Name: Acufection와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 학습하세요 플라스미드 DNA를 마우스 피부에 경제적으로 전달하는 Acufection 방법을 통해 면역 관련 유전자의 기능을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 피부 염증 및 건선 치료 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 과학 기술부에서 부여에 의해 지원되었다 (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). 우리는 박사 감사합니다. 원고를 읽기위한 베티 우 셰 행정 원장과 하와이 대학에서 스탠포드 대학 박사 피터 호프만에서 NTU에 치엔 쿠오 리, 리 저보니, 농업 생명 공학의 기술 지원 NTU에서 윤 치엔 박사 웬 - 치 웨이 기술 자문에 대한 중앙 연구원에서 연구 센터.

8에서 여성 마우스 - 연령 12 주 본 연구에 사용되었다. C57 / BL6 야생 - 타입 (WT)와 결핍 IL-15 (IL15 - / -) 마우스는 각각 국립 실험 동물 센터 (NLAC), 대만, 타 코닉 농장에서 구입 하였다. IL15 +/- 이형의 단면으로부터 제 3 세대의 비율 결핍 IL-15 (IL15 - - /) 및 IL-15을 보이면서 (+/- IL15 및 IL15은 + / +) 1을 나타내었다. IL15의 유전자형 - / - 생쥐는 PCR 분석에 의해 확인 하였다. 마우스는 실험 동물 센터 (LAC), 국립 대만 대학교 의학 (NTU) 대학에서 특정 병원체 무료 (SPF) 시설에서 유지되었다. 마취 대상 및 방법을 포함한 모든 동물의 절차는 공중 보건 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (동물 프로토콜 20130225 승인의 진술서)의 국립 대만 대학 의과 대학 및 대학의 승인 동물 프로토콜에 따라 수행되었다. &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. 침의 제조 참고 : 침술 바늘은 핸들과 바늘 끝 (그림 1A)로 구성된 의료 장치입니다. 침술 바늘의 직경은 0.35 mm (28 G)는 0.2 mm (36 G)에서이었다. 우리는 피부를 따끔 따끔하는 동안 잠재적 인 과도한 세포 손상을 방지하기 위해 바늘의 최고 지점을 선택합니다. 13mm (0.5)에 25 mm (1.0)에 40 mm (1.5) 및 길이 50 ​​mm (2.0)를 포함하는 0.2-mm 바늘 길이의 4 가지가있다. 13mm 길이 10 개 바늘의 번들 C57BL / 6 마우스의 피부에 바늘을 진동하는 동안 가장 편안한 그립을 제공했다. 이 방법은 큰 동물의 피부에 이상 손으로 연구자에 의해 수행되는 경우 매개 변수를 수정할 수 있습니다. <ol><li> 멸균, 비발 열성 패키지에서 침을 제거합니다. 멸균 드레이프에 바늘을 놓습니다. </li><li> 난 10 바늘을 함께 결합하는 접착 라벨 테이프를 사용NA 번들 (도 1b). 참고 : 10 개 바늘 기하학적 원통 모양을 형성하도록 배치된다. 편의를 위해, 접착 테이프를 적용하기 전에 구성을 안정화 파라핀 필름의 조각을 사용한다. 모든 바늘 포인트가 동일 평면 상에 있는지 확인합니다. 대신 하나의 바늘의 번들을 사용하면 바늘과 피부의 접촉 면적을 증가시켜 최대 DNA 주입을 용이하게합니다. </li></ol> 2. 많은 양의 준비 및 독소가없는 플라스미드 DNA <ol><li> 플라스미드 DNA 화학적 유능한 박테리아 세포를 형질. </li><li> 선택한 LB 배지 함유 항생제 3ml를 단일 박테리아 콜로니를 접종하고, 밤새 진탕하에 37 ℃에서 배양한다. </li><li> C. 