Name: 표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 배우세요 매크로폼 기반 면봉 표본 추출 방법으로 환경 표면의 노로 바이러스를 검출하고 정량하는 기술입니다. 이 프로토콜은 오염 역학 평가와 방역 전략 효과성 분석에 활용됩니다.

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필드 1. 면봉 샘플링 <ol><li> 장갑의 깨끗한 쌍을 착용 할 것. </li><li> 측정 테이프자를 사용하여 표면을 만지지 않고 샘플링 에리어의 크기를 측정한다. 가능한 한 정확하게 영역을 추정하고 보고서 양식 (보충 표 1)를 작성하려고합니다. </li><li> 가능한 누출 및 라벨 샘플 수송 가방과 면봉 키트에 대한 면봉 키트를 확인합니다. </li><li> 다음 샘플링 에리어 걸쳐 면봉 이동 : 수평 방향의 하나의 선, 세로 방향으로 하나의 스트로크와, 대각 방향에 하나의 획. 700cm 2보다 표면적이 큰 면봉하지 마십시오. </li><li> 튜브에 각각 면봉을 놓고 안전하게 뚜껑을 조입니다. </li></ol> 실험실에 면봉 2. 보관 및 운송 <ol><li> 최대 48 시간 동안 4 ° C에서 면봉을 유지합니다. 오랜 기간 동안 보관이 필요한 경우, -20 ° C에서 면봉을 저장 (또는 -70 ° C). </li><li> 0-4 ℃에서 튜브를 유지 (즉,. 컬렉션의 24 ~ 48 시간 이내에 실험실 및 선박에 운송 중 절연 된 용기에) 콜드 팩을 사용합니다. </li></ol> 3. 바이러스 농도 바이러스 RNA 추출 및 정제 주 : 달리 명시되지 않는 한 모든 원심 분리 단계는 실온에서 5 분 동안 5,000 XG에서 테이블 탑 원심 분리기를 사용한다. 보편적 인 핵산 추출 (UNEX) 버퍼로 작업 할 때 추가로주의해야합니다. 고글 또는 안면 보호대를 착용하십시오. <ol><li> 한 15 ML의 튜브와 각 샘플에 대해 하나의 RNA 미디 열 레이블. 각 실험에 부정적인 추출 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 10 면봉 대한 분해 용액을 제조 PBST 25 mL로 UNEX 완충액 25 ㎖를 혼합하여 (0.02 %를 함유하는 PBS pH를 7.2 트윈 80). </li><li> 용해 액 50 ㎖에 coliphage의 MS2 서스펜션 (10 6 PFU / μL) 50 μL를 추가합니다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 면봉을 넣고 5 ml의 용해 액을 추가합니다. 혼합하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li>10 초 동안 각 튜브와 소용돌이에 5 ml의 100 % 에탄올을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 15 ML의 튜브에서 면봉을 제거 초과 액체를 제거하고 면봉을 폐기 튜브의 측면에 살짝 누르면 (이 UNEX 버퍼를 포함). 나머지 볼륨은 9 ~ 10 mL의 사이에 있어야한다. </li></ol> 4. 미디 열 바이러스 핵산 추출 <ol><li> 조심스럽게 미디 컬럼, 원심 분리기에 단계 3.6에서 4.5 mL의 UNEX / 에탄올 혼합물을 전송하고, 여과 액을 버린다. </li><li> 동일한 열, 원심 분리기에 같은 혼합물로부터 또 다른 4.5 mL로로드하고, 여과 액을 버린다. </li><li> 제 씻지 미디 칼럼, 원심 분리기에 70 % 에탄올 3.5 mL를 추가하고, 여과 액을 버린다. </li><li> 제 씻지 미디 컬럼에 70 % 에탄올의 또 다른 3.5 mL의 추가. 원심 분리기 여과 액을 버리고. </li><li> 건조 스핀를 들어, 에탄올의 모든 흔적을 (부정적인 바이러스 성 RNA 복구에 영향을 미칠 수있는)을 제거하기 위해 미디 열을 원심 분리기. </li><li>새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브의 미디 열을 놓습니다. 