Name: 지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 배우세요 지역 필드 형광 현미경법을 이용하여 심장 내부 칼슘 농도와 막 전위를 측정하는 방법을. Langendorff 장치와 분자 프로브를 활용해 심근경색 및 허혈 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 제시된 작품의 중요한 논의 박사 알리샤 Mattiazzi 감사합니다. 이 작품은 NIH로부터 연구비 (R01 HL-084487) ALE에 지원되었다.

이 프로토콜은 모든 마우스 처리는 UC 머 시드 기관 동물 관리 및 사용위원회 (제 2008-201)에 의해 승인되었다. 앵무새와 실험 과학 연구에 대한 베네수엘라 연구소 (이 비치)의 과학위원회에 의해 설립 동물 사용의 일반적인 정책에 따라 1999 년에 실시 하였다. 1. 랑겐 돌프 세트까지 준비 <ol><li> 140의 NaCl, 5.4 KCl을,이 CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 0.33 HPO 4, 10 글루코스, 10 HEPES 2 나트륨 : MM에서 다음과 용질 농도를 함유 타이로드 용액을 제조 하였다. NaOH로 7.4로 타이로드 용액의 pH를 조정 한 후 0.22 ㎛의 필터를 통해 용액을 필터. </li><li> 60 ML의 주사기에 타이로드 용액 (11), (12)는도 4에 도시 설정 수평 랑겐 돌프의 모든 튜브를 넣습니다. 모든 기포를 제거해야합니다. </li><li><stroNG&gt;도 4에 도시 된 바와 같이 침수 플라스틱 &quot;에어 스톤&quot;을 사용하여 100 % O 2 평형 타이로드 용액. <ol><li> 오 2 탱크에 플라스틱 튜브를 연결합니다. </li><li> 60 ML의 주사기에서 타이로드 용액에 5 &quot;튜브를 낮추기 위해 플라스틱 티 어댑터를 추가합니다. </li><li> 타이로드 솔루션으로이 뜻 거품 밖으로 O 있도록 5 &quot;튜브의 끝 부분에 플라스틱 공기 돌을 연결합니다. </li></ol></li><li> 캐 뉼러로 사용되는 바늘 주위에 비 흡수성 수술 용 봉합사를 놓습니다. 니들은 다른 솔루션 역 관류를 허용하는 매니 폴드 (도 4 참조)에 결합된다. 마지막으로, 심장의 대동맥은 바늘로 유관됩니다. </li></ol> 2. 동물 준비 및 심장 해부 <ol><li> 헤파린 마우스를 달아 주입 (예. 마우스 무게 20g의 20 단위 또는 200 μL로 주입) 자궁 전위에 의해 안락사 전에 15 분. 마취 잉꼬 따라 t오 동물을 사용하여 IACUC 프로토콜의 가이드 다음은 자궁 경부 전위를 진행합니다. 참고 : 8 주 오래 된 마우스 또는 20g의 앵무새를 사용합니다. </li><li> euthanization 후 흉강에서 마음을 제거합니다. 마우스에 대한 설명과 동일하게 잉꼬 마음의 압축을 풉니 다. <ol><li> 에탄올로 마우스의 가슴을 청소합니다. </li><li> 해부 가위를 사용하여 하복부에 절개를 한 후 목을 향해 측면을 잘라. </li><li> 절단 된 조직을 다시 당겨 아래로 핀. </li><li> 다이어프램을 잘라. 심장의 손상을 방지하기 위해 조리개를 절단 할 때주의해야합니다. </li><li> 폐와 주변 조직을 제거합니다. </li><li> 를 압박하지 않고 마음을 특종 핀셋을 사용합니다. 가능한 한 오랫동안 대동맥을 잘라. </li></ol></li><li> 약 1 mL의 타이로드 용액을 작은 무게 보트에 마음을 전송. </li><li> 비 흡수성 봉합사를 사용하여 수술하는 통해 수평 랑겐 돌프 장치 상 대동맥 넥타이바늘. 이 미세 핀셋의 도움으로 심장 대동맥을 묶어. 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로 위치한 밸브를 개방하여 역 관류를 시작한다. </li><li> 심장이 10 분 동안 안정화 할 수 있습니다. 피와 염료를로드하기 전에 심장 주위의 지방 조직을 청소하는이 시간을 사용합니다. 핀셋으로 마음의베이스 근처의 지방 조직을 당겨 작은 해부 가위를 사용하여 잘라. 해부 현미경의 관점에서이 작업을 수행해야합니다. </li></ol> 3. 세포질 칼슘 측정 : 염료 루비로드 - 오전 2시 준비 <ol><li> 염료를 50㎍을 함유하는 염료 제조업체에서 제공하는 특수 패키징 플라스틱 바이알 DMSO의 20 % 플루 20 μL (비이 온성 계면 활성제)를 추가한다. </li><li> 거품을 피하고로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 비이 온성 계면 활성제 및 투명한 유리 바이알에 특별한 포장 플라스틱 바이알에서 염료 혼합 DMSO 전송. 