Name: 제브라 피쉬의 고혈당의 급성 및 만성 모델 : 고혈당의 영향을 평가하는 방법 - 신경 세포 및 방사선 표지 된 분자의 생체 분포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 배우세요 제브라피쉬에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 수립하고 PET/CT 영상으로 방사선 표지 분자의 생체분포를 추적하는 방법을. 이 기법은 당뇨 합병증 연구와 중추신경계 재생 메커니즘 이해에 활용됩니다.

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우리는 비디오 편집 (특히 Jean-François Février, Eric Esnault, Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan (보이스 오버), Mary Osborne-Pellegrin (교정)에 대한 La RUunion University의 Direction des Usages du Numérique (DUN) 음성 해설 및 사이로 (CYROI) 플랫폼. 이 작품은 La RUunion University (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, 유럽 연합 (CPER / FEDER) 및 Philancia 협회의 교부금으로 지원되었습니다. ACD는 La Réunion University (Contrat Doctoral)의 국장급 인 Supérieur et de la Recherche의 교육부 장관으로부터 교부금을 수여 받는다.

성인 야생형 제브라 피쉬 ( Danio rerio )는 표준 광주 기 (14/10 시간 명 / 암흑) 및 온도 (28 ℃) 조건하에 유지되었다. 모든 실험은 프랑스 및 유럽 공동체 연구 동물 사용 가이드 라인 (86 / 609 / EEC 및 2010 / 63 / EU)에 따라 수행되었으며 동물 실험을 위해 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 1. Zebrafish에서 급성 고혈당의 모델 수립 <ol><li> 트리 카인 400mg을 물 97.9mL와 1M Tris / HCl 완충액 (pH 9) 2.1mL에 녹여 트리 세인 (MS-222)의 원액을 조제한다. -20 ℃에서 보관을 위해 pH를 7로 조정하고 분액하십시오. </li><li> 생식 수 (최종 트리 케인 농도 : 0.02 %) 100 mL에 트리 카인 (원액) 5 mL를 넣고 성인 제브라 피쉬의 마취제를 준비합니다. </li><li> 그것이 움직일 때까지 하나의 제브라 피쉬 (3 개월에서 6 개월)를 탱크에서 마취제로 옮깁니다. </li><li> 레절단 피펫을 사용하여 물고기를 이동하고 흡수성 티슈 페이퍼에서 신속하게 건조시킵니다. </li><li> 물고기의 무게를 잰다. </li><li> 1X PBS에 녹아있는 D- 글루코오스 주사기를 준비하고 D- 포도당 (2.5g / kg bodyweight) 50 μL를 주사하십시오. 참고 : 예를 들어, 0.6g의 어류에는 50 %의 3 % D- 글루코스 / PBS 용액이 제공됩니다. </li><li> 물고기를 등 뒤에 넣고 주사기의 바늘을 복강 내 구멍에 넣습니다. </li><li> 천천히 D- 포도당 / PBS 용액을 주입 한 다음 물고기를 다시 물에 넣으십시오. </li><li> 물고기가 완전히 회복 될 때까지 물고기를 확인하십시오. 혈당 측정을 수행하는 데 필요한 시간에 도달 할 때까지 탱크로 되돌립니다. 참고 : 주사 후 1.5 시간에 혈당을 측정합니다. </li></ol> 2. Zebrafish에서 만성 고혈당 모델 구축 <ol><li> 깨끗한 어류 용 물 2 L을 준비하십시오. </li><li> D- 포도당 40g을 2L의 어류에 녹여 최종 D- 포도당 농도를111 mM. </li><li> 5 ~ 7 마리의 성인 제브라 피쉬를 D- 글루코스 함유 물에 담근다. </li><li> 박테리아 또는 다른 미생물의 번식을 피하기 위해 2 일마다 D- 포도당 어항을 교체하십시오. </li><li> 14 일간의 치료 후 혈류량 측정 전에 D- 포도당을 몸 밖으로 제거하기 위해 담수에 잠깐 물고기를 놓으십시오. </li></ol> 3. Zebrafish의 혈당 수치 측정 <ol><li> 빠른 안락사를 위해 얼음으로 물고기를가립니다. 참고 : 과량의 트리 케어를 사용하지 마십시오. 혈당 수치의 변화가 심합니다. 물고기를 얼음에 너무 오랫동안 넣어 두지 마십시오. 