항생제를 LB 배지 100 250 mL로 37 ℃에서 밤새 진탕 : 1의 세균 배양을 희석하여 배양을 확장 </li><li> 고해서 양질를 사용하여 DNA를 대량으로 준비Y, 제조업체의 지침에 따라 내 독소 무료 플라스미드 준비 키트. 참고 : Acufection 프로토콜은 높은 순도와 플라스미드 DNA를 대량으로 필요합니다. 고품질의 사용은, 내 독소 무료 및 열 정제 플라스미드 DNA를 권장합니다. </li><li> 멸균 수에 DNA를 용출시켰다. acufection에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 작은 씩에 ​​보관 DNA. 참고 : 일관성있는 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 DNA의 반복 동결과 해동을 피하십시오. </li><li> acufection 무균 PBS에 1 ㎎ / ㎖로 플라스미드 DNA를 희석. </li></ol> Acufection 3. 절차 주 : DNA의 최적 량 및 대상 피부면의 면적이 다른 유전자 변화 및 더 최적화 될 필요가있다. 찌름 힘 횟수 피부 두께에 따라서 달라질 수있다 또한 피부의 각질층 느슨하게. 이러한 조건은주의 깊게 acufected 진 트랜스크리의 발현 수준을 평가 한 후 결정해야한다QRT-PCR에 의한 점. <ol><li> 마우스 체중을 복막 주사 tribromoethanol (GM 체중 당 400 μg의)을 관리. 참고 : 2,2,2- tribromoethanol 일반적으로 마우스에 사용 된 주사 마취 에이전트입니다. 용액은 2- 메틸 -2- 부탄올 중 2.5 %를 함유하는 증류 물 (200 mL) 중이 아닌 약제 학적 등급 2,2,2- tribromoethanol (2.5 g)를 용해시킴으로써 제조된다. </li><li> 마취하에 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 안과 연고를 사용합니다. 참고 : - 2 분 마취 효과는 1에서 유도됩니다. 수술 전에 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 발가락 핀치 반사를 확인합니다. </li><li> 지느러미 측면 피부를 면도하고 모발에 케라틴 단백질을 용해 제모 크림을 적용합니다. 참고 : 머리를 제거하는 제모 크림의 사용은 피부에 DNA의 주입을 용이하게합니다. </li><li> 제모 크림을 닦아 물을 적신 면봉을 사용합니다. 주 : 제모 크림은 물에 용해입니다. 크림 줘야의 완전 제거L은 기름기 표면을 방지하고 더 나은 찌름 결과를 확인합니다. </li><li> 피부 표면을 소독하기 위해 70 % 에탄올에 적신 멸균 면봉을 사용합니다. </li><li> 마크 미리 측정 스텐실 면도 한 피부의 목표 영역 (1cm X 1cm). 참고 : 대상 사이트를 표시하는 것은 위아래 정의 된 영역 내에서 바늘 번들을 적용하는 데 도움이 될 것입니다. 이 실험 실험 간 변동을 최소화하는 표면적 DNA에 동일한 양의 전달을 보장하는 것이 중요하다. </li><li> 피부에 표시된 플라스미드 DNA (μg의 10)의 10 μL 강하를 놓는다. 참고 acufection위한 DNA의 양은 다른 유전자 발현 벡터의 종류에 따라 달라진다. 사용되는 DNA의 양을주의 깊게 관심의 실험을 수행하기 전에 적정해야한다. 10 μL 작은 액적이며 ​​샤프트 동안 굴러없는 면도를 면도하고 피부에 잘 앉는다. 마우스 A를 비교하는 10 μL 빈 벡터 DNA로 처리 된 마우스의 대조군을 포함연구 유전자 cufected. </li><li> 침술 바늘 번들 (그림 1B)를 누른 상태에서 100 배 또는 피부가 사라집니다 PBS의 DNA에서 수분까지 상하 운동으로 표시된 표면을 찌르. 참고 : 피부 표면의 일부 홍반이 발생할 수 있습니다. 