미디 칼럼에 250 μL 용출 버퍼를 추가; 가장 높은 바이러스 성 RNA 복구를 얻기 위해 원심 분리하기 전에 1 분 동안 기다립니다. </li><li> -70 ° C에서 추출 된 핵산을 저장하거나 5 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> RNA 깨끗하고 집중 키트를 사용하여 바이러스 핵산의 5 농도 <ol><li> RNA는 10 초 동안 위의 단계 4.7과 와동에 용출 된 RNA의 250 μL에 버퍼를 바인딩의 500 μL를 추가합니다. </li><li> 10 초 동안 750 μL 100 %를 에탄올과 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 각 샘플에 대한 스핀 열 레이블. 스핀 칼럼에 750 μL 샘플을로드합니다. </li><li> 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기 상에 남아있는 750 μL를로드합니다. </li><li> 프리 워시를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 400 μL RNA 준비 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 첫 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 800 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 두 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 열 원심 분리기를 회전 400 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 건조 스핀를 들어, 2 분 동안 12,000 XG에 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거하는 스핀 컬럼을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 스핀 컬럼을 전송합니다. </li><li> 스핀 컬럼 상에 25 μL의 용출 완충액을 첨가하고 실온에서 1 분 동안 배양한다. 이 컬럼으로부터 RNA 바이러스의 회수를 증가시킬 것이다. </li><li> 1 분 동안 10,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리하여 RNA를 수집합니다. </li><li> 어느 -70 ° C에서 RT-qPCR에 (6 단계) 또는 저장 RNA에 직접 진행합니다. </li></ol> 6. 유전자형 I의 Mutiplex RT-qPCR에 탐지 및 II Noroviruses 및 Coliphage MS 2 (보충 표 2) <ol><li> 청소 작업 표면 pipettES,의 RNase의 오염 제거 용액와 원심 분리기는 오염 가능성을 줄일 수 있습니다. </li><li> 얼음에 RT-qPCR에 시약을 녹여. (별도의 영역 / 방에) 얼음에 해동 RNA. </li><li> 반응의 수를 결정하고 적어도 10 % 이상을 추가 (열 반응이 필요한 경우, 예를 들면, 11의 마스터 믹스를 확인). </li><li> 5 초 동안 25 배 RT-qPCR에 효소를 제외 소용돌이 개별 마스터 믹스 구성 요소. 조심스럽게 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 효소를 혼합한다. </li><li> 5 초 동안 간단히 원심 분리기 마스터 믹스 구성 요소. </li><li> 키트 지침에 따라 노로 바이러스 GI과 GII의 실시간 RT-PCR 검출을위한 마스터 믹스를 준비하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (보충 표 3)에서 노로 바이러스 특이 적 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 추가합니다. </li><li> 위아래로 5 ~ 10 회 피펫 팅하여 마스터 믹스 믹스 (텍싱하지 않는 것이 좋습니다). 실시간 PCR을 96 웰 플레이트의 각 웰에서의 마스터 믹스를 22 μL 분취. </li><li> 소용돌이 샘플 RNA5 초 동안, 그리고 짧은 (5 초) 원심 분리하여 수집합니다. </li><li> RT-qPCR에 판 (표 2에서 템플릿을 따라)에 샘플 RNA와 GI과 GII 양성 대조군의 3 μL를 추가합니다. 