타이로드의 SOLU 1 mL를 넣고투명한 유리 병에 기. </li><li> 목욕 초음파기에서 15 ~ 20 분 동안 초음파 처리. </li><li> 실온에서 30 분 동안 연동 펌프를 사용하여 염료를 관류. <ol><li> 염료 실에 염료를 놓습니다. </li><li> 매니 폴드에 연결된 모든 다른 배관 라인을 압축하는 기계적 클램프를 사용한다. 클램프는 매니 폴드 위에 배치됩니다. 이를 60 mL의 주사기에 연결된 배관에 역류하는 것을 방지한다. </li><li> 염료를 순환 시작 관류 연동 펌프를 켭니다. 즉시 60 ml 주사기 아래의 3 방향 밸브를 닫는다. </li><li> 심장에 관류 된 염료를 재순환하는 마음 옆에 흡입 연동 펌프에 연결된 작은 튜브를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 4. 내부-SR 칼슘 2 + 측정 : 염료 매기 - Fluo4AM 준비 <ol><li> 루비로드 - 오전 2시와 동일한 방식으로 매기 - Fluo4AM를 준비합니다. 단계별 지침은 3 장을 참조하십시오. </li><li> Afte염료 로딩 R, 역 관류를 시작 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로있는 밸브를 연다. 매니 폴드 위의 클램프를 제거해야합니다. </li><li> 수평 챔버에 타이로드 솔루션을 추가하고 37 ° C로 예열. </li><li> 45 분 동안 타이로드 솔루션 레트로 관류는 세포질 염료를 제거합니다. </li></ol> 5. 멤브레인 잠재적 인 측정 : 염료 디 - 8 - ANEPPS 준비 <ol><li> 염료 5 ㎎을 포함하는 염료 바이알에 99 % 에탄올 5 mL를 추가한다. </li><li> 나누어지는 리피터 피펫을 사용하여 500 개인 1 ML의 플라스틱 튜브에 10 μL. </li><li> -20 ° C에서 고속 진공 건조하는 저장소. </li><li> 건조 된 염료의 10 μg의와 플라스틱 병에 20 20 %의 μL 플루 DMSO에 추가합니다. </li><li> 거품을 피하고로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 플라스틱 병에서 눈금 실린더 (10 ㎖)에 플루와 염료로 DMSO를 포함 믹스를 전송합니다. 최종 VO에 타이로드 솔루션을 추가5 ㎖의 LUME. </li><li> 목욕 초음파기에서 20 ~ 25 분 동안 초음파 처리. </li><li> 연동 펌프를 사용하여 30 분 동안 심장 내로 관류. 3.5 절에서 단계별 지침을 참조하십시오. </li></ol> 6. 심 외막 신호를 기록 <ol><li> 염료를로드 한 후, 매니 폴드 위의 클램프를 제거하여 타이로드 용액과 마음을 복고 - 관류. 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로있는 밸브를 연다. 10 분 동안 레트로 관류의 타이로드 솔루션은 마음을 안정. </li><li> 타이로드 솔루션 가로 실을 작성하고 37 ° C로 목욕 온도를 가지고 펠티에 장치의 전원을 켭니다. </li><li> 마음의 표면에 광섬유를 배치합니다. <ol><li> 2 mL를 피펫 내부의 광섬유를 배치 한 다음 미세 조작기에 피펫을 첨부합니다. </li><li> 약간 LV의 표면에 광섬유를 눌러 미세 조작기를 사용합니다. </li></ol></li><li> 외부 난방 조절이파형 발생기에 의해 제어되는 자극과 실온. <ol><li> 1 ms의 폭의 사각형 펄스를 제공하는 파형 생성기 프로그램. </li><li> 외부 적으로 동기화 될 수있는 자극을 설정하고 파동 발생기에 외부 입력을 연결한다. </li><li> 자극기의 각 출력에, 마지막에 납땜 침술 바늘로 와이어를 연결합니다. </li><li> 약 3mm 떨어져 서로 마음의 정점에 모두 침을 놓습니다. </li><li> 바늘이 조직에 배치됩니다 만 후 전기 충격을 방지하기 위해 자극기의 출력을 켭니다. </li></ol></li><li> 인수 소프트웨어에서, 10 kHz로 획득 주파수를 조정합니다. </li></ol> 7. 심 내막 신호를 기록 <ol><li> 염료를로드 한 후 마음을 안정시키기 위해 6.1 및 6.2 단계를 참조하십시오. </li><li> 광섬유의 크기를 급격히 23Ga 점을 이용하여, 격벽에 가까운 LV 심장의 표면에 작은 구멍을 만든다. </li> &lt;리&gt;은 미세 조작기를 이용하여 내막에 처음으로 광섬유의 위치에 도움이되도록 유리체 강내 수술 공막 어댑터를 놓습니다. </li><li> 외부 마음을 조절이. 6.4 단계를 참조하십시오. </li><li> 수집 소프트웨어에서, 10 kHz로 획득 주파수를 조정합니다. </li></ol>