혈액이 굳어지게됩니다. </li><li> 흡수 티슈 페이퍼로 물고기를 닦아서 모든 물을 제거하고 혈당 측정 중에 혈액 희석을 피하십시오. </li><li> 해부 포셉을 사용하여 눈을 제거하고 안구가 혈액으로 채워질 때까지 기다리십시오. </li><li> glucometer에 테스트 스트립을 넣고 i스트립을 눈 구멍에 넣으십시오. </li><li> 혈당치를 측정하십시오. </li></ol> 4. 고혈당 후 뇌 세포 증식 분석 <ol><li> 솔루션 및 버퍼 : 요구 사항 및 준비 <ol><li> 증류수 2 O (dH 2 O) 900 ML에 10X PBS 100 ML을 추가하여 1X PBS 1 L을 준비하고 섞는다. </li><li> 0.2 % 세제 (PBS-T, 재료 표 참조)로 1x PBS를 준비합니다. 참고 : 1L의 PBS-T를 준비하려면 1L의 PBS에 2mL의 세제 ( 재료 표 참조)를 넣으십시오. </li><li> 에탄올 시리즈 (100 % x 2, 95 %, 85 %, 70 %, 50 %, 30 %)와 0.85 % NaCl을 준비하십시오. </li><li> 차단 완충액을 준비하십시오 : 0.5 %에서 1 % 분유를 함유하는 PBS-T. 참고 : 200 mL의 차단 완충제를 준비하려면 200 g의 PBST에 2 g의 분유를 넣으십시오. </li><li> 항원 검색 버퍼, 시트르산 나트륨을 준비합니다. 참고 : 1 L의 구연산 나트륨 완충액을 준비하려면 2.94 g의 구연산 나트륨 트리나트륨 염은 1 L의 dH 2 0으로 탈수한다. 1 L로 채우기 전에 pH를 6으로 조정한다. </li><li> 1 % PBS 100 ML에 paraformaldehyde 4g을 추가하여 4 % paraformaldehyde - PBS 버퍼를 준비합니다. 완전히 녹일 때까지 58-60 ° C에서 교반하면서 따뜻하게합니다. </li></ol></li><li> 면역 조직 화학을위한 샘플 준비 : 고정 및 탈수 <ol><li> 혈당치를 측정 한 후, 아가미 뒤의 머리 부분을 잘라서 머리를 몸에서 분리하십시오. 참고 : 또는 뇌는 mRNA 추출과 같은 다른 실험을 위해 직접 추출 및 동결 될 수 있습니다. </li><li> PBS (PFA - PBS)에 용해 4 % paraformaldehyde 4 ° C에서 밤새 머리를 수정. </li><li> 다음날 PBS에서 머리를 간단히 씻어냅니다. </li><li> 현미경을 사용하여 두뇌를 조심스럽게 해부하십시오. PBS로 고정 머리를 헹구고 해부 현미경으로 머리를 고정하는 바늘을 사용하십시오. 포셉으로 눈과 두개골의 꼭대기를 제거하십시오. Carefully 뇌를 추출하고 1x PBS에 넣으십시오. </li><li> 1 분 PBS로 30 분 동안 0.85 % NaCl, 15 분 동안 70 % EtOH / 0.85 % NaCl (v / v), 15 분 동안 70 % EtOH (2 회), 20 분 동안 85 % EtOH 분, 95 % EtOH 20 분 및 100 % EtOH 20 분 (두 번). 최종 100 % EtOH 용액에서 밤새 품어 낸다. 참고 : 탈수 된 뇌는 파라핀을 묻기 전에 4 ° C에서 100 % EtOH로 몇 개월 동안 머물 수 있습니다. </li></ol></li><li> 면역 조직 화학을위한 샘플 준비 : 파라핀 임베딩을위한 조직 준비 <ol><li> 작은 유리 비이커에 두뇌를 놓습니다. 참고 : 톨루엔이 일부 플라스틱을 손상시킬 수 있으므로 플라스틱 콘센트를 사용하지 마십시오. </li><li> 뇌는 톨루엔으로 완전히 회수되어야하므로 에탄올을 제거하고 톨루엔으로 교체하십시오. 톨루엔으로 30 분간 2 번 목욕하십시오. </li><li> 톨루엔을 제거하고 삽입 카세트에 두뇌를 놓습니다. 밀폐 된 카세트를 5 번에 녹은 파라핀 시리즈 비이커에 넣으십시오.8-60 ℃ (각 파라핀 비커에서 30 분). 예열 봉입 포셉을 켭니다. 파라핀 배스가 끝나면 카세트를 꺼내 일부 액체 파라핀을 주형에 부으십시오. </li><li> 용융 된 파라핀을 곰팡이에 붓고 두뇌를 안으로 넣습니다. 두뇌의 전후 방향을 가이드로 사용하여 예열 봉입 포셉을 사용하여 두뇌를 동양화하십시오. 파라핀을 매설 기계의 냉각 부분에 경화시킵니다. </li><li> 기술적 인 이유로 앞뒤 축을 따라 두뇌를 배치하십시오. 파라핀 블럭을 풀어 낸 후 카세트에 자르고 파라핀을 적당한 방향으로 넣고 횡단 절단을하도록합니다. </li><li> 파라핀 블록을 마이크로톰의 팔에 삽입하십시오. 뇌 샘플 레벨에 도달 할 때까지 50 μm 두께의 섹션을 자릅니다. 공중 그네를 얻기 위해 파라핀 블록을 다듬고 절단 두께를 7 μm로 조정하십시오. 솔을 사용하여 파라핀 리본을 모아 검은 색 냅킨에 올려 놓습니다.어. 3 ~ 4 섹션마다 부드럽게 자르십시오. </li><li> 온난화 판에 슬라이드를 올려 dH 2 O 물로 덮으십시오. </li><li> 부드럽게 잘라 리본을 물 위에 놓습니다. 