노 템플릿 제어 (NTC) 우물에 클레아 제-freewater의 3 μL를 추가합니다. </li><li> 광학 접착제 필름 실시간 플레이트를 밀봉. </li><li> 1 분 웰에 존재할 수있는 임의의 기포 또는 액체 방울을 제거하기 위해주의 깊게 1300 XG에서 실시간 플레이트를 원심 분리. </li><li> 10 분 동안 1) RT 단계 : 실시간 PCR 장비 및 설정 다음 열 순환 조건을 설정합니다. Taq 중합 효소의 45 ° C (2) 활성화, 10 분에서. 95 ° C에서 및 (3) 95 ℃에서 15 초간 45 사이클, 그리고 60 ℃에서 60 초. </li></ol> 면봉 샘플에서 노로 바이러스의 7 정량화 <ol><li> RT-qPCR의 결과 (보충 표 3)의 유효성을 검사 양성 및 음성 대조군의 결과를 확인합니다. </li><li> 각각의 표준 곡선이 사항을 만족하는지 확인사용할 수있는 값은 보조 표 2에 주어진 수학 식 (1)를 사용하여 표준 곡선의 전체 표준 편차를 계산합니다. (식 1) %의 효율 = 100 × 10 (평균 코네티컷 값 절편) / 경사. </li><li> PCR을 열 순환기 소프트웨어는 각각의 표준 곡선에 대한 기울기를 계산하지 않으면 기울기 R 통계 소프트웨어를 이용하여 회귀 2 값 (예를 들어 엑셀, SPSS 또는 SAS)를 결정한다. 또한, 방정식 나는 다음과 같은 표준 곡선에 대한 %의 효율을 계산 </li><li> 보충 표 4에 명시된 기준에 맞는 표준 곡선에 기초하여 모든 테스트 샘플에 대한 열 순환기 소프트웨어에 의해 산출 된 RNA 카피 수를 기록한다. 기준을 충족하거나 거짓 양성 대조군이없는 표준 곡선 t 모자와 함께 어떤 샘플을 다시 실행하십시오. PCR 억제를 모니터링 할 수있는 내부 통제로 추가 된 coliphage MS2의 코네티컷 값을 확인합니다. </li><li> RNA 카피 (P)의 총 개수를 결정는 RT-qPCR의 반응에 사용 된 RNA (3 μL 5)의 것과 총 RNA의 용출 부피 (25 내지 50 μL)의 비율로 단계 7.2에서 계산 된 RNA 복사 개수를 곱하여 ER 샘플. 대안 적으로, 분석 대상물의 표면적 (cm 2)에 의해 총 RNA 복사 개수를 분할함으로써 RNA 농도를 계산한다. </li></ol> 헤미 중첩 된 기존의 PCR 증폭에 의해 실시간 RT-PCR 긍정적 인 샘플의 8 유전자형 <ol><li> RT-PCR 분석의 각 프라이머 세트에 대한 마스터 믹스의 첫 번째 라운드를 준비합니다 (보충 표 2, 5). </li><li> 마스터 믹스 20 μL에 노로 바이러스 양성 RNA의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 다음과 같은 조건에서 RT-PCR을 실행하여, (1) 실온에서 95 ° C에서 Taq 중합 효소의 42 ° C (2) 활성화, 15 분에서 30 분 동안 단계, 및 (3) 95 ℃에서 30 초, 40주기 50 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 60 초. 40 사이클 후, 72 ℃에서 추가로 10 분 동안 배양한다. </li><li>RT-PCR 분석 각각의 프라이머 세트 (보충 표 2와 5)에 대한 이잖아요 믹스의 두 번째 라운드를 준비합니다. </li><li> 23 μL 마스터 믹스를 추가하고 각 튜브 (이상적으로 1 차 제품의 RNase없는 물에 1/10 희석한다)에 (첫 라운드에서) 1 라운드 RT-PCR 제품의 2 μL를 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 8.3. </li><li> (PH 8.3에서 40 mM 트리스, 20 mM의 아세트산 및 1 mM의 EDTA) 100 ㎖ 1X 트리스 - 아세테이트 EDTA 2 % 아가 로스 겔을 제조. 전자 레인지의 혼합물을 가열하여 아가로 용해한 후, 60 ~ 70 ℃로 냉각 한 후, 혼합물을 제조 된 겔을 100㎖ 당 핵산 얼룩 10 μL를 추가 겔 붓고 콤 삽입. 겔은 적어도 30 분 동안 정착하자. </li><li> 6X 로딩 염료 3 μL 각 RT-PCR 생성물의 15 μl를 섞는다. 로드 각 시료 15 μL 및 1 시간 동안 100 V의 아가로 오스 겔 electrophorese. </li><li> 겔에서 적절한 크기 (GI 330 BP와 GII 341 BP)의 소비세 대상 RT-PCR 단편상업적 겔 추출 키트를 사용하여 RNA를 정제 거라고. 정제 된 PCR 생성물은 이제 생거 시퀀싱에 사용될 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 상충되는 이해관계가 없습니다. 이 보고서의 조사 결과와 결론은 저자의 것이며 반드시 질병통제예방센터의 공식 입장을 나타내는 것은 아닙니다.

