 발현은 비자극 T 세포에서 측정된 값보다 20배 더 높았습니다. 이를 통해 GFP 억제 화합물을 쉽게 검출할 수 있는 작용 영역(window of action zone)을 생성할 수 있었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 36~48시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 각 단계 후에 세포 수를 세는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 절차 이후에 ELISA 또는 western blotting과 같은 다른 방법을 통해 추가적인 질문들에 대한 답을 구할 수 있습니다. 이 기술은 설치류의 면역 조절 약물 발견을 위한 토대를 마련할 것입니다.이 영상을 시청한 후에는 Nurr77 GFP 마우스 플레이트에서 유래한 T 세포 또는 B 세포를 분리하고 활성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 약물의 민감하고 신속한 스크리닝을 위한 생물 발광 분석의 유용성을 강조하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 약물은 단독으로 또는 조합하여 작용 방식의 시너지 효과를 평가할 수 있습니다.

세포 생물 발광 기반 분석법: 조합 약물 스크리닝을 위한 고처리량 방법

이 동영상은 형광 기반 분석을 통한 면역 조절 화합물의 스크리닝을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질 발현 카세트를 가진 형질전환 마우스 유래 T 림프구는 이러한 화합물로 처리됩니다. 향상된 GFP 신호와 감소된 GFP 신호를 통해 화합물의 자극 및 억제 효과를 각각 식별할 수 있습니다.

면역조절 화합물 스크리닝을 위해 엔지니어링된 림프구를 사용한 형광 기반 분석

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

학습하세요 형광 기반 림프구 분석법을 이용한 소분자 면역조절제 고처리량 스크리닝 방법을. Nurr77 GFP 형질전환 마우스에서 T세포 및 B세포를 분리하고 활성화하여 면역학 연구와 신약 개발에 활용할 수 있습니다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

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