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이 문서는 심장 근세포 생체의 기능을 평가하기 위해 국소 체 형광 기술을 설명하기에 중심. 결합 된 환경에서 이러한 세포의 연구뿐만 아니라 더 많은 생리적 인뿐만 아니라 장기 레벨 병리학을 평가하기위한 매우 적합하다. 여기 수축 커플 링 (ECC)를 기본 셀룰러 이벤트 세포 내 칼슘 역학을 모니터링 분자 프로브의 사용과 전체 기관 수준에서 (루비로드 2 세포질 칼슘을 매기-Fluo4 SR 칼슘) 평가 될 수 있으며, 전기 활동 (디 -8- ANEPPs). 여기, 우리는 모두 흥분과 광섬유를 이용하여 형광 지표에서 방출을 수집 세 LFFM의 표면 형광 기법을 제시 하였다. 이들은 사용 된 광원과 광 변조의 유형에 따라 다르다. LEDFM도 PLEDFM에 펄스 수의 LED를 사용하는 반면 PLFFM는, 빛, CLFFM 연속 레이저 빛을 사용하여 펄스 레이저를 사용합니다. 이 모든한 세트로서도 1에 제시되지만, 세 개의 표면 형...

핵심은 심장 혈관 시스템의 중심 기관이다. 심장의 수축은 세포 내에서 증가 [칼슘 2 +]에 의해 시작된다. 세포 내 칼슘 방출의 전기적 흥분성 변화 사이의 관계는 역사적으로 효소 적 세포 해리 (1, 2)에서 연구되고있다. 그러나, 심근 세포 대사되어 전기적 및 기계적 4 3 결합된다. 격리되면, 근육 세포가 물리적으로 결합되지 없지만, 상이한 계층에서 심근 세포를 해리 5 동안 혼합한다. 또한, 전압 클램프 조건 하에서 분리 된 세포 연구로부터 나왔다 막대한 장점, 6, 7, 8의 전기 syncytium ALWA 같은 심장의 본질 불구YS는 조직 3에 존재하는 것과 세포를 분해하는 방법을 기능적으로 다른 질문을 제기. 이 논문에서는 본래 심장 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 기술을 사용하여 심장 생리학의 기술에서 얻어진 발전을 설명한다. LFFM는 세포질 칼슘, 내 근질 세망 (SR) 칼슘과 막 잠재력 등 여러 생리적 변수를 측정하는 형광 표시를 사용합니다. 이러한 측정은 심실 압력 9, 10, 9 심전도, 전기 활동 전위 (APS), 이온 전류 및 기록 갇힌 화합물 (4)의 플래시 광분해, (11)과 함께 동시에 얻을 수있다. 또한, 이들 측정은 가까운 높은 주파수에서 그대로 심장 페이싱에 의해 얻을 수있다생리 요금에 연구. 여러 문서 있지만 9, 11, 12, 13, 14 LFFM 기술을 이용하여 우리 그룹에 의해 출판 된, 이러한 기술과 관련된 기술적 인 복잡성의 추정은 심장 및 다른 기관에 생체 생리 현상 공부의 다량 사용을 방지하고있다. LFFM 기술 (도 1)이 조직과 접촉하는 멀티 모드 광파이버를 사용하여 얻어진 표면 형광 측정에 기초한다. 접촉 형광 영상 법처럼, 광학 해상도는 직경, 섬유의 개구 수 (NA)에 따라 달라진다. 광섬유의 NA보다 작은 직경 측정의 공간 해상도를 증가시킬 것이다. NAS 및 섬유 직경은 각각 0.22에서 mm 0.66과 μm의 1 (50)에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 에서개구를 주름은 큰 입체각에서 도착 광자를 받아들임으로써 잡음비 (S / N)에 신호를 개선한다. 표면 형광 장치로서 작용하기 위해서는, 광 빔은 비구면 렌즈 표면 형광 또는 목적을 가진 광섬유에 집중되는 경우, 렌즈의 NA와 광 매치. 이 검색은 여기 및 형광 물질에 의해 방출되는 광자를 다시 수집하는 에너지 전달을 최대화한다. 조직에 들어 외인성 형광 표시기를 자극하기 위해, 다른 광원, 조명 모드가 이용 될 수있다. 펄스 지역 필드 형광 현미경 (3), 12 (PLFFM)를 사용하여 우리의 선구적인 연구는 저가의 피코 초 레이저 (그림 1a, PLFFM)를 사용. 광원이 유형의 실질적으로 인한 색소 표백 않고 조명 영역 하에서 형광 분자의 흥미로운 큰 분획의 큰 장점을 갖는다짧은 펄스 (12) 기간. 게다가 초단 펄스의 사용은 염료 (12)의 형광 수명의 평가를 허용했다. 형광 수명은 칼슘 결합 염료 분자의 비율을 정량하는 데 사용될 수있는 특성이다. 불행히도, 펄스 간에서 진폭 펄스 및 변화의 시간적 터링 색소에 결합하는 리간드에 의해 생성 된 형광의 변화가 큰 경우에,이 실험 전략의 적용을 제한한다. 연속파 (CW) 레이저는 일반적 LFFM (도 1b, CLFFM)의 메인 조명 원으로 사용된다. 레이저 빔은 연속 조직을 조명하거나 ferroelectrically 변조 될 수있다. 빔의 강유전체 변조 마이크로 광 펄스를 생성 할 수있다. 이 변조는 외부의 하드웨어에 의해 제어 될 수있다. 이 절차는뿐만 아니라 극적으로 t을 감소그는 광 펄스의 시간적 지터하지만, 또한 서로 다른 파장의 광선을 혼합 할 수 있습니다. 보의 혼합은 다른 레이저에서 다중 광선에 의해 수행된다. 결과적으로, 상이한 스펙트럼 특성을 가지는 다수의 염료는, 예를 들면, 생리 학적 변수의 다양한 측정을 수행하도록 기대 될 수 루비로드 -2- 세포질 칼슘 들면 MagFluo4 인트라 SR 칼슘 및 디 -8- ANEPPS 대한 대 막 잠재력. LFFM의 광원으로서 레이저가 본 다양한 장점 있지만, 광원의 다른 유형의 발광 다이오드 (LED)를 포함하여 사용할 수있다. 이 경우, 상기 여기 광원은 InGaN으로 LED (도 1C, PLEDFM)로 구성되었다. 전도대의 전자가 가전 자대의 정공과 재결합 할 때의 LED에서 광자 자발적 방출된다. 고체 레이저와의 차이는 발광 다른 광자에 의해 자극되지 않는다는 것이다. 이것은 비 - 간섭 성 빔의 결과LED의 넓은 스펙트럼 방사. 하이 파워 LED의 종류가 사용될 수있다. 디 -8- ANEPPS 및 CA에 대해를 사용하여 AP의 레코딩을위한 2+ 과도 FLUO-4 또는 크기 - FLUO-4, 우리는 485 나노 미터 (블루), 20 nm의 절반 폭의 전형적인 피크 방출을 갖는 LED를 사용하여 기록 (그림 1D). 루비로드-2로 기록 칼슘 과도를 들어, LED는 540 nm의 (녹색), 35 nm의 (도 1D)의 절반 폭 일반적인 발광 피크를 가지고 있었다. LED는 밴드 파장에서 방출하기 때문에 자신의 스펙트럼 방사를 좁힐 필터를 필요로한다. 또, 펄스 광은 20 μs의 지속 시간 1.6 kHz의 속도로 생성 될 수있다. LED는 빠르고 전력 MOSFET 전계 효과 트랜지스터로 펄스 하였다. 다른 지표 동시 녹화 시간 다중화 LED에 의해 수행 될 수있다. 불행히도, LED에 의해 방출 된 광은 레이저 광과 비교하여 광섬유에 초점을 더 어렵다. 따라서, 우리의 주요 단점LED를 보내고 그들의 방출 프로파일 메인 축으로부터의 각도 변위 (± 15 °)를 가지며, 보조 광학 그것을 보정하기 위해 사용되어야한다는 것이다. 전술 한 광학 모든 구성에서, 여기 광은 다이크로 익 미러의 ​​도움으로 반사된다. 