파라핀 리본이 충분히 펼쳐지거나 펼쳐지면 흡수 티슈 페이퍼로 물을 제거합니다. 마지막 방울을 기계적으로 제거하십시오. 슬라이드에서 물을 제거하고 약 30 ~ 40 ° C에서 가온 플레이트에서 3 시간 이상 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 면역 조직 화학 요법 <ol><li> 파라핀 왁스를 각각 7 분 동안 3 개의 크실렌 용기에 넣고 뽑아 낸다. </li><li> 95 % EtOH, 85 % EtOH, 70 % EtOH 및 30 % EtOH를 각각 30 초 동안 욕조에 넣고 2 분 동안 100 % EtOH의 두 용기에 슬라이드를 넣고 절편을 보충하십시오. 마지막으로 간단히 슬라이드를 DH 2 O에 넣고 PBS로 두 번 5 분씩 두었다. </li><li> 전자 레인지 (500 W에서 2 분)에서 구연산 완충액 중 섹션을 항온 처리하여 항원 검색을 수행하십시오.버퍼가 끓기 시작합니다. 슬라이드를 실온에서 15 분간 회복시킵니다. </li><li> PBST에서 3 번씩 5 분씩 씻고 1 % 우유가 들어있는 PBST에서 45 분 동안 차단하십시오. 1 차 항체 (증식 성 세포 염색을 위해 증식하는 세포핵 항원 (PCNA); 1/100)을 완충액 ( 즉, PBST, 1 % 우유)으로 희석하여 밤새 배양하십시오. </li><li> PBST에서 3 번씩 5 분씩 씻고, 블로킹 완충액과 DAPI (1/500)로 희석 한 적절한 2 차 항체 ( 예 : 염소 항 마우스 Alexa Fluor 488; 1/200)로 90 분 동안 절편을 배양하십시오. </li><li> PBST로 5 분씩 3 번 씻고 슬라이드를 형광 장착 매질로 장착하십시오 (재료 표 참조). </li><li> epifluorescence 및 / 또는 공 촛점 현미경을 사용하여 얼룩을 분석합니다. </li><li> 적어도 세 가지 별개의 관심 영역의 적어도 세 연속 뇌 섹션에 뇌 세포의 확산을 계량imals. 참고 : 또는, 뇌 embedding은 이전에 설명한대로 vibratome sectioning 및 자유 부동 immunohistochemistry로 진행하기 위해 아가로 오스에서 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 고혈당이 뇌 회복 메커니즘에 미치는 영향 연구 참고 : 이전에 설명한 24 , 25 , 26 번 과 같이 중뇌의 찔린 상처를 입은 후에 급성 및 만성 고혈당증에서 뇌의 수사를 수행 할 수 있습니다. 간단히: <ol><li> 성인 제브라 피쉬를 트리 세인으로 마취합니다. </li><li> 빛과 해부 현미경에 물고기를 놓습니다. </li><li> 한 손으로 물고기를 잡으십시오. </li><li> 반면에, 30 G 주사기를 두개골을 통해 수직으로 오른쪽 뇌간 반구의 중간 영역에 삽입하십시오. </li><li> 신선한 생선 수, D- 포도당 보충 수 (111mM), 어류를 조절할 수 있습니다. 물고기가 부상당한 후 7 일 동안 생존 할 수있게하십시오. 참고 : 나머지 절차는 4 단계를 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 5. Zebrafish의 PET / CT에 의한 방사성 표지 분자의 생체 분포 관찰 : 포도당 대사를 분석하기위한 Fluorodeoxyglucose ([18F] -FDG) <ol><li> [18F] -FDG의 식염수 20 MBq을 함유 한 50 μL 주사기를 준비하십시오. </li><li> 방사선 보호 스크린 뒤에 주사기를 놓습니다. </li><li> 성인 제브라 피쉬를 트리 세인으로 마취합니다. </li><li> 생선을 방사선 방호 스크린 뒤에 놓습니다. </li><li> [18F] -FDG를 복막 내강에 주입하십시오. 생선 배 밖으로 누출 될 수있는 잔류 [18F] -FDG의 검출을 막기 위해 작은 티슈 페이퍼로 주사 부위를 닦으십시오. </li><li> 방사성 동위 원소 보정기를 사용하여 주사기와 조직에 포함 된 남아있는 활동을 측정하여 정확한 주입 선량을 계산하십시오. </li><li> 물고기를ew, tricaine에 적신 흡수성 조직의 작은 조각을 부드럽게 감싼다. 흡수 조직과 함께 물고기를 PET / CT 이미 저의 침대에 놓습니다. </li><li> PET / CT 영상 시스템에 침대를 삽입하고 수집을 시작합니다. </li><li> PET / CT 획득을 계속하십시오. </li><li> 절차가 끝나면 물고기를 신선한 양의 물에 다시 넣으십시오. 참고 : [18F] -FDG 주사 후 물고기를 PET에 다시 한번 마취시키기 전에 [18F] -FDG의 확산을 촉진하기 위해 10 분에서 1 시간 동안 소량의 담수에 넣을 수 있습니다. / CT 영상. </li></ol>