피가 깊은 상처를 피합니다. PBS에서 DNA로부터 수분 (10 μL)을 피부에 사라지면 피부 표면에서의 움직임을 샤프트 위아래의 수는 동작 가능하게 결정된다. 이 acufection-전달 유전자 가장 일관된 결과를 제공했기 때문에 우리는 30 초에 100 번을 결정했다. 해당하는 경우, 바늘은 최대 6 개의 표적 피부 찌르는 (1cm X 1cm 각)에 대해 재사용 될 수있다. acufection 사이에 70 %의 에탄올과 PBS에서 바늘을 씻어. 그들이 무딘 또는 교차 오염을 방지하기 위해 다른 플라스미드 DNA에 대한 때 새 바늘로 변경합니다. </li><li> 웨이크까지 체온을 유지하기 위해 가열 패드 acufected 마우스 놓는다. </li><li> 그들이있을 때 자신의 케이지에 마우스를 반환회복 충분한 의식. 참고 : 않은 acufected 쥐의 케이지에서 별도의 새장에 acufected 마우스를 유지 (케이지 미만 5 동물). </li><li> 장소에 물병을 넣고 IVC (개별 환기 케이지) 랙에 새장을 반환합니다. </li></ol> 4. 수술 후 케어 <ol><li> 시술 후 첫 48 시간 동안, 밀접하게 행동 변화 (불안, 교반 또는 섭식 장애) 또는 비정상적인 모양 (거친 털 코트 또는 구부리고 자세)를 포함한 모든 불편에 대한 마우스를 모니터합니다. </li></ol> IL-15ΔE7-acufected 스킨의 제 퀴 모드 (IMQ) 치료 참고 : acufected 유전자의 전사 발현과 단백질 생산은 관심의 플라스미드가 삼일 형질 전환 후 각성제의 다른 유형으로 처리 할 수와 acufected 일 3. 마우스에 감지 할 수 있습니다. 우리는 IMQ 크림과 IL-15ΔE7-acufected 마우스 피부를 처리하여 여기에 설명한다. IMQ는 imidazoquinolin 아민 승인 F이고또는 외부 생식기 및 주 산기 사마귀 (13)을 치료. 국소 IMQ 처리는 판상 피부 표피 증식 및 피부 호중구 침윤 12, 14, 15의 발현과 마우스에서 인간 건선과 같은 피부 질환을 유발하는 것으로되어있다. 주 : 플라스미드 벡터는 C 말단 (PEF-IL-에서 IL-2 신호 펩티드 및 FLAG 태그 측면 연장 인자 -1 α의 조절 (PEF)하에 전장 마우스 IL-15의 cDNA를 포함 뱀 포드 등에 의해 기술 된 바와 같이 제조 하였다 (15), 5859 염기쌍). (16). 플라스미드 잔기에서 처음 16 개 개의 아미노산을 삭제하기 위해 IL-15 주형 33 사용 - SOE 의해 IL-15ΔE7 (PEF-IL-15ΔE7, 5,811 염기쌍)에 IL-15 유전자의 엑손 7 48 (합성 오버랩 연장) PCR 방법 (17). 성공적이었다 세균성 식민지IL-15ΔE7 형질는 제한 효소 절단에 의해 확인되고 DNA 서열 12, 18 따랐다. 프로토콜 2 단계에서 설명 된 바와 같이 내 독소가없는 플라스미드 DNA를 대량으로 제조 하였다. <ol><li> tribromoethanol (GM 체중 당 400 μg의)의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 acufected 마취 하에서 건조를 방지하기 위해 눈 안과 의사 연고를 적용한다. 수술 절차를 시작하기 전에 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 발가락 핀치 반사를 확인합니다. 주 : 2cm X 2cm 피부가 IMQ 치료되기 때문에, 필 - 15ΔE7 플라스미드 DNA (용량 당 10 μL PBS에서 10 μg의) 2 투여 2 개 표적 부위에 acufected된다 (1cm X 1cm 각). </li><li> 표 피부 (2cm X 2cm)을 acufected 면적의 측면. </li><li> 국소 표시된 면적에 IMQ 크림을 적용하는 Q-팁 어플리케이터를 사용합니다. 