빔이어서 조직에 위치하는 다중 모드 광섬유 상에 비구면 렌즈는 현미경 대물 렌즈에 의해 집광된다. 모든 표면 형광 장치에서와 같이, 다이크로 익 미러는 출사 된 광으로부터 음원을 분리하는 역할을한다. 방출 된 빛의 스펙트럼은 반영 여기를 제거하기 위해 다시 차단 필터를 통해 이동한다. 마지막으로, 출사 광은 광 검출기 (도 1) 상에 목적으로 집중된다. 전류 빛의 전달은 실리콘 애벌 런치 포토 다이오드에 의해 수행된다. 이 다이오드는 빠른 응답 및 낮은 광 검출을 허용하는 높은 감도를 가지고있다. 그만큼애벌랜치 포토 다이오드에 의해 생성 된 광전류는 두 가지 방식으로 증폭 될 수있다 : 트랜스 임피던스 증폭기의 전압 (도 1F)로 전류 변환하는 저항성 피드백 요소 (도 1E)을 갖는 또는 적분기로. 첫 번째 방법을 사용하여, 출력 전압과 광전류 피드백 저항에 비례한다. 피코 초 레이저 펄스의 저항 검출의 전형적인 예는도 2a, 2b 및 2c에 도시되어있다. 패널 2a는 트랜스 임피던스 증폭기의 출력을 도시하고 패널 (2B)은 별표 (*)로 표시된 구간의 시간 전개를 보여준다. 피크 추적 알고리즘은 형광 응답 (12)의 피크 (적색)과베이스 (녹색)을 검출하도록 실시 하였다. 기본 형광 측정은 주변 조명기구에 의해 도입 된 애벌랜치 포토 다이오드의 암전류와 간섭 양자의 정보를 제공한다HT 및 전자기 커플 링. 피크 염기의 표현은도 2c에 도시된다. 이 그림은 박동 잉꼬 심장의 심장주기 동안 2 + 칼슘 결합 염료 (루비로드-2)에 의해 방출되는 형광을 보여줍니다. 두 번째 방법에있어서, 상기 적분기의 출력 전압 및 전류 피드백 용량의 함수이다 (도 2D, 2E 및 2F). 어떤 외부 조명과 제 1 및 펄스 LED로부터인가 된 광 펄스와 두 번째 그림 2 층은 두 개의 연속적인 통합주기를 보여줍니다. 자세한 설명은도 2g과 2 시간에 제시되어있다. 이 접근법은 더 힘든 있지만 의한 피드백 커패시터의 열 잡음의 부재로 큰 S / N을 제공한다. 기기는 여기 광을 모두 제어 다중화를 생성하고 headstage 통합 및 입술 명령하는 타이밍 단을 포함등 기간. 이것은 일반적으로도 데이터의 온라인 회귀 계산으로 통합 된 출력 신호의 디지털 미분을 행하는 디지털 신호 처리 회로가 수행된다. 저항 피드백을 사용하는 경우에는, 어느 A / D 수집 보드를 사용할 수있다. 마지막으로, 우리 LFFM 기법 다용도이며 하나 이상의 영역으로부터 기록하도록 구성 될 수있다. 빛의 경로에 빔 스플리터를 추가하면 우리는 두 개의 광섬유로 빛을 분할 할 수 있습니다. 각 광섬유는 그 외인성 형광 프로브로부터 독립적으로 여기시키기 조직 기록 방출 서로 다른 영역에 배치 될 수있다. 이 수정은 생리 학적 변수에 영향을 미치는 방법을 해부학 적 지역적 차이 평가하기 위해 우리를 허용합니다. 도 3은 두 개의 광 화이버는 전층 전기 또는 세포를 측정하기 위해 사용되는 CW 여기 광을 분할하기 위해 사용되는 빔 스플리터를 도시한다 [칼슘] 레벨 재치시간 마이너 침입. 전층 신호는 하나의 내막의 섬유 심실 벽의 외막 층의 다른 배치하여 기록 할 수있다. 따라서, LFFM 기술은 상이한 영역에서 셀룰러 신호의 시간 경과를 측정하는 기능이 지역 변경 병리학 적 상황에서 발생하는지 테스트하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>시그마</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>시그마</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 용액</td><td>시그마</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘 용액</td><td>시그마</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 히르산화물</td><td>시그마</td><td>S-8045</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m 나일론 멤브레인 필터</td><td>Whatman</td><td>7402-004</td><td></td></tr><tr><td>매니폴드 MPP</td><td>워너</td><td>64-0216&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 정밀 글라이드 바늘</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>블랙 꼰 실크 끈 (비 흡수성 외과 봉합사)</td> <td>AllMech Tech</td><td>LOOK-SP105</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 주입 1000USP / mL</td><td>AllMech Tech</td><td>NDC63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>DMSO D8779</td><td>시그마</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>블레비 스타틴</td><td>시그마</td><td>856925-71-8</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20 % 용액</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td></td></tr><tr><td>Materflex C / L 연동 펌프</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-26</td><td></td></tr><tr><td>Isostim 자극기</td><td>세계 정밀 기기</td><td>A320RC</td><td></td></tr><tr><td>파형 발생기</td><td>Teledyne Lecroy</td><td>WaveStation 2012</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기 FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td>1533530</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 튜빙 ID : 1/32 "OD : 3/32 "벽 1/32"</td><td>구성 요소 공급</td><td>TET-031A</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 튜빙 ID : 3/32 "OD : 5/32"벽 1/32 "</td><td>구성 요소 공급</td><td>TET-094A</td><td></td></tr><tr><td>3 방향 밸브 용 어댑터 luer 잠금</td><td>장치 