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잠재적 이해 상충은 공개되지 않았다.

이 연구는 제브라 피쉬에서 고혈당의 급성 및 만성 모델을 수립하는 다양한 방법을 설명합니다. 이 절차의 주요 이점은 다음과 같다 : (1) 연구에 사용 된 포유류 수의 감소, (2) 설치가 쉽고 신속한 구현, (3) 경제적이다. 따라서 그러한 모델은 죽상 혈전증, 심혈 관계 기능 이상, 망막 병증, 혈액 뇌 장벽 누출, 구성 적 및 재생성 신경 발생을 비롯한 여러 생리 학적 과정에 미치는 영향을 연구하기 위해 많은 동물에 대한 고혈당의 영향을 조사 할 수 있습니다. 이 연구는 정상 또는 상해 유발 조건에서 뇌 세포 증식에 ​​대한 고혈당의 영향에 대한 조사를 진행하는 방법을 설명합니다. 만성 고혈당 절차의 한 가지 중요한 한계는 일부 실험에서 일부 물고기는 만성적 침지 후 고혈당증을 나타내지 않는다는 것입니다D- 글루코오스 수중 (111 mM, 14 일). 응답 성 및 비 반응성 어류의 비율은 이전에 Dorsemans 및 동료 (2016)에 의해 각각 83 % 대 17 %로 ...

고혈당은 과도한 혈당 수준으로 정의됩니다. 급성 스트레스의 상황을 반영 할 수는 있지만, 고혈당은 또한 종종 인슐린 분비 및 / 또는 저항의 만성적 인 장애인 당뇨병의 진단으로 이어지는 상태입니다. 2016 년에 당뇨병으로 살고있는 성인의 수는 전 세계적으로 4 억 2200 만 명에 이르며 매년 150 만 명이이 질병으로 사망하여 심각한 건강 문제가됩니다 1 . 실제로 통제되지 않는 당뇨병은 심혈관 계, 신장 및 말초 및 중추 신경계에 영향을 미치는 몇 가지 생리 장애를 유발합니다. 흥미롭게도 급성 및 만성 고혈당증은 인지력을 변화시키고 치매와 우울증에 기여할 수 있습니다 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . 또한, 환자 w의 입학고혈당증은 허혈성 뇌졸중 7 , 8 , 9 , 10 , 11 후 기능적, 신경 학적 및 생존의 결과와 관련이있다. 또한 고혈당증 / 당뇨병은 신경 줄기 세포 활동과 신경 세포 분화, 이주 및 생존에 영향을줌으로써 성인 신경 발생, 새로운 신경 세포의 생성을 유도하는 과정에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다 2 , 12 . 포유류와 달리 zebrafish와 같은 원숭이 생선은 뇌 전체에 강력한 신경 인성 활동을 나타내며 성인 13 , 14 , 15 , 16 세 사이의 뇌 회복에 탁월한 능력을 나타냅니다. 주목할 만하게, 그런 수용량은 neu의 끈기 때문에 가능하다방사형 glia와 neuroblasts를 포함한 ral stem / progenitor 세포 17 , 18 , 19 . 또한, zebrafish는 최근 비만과 고혈당 / 당뇨병을 포함한 대사 장애를 연구하기위한 모델로 등장했습니다 20 , 21 , 22 . 제브라 피쉬가 고혈당증과 신경 발생의 잘 알려진 모델이지만, 고지혈증이 뇌의 항상성과인지 기능에 미치는 영향을 조사한 연구는 거의 없습니다 12 , 23 . 구성 및 상해 유도 된 뇌 세포 증식에 ​​대한 고혈당의 영향을 결정하기 위해 D- 포도당의 복강 내 주사를 통해 급성 고혈당 모델을 만들었다. 또한 만성 고혈당 모델은 생선을 물에 담그면 재현되었다.D- 포도당 12 . Zebrafish는 연구에서 많은 이점을 보입니다. 그들은 개발의 첫 번째 단계에서 싸고 쉽게 올릴 수 있으며 투명한 상태이며 게놈은 시퀀싱되어 있습니다. 이 연구의 맥락에서, 그들은 또한 다음과 같은 몇 가지 장점을 보여준다. (1) 인간과 비슷한 생리 학적 과정을 공유하여 생물 의학 연구에 중요한 도구가된다. (2) 뇌의 항상성과 신경 발생에 미치는 고혈당의 영향을 신속하게 조사 할 수있다. (3) 그들은 대안 모델이며, 연구에 사용 된 포유류의 수를 줄일 수있다. 마지막으로 zebrafish는 PET / CT를 사용하여 방사선 표지 된 분자 및 잠재적 치료제의 생체 분포를 테스트하기위한 모델로 사용할 수 있습니다. 다음 절차의 전반적인 목표는 zebrafish에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 설정하는 방법을 시각적으로 문서화하고 zeb고지혈증 상태에서 뇌 리모델링을 평가하고 PET / CT를 사용하여 방사성 표지 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)를 모니터링합니다.