Noroviruses 18 10 3 바이러스 입자 20 ~ 50 %의 인간 감염 복용량을 가지고있다. 따라서, 표면도 낮은 수준의 오염은 공중 보건 위험을 초래할 수 있습니다. 내부 대조군으로서 추출 운송 중 1) 면봉 다른 재료, 2) 저장 조건 면봉 3) 바이러스 성 RNA 농도, 4) coliphage MS2 : 면봉 샘플링 프로토콜의 여러 측면을 포함하여 평가 하였다. 최근까지,면, 폴리 에스테르, 나일론 등) 닦아 대전에서 만든 면봉의 성능을 평가했다 및 필드 사용 13, 14, 15, 21, 22에 대해 제안했다. ...

<html> 인간의 noroviruses는 전염병과 산발적 급성 위장염 전 세계적으로 1, 2, 3의 주요 원인이다. 이 바이러스는 매우 전염성이 전송은 사람의 상호 작용으로 또는 간접적으로 오염 된 음식, 물 또는 환경 표면과 접촉을 통해 직접 사람을 통해 발생합니다. Noroviruses는 장시간 흘리고 연장 환경면에서의 바이러스 생존 1, 2, 3에 설명 된 수있다. 피크 흘리는 동안 바이러스 입자 수십억 대변 그램 당 방출하고, 구토 같은 감염 4, 5, 6, 7, 8 일으키는 바이러스 입자의 충분한 개수를 포함EF &quot;&gt; 9,10. 또한 무생물 표면과 사람의 피부의 바이러스의 이동이 발생하기 쉬운 2, 11, 12. 따라서, 환경 오염의 모니터링이 발생 조사 돕기 및 정화의 효과를 평가할 수 있으며 소독 절차. 몇몇 환경 샘플링 프로토콜 로타 바이러스의 검출에 대해 설명되었지만, coliphage MS2, 고양이 calicivirus (FCV) 및 박테리오파지 P22 13, 14, 15, 16. 그러나, 고속 탈수 (&lt;1 시간) 작은 표면적을 포함하여이 연구에 기술 검증 조건 (25 X 100cm 2), 적절 필드 설정을 표현하지 않을 수 있습니다. 또한 ENVIRO 낮은 오염 수준을 예상nmental 표면은 거의 바이러스 입자를 감지 할 수있는 프로토콜을 필요로한다. 우리는 노로 바이러스의 검출 및 입력을위한 macrofoam 기반 표면 샘플링 방법을 개발했다. 이 방법은 여러 노로 바이러스 발생시 검증되었습니다. 프로토콜이 포함 1) (2) 최선의 방법 실험실에 수집 및 운송 중에 샘플의 무결성을 유지하고, 노로 바이러스 3) 실험실 테스트 및 타이핑 환경면에서 면봉 샘플을 수집하는 방법에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>키트의 일반 이름</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrofoam swab</td><td>Premoistened EnviroMax Swab kit&nbsp;</td><td>Puritan</td><td>2588060PFUW</td></tr><tr><td>RNA 용해 버퍼&nbsp; </td><td>CDC UNEX 버퍼</td><td>Microbiologics</td><td>Cat No MR0501</td></tr><tr><td>RNA 추출 스핀 컬럼</td><td>Midi 컬럼</td><td>Omega Biotek</td><td>Cat No R6664-02</td></tr><tr><td>RNA 정제 스핀 컬럼</td><td>Zymol RNA 클린 및 농축기 키트&nbsp;</td><td>자이모 리서치</td><td>고양이 번호 R1016</td></tr><tr><td>실시간 RT-PCR 키트</td><td>AgPath 키트 원스텝 RT-PCR 키트</td><td>Life Technologies</td><td>Cat No</td></tr> <tr><td>4387391기존 RT-PCR 키트</td><td>Qiagen 원스텝 RT-PCR 키트</td><td>Qiagen 키트</td><td>Cat No</td></tr> <tr><td>210212Gel 추출 키트</td><td>Qiagen QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen kit</td><td>Cat No 28704 or 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Cat No 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>RNA run-off transcripts</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Realtime PCR 플랫폼</td><td>Applied Biosystems</td><td>Model ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>Optical 96-well 반응 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4316813</td></tr><tr><td></td><td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp; showAddButton=true& 제품 ID=4306311&; _bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF 6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx% 0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D& returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp 투명 접착 필름&nbsp; </A></td><td>Thermo Scientific</td><td>고양이 4306311 없음</td></tr></tbody></table>