Cole-Parmer</td><td>EW-31200-80</td><td></td></tr><tr><td>티 어댑터 및 플라스틱 피팅</td><td>Cole-Parmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 클램프</td><td>WaterZoo</td><td>2465</td><td></td></tr><tr><td>펠티에</td><td>TE 기술</td><td>TE-127-2.0-2.5</td><td></td></tr><tr><td>RHOD-2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M14206</td><td></td></tr><tr><td>침술</td><td>LHASA</td><td>TC1.20x13</td><td></td></tr><tr><td>60 mL BD 주사기, luer-lok</td><td>포함, Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>LabView,</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td><td>, Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td></td></tr><tr><td>디지털 신호 처리 회로, DSP TMS 320</td>, <td>Texas Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Longpass Dichroic mirror, 567 nm</td><td>ThorLabs</td><td>DMLP567L</td><td></td></tr><tr><td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-437</td><td></td></tr><tr><td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-438</td><td></td></tr><tr><td>Longpass colored glass filter 590 nm&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>FGL590</td><td></td></tr><tr><td>녹색 Nd-YAG 레이저 532 nm, 500 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>레이저 <td>Siskiyou</td><td>MX130R</td><td></td>다중 모드 광섬유 200 &micro<td>용 Micromanipulator</td></tr><tr><td>; m NA 0.39</td><td>ThorLabs</td><td>FT200UMT</td><td></td></tr><tr><td>LED 파란색</td><td>Lumileds</td><td>L135-B475003500000</td><td></td></tr><tr><td>LED 녹색</td><td>Lumileds</td><td>L135-G525003500000</td><td></td></tr><tr><td>큐브 빔 스플리터, 비편광</td><td>ThorLabs</td><td>BS007</td><td></td></tr><tr><td>36" 길이, 도브테일 광학 레일</td><td>Edmund Optics</td><td>54-402</td><td></td></tr><tr><td>2.5" 너비, 도브테일 캐리어</td><td>Edmund Optics</td><td>54-404</td><td></td></tr><tr><td>0.75" 여행, 마이크로미터 스테이지</td><td>Edmund Optics</td><td>37-983</td><td></td></tr><tr><td>Dovetail 광학 레일 3"</td><td>ThorLabs</td><td>RLA075/M</td><td></td></tr><tr><td>Dovetail 레일 캐리어 1"</td><td>ThorLabs</td><td>RC1</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche photodiode Helix 902</td><td>Digi-Key</td><td>HELIX-902-200</td><td></td></tr><tr><td>Objective holder XY Translator& 주의;</td><td>ThorLabs</td><td>ST1XY-S</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 브레드보드 6" x 6"</td><td>ThorLabs</td><td>MB6</td><td></td></tr><tr><td>Nexus otpical 테이블 4' x 6'ThorLabs</td><td></td> <td>T46HK</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 캡 스크류</td><td>ThorLabs</td><td>HW-KIT5/M</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 시트</td><td>Home Depot/Lowes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>실가드 184</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 젤&nbsp;</td><td>월마트/홈 디포</td><td>2-파트 5 분 clr 1oz</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 정밀 글라이드 니들</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>23G 프리시전 글라이드 니들</td><td>B-D</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 베이스, 25 mm x 75 mm x 10 mm</td><td>ThorLabs</td><td>BA1/M</td><td></td></tr><tr><td>와이어 선반 포스트 36"</td><td>Alera</td><td>AALESW59PO36SR</td><td></td></tr><tr><td>와이어 선반</td><td>Alera</td><td>ALESW582424SR</td><td></td></tr><tr><td>포스트 및 앵글 클램프</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M-P5</td><td></td></tr><tr><td>염료 챔버용 유리 주사기</td><td>Wheaton</td><td>W851020</td><td></td></tr><tr><td>고무 마개</td><td>홈 사이언스 도구</td><td>CE-STOP01C</td><td></td></tr></tbody></table>