주의 : 단계 5.1 첫 번째 투여 하였다 (60 mg / 투여 량)에 대해 수행된다.다음 연속 투여가 아닌 마취 된 쥐에 적용됩니다. </li><li> 고화질 캠코더와 함께 매일 IMQ 처리 지느러미 피부의 변화를 문서화합니다. 참고 : 한 사람이 또 다른 기록하는 동안 마우스를 보유하고 있습니다. 스틸 사진을 촬영하고 나중에 편집됩니다. </li><li> IMQ 처리 후 4 일째 또는 7 일째 경추 탈구 하였다 tribromoethanol의 과량 (GM 체중 당 800 μg의)을 주입하여 마우스를 안락사. 피부는 절개되고 처리된다 (- 4.5 4.1 단계). </li></ol> 마우스 피부 6. 균질 현탁액 <ol><li> 꼬리의 기지에서 수평 컷을 만들기 위해 수술 가위를 사용합니다. 사지의베이스에 양자 진행하고 앞다리의베이스에 측면을 따라 수직으로 절단하는 것을 계속한다. </li><li> 조심스럽게 앞쪽에 후부에서 하부 조직으로부터 피부를 벗겨. 등쪽 피부를 잘라 가위를 사용합니다. 멸균 페트리 접시에 피부를 놓습니다. </li><li> 대상을 절제하기 위해 메스를 사용하여피부 즉시 액체 질소에 동결. 참고 실험 실험 간 변동을 최소화하기 위해 각각의 마우스에 대해 고정 된 동일한 acufected없이 피부의 크기 (1cm X 1cm) 또는 IMQ 처리를하여 (2cm X 2cm). </li><li> 핸들과와 유 봉, 사전 냉장 2 칸 박격포의 중심에 냉동 피부 조직을 놓습니다. 조직을 분쇄하기 위해 박격포에 리드 망치를 사용합니다. </li><li> 신속 RNA 추출 또는 단백질 용 해물을 얻기 위해 50 μL의 PBS 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 튜브에 세포 용해 시약 500 μL를 포함하는 새로운 튜브로 분쇄 된 조직을 놓는다. </li></ol> 스킨 부분의 제 H &amp; E 염색과 면역 <ol><li> 카세트에서 피부 조직을 놓고 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드에 젖어. </li><li> 우리의 경우에는 LAC, NTU에서 병리학 실험실에서 수행 하였다 퍼가 부 조직. 주 : 단면 5 ㎛의 두께로 절단한다. 장소 조직 섹션에 ì양전하를 슬라이드 위에 기능. </li><li> 15 분 동안 65 ° C에서 슬라이드를 가열한다. </li><li> 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 회 100 %, 95 %, 80 %, 75 %, 60 % 및 재수 50 % 에탄올 (각 5 분)에 순차 침지 한 다음 5 분간 크실렌 대체물을 포함하는 탱크에 대응하는 랙을 담근다. 염색 전에 3 분 동안 수돗물 슬라이드를 담근다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 수행합니다. 주 : H &amp; E 염색은 LAC, NTU에서 병리학 실험실에서의 요청에 따라 수행 하였다. </li><li> 면역 조직 화학 염색을 위해, 비특이적 백그라운드 염색을 감소시키기 위해 5 분 동안 실온에서 차단 용액으로 차단 부. 참고 : 블록 솔루션은 상업적으로 면역 염색 기술로 개발되고있다. 어떤 동물 혈청이 제품에 포함되지 않습니다. </li><li> 블록 솔루션을 씻어 PBS에서 슬라이드를 찍어. </li><li> 1:10 PBS에서 차단 용액을 희석하고, 2 % 소 태아 혈청 (FBS) (희석액)을 추가한다. </li><lI&gt; 피펫 적절히 희석 차 항체 부분 상에 실온에서 60 분 동안 배양한다. 참고 : 항체를 희석 용액에 희석된다. 염색이 항체 농도는 1에서 최적화되었다 : 800 내지 1 : 200 Ki67 (클론 SolA15) 및 Ly6G (클론 1A8)에 대해 각각. 