<table><tbody><tr><td>1mL Luer-Lok 주사기</td><td>BD, 미국</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>4',6'-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>7mL 보석 용기 일반 실험실</td><td>Dutscher, 프랑스</td><td>080171</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td><td>당 Sigma-Aldrich, 독일</td><td>67021</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Life Sciences, 일본</td><td>Hamamatsu ORCA-ER</td><td></td></tr><tr><td>일회용 베이스 몰드&nbsp;</td><td>Simport, Canada</td><td>M475-2</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 Alexa fluor 488</td><td>Life Technologies, 미국</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Embedding center</td><td>Thermo Scientific, 미국</td><td>Shandon Histocentre 3</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon, 일본</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodeoxyglucose (18F-FDG)</td><td>Cyclotron, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈당계 테스트 스트립</td><td>LifeScan, 프랑스</td><td>One-Touch 143 Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa fluor 594</td><td>Life Technologies, 미국</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>In-Vivo 이미징 시스템</td><td>TriFoil Imaging, 캐나다</td><td>Triumph Trimodality&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Scientific, 미국</td><td>Microm HM 355 S</td><td></td></tr><tr><td>단클론 마우스 anti-PCNA</td><td>DAKO, USA</td><td>클론 PC10</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>폴리클론 토끼 안티-GFAP</td><td>DAKO, USA</td><td></td><td></td></tr> Z033429 <tr><td>슬라이드 건조 벤치</td><td>Electrothermal, 미국</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>시트르산나트륨 삼나트륨 염 탈수물&nbsp;</td><td>Prolabo, France</td><td>27833.294</td><td></td></tr><tr><td>멸균 바늘</td><td>BD Microlance 3</td><td>30 G 1/2 ; 0.3 mm&times; 13 mm</td><td></td></tr><tr><td>학생용 Dumont #5 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>학생용 수술용 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>91400-14</td><td></td></tr><tr><td>Superfros Plus Gold Slides</td><td>Thermo Scientific, 미국</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>외과 현미경</td><td>Leica, France</td><td>M320-F12</td><td></td></tr><tr><td>조직 임베딩 카세트</td><td>Simport, 캐나다</td><td>M490-10</td><td></td></tr><tr><td>조직 매립 매체</td><td>LeicaBiosystems, 미국</td><td>39602004</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS-222</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>X100-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>벡타실드 매체&nbsp;</td><td>Vector Laboratories, 미국</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>어류 균주</td><td>AB</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>강한>식염수 인산염 완충액 (10X PBS) pH 7.4 (1 리터용)</td><td></td><td></td><td>10X PBS를 준비하기 위해 다음&nbsp; 염을 추가하고 증류수로</td></tr> <tr><td>1 리터로 완성하십시오.염화칼륨 (MM : 74.55 g / mol) : 2.00 g</td><td> Sigma-Aldrich, 독일</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일 염기성 (MM : 136,09 g / mol) : 2.40g </td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td> 염화나트륨 (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>S9888<</td><td></td></tr><tr><td>em>인산나트륨이염기성(MM: 141,96 g): 14,40 g</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>795410</td><td></td></tr></tbody></table>

제브라 피쉬의 고혈당의 급성 및 만성 모델 : 고혈당의 영향을 평가하는 방법 - 신경 세포 및 방사선 표지 된 분자의 생체 분포

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

고혈당은 심혈 관계 및 뇌 기능 장애로 이어지는 주요 건강 문제입니다. 예를 들어 뇌졸중 후 신경 학적 문제가 증가하고 신경 인성 과정을 손상시키는 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 성인 제브라 피쉬는 고혈당 / 당뇨병을 모방하고 구성 적 및 재생성 신경 발생을 조사하기위한 관련적이고 유용한 모델로 최근 등장했습니다. 이 연구는 고혈당의 제브라 피쉬 (zebrafish) 모델을 개발하여 항상성 및 뇌 수복 조건 하에서 뇌 세포 증식에 ​​대한 고혈당의 영향을 탐구하는 방법을 제공합니다. 급성 고혈당증은 성인 제브라 피쉬에 D- ​​포도당 (2.5g / kg bodyweight)을 복강 내 주사하여 측정한다. 만성 고혈당증은 14 일 동안 물을 함유 한 D- 포도당 (111 mM)에 성인 제브라 피쉬를 담그면 유도됩니다. 혈당 수준 측정은 이러한 여러 접근법에 대해 설명됩니다. 구성 당뇨병에 대한 고혈당의 영향을 조사하는 방법뇌파의 기계적 손상을 기술하고, 뇌를 해부하고, 파라핀을 삽입하고, 마이크로톰으로 절편을 만들고, 면역 조직 화학 절차를 수행함으로써 재생 신경 발생을 입증합니다. 마지막으로, PET / CT를 사용하여 방사성 동위 원소 표지 된 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)의 생체 분포를 연구하기위한 관련 모델로 제브라 피쉬를 사용하는 방법도 설명합니다.