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

인간의 noroviruses는 전염병이 전 세계적으로 산발적 위장염의 주요 원인입니다. 대부분의 감염이 어느 환경 표면 또는 음식을 통해 간접적으로 개인 대 개인 경로를 통해 직접 전파 또는 때문에, 오염 fomites과 무생물 표면은 노로 바이러스의 발생시 바이러스의 확산을위한 중요한 차량이다. 우리는 개발 검출 및 하드 표면에서 인간의 noroviruses의 입력에 대한 macrofoam 면봉을 사용하여 프로토콜을 평가 하였다. 섬유로 만들어진 면봉 또는 정전기 방지 물티슈에 비해 macrofoam 면봉는 최대 700cm 2의 변기 표면에서 바이러스 복구 (범위 1.2-33.6 %)을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 스핀 열을 사용하여 바이러스 성 RNA의 면봉에서 바이러스의 추출과 더 집중하는 단계를 포함한다. 노로 바이러스 위장염이 있었다 유람선 및 장기 요양 시설의 표면에서 수집 한 217 면봉 샘플의 총, 127 (58.5 %)RT-qPCR에 의한 GII의 노로 바이러스 양성 반응보고했다. 이 29 (22.8 %)의 성공적 유전자형을 할 수있다. 결론적으로, 우리는 임상 샘플을 사용할 수없는 경우 바이러스의 검출뿐만 아니라 발생시 환경 오염의 수준을 결정하는데 도움이 될 수 개발 된 프로토콜을 사용하여 환경 표면 노로 바이러스의 검출; 또한 치료 전략의 효과의 모니터링을 용이하게 할 수있다.

도 1은 면봉 샘플링 프로토콜의 흐름도를 나타낸다. 이 프로토콜은 네 가지 주요 단계로 구성; 1) 샘플 수집, 2) 시료의 저장 및 수송, 3) 바이러스 성 RNA의 정제 및 농도 4) RT-qPCR의 분석 및 유전자형. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> 그림 1 : 노로 바이러스의 환경 표면 샘플링에 대한 최종 프로토콜의 차트 흐름 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55205/55205fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <p class="jove_content" fo:...

환경적으로 단단한 표면에서 노로바이러스를 검출하고 정량화하기 위해 매크로폼 기반 샘플링 방법론이 개발되고 평가되었습니다.