이 농도는 배경 얼룩없이 별개의 얼룩을 보여 발견된다. <ol><li> 동일한 용액은 이차 항체의 비특이적 결합에 대해 제어하는 ​​차 항체를 생략과 동일한 실행 한 직렬 섹션 얼룩. </li></ol></li><li> 세척을 5 분마다 TBS 세 번 더하기 0.1 % 트윈 -20 (TBST 용액)을 슬라이드. 세척 사이의 변경 솔루션입니다. </li><li> 각 구역에 표지 된 중합체의 한 방울을 피펫 및 40 분 동안 실온에서 배양한다. 주 : 표지 중합체 상업적 된 Fab &#39;단편 감소 옥시다아제 및 이차 항체 아미노산 중합체를 조합하여 제조된다. 시약은 사용 준비가마우스 조직 절편의 면역 조직 화학 염색. </li><li> 워시는 5 분마다 TBST에 세 번 슬라이드. 세척 사이의 변경 솔루션입니다. </li><li> 피펫 3,3&#39;- diaminobenzindine 조직 섹션 위에 tetrahydrochloride (DAB) 솔루션과 갈색 침전물이 밝은 필드 현미경 아래에 보일 때까지 실온에 서 보자. 주 : DAB는 퍼 옥시 다제의 존재 하에서 석출하는 시간은 약 30 분이다. </li><li> 과산화 효소 활동을 중지하기 위해 물에 슬라이드를 담가. 핵 염색 메틸 녹색 솔루션의 딥 슬라이드. 워시는 5 분마다 PBS에 세 번 슬라이드. </li><li> 영구 장착 매체 (부 당 8 μL)으로 덮여 염색 섹션 위에 커버 슬립을 놓는다. </li></ol> 제 사진 및 분석 스테인드 조직 절편의 <ol><li> 명 시야 현미경으로 H &amp; E 염색 IHC 조직 절편을 시각화. 현미경에 연결된 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 사용하여 이미지를 캡처. Q 들어uantitative 분석, 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다 <ol><li> 20 배 목표와 scanscope를 사용하여 전체 스테인드 섹션을 검색합니다. </li><li> 표피의 1 mm 세그먼트 내의 표피 두께를 측정하고, 세그먼트 내의 Ki67 면역 세포의 수를 계산. 참고 : 정량 분석은 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 표피 두께 기저층과 표피의 최 외곽 층 사이의 거리에 의해 정의된다. </li><li> 바로 국소 IMQ 처리 피부 아래의 피부 영역 (230 X 270 μm의 구형 2)에 Ly6G 면역 세포의 수를 계산. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 재정적 이해에는이 없습니다.

acufected 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 가장 중요한 단계는 균일 진동과 피부의 각질층을 느슨하게한다. 피부를 절단하지 않고 부드럽게 바늘을 누르는 동안, 힘이 표면을 누르기 힘든 충분해야한다. 1cm X 1cm의 면적에 10 μL의 용액에서 DNA의 흡수를 용이하게하기 위해, 바늘은 30 초에 100 회 상하 진동을한다. 하나는 피부를 찌를 필요가 힘을 결정하고 acufected 유전자의 최고 발현 수준을 산출하기 위해 필요한 횟수를 주목하여 할 수 있습니다. 플라스미드 DNA의 양에 대한 수정은 상이한 유전자에 따라 달라질 수 있기 때문에 acufection가 필요함 후 발현의 만족스러운 수준에 도달하기 위해 적용 하였다. 적정 실험은 플라스미드 DNA의 최적 량은 물론, 실험 전에 적용되도록 결정하도록 수행되어야한다. 정량적 RT-PCR 분석의 결과는 O를 결정하는 데 도움이 될 것입니다플라스미드 DNA의 양 ptimal하고 재현 가능한 결과를 얻기 위...