이 기사에 설명 된 절차를 사용하여 성인 제브라 피쉬에서 D- 포도당 (2.5 g / kg bodyweight) 복강 내 주입을 실시하고 주입 1.5 시간 후 혈당 수치가 유의하게 증가했습니다 ( 그림 1A ). 주사 후 24 시간에 D- 글루코오스와 PBS를 주사 한 어류 간에는 혈당치가 비슷 하였다. 만성 치료를 위해, 제브라 피쉬는 D- 포도당 물 (111 mM)에 담갔다가 치료 14 일 ( 그림 1B )이 끝날 때 고혈당증이되었다 ( 그림 12 ) . 고혈당이 뇌 세포 증식에 ​​미치는 영향을 조사하기 위해 급성 및 만성 고혈당의 유...

이 연구는 제브라 피쉬에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 목표는 구성 및 상해 유발 신경 발생과 같은 생리적 과정에 대한 고혈당의 영향을 조사하는 것입니다. 이 연구는 또한 PET / CT를 사용하여 방사성 동위 원소 표지 된 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)를 따르는 제브라 피쉬의 사용을 강조합니다.

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

다음 절차의 전반적인 목적은 고혈당 조건에서의 뇌 리모델링을 평가하고, 제브라피시 내에서 방사성 표지 분자를 추적하는 것입니다. 고혈당증은 혈당 농도가 과도하게 높은 상태를 특징으로 합니다. 만성 고혈당증은 당뇨병성 상태로 인해 발생할 수 있으며, 다양한 혈관 기능 장애를 유발하여 결과적으로 심근경색, 뇌졸중 또는 당뇨병성 족부 궤양과 같은 임상적 합병증을 일으킬 수 있습니다.또한, 스트레스로 인한 급성 고혈당은 허혈성 뇌졸중에서 출혈성 합병증을 촉진할 수 있습니다. 제브라피시는 인간의 질환과 그것이 중추신경계에 미치는 영향을 이해하기 위한 흥미로운 모델입니다. 특히 성체 물고기의 뇌는 포유류에 비해 강력한 신경 발생 능력과 뛰어난 뇌 복구 메커니즘 능력을 보여주므로, 제브라피시는 급성 및 고혈당 조건의 스트레스 이후 뇌 리모델링을 조사하기 위한 좋은 모델이 됩니다.또한 방사성 표지 분자 및 잠재적 치료제의 생체 내 분포를 조사할 수 있습니다. 모든 실험은 연구용 동물 사용에 관한 프랑스 및 유럽 공동체 가이드라인에 따라 수행되었으며, 지역 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 뜰채를 사용하여 물고기를 조심스럽게 잡으십시오.물에서 최종 농도가 0.02%가 되도록 희석한 소량의 트리케인(tricaine) 마취제에 물고기를 넣습니다. 물고기의 움직임이 멈출 때까지 기다립니다. 커팅된 피펫을 사용하여 물고기를 꺼내어 흡수성 조직지 위에 조심스럽게 올려놓아 최대한 물기를 제거합니다.체중 1kg당 2.5g의 d-glucose를 50µL 용량으로 주입하기 위해 물고기의 무게를 잽니다. 예를 들어, 0.6g 무게의 물고기에는 3% d-glucose PBS 용액 50µL를 투여합니다. 물고기를 등으로 눕힌 후 한 손으로 고정합니다.다른 한 손으로 시린지 바늘을 복강 내에 삽입하고, d-glucose PBS 용액을 천천히 주입합니다. 바늘을 제거하고 물고기를 다시 수조에 넣습니다. 물고기가 완전히 회복될 때까지 관찰합니다.혈당 수치는 보통 1 1/2시간 후에 측정합니다. 만성 고혈당 상태를 모방하기 위해, 최종 농도가 111 millimolar인 d-glucose 2리터 탱크를 준비합니다. 이를 위해 d-glucose 40g을 정량하여 빈 탱크에 넣습니다.수조에 물고기 사육수 2L를 채우고, 최대 7마리의 물고기를 넣습니다. 박테리아 또는 기타 미생물의 증식을 방지하기 위해 2일마다 포도당 용액을 교체합니다. d-glucose를 이용해 14일간 처리함으로써 만성 고혈당 상태를 유도합니다.뜰채로 물고기를 잡은 후 얼음 위에 놓습니다. 신속한 안락사를 위해 물고기를 얼음으로 덮습니다. 물고기를 꺼내 닦아내어 혈액 샘플을 희석시킬 수 있는 물방울을 제거합니다.해부용 핀셋으로 눈을 제거하고, 안와에 혈액이 찰 때까지 기다립니다. 혈당계에 검사지를 끼운 후, 검사지를 안와에 삽입합니다. 혈당 농도 수치를 기록합니다.급성 고혈당의 경우, d-glucose를 복강 내 주사하면 그림과 같이 주사 후 1 1/2시간 뒤에 혈당 수치가 유의미하게 증가합니다. 만성 고혈당의 경우, 물고기를 d-glucose 용액에 침지시키면 14일간의 처리 후 그림과 같이 혈당 수치가 유의미하게 증가합니다. 절차의 마지막 단계에서 해부 가위로 머리와 몸통을 분리하고, 면역 조직 화학 실험을 위해 PBS로 희석한 4% paraformaldehyde에 머리를 넣습니다.4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 또는 뇌를 직접 추출하여 mRNA 추출과 같은 다른 실험을 위해 냉동 보관할 수도 있습니다. 