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

본 매크로폼 기반 표면 샘플링 방법의 전반적인 목표는 유행의 원인을 규명하고, 바이러스의 환경 오염 역학을 종합적으로 평가하며, 노로바이러스에 대한 정화 전략의 효과를 확인하는 것입니다. 본 프로토콜에서는 환경 표면에서 면봉 샘플을 수집하는 방법과 수집된 면봉의 보관 및 운송 방법, 그리고 이러한 면봉에서 노로바이러스를 검출하고 유형을 분석하는 데 권장되는 실험실 프로토콜에 대해 상세히 설명합니다. 본 노로바이러스 환경 면봉 프로토콜의 뚜렷한 개선점은 최적의 면봉 재질을 결정하고, 단단한 표면에서 어느 정도의 노로바이러스를 회수할 수 있는지 확인했으며, 더 넓은 표면 영역을 효과적으로 샘플링하는 데 본 프로토콜을 사용할 수 있다는 점입니다.본 영상에서는 연구원 박근우와 Preeti Chhabra가 노로바이러스의 검출 및 유형 분석을 위한 스왑 프로토콜을 시연하겠습니다. 스왑을 시작하려면 샘플링 구역으로 이동하여 가로 방향으로 한 번, 세로 방향으로 한 번, 그리고 대각선 방향으로 한 번씩 스왑을 움직여 닦아냅니다. 각 스왑을 별도의 튜브에 넣고 캡을 단단히 닫습니다.스테인리스 스틸, 변기 시트 표면 및 문손잡이 표면의 샘플을 채취합니다. 다음으로, 각 샘플당 15-밀리리터 튜브 하나와 RNA Midi 컬럼 하나에 라벨을 부착합니다. 각 실험에 음성 추출 대조군을 포함하십시오.범용 핵산 추출(universal nucleic acid extraction) 또는 UNEX 버퍼 폐기물을 수집할 빈 병을 준비합니다. 스왑 10개 분량의 용해액을 준비하려면 UNEX 버퍼 25 milliliters와 PBST 25 milliliters를 혼합합니다. 용해액 50 milliliters에 coliphage MS2 현탁액 50 microliters를 첨가합니다.15-milliliter 튜브에 면봉을 넣고, lysis solution 5milliliter를 첨가합니다. 면봉을 용액 내에서 혼합한 후, 혼합물을 상온에서 배양합니다. 각 튜브에 100%ethanol 5milliliter를 첨가하고, 튜브를 10초 동안 볼텍싱합니다.15-milliliter 튜브에서 스왑을 조심스럽게 꺼내어, 튜브 벽면에 살짝 눌러 과잉 액체를 제거한 후 스왑을 버립니다. UNEX 에탄올 혼합물 4.5 milliliters를 Midi 컬럼으로 조심스럽게 옮기고 컬럼을 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 버립니다.동일한 혼합물 4.5 milliliters를 같은 컬럼에 추가로 로딩한 후, 컬럼을 원심분리합니다. 여과액은 버립니다. 첫 번째 세척을 위해 Midi 컬럼에 70%ethanol 3.5 milliliters를 넣고 컬럼을 원심분리합니다.원심분리 후 여과액을 버립니다. 두 번째 세척을 위해 Midi 컬럼에 70% ethanol 3.5 milliliters를 추가로 넣습니다. 원심분리 후 여과액을 버립니다.건식 원심분리를 위해 Midi 컬럼을 원심분리하여 에탄올 성분을 모두 제거합니다. Midi 컬럼을 새로운 15-milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다. 바이러스 RNA 회수율을 극대화하기 위해 Midi 컬럼에 250 microliters의 용출 완충액을 가하고, 원심분리 전 1분 동안 기다립니다.RNA 결합 버퍼 500 µL를 RNA 250 µL에 추가하고, 혼합물을 10초 동안 볼텍싱합니다. 100% ethanol 750 µL를 추가하고 10초 동안 볼텍싱합니다. 그다음, 각 시료에 맞게 스핀 컬럼에 라벨을 부착합니다.750 µL의 샘플을 스핀 컬럼에 로딩하고, 스핀 컬럼을 원심분리합니다. 통과액은 버립니다. 나머지 750 µL를 스핀 컬럼에 로딩하고, 컬럼을 원심분리합니다.예비 세척을 위해, 각 스핀 컬럼에 RNA prep buffer 400 µL를 넣고 컬럼을 원심분리합니다. 통과액은 버립니다. 1차 세척을 위해, 각 스핀 컬럼에 RNA wash buffer 800 µL를 넣고 컬럼을 원심분리합니다.통과액을 버립니다. 두 번째 세척을 위해 각 스핀 컬럼에 400 µL의 RNA 세척 버퍼를 넣고 원심분리합니다. 통과액을 버립니다.