지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

심장에서 분자 신호 전달 연구는 일반적으로 고립 된 근육 세포에서 수행된다. 그러나, 허혈 및 부정맥과 같은 많은 병리학 적 상황은 완전히 전체 기관 수준에서 잘 이해 될 수있다. 여기서는 본래 심장 세포 신호를 측정 할 수 있도록 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 분광 기법을 제시한다. 이 기술은 랑겐 돌프 관류 심장 및 형광 신호를 기록하는 광 화이버의 결합에 기초한다. LFFM 정상 및 병적 상태에서 마음을 연구하는 심장 혈관 생리학의 분야에서 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 다중 심장 변수는 상이한 형광 표시기를 사용하여 모니터링 할 수있다. 다음은 세포질 [칼슘 2 +] 내 근질 세망 [칼슘 2 +]와 막 전위를 포함한다. 외인성 형광 프로브 흥분 방출 된 형광 LFFM의 표면 형광 기법의 세 가지 다른 배열 검출이 논문에서 제시 s의. 이러한 기술들 중 중앙의 차이는 여기하고 상기 여기 광을 변조 방식에 사용되는 광원의 종류이다. 연속파 LFFM (CLFFM)는 연속 여기 레이저 광을 사용하는 반면 펄스 LFFM (PLFFM)의 레이저 광 펄스를 사용한다. 마지막으로, 발광 다이오드 (LED)는 제 3 광원으로 사용했다. 이 비 간섭 장치는 펄스 형 LED 형광 현미경 (PLEDFM)라고한다.