다음 날, 고정된 머리를 PBS로 헹구고 해부 현미경 하에서 바늘로 고정합니다.남은 눈을 제거하고, 포셉을 사용하여 두개골 상단을 조심스럽게 엽니다. 그런 다음 뇌를 조심스럽게 추출하여 1x PBS에 넣습니다. 고정된 뇌는 에탄올 농도를 단계적으로 높여가며 탈수시킨 후, 톨루엔에 30분씩 두 번 침전시킵니다.그 다음 뇌 조직을 임베딩 카세트에 넣고 뚜껑을 조심스럽게 닫습니다. 카세트를 58~60 °C의 용융 파라핀에 넣습니다. 뇌의 파라핀 임베딩 과정 동안 가열 포함 포셉(warming inclusion forceps)의 전원을 켭니다.카세트를 깨끗한 파라핀 배스에 넣습니다. 파라핀 배스 과정이 끝나면 카세트를 꺼냅니다. 몰드에 액체 파라핀을 적당량 붓습니다.카세트를 열고, 녹은 파라핀이 담긴 몰드 안에 뇌 조직을 넣습니다. 워밍 인클루전 포셉을 사용하여 뇌의 방향을 잡습니다. 몰드에 녹은 파라핀을 가득 채우고, 임베딩 머신의 냉각부에서 굳힙니다.기술적인 이유로, 뇌는 전-후축에 따라 배치해야 합니다. 파라핀 블록의 몰드를 제거한 후, 이를 적절히 잘라내고 녹은 파라핀을 이용하여 횡단면 절단이 가능한 올바른 방향으로 카세트에 고정합니다. 파라핀 블록을 마이크로톰 암(arm)에 삽입하고, 뇌 샘플 층에 도달할 때까지 50 µm 두께로 절편을 제작합니다.그 다음, 파라핀 블록을 다듬어 사다리꼴 모양으로 만들고, 절편 두께를 7 µm로 조정합니다. 세밀한 붓을 사용하여 파라핀 리본을 수집하고 검은색 종이 위에 올립니다. 파라핀 리본을 3~4개 절편마다 나누어 절단합니다.슬라이드를 가온판 위에 놓고 증류수로 덮습니다. 절편을 슬라이드 위의 물 위에 조심스럽게 배치하고 40 °C까지 가온합니다. 파라핀 리본이 충분히 펼쳐지면 흡수성 티슈로 물기를 제거합니다.보여지는 바와 같이, 마지막 방울들을 기계적으로 제거합니다. 프로토콜에 설명된 면역조직화학 절차를 수행하기 전, 슬라이드를 최소 2시간 동안 건조시키십시오. 면역조직화학 처리 후, 고혈당증이 뇌세포 증식에 미치는 영향을 연구하기 위해 에피형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 슬라이드를 분석합니다.뇌 세포 정량화는 최소 3개의 연속 절편 또는 관심 영역에서 수행합니다. 여기에서 PCNA 양성 세포에 해당하는 증식성 세포가 녹색으로 나타납니다. 보시는 바와 같이, 만성 고혈당은 복측 종뇌, 배측 종뇌, 그리고 외측 및 후방 함몰 주변의 미측 시상하부에서 PCNA 항체로 녹색 표지된 증식성 세포의 수를 감소시킵니다.또는, 고혈당이 손상 유도 신경발생에 미치는 영향을 연구하기 위해, 만성 고혈당 처리 중에 종뇌의 찌름 상처(stab wound) 손상을 유발할 수 있습니다. 이를 위해, 7일 동안 처리한 물고기를 마취하고 해부 현미경 아래에 둡니다. 30게이지 주사기를 두개골을 통해 오른쪽 종뇌 반구의 중심부로 수직으로 밀어 넣습니다.이 절차를 마친 후, 물고기를 정해진 시간 동안 다시 수조로 옮겨야 합니다. 본 실험에서는 물고기를 d-glucose가 포함된 물에서 7일 동안 생존시킨 후 희생시켰습니다. 대뇌 말단(telencephalon)의 자창 부상은 병변 발생 7일 후, 손상된 뇌 반구의 증식 작용을 강력하게 상향 조절합니다.본 연구 데이터에 따르면 만성 고혈당증은 종뇌(telencephalon)의 자창 손상 후 세포 증식을 감소시킴으로써 뇌 회복 과정을 현저히 저하시키는 것으로 나타났습니다. 제브라피시는 방사성 표지 분자의 생체 내 분포 연구에도 활용될 수 있습니다. 이에 따라 본 연구에서는 제브라피시 유기체 내의 포도당 대사를 연구하기로 하였습니다.물고기를 먼저 마취한 후, 마취제가 적셔진 조직 위에 놓습니다. 그런 다음 물고기를 방사선 차폐창 뒤에 배치합니다. 50 µL의 fluorodeoxyglucose가 담긴 주사기를 준비합니다.물고기를 등으로 눕힌 상태에서 20 MBq의 FDG 50 µL를 복강 내로 주입합니다. 그 후 물고기를 마취제가 적셔진 다른 조직 위에 올려놓습니다. 물고기를 조심스럽게 감싸서 PET 스캔 영상 장치의 암(arm) 위에 위치시킵니다.팔을 PET 스캔 장치에 넣고 영상 촬영 절차를 수행합니다. 여기서 FDG가 주입 부위뿐만 아니라 물고기의 머리, 특히 뇌와 척수 전반에서 검출되는 것을 확인할 수 있습니다. 본 연구에서는 제브라피쉬에서 급성 및 만성 고혈당을 유도하는 두 가지 서로 다른 방법을 제시하며, 고혈당이 정상 상태 및 손상 유도 조건에서 뇌세포 증식을 저해함을 보여줍니다.결론적으로, 제브라피시는 중추신경계에서 고혈당의 유해한 영향을 조사하기 위한 적절한 모델로 사용될 수 있습니다. 또한 PET 스캔을 통해 방사성 표지 분자의 생체 내 분포를 평가하는 것도 가능합니다.