건조 회전을 위해, 스핀 컬럼을 원심분리하여 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 1.5-milliliter 마이크로원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 스핀 컬럼에 25 microliters의 용출 버퍼를 첨가하고, 컬럼에서 바이러스 RNA 회수율을 높이기 위해 상온에서 1분 동안 배양합니다.스핀 컬럼을 10,000 ×g에서 1분 동안 원심 분리하여 RNA를 수집합니다. 즉시 실시간 PCR을 진행하십시오. 멀티플렉스 실시간 RTPCR을 계속하기 전에, 작업대, 피펫 및 원심 분리기를 RNase 제거 용액으로 세척하십시오.실시간 PCR 시약을 얼음 위에서 해동합니다. 샘플 RNA는 별도의 구역에서 얼음 위로 해동합니다. 반응 횟수를 결정하고, 피펫팅 중 손실분을 고려하여 마스터 믹스용 시약을 최소 10% 더 준비합니다.다음으로, 개별 마스터 믹스 성분들을 5초 동안 볼텍싱합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 효소를 조심스럽게 혼합합니다. 마스터 믹스 성분들을 5초 동안 짧게 원심분리합니다.그 다음, 키트 설명서에 따라 노로바이러스 G1 및 G2의 RTPCR 검출을 위한 마스터 믹스를 준비하고, 1.5-밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 노로바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 프로브를 추가합니다. 이어서, 피펫팅을 통해 마스터 믹스를 7회 상하로 혼합합니다. 실시간 PCR 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 22 µL씩을 분주합니다.샘플 RNA를 5초 동안 볼텍싱하고, 5초간 원심분리하여 내용물을 회수합니다. 샘플 RNA 양성 대조군과 10배 연속 희석한 G1 및 G2 RNA 전사물을 실시간 PCR 플레이트에 3 µL씩 추가합니다. 무핵산분해효소 처리수(nuclease-free water) 3 µL를 템플릿 대조군(NTC) 웰에 추가합니다.광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 웰 내에 존재할 수 있는 기포나 액체 방울을 제거하기 위해 플레이트를 1,300 ×g에서 1분 동안 조심스럽게 원심 분리합니다. 그다음, 실시간 PCR을 설정하고 열 순환 조건을 입력합니다.G1 및 G2 전사체 모두에 대한 표준 곡선을 결정합니다. 각 표준 곡선을 사용하여 Ct 값을 RNA copy 수로 변환합니다. 총 RNA 용출액의 부피와 실시간 분석에 사용된 총 RNA 양의 비율을 구하여 샘플당 총 RNA copy 수를 계산합니다.hemi-nested conventional RTPCR을 사용하여 노로바이러스 양성 샘플의 유전형을 분석하려면, 먼저 1차 RTPCR을 위한 마스터 믹스를 준비하고, 미리 라벨이 부착된 PCR 튜브에 20 µL씩 분주합니다. 각 튜브에 5 µL의 RNA를 첨가합니다. 1차 RTPCR이 완료되면, 새 튜브에 23 µL씩 분주하여 hemi-nested 2차 PCR 라운드를 위한 마스터 믹스를 준비합니다.마지막으로, 각 튜브에 1차 PCR 생성물 2 µL를 추가합니다. 매크로폼 기반의 면봉 샘플링 방법은 노로바이러스 위장염 의심 사례가 보고된 크루즈 선박에서 수집한 샘플을 통해 현장 테스트되었습니다. 노로바이러스 양성 판정을 받은 17개의 면봉 샘플 중 4개에서 유전자형 분석이 가능했으며, 모든 샘플은 동일한 G2 서열을 나타냈습니다.바이러스 양 측정은 변기 시트와 같이 심하게 오염된 표면의 상태를 평가할 수 있게 해주었습니다. Cycle threshold 또는 Ct 값과 이러한 시료의 시퀀싱 능력 간의 관계는 실시간 RTPCR을 통해 확인되었습니다. 총 217개의 면봉 시료 중 127개가 G2 노로바이러스 양성으로 판정되었습니다.Ct 값이 24에서 27 사이인 면봉 검체와 28에서 31 사이인 면봉 검체의 유전자형 분석 성공률은 각각 100%와 72.2%였습니다. 이와 대조적으로, Ct 값이 32에서 36 사이 및 37에서 40 사이인 면봉 검체는 각각 22%와 1.6%만이 성공적으로 시퀀싱되었습니다. 본 연구에서 입증하였듯이, 이 프로토콜을 통해 노로바이러스 유행 시 환경 오염 수준을 결정하고, 임상 검체를 사용할 수 없을 때 유행의 가능한 원인을 감지하며, 세척 방법의 효과를 판정할 수 있습니다.가장 정확한 결과를 얻기 위해서는 서로 다른 샘플 간의 결과 편차를 최소화하기 위해 이 프로토콜을 정확하게 따르는 것이 매우 중요합니다.

