표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

매크로폼 기반 표면 샘플링 방법의 전반적인 목표는 발병 병인, 바이러스의 환경 오염 역학에 대한 전반적인 평가 및 노로바이러스에 대한 치료 전략의 효과를 식별하는 것입니다. 이 프로토콜은 환경 표면에서 면봉 샘플을 수집하는 방법과 이러한 면봉을 보관 및 운송하는 방법, 그리고 이러한 면봉에서 노로바이러스를 검출하고 분류하는 데 권장되는 실험실 프로토콜에 대해 자세히 설명했습니다. 노로바이러스에 대한 이 환경 면봉 프로토콜의 분명한 개선점은 최상의 면봉 재료 유형, 단단한 표면에서 노로바이러스를 회수할 수 있는 양, 프로토콜을 사용하여 더 넓은 표면적을 샘플링할 수 있다는 것입니다.

이 영상에서는 두 명의 과학자인 박근우 교수와 프리티 차브라 교수가 노로바이러스의 검출 및 분류를 위한 면봉 프로토콜을 시연합니다. 면봉 채취를 시작하려면 샘플링 영역으로 이동하여 수평 방향으로 한 번, 세로 방향으로 한 번, 대각선 방향으로 한 번의 스트로크로 샘플링 영역을 가로질러 면봉을 움직입니다. 각 면봉을 별도의 튜브에 넣고 캡을 단단히 조입니다.

스테인리스 스틸로 표면을 샘플링하고, 변기 시트를 샘플링하고, 문 손잡이를 샘플링합니다. 다음으로, 각 샘플에 대해 15ml 튜브 1개와 RNA Midi 컬럼 1개를 라벨링합니다. 각 실험에 음성 추출 대조군을 포함합니다.

범용 핵산 추출 또는 UNEX, 완충 폐기물을 수집하기 위해 빈 병을 준비합니다. 10개의 면봉에 대한 용해 용액을 준비하려면 25ml의 UNEX 버퍼와 25ml의 PBST를 혼합합니다. 50마이크로리터의 coliphage MS2 현탁액을 50ml의 용해 용액에 첨가합니다.

15ml 튜브에 면봉을 넣고 5ml의 용해 용액을 추가합니다. 면봉을 용액에 섞고 혼합물을 실온에서 배양합니다. 각 튜브에 100% 에탄올 5ml를 넣고 10초 동안 튜브를 소용돌이칩니다.

15mm 튜브에서 면봉을 조심스럽게 제거하고 튜브 측면에 부드럽게 눌러 과도한 액체를 제거한 다음 면봉을 버립니다. 4.5ml의 UNEX 에탄올 혼합물을 Midi 컬럼에 조심스럽게 옮기고 컬럼을 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 버리십시오.

동일한 혼합물에서 4.5ml를 동일한 컬럼에 추가로 로드한 다음 컬럼을 원심분리합니다. 여과액을 폐기합니다. 첫 번째 세척의 경우 3.5ml의 70% 에탄올을 Midi 컬럼에 추가하고 컬럼을 원심분리합니다.

스핀 후 여과액을 버리십시오. 두 번째 세척의 경우 Midi 컬럼에 3.5ml의 70% 에탄올을 더 추가합니다. 여과액을 원심분리기하고 폐기합니다.

건식 탈수의 경우 Midi 컬럼을 원심 분리하여 에탄올의 모든 흔적을 제거합니다. Midi 컬럼을 새 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 250마이크로리터의 용리 완충액을 Midi 컬럼에 추가하고 원심분리하기 전에 1분 동안 기다렸다가 바이러스 RNA에 대한 가장 높은 회수율을 얻습니다.

250마이크로리터의 RNA에 500마이크로리터의 RNA 결합 완충액을 추가하고 혼합물을 10초 동안 와류로 만듭니다. 750 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 넣고 10 초 동안 와류를 일으킵니다. 다음으로, 각 샘플에 대한 스핀 열에 레이블을 지정합니다.

750마이크로리터 샘플을 스핀 컬럼에 로드하고 스핀 컬럼을 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다. 나머지 750마이크로리터를 스핀 컬럼에 로드하고 컬럼을 원심분리합니다.

사전 세척의 경우 각 스핀 컬럼에 400마이크로리터의 RNA 분취 버퍼를 추가하고 컬럼을 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다. 첫 번째 세척의 경우 각 스핀 컬럼에 800마이크로리터의 RNA 세척 버퍼를 추가하고 컬럼을 원심분리합니다.

플로우 스루를 폐기합니다. 두 번째 세척의 경우 각 스핀 컬럼에 400마이크로리터의 RNA 세척 버퍼를 추가하고 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.

건식 탈수의 경우 스핀 컬럼을 원심 분리하여 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 스핀 컬럼에 25마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고 실온에서 1분 동안 컬럼을 배양하여 컬럼에서 바이러스 RNA 회수율을 높입니다.