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Research

연구

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여기, 우리는 방법 프로토콜 neoangiogenesis 및 구조적인 변화에 연결 된 장기 혈관 병 리의 설정에서 빠른 읽기로 쉽게 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish 망막 맥 관 구조 분석 수 있는 논의.

물고기는 눈을 통해 당뇨병을 공부: 기정, 시각화, 및 성인 tg(fli:EGFP) Zebrafish 망막 맥 관 구조 분석

우리는 인지 성능을 평가하기 위해 설계된 행동 챔버를 제시한다. 우리는 일단 인수한 후, 제브라피쉬가 8주 후에 그 일을 기억한다는 것을 보여주는 데이터를 제공합니다. 우리는 또한 고혈당 얼룩말 물고기인지 성능을 변경 했다 보여줍니다., 이 패러다임 인식 및 메모리를 평가 하는 연구에 적용 할 수 있음을 나타내는.

제브라피쉬를 모델 시스템으로 사용하는 3챔버 선택 행동 작업

이 프로토콜은 비침습적으로 최대 8 주 동안 얼룩말 피시의 고혈당을 유도합니다. 이 프로토콜을 사용하여 고혈당증의 부작용에 대한 심층적인 연구가 이루어질 수 있습니다.

제브라피시에서 장기간 고혈당증을 생산하는 포도당에 대체 침수

우리는 동축 노즐을 사용하여 만능 줄기 세포(PS 세포)를 알기네이트 하이드로겔 캡슐에 캡슐화하는 방법을 확립했습니다.  이는 세포가 과도하게 응집되는 것을 방지하고 현탁 배양에서 세포가 겪는 전단 응력을 제한합니다.  이 기술은 PS 세포의 대량 생산과 줄기 세포 틈새 시장에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

이 연구에서는 제브라피시 유충에 대해 EBD(Evans Blue Dye) 분석을 수행하는 간단한 방법을 설명합니다.  이 기술은 골격근 무결성의 특성화와 근이영양증의 제브라피시 모델을 묘사하기 위한 강력한 도구이며 새로운 치료법 개발을 위한 귀중한 방법입니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

얼룩말은 근육 기능과 질병을 연구하는 훌륭한 모델입니다. 초기 배발생 동안 제브라피쉬는 규칙적인 근육 수축을 시작하여 리드미컬한 수영 행동을 일으키며, 이는 근육이 파괴될 때 변경됩니다. 여기에서는 근육 기능의 척도로서 수영 성능을 조사하기 위해 촉각 유발 반응 및 운동 분석에 대해 설명합니다.

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

배우세요 제브라피쉬에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 수립하고 PET/CT 영상으로 방사선 표지 분자의 생체분포를 추적하는 방법을. 이 기법은 당뇨 합병증 연구와 중추신경계 재생 메커니즘 이해에 활용됩니다.

제브라 피쉬의 고혈당의 급성 및 만성 모델 : 고혈당의 영향을 평가하는 방법 - 신경 세포 및 방사선 표지 된 분자의 생체 분포

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