swab-sampling-method-for-the-detection-of-human-norovirus-on-surfaces

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

primers와 열린 독서 프레임 1 (ORF1) ORF2 접합 영역입니다 노로 바이러스의 게놈 중 가장 보존 지역에 대한 구체적인 TaqMan 프로브를 이용하여 아이들의 stools에서 탐지 및 노로 바이러스의 분리의 genogroup 식별을위한 원 - 스텝 RT-PCR 분석 설명했다. 비상업적인 비용 효율적인 RNA 추출 방법을 자세히 설명하고 있습니다.

Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR

이 동영상은 인간 장내 세균에 결합하는 인간 노로바이러스 유사 입자(VLP)를 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다. 박테리아 현탁액은 VLP와 혼합되고 배양되어 VLP-박테리아 복합체가 형성될 수 있도록 합니다. 그런 다음 복합체를 형광단 태그가 지정된 VLP 특이적 항체로 라벨링한 다음 유세포 분석 기반 시각화 및 정량화를 통해 VLP 결합 박테리아의 비율을 식별합니다.

인간 노로바이러스 VLP와 장내 세균의 결합을 정량화하기 위한 분석

EPA Method 1615는 전기 양성 필터를 사용하여 엔테로바이러스와 노로바이러스를 환경 및 음용수에 농축합니다. 이 원고는 Method 1615 분석을 위한 샘플 수집 절차를 설명합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

여기에서는 Buffalo Green Monkey 신장 세포주를 사용하여 총 배양 가능한 바이러스를 측정하는 절차를 제시합니다. 이 절차는 환경 및 음용수에서 감염성 바이러스의 발생을 측정하기 위한 표준화된 도구를 제공합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

여기에서는 역전사-정량적 PCR을 사용하여 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 정량화하는 절차를 제시합니다. EPA Method 1615의 표준화된 절차를 통해 지하수에서 바이러스가 회수되는 평균 비율은 소아마비 바이러스의 경우 20%, 쥐 노로바이러스의 경우 30%였다.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

일상적인 탐지 방법 바이러스 성 게놈 증폭을 이용 하는 비 전염 성 입자에서 전염 성 차별을 그들의 무 능력에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목적은 aptamer 바인딩, 동적 산란, 및 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 노로바이러스 입자의 차별에 도움이 다른 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 것입니다.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

이 프로토콜의 목적은 진핵 병원체 인간 노로바이러스의 결합을 박테리아에 정량화하는 것이다. 초기 바이러스-박테리아 부착 분석을 수행한 후, 유동 세포측정은 집단 내에서 바이러스 결합 박테리아를 검출하는 데 사용된다.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

시민 과학 프로젝트는 SARS-CoV-2에 대한 환경 샘플을 수집하기 위해 샌디에고 주민을 모집하도록 설계되었습니다. 다국어 웹 기반 플랫폼은 사용자 친화적인 모바일 장치 인터페이스를 사용하여 데이터 제출을 위해 만들어졌습니다. 실험실 정보 관리 시스템은 실시간 결과 추적을 통해 지리적으로 다양한 수천 개의 샘플을 수집할 수 있도록 했습니다.

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

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운동은 면역 세포의 apoptosis를 유도 할 수있다. 다양한 측정 한계는 특히 사전 심사에 혈액 샘플을 분리하고 치료하는 데 필요한 시간의 양을 관련된있다. 보여주는 운동 유발성 림프구의 apoptosis의 분석을위한 신속하고 법으로서 절차입니다.

운동 유발성 Apoptosis 림프구의 결정을위한 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 방법론

배우세요 매크로폼 기반 면봉 표본 추출 방법으로 환경 표면의 노로 바이러스를 검출하고 정량하는 기술입니다. 이 프로토콜은 오염 역학 평가와 방역 전략 효과성 분석에 활용됩니다.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

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