10, 000 시간 G에 1 분 동안 스핀 컬럼을 원심 분리하여 RNA를 수집합니다. Real-Time PCR로 바로 진행합니다. 멀티플렉스 real-time RTPCR을 계속하기 전에 RNase 오염 제거 솔루션으로 작업 표면, 피펫 및 원심분리기를 청소하십시오.

Real-Time PCR 시약을 얼음 위에서 해동합니다. 샘플 RNA를 별도의 얼음 위에서 해동합니다. 반응 횟수를 측정하고 피펫팅 중 손실을 제어하기 위해 마스터 믹스에 대해 최소 10% 더 많은 시약을 준비합니다.

다음으로, 개별 마스터 믹스 구성 요소를 5초 동안 볼텍스합니다. 튜브를 튕겨 효소를 조심스럽게 섞습니다. 마스터 믹스 구성 요소를 5초 동안 짧게 원심분리합니다.

그런 다음 키트 지침에 따라 노로바이러스 G1 및 G2의 RTPCR 검출을 위한 마스터 믹스를 준비하고 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 노로바이러스 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머와 프로브를 추가합니다. 다음으로, 위아래로 7회 피펫팅하여 마스터 믹스를 혼합합니다. 22마이크로리터의 마스터 혼합물을 Real-Time PCR 플레이트의 각 웰에 분취합니다.

5초 동안 샘플 RNA를 와류로 만들고 5초 원심분리로 내용물을 수집합니다. 3마이크로리터의 샘플 RNA 양성 대조군과 G1 및 G2 RNA 전사체의 10배 연속 희석액을 Real-Time PCR 플레이트에 추가합니다. 3마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 노드 템플릿 컨트롤 또는 NTC 웰에 추가합니다.

광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 1, 300회 G에서 1분 동안 플레이트를 조심스럽게 원심분리하여 웰에 존재할 수 있는 기포나 액체 방울을 제거합니다. 그런 다음 Real-Time PCR을 설정하고 열순환 조건을 입력합니다.

G1 및 G2 전사체 모두에 대한 표준 곡선을 결정합니다. 각각의 표준 곡선을 사용하여 Ct 값을 RNA 복제로 변환합니다. 총 RNA 용리액의 부피와 실시간 분석에 사용된 RNA의 총량의 비율을 취하여 샘플당 총 RNA 복제 수를 계산합니다.

헤미 중첩 기존 RTPCR을 사용하여 노로바이러스 양성 샘플의 유전형 분석을 수행하려면 먼저 1차 RTPCR에 대한 마스터 믹스를 준비하고 사전 라벨링된 PCR 튜브에 20마이크로리터 분취액을 분주합니다. 각 튜브에 5마이크로리터의 RNA를 추가합니다. 첫 번째 라운드 RTPCR이 완료된 후 23마이크로리터의 부분 표본을 새 튜브에 분주하여 반짝 중첩 두 번째 PCR 라운드를 위한 마스터 믹스를 준비합니다.

마지막으로, 각 튜브에 첫 번째 라운드 PCR 산물 2마이크로리터를 추가합니다. 매크로폼 기반 면봉 샘플링 방법은 노로바이러스 위장염이 의심되는 사례를 보고한 유람선에서 채취한 샘플에 대해 현장 테스트를 거쳤습니다. 17개의 노로바이러스 양성 면봉 샘플 중 4개는 유전형 분석이 가능하며 모든 샘플은 동일한 G2 염기서열을 가지고 있습니다.

바이러스 부하 측정을 통해 변기와 같이 심하게 오염된 표면을 평가할 수 있었습니다. cycle threshold 또는 Ct 값의 관계는 이러한 샘플을 시퀀싱하는 능력에서 실시간 RTPCR에 의해 결정되었습니다. 총 217개의 면봉 샘플 중 127개에서 G2 노로바이러스 양성 반응이 나왔습니다.

Ct 값이 24 및 27 사이 및 28과 31 사이인 면봉 샘플은 각각 100% 및 72.2%의 비율로 유전자형 분석을 수행했습니다. 대조적으로, Ct 값이 32 및 36 및 37 - 40 사이인 면봉 샘플의 22% 및 1.6%만이 성공적으로 염기서열 분석되었습니다. 우리가 입증한 바와 같이, 이 프로토콜을 통해 노로바이러스 발병 시 환경 오염 수준을 결정하고, 임상 샘플을 사용할 수 없을 때 발병의 가능한 원인을 감지하고, 세척 관행의 효율성을 결정할 수 있습니다.

가장 정확한 결과를 얻으려면 서로 다른 샘플 간의 결과 변동을 최소화하기 위해 이 프로토콜을 정확하게 따르는 것이 매우 중요합니다.