지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징

이 국소 분야 형광 현미경 이미징 기술의 전반적인 목표는 분자 프로브를 사용하여 세포 내 칼슘 수치 또는 전체 심장 수준에서 접근하기 어려운 심장 영역의 막 전위를 측정하는 것입니다. 이 방법은 심정지 및 허혈과 관련된 주요 심혈관 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 전기적, 기계적, 신진대사적으로 계속 결합되는 온전한 장기의 세포 이벤트에서 심장 특성을 측정한다는 것입니다.

먼저 수평 Langendorff 장치를 준비합니다. 새로 준비한 Tyrode 용액을 60ml 주사기에 넣고 설정과 관련된 모든 튜브를 추가합니다. 채워지면 모든 기포를 제거하십시오.

그런 다음 물에 잠긴 플라스틱 에어스톤에서 전달되는 순수한 산소 가스로 로드된 용액을 평형화합니다. 다음으로, 바늘 주위에 비흡수성 외과용 봉합사를 놓습니다. 이것은 장치에 부착될 때 심장을 역관류하는 캐뉼라 역할을 합니다.

다음으로, 헤파린을 주입하고 동물을 안락사 시킨 후 심장을 채취합니다. 먼저 에탄올로 가슴을 청소합니다. 시연은 쥐를 사용한 것이지만 잉꼬 심장 적출에도 동일한 절차가 적용됩니다.

그런 다음 해부 가위를 사용하여 하복부를 절개한 다음 목 쪽으로 측면을 자릅니다. 그런 다음 심장을 피하면서 횡격막을 조심스럽게 잘라냅니다. 이제 자른 조직을 뒤로 당겨 고정합니다.

다음으로 폐와 주변 조직을 제거하여 심장을 노출시킵니다. 일단 노출되면 핀셋을 사용하여 심장을 쥐어짜지 않고 퍼냅니다. 대동맥을 잘라 동물에서 분리하고 가능한 한 많은 대동맥을 심장에 붙어있게 두십시오.

그런 다음 1ml의 Tyrode 용액이 담긴 작은 계량 보트에 심장을 적재합니다. 해부 현미경으로 핀셋과 가위를 사용하여 심장을 둘러싼 혈액과 지방 조직을 빠르게 제거합니다. 비흡수성 외과용 봉합사와 바늘을 사용하여 대동맥을 Langendorff 장치의 수평 연결부에 부착합니다.

두 개의 가는 핀셋을 사용하여 매듭을 고정합니다. 그런 다음 밸브를 열어 Tyrode 용액을 방출하여 역관류를 시작합니다. 주변 조직을 청소하고 이물질을 흡입하여 심장이 10분 동안 안정되는 동안 수평 챔버를 깨끗하게 유지합니다.

염료를 신선하게 만드십시오. Rhod-2 AM의 경우 제조업체의 50마이크로그램 염료 패키지에 20마이크로리터의 20%플루로닉 및 DMSO를 추가합니다. 거품을 피하면서 피펫팅하여 혼합합니다.

그런 다음 액화 염료를 투명 유리 바이알에 옮기고 Tyrode 용액 1ml를 추가합니다. 15-20 분의 초음파 처리를 사용하여이 혼합물에 염료를 완전히 용해시킵니다. 다음으로, 제조된 염료를 실온에서 연동 펌프를 사용하여 관류합니다.

먼저 염료 챔버에 염료를 로드한 다음 매니폴드에 연결된 모든 튜빙 라인을 고정하고 역류를 방지하기 위해 클램프를 매니폴드 위로 유지합니다. 그런 다음 펌프를 켜고 즉시 60ml 주사기 아래의 삼방향 밸브를 닫습니다. 펌프의 흡입 끝에 부착된 작은 튜브를 심장 옆에 놓고 염료가 관류된 후 염료를 재순환시킵니다.

작은 게이지 바늘을 잡고 정점을 통해 꼬집어 압력을 완화합니다. 그런 다음 30분 동안 심장에 염료를 주입합니다. 이 기간 동안 허혈과 조직 손상을 유발할 수 있는 기포가 조직에 침투하지 않도록 염료의 수준을 평가하는 것이 매우 중요합니다.

염료를 관류한 후, Tyrode 용액으로 심장을 역관류합니다. cl을 제거하십시오amp 매니폴드 위에. 판막을 열고 10분 동안 심장이 안정될 때까지 기다립니다.

역관류하는 동안 수평 챔버를 Tyrode 용액으로 채우고 펠티에 장치를 켜서 수조 온도를 섭씨 37도로 가져옵니다. 실험을 위해 광섬유 조명을 준비하려면 먼저 광섬유를 2 밀리리터 피펫 안에 넣으십시오. 그런 다음 피펫을 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다.

micromanipulator를 사용하여 광섬유를 외심실 표면에 약간 누릅니다. 다음으로, 1밀리초 너비의 사각 펄스를 제공하도록 파동 발생기를 프로그래밍합니다. 그리고 심장 자극기를 외부에서 동기화하고 파동 발생기에 연결하도록 설정합니다.

두 개의 자극기 출력 각각에서 끝에 침술 바늘이 납땜된 와이어를 연결합니다. 두 개의 침을 심장 정점에 약 3mm 간격으로 부착합니다. 바늘이 놓인 후에만 자극기를 시동하여 우발적인 충격을 피하십시오.

이제 심외막 신호를 기록하려면 소프트웨어에서 수집 주파수를 10kHz로 조정하십시오. 심내막 신호를 수집하려면 동일한 절차를 따르되 23게이지 바늘을 사용하여 중격 근처의 외심실에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 미세 조작기를 사용하여 두 번째 광섬유를 심내막에 배치합니다.

transmural 기능에 접근하기 위해, 심내막과 외심에서 기록된 활동 전위의 형태를 비교했습니다. CLFFM 기법을 사용하여 di-8-ANEPPS로 심장을 치료한 후 형광 기록을 남겼습니다. 활동 전위는 심내막에서 특히 1상에서 더 느렸습니다.

활동 전위의 지속 시간은 활동 전위가 어느 정도 재분극하는 데 걸리는 시간으로 설명되었습니다. 지속 시간이 정규화되고 0 단계에서 겹치도록 이동되면 비교할 수 있습니다. 1단계에서는 실제로 상당한 차이가 있었습니다.

다음으로, Rhod-2 AM을 사용하여 세포 내 칼슘을 모니터링했습니다. 세포 내 칼슘의 지역적 차이를 비교하기 위해 칼슘 과도도의 동역학을 평가했습니다. 이에 비해 과도현상이 최고조에 달하는 시간은 심내막에서 약 2밀리초 더 길었습니다.

전반적으로, 심내막의 칼슘 일시성은 심내막보다 훨씬 느린 동역학을 가졌습니다. 이 기술을 마스터하면 심장에서 접근하기 어려운 영역에서 세포 내 칼슘 과도 및 활동 전위를 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 설정의 Langendorff 부분은 다양한 화학 물질을 심장에 주입하고 심장 특성에 미치는 영향을 평가하는 것이 매우 실용적입니다.