내막과 외막의 AP와 칼슘 2 + 과도 심실 벽에 걸쳐 신호를 비교하기 위해, 하나의 광섬유는 심장 내막에 배치되고, 심장 외막에있는 다른. 심장 외막에서 하나로 내막에서 기록 된 AP의 형태를 비교하면 전층 기능을 평가하는 가장 좋은 방법입니다. 심실 벽은 매우 이질적이며, 따라서, 액세스 포인트의 형태는이 두 지역에서 매우 다릅니다. 잘 내막 덜 갖는 것으로 알려져 I의 외막 17, 18, 19 이상. 덜 나는 내막 <sup class="...

중심부에 위치한 분자 이벤트는 기관의 전기 및 수축 기능을 조정. 여기에 제시된 지역 필드 형광 현미경 기술의 집합은 그대로 마음에 휴대 변수의 기록을 할 수 있습니다. 심장 기능을 정의하는 메커니즘을 확인하면 마음이 병적 인 상황에서 어떻게 작동하는지 이해에 중요하다.

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

본 국소 전장 형광 현미경 이미징 기술의 전반적인 목적은 분자 프로브를 사용하여 전체 심장 수준에서는 접근하기 어려운 심장 부위의 세포 내 칼슘 농도 또는 막전위를 측정하는 것입니다. 이 방법은 심정지 및 허혈과 관련된 주요 심혈관 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포들이 전기적, 기계적, 그리고 대사적으로 계속 결합되어 있는 온전한 장기 내의 세포 사건으로부터 심장 특성을 측정할 수 있다는 점입니다.먼저, 수평형 Langendorff 장치를 준비합니다. 60 milliliter 주사기에 갓 조제한 Tyrode 용액을 채우고, 설정에 필요한 모든 연결 튜브를 장착합니다. 용액을 채운 후, 모든 기포를 제거합니다.그런 다음, 물속에 잠긴 플라스틱 에어스톤을 통해 공급되는 순수 산소 가스로 로딩된 용액을 평형화합니다. 이어서, 바늘 주위에 비흡수성 외과용 봉합사를 배치합니다. 이것은 장치에 연결되었을 때 심장을 역관류시키기 위한 캐뉼라 역할을 하게 됩니다.다음으로, 헤파린을 투여하고 동물을 안락사시킨 후 심장을 적출합니다. 먼저 에탄올로 흉부를 소독합니다. 시연은 생쥐를 대상으로 하지만, 동일한 절차를 잉꼬의 심장 적출에도 적용할 수 있습니다.다음으로, 해부 가위를 사용하여 하복부를 절개한 후 목 방향으로 양옆을 따라 절개합니다. 그런 다음 심장을 피해 횡격막을 조심스럽게 절개합니다. 이제 절개한 조직을 뒤로 당겨 핀으로 고정합니다.다음으로, 심장을 노출시키기 위해 폐와 주변 조직을 제거합니다. 심장이 노출되면 핀셋을 사용하여 심장을 압박하지 않고 조심스럽게 들어 올립니다. 대동맥을 절단하여 동물로부터 분리하며, 이때 가능한 한 많은 대동맥 부위가 심장에 붙어 있도록 합니다.그 다음, 1 mL의 Tyrode 용액이 담긴 작은 웨잉 보트에 심장을 넣습니다. 해부 현미경 하에서 핀셋과 가위를 사용하여 심장 주변의 혈액과 지방 조직을 빠르게 제거합니다. 흡수되지 않는 외과용 봉합사와 바늘을 사용하여 대동맥을 Langendorff 장치의 수평 연결부에 고정합니다.두 개의 미세 핀셋을 사용하여 매듭을 고정합니다. 그런 다음, 밸브를 열어 Tyrode 용액을 흘려보냄으로써 역류 관류를 시작합니다. 심장이 10분 동안 안정화되는 동안, 수평 챔버의 청결을 유지하기 위해 주변 조직을 세척하고 잔해물을 흡입하여 제거합니다.염료를 새로 조제하십시오. Rhod-2 AM의 경우, 제조사에서 제공하는 50 microgram 염료 패키지에 20% Pluronic과 DMSO 20 microliters를 첨가합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 피펫팅하여 혼합하십시오.그 다음, 액상화된 염료를 투명 유리 바이알로 옮기고 Tyrode 용액 1 mL를 첨가합니다. 15~20분 동안 초음파 처리(sonication)를 하여 이 혼합물에 염료를 완전히 녹입니다. 이어서, 준비된 염료를 연동 펌프를 사용하여 실온에서 관류합니다.먼저 염료 챔버에 염료를 채운 다음, 매니폴드에 연결된 모든 튜브 라인을 클램프로 고정하며, 역류를 방지하기 위해 클램프를 매니폴드 위쪽에 위치시킵니다. 다음으로 펌프의 전원을 켜고, 60 milliliter 시린지 아래에 있는 3방향 밸브를 즉시 닫습니다. 펌프의 흡입단에 연결된 작은 튜브를 심장 옆에 배치하여 관류된 염료가 재순환되도록 합니다.가는 바늘을 사용하여 심첨부를 찔러 압력을 완화합니다. 그 후, 30분 동안 염료로 심장을 관류시킵니다. 이 과정 동안 염료의 수위를 확인하는 것이 매우 중요한데, 이는 기포가 조직 내로 유입되어 허혈 및 조직 손상을 일으키는 것을 방지하기 위함입니다.