제브라 피쉬의 고혈당의 급성 및 만성 모델 : 고혈당의 영향을 평가하는 방법 - 신경 세포 및 방사선 표지 된 분자의 생체 분포

다음 절차의 전반적인 목표는 고혈당 상태에서 뇌 리모델링을 평가하고 제브라피시의 방사선 표지 분자를 추적하는 것입니다. 고혈당증은 혈당이 과도하게 농축되는 것이 특징입니다. 만성 고혈당증은 당뇨병 질환으로 인한 것일 수 있으며, 다양한 혈관 기능 장애를 유발하여 심근 경색, 뇌졸중 또는 당뇨병성 족부 궤양과 같은 임상 합병증을 유발할 수 있습니다.

또한 스트레스로 인한 급성 고혈당은 허혈성 뇌졸중의 출혈성 합병증을 촉진할 수 있습니다. 제브라피시는 인간의 질병과 질병이 중추 신경계에 미치는 영향을 이해하는 데 흥미로운 모델입니다. 성체 물고기의 뇌가 포유류에 비해 강렬한 신경인성 능력과 뇌 복구 메커니즘에 대한 뛰어난 능력을 보인다는 점을 감안할 때, 제브라피쉬는 급성 및 고혈당 상태에서 스트레스를 받은 후 뇌 리모델링을 조사하는 데 좋은 모델입니다.

또한 무선 표지된 분자 및 잠재적인 치료제의 생체 내 분포를 조사할 수 있습니다. 모든 실험은 연구에 동물을 사용하는 것에 대한 프랑스 및 유럽 공동체 지침에 따라 수행되었으며 동물 실험에 대한 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 물고기 그물로 물고기를 부드럽게 잡습니다.

물고기를 소량의 트리카인 마취제에 넣고 물에서 0.02%의 최종 농도로 희석합니다. 물고기가 움직임을 멈출 때까지 기다리십시오. 자른 피펫을 사용하여 생선을 제거하고 흡수성 티슈 페이퍼에 부드럽게 올려 물을 최대한 제거합니다.

주사용 d-포도당 주사기(체중 1kg당 2.5g)의 50마이크로리터를 준비하기 위해 물고기의 무게를 잰다. 예를 들어, 0.6g의 물고기는 50마이크로리터의 3%d-포도당 PBS 용액을 받게 됩니다. 물고기를 등에 눕히고 한 손으로 유지하십시오.

다른 손으로 주사기의 바늘을 복강강에 삽입하고 d-포도당 PBS 용액을 천천히 주입합니다. 바늘을 제거하고 물고기를 물고기 물에 다시 넣으십시오. 물고기가 완전히 회복될 때까지 물고기를 확인하십시오.

그들의 혈당 수치는 일반적으로 1 1/2 시간 후에 측정됩니다. 만성 고혈당을 모방하려면 최종 농도인 111밀리몰에서 2리터의 d-포도당 탱크를 준비합니다. 이를 위해 40g의 d-포도당 무게를 측정하고 빈 탱크에 넣으십시오.

수조에 2리터의 물고기 물을 채우고 최대 7마리의 물고기를 넣으십시오. 박테리아 또는 다른 미생물의 성장을 피하기 위해 이틀에 한 번씩 포도당 용액을 교체하십시오. 만성 고혈당증은 d-포도당으로 14일 동안 치료하면 얻을 수 있습니다.

어망으로 물고기를 잡아 얼음 위에 올려 놓습니다. 빠른 안락사를 위해 물고기를 얼음으로 덮으십시오. 혈액 샘플을 희석시킬 수 있는 물방울을 제거하기 위해 물고기를 가져다가 닦습니다.

해부 겸자로 눈을 제거하고 안강에 피가 가득 찰 때까지 기다립니다. 혈당계에 테스트 스트립을 놓고 스트립을 안강에 삽입합니다. 혈당 농도의 값을 기록하십시오.

급성 고혈당증의 경우, d-포도당의 복강내 주사는 주사 후 1 1/2시간 후에 혈당 수치를 현저히 증가시킵니다. 만성 고혈당증의 경우, 생선을 d-포도당 용액에 담그면 치료 14일 후에 나타난 바와 같이 혈당 수치가 크게 증가합니다. 절차가 끝나면 해부 가위로 몸체와 머리를 분리하고 면역 조직 화학 실험을 위해 PBS에 희석 한 파라 포름 알데히드 4 %에 머리를 넣으십시오.

섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 또는 뇌를 직접 추출하고 mRNA 추출과 같은 다른 실험을 위해 동결할 수 있습니다. 다음 날, 고정 헤드를 PBS로 헹구고 해부 현미경으로 바늘로 유지합니다.

나머지 눈을 제거하고 집게로 두개골 상단을 부드럽게 엽니다. 그런 다음 뇌를 조심스럽게 추출하여 1x PBS에 넣습니다. 고정된 뇌는 에탄올 농도를 증가시키는 일련의 과정에서 단계적으로 탈수된 다음 톨루엔을 30분 동안 두 번 목욕시킵니다.