염료를 관류한 후, Tyrode 용액으로 심장을 역관류하십시오. 매니폴드 상단의 클램프를 제거합니다. 밸브를 열고 심장이 10분 동안 안정화되도록 둡니다.역관류 동안, 수평 챔버를 Tyrode 용액으로 채우고 Peltier 장치를 켜서 배스 온도를 37 °C로 맞춥니다. 실험을 위한 광섬유 조명을 준비하려면, 먼저 광섬유를 2 mL 피펫 안에 넣습니다. 그런 다음 피펫을 마이크로매니퓰레이터에 부착합니다.마이크로매니퓰레이터를 사용하여 광섬유를 외측 뇌실 표면에 살짝 누릅니다. 다음으로, 파형 발생기를 프로그래밍하여 폭이 1 ms인 사각 펄스를 제공하도록 설정합니다. 그리고 심장 자극기를 외부 동기화 모드로 설정하고 파형 발생기에 연결합니다.두 개의 자극기 출력단 각각에 끝부분에 침이 납땜된 전선을 연결합니다. 심장 첨단 부위에 약 3mm 간격으로 침 두 개를 부착합니다. 우발적인 전기 충격을 방지하기 위해, 반드시 침을 모두 배치한 후에 자극기를 작동시키십시오.이제 서심외막 신호를 기록하려면 소프트웨어의 획득 주파수를 10 kilohertz로 조정하십시오. 심내막 신호를 수집하려면 동일한 절차를 따르되, 23 gauge 바늘을 사용하여 중격 근처의 외측 심실에 구멍을 뚫으십시오. 그런 다음 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 두 번째 광섬유를 심내막 내에 배치하십시오.전층 기능을 분석하기 위해 심내막과 심외막에서 기록된 활동 전위의 형태를 비교하였습니다. CLFFM 기술을 사용하여 di-8-ANEPPS로 심장을 처리한 후 형광 기록을 수행하였습니다. 활동 전위는 심내막에서 더 느리게 나타났으며, 특히 1상(phase one)에서 이러한 경향이 뚜렷했습니다.활동 전위의 지속 시간은 활동 전위가 일정 수준까지 재분극되는 데 걸리는 시간으로 정의되었습니다. 지속 시간을 정규화하고 0상에서 겹치도록 이동시켰을 때, 상호 비교가 가능했습니다. 분석 결과, 1상 동안 유의미한 차이가 나타났습니다.다음으로, 세포 내 칼슘을 모니터링하기 위해 Rhod-2 AM을 사용하였습니다. 세포 내 칼슘의 지역적 차이를 비교하기 위해, 칼슘 일시적 변화(calcium transience)의 역학을 평가하였습니다. 비교 결과, 심내막에서 일시적 변화의 피크 도달 시간이 약 2ms 더 길었습니다.전반적으로 심내막의 칼슘 일시적 변화(calcium transience)는 심외막보다 유의하게 느린 역학적 특성을 보였습니다. 이 기술을 숙달하면 심장에서 접근하기 어려운 부위의 세포 내 칼슘 일시적 변화와 활동 전위를 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 셋업의 Langendorff 부분은 심장에 다양한 화학 물질을 관류시키고, 이것이 심장 특성에 미치는 영향을 평가하는 데 매우 실용적입니다.

local-field-fluorescence-microscopy-imaging-cellular-signals-intact

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

공 초점 주사 현미경은 살아있는 동물의 관류 심장이나 골격근에 단일 미토콘드리아 이벤트 이미징에 적용된다. 수퍼 옥사이드 깜박이고 막 잠재적 인 변동으로 단일 미토콘드리아 프로세스의 실시간 모니터링은 생리학 관련 맥락에서 병리학 섭동 동안 미토콘드리아 기능의 평가를 가능하게한다.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징 생체

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

여기에서 우리는 심혼에 있는 심실 광학 카테터를 심장 벽을 가로질러 흡광도 분광학을 능력을 발휘하기 위하여 공류된 심혼에 이용하는 방법을 소개합니다. 얻은 데이터는 조직 산소 장력뿐만 아니라 기질 활용 및 멤브레인 잠재력에 대한 강력한 정보를 이 유비쿼터스 제제에서 심장 성능 측정과 동시에 제공합니다.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

배우세요 지역 필드 형광 현미경법을 이용하여 심장 내부 칼슘 농도와 막 전위를 측정하는 방법을. Langendorff 장치와 분자 프로브를 활용해 심근경색 및 허혈 연구에 활용할 수 있습니다.

지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징

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