그런 다음 뇌를 임베딩 카세트에 넣고 뚜껑을 조심스럽게 닫습니다. 카세트를 섭씨 58도에서 60도에서 녹인 파라핀에 넣으십시오. 뇌의 파라핀 임베딩 동안, 온난화 포옹 겸자를 켜십시오.

카세트를 깨끗한 파라핀 수조에 넣으십시오. 파라핀 목욕이 끝나면 카세트를 꺼냅니다. 틀에 액체 파라핀을 붓습니다.

카세트를 열고 녹은 파라핀 안에 뇌를 넣는다. 온난화 포함 겸자로 뇌의 방향을 잡으십시오. 녹은 파라핀으로 금형을 채우고 임베딩 기계의 냉각 부분에서 굳히십시오.

기술적인 이유로, 뇌는 전방-후방 축에 따라 배치되어야 합니다. 파라핀 블록을 성형한 후 잘라내고 파라핀이 녹은 카세트에 가로 절편을 허용하기 위해 올바른 방향으로 고정합니다. 마이크로톰의 팔에 파라핀 블록을 삽입하고 뇌 샘플 수준에 도달할 때까지 50마이크로미터 절편을 자릅니다.

그런 다음 파라핀 블록을 잘라 공중그네를 얻고 절편 두께를 7마이크로미터로 조정합니다. 고운 페인트 브러시로 파라핀 리본을 모아 검은 종이에 붙입니다. 파라핀 리본을 3-4 섹션마다 자릅니다.

보온 플레이트에 슬라이드를 놓고 증류수로 덮습니다. 슬라이드의 물 부분을 부드럽게 놓고 섭씨 40도까지 예열합니다. 파라핀 리본이 충분히 펴지면 흡수성 티슈로 물을 제거하십시오.

마지막 방울은 그림과 같이 기계적으로 제거됩니다. 프로토콜에 설명된 면역조직화학 절차를 수행하기 최소 2시간 전에 슬라이드를 건조시킵니다. 면역조직화학(immunohistochemistry) 후, 고혈당증이 뇌세포 증식에 미치는 영향을 연구하기 위해 상형광(epifluorescence) 또는 컨포칼(confocal) 현미경으로 슬라이드를 분석합니다.

뇌 세포 정량화는 적어도 3개의 연속적인 섹션 또는 관심 영역에서 이루어집니다. 여기서 PCNA 양성 세포에 해당하는 증식 세포는 녹색으로 나타납니다. 보시다시피, 만성 고혈당증은 PCNA 항체로 녹색으로 표시된 증식 세포의 수를 감소시키며, 배쪽 망사, 배쪽 망사, 꼬리 시상하부, 측면 및 후방 함몰부 주위에서 발생합니다.

대안적으로, 고혈당증이 손상으로 인한 신경발생에 미치는 영향을 연구하기 위해, 만성 고혈당 치료 중에 텔렌스팔론의 찌르기 상처 손상을 시행할 수 있습니다. 이를 위해 7일 처리된 물고기를 마취하고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 30 게이지 주사기를 두개골을 통해 오른쪽 망막 반구의 중앙으로 수직으로 밀어 넣습니다.

이 절차가 끝나면 물고기는 필요한 시간 동안 수조로 되돌려 보내야합니다. 여기에서 물고기는 희생되기 전에 d-포도당 물에서 7일 동안 생존할 수 있었습니다. 뇌파의 찌르기 상처 부상은 병변 후 7일 동안 손상된 반구의 증식을 강력하게 상향 조절합니다.

본 연구의 데이터는 만성 고혈당증이 텔뇌팔론의 칼에 찔린 상처 손상 후 세포 증식을 감소시킴으로써 뇌 치유 과정의 현저한 감소를 유도한다는 것을 보여줍니다. 제브라피쉬는 또한 무선 표지된 분자의 생체 분포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 제브라피시 유기체의 포도당 대사를 연구하기로 결정했습니다.

물고기는 먼저 마취하고 마취제를 적신 티슈 위에 올려 놓아야 합니다. 그런 다음 물고기를 무선 보호 창 뒤에 놓습니다. 50마이크로리터의 플루오로데옥시글루코스를 함유한 주사기를 제조합니다.

물고기를 등에 대고 놓고 20메가베크렐에서 50마이크로리터의 FDG를 복강내로 주입합니다. 그런 다음 물고기를 마취제로 적신 다른 조직에 놓습니다. 부드럽게 감싸져 PET 스캔 이미저의 암에 위치합니다.

암을 PET 스캔에 삽입하고 이미징 절차를 수행합니다. 여기에서 FDG는 주사 부위뿐만 아니라 물고기의 머리, 특히 뇌와 척수 전체에서도 검출된다는 것을 알 수 있습니다. 이 연구에서는 제브라피시에서 급성 및 만성 고혈당증을 확립하는 두 가지 방법을 제공하며, 고혈당증이 정상 및 부상으로 유발된 조건에서 뇌세포 증식을 손상시킨다는 것을 보여줍니다.

결론적으로, 제브라피쉬는 중추신경계에서 고혈당증의 해로운 영향을 조사하기 위한 관련 모델로 사용될 수 있습니다. 또한 PET 스캔을 통해 방사성 표지 분자의 생체 내 분포를 평가할 수 있습니다.