피부 숙주 방어의 첫 번째 라인이다. 각질 세포 (KCS)는 인간과 쥐의 피부의 주요 세포 유형입니다. 환경 적 자극 (예를 들면 태양 광, 산소, 화학 물질 및 병원균 침입)에 응답하여, 관세청 활성화 및 IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-α과 같은 염증성 사이토 카인 및 케모카인의 다양한 생산되고 α 및 GM-CSF 1. 이들은 피부에 면역 세포의 채용을 트리거합니다. 악화되는 피부 염증은 종종 급성 자궁외 접촉 피부염 및 만성 T 세포 매개 성 염증 (예를 들어 알레르기 성 접촉 피부염 및 건선) 2 등 다양한 인간 질병과 연관되어 있습니다. KC 활성화를 억제함으로써 피부의 염증 반응을 조절하는 것은 피부 염증을 치료하는 그럴듯한 방법입니다. 이 프로토콜은 일시적으로 면역 고해상도를 연구하기 위해 표피에서 사이토 카인 유전자를 표현하는 새로운 접근 방식을 설명합니다피부에 이러한 치료에 결과적 ponse. 표피는 피부의 가장 표층을 구성한다. 그러한 피부의 심층 들어가는 병원체 핵산과 같은 외부 물질을 유지하는 물리 장벽으로서 기능한다. 여러 바늘없는 기술은 표피 DNA 전달 3, 4 설립되었다. 용액 중의 DNA 또는 양이온 성 리포솜 또는 아데노 바이러스 벡터와 연관된 직접 이러한 각질층의 제거 또는 시약과 함께 탈모 치료 기법으로 변성 표피에 적용되었다. 각질화 된 상피를 제거하여 DNA는 면역 반응을 유도하는 5 각화 세포 및 랑게르한스 세포, 표피의 장벽 작용을 넘어 용이하게한다. 큰 표면적이 DNA 전송을 위해 사용할 수 있으며이 방법은 바늘을 포함하지 않지만, 요구 사항을 포함하여 단점이있다스트리핑에 의해 - (100 μg의 10), 피부 가혹하고 DNA 전달 부스터 6 않고 면역화 된 동물에서 면역 반응을 유도하는 일관성있는 결과 DNA의 대량 대한. 피부 벗은 DNA의 미립자 - 매개 세포 내 전달은 면역 반응을 7, 8을 유도하는 고효율 및 재현성 것으로 밝혀졌다. 휴대용 유전자 총 가압 헬륨 기류 (9)의 수단에 의해 크기가 2 ㎛의 직경의 플라스미드 DNA 코팅 된 금 입자는 피부의 표적 부위 도배 사용되고있다. 플라스미드 DNA는 아마도 피부 KCsand 수지상 세포에 의해 흡수되고, 단백질은 로컬 표현 또는 수지상 10 림프절로 이송된다. 유전자 총 시스템은 간단하고 제한된 기술 경험은 &quot;DNA의 BUL을 준비하고 제공하기위한 비용이 필요하지만하자 &quot;(즉, 금 분말, 헬륨 가스)와 유전자 총을위한 자체는 일반 응용 프로그램을 제한하고있다. 실험은 서로 다른 위치에서 수행 할 때 또한, 헬륨 가스 공급 시스템에 대한 요구 사항이 유전자 총 수송의 용이성을 제한합니다. Microseeding 단일 분사 입자 충격 (11)에 비해 유전자 전달의 높은 효율을 달성하는 것으로 입증되었다. Microseeding 입자 비드를 사용하지 않고 피부에 DNA를 전달하기 위해 문신 총을 사용한다 (11). 진동이 방법을 이용하여 피부에 미세 바늘이 가능성 직접 동시에 여러 세포에 DNA를 전송하므로 세포막을 긁어. 그러나, 0.254 mm 직경의 바늘 주사 다수과 관련된 통증이 단점이다. 여기에서 우리는 생체 내에서 DNA 전달에 대한 대안 접근 방식을 제공합니다. 은 &quot;acufection&quot; </str옹&gt; 우리는 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스의 피부에 플라스미드 DNA를 전달하는 경제적이고 효율적인 방법을 제공합니다. 간략 10 개 침 (× 길이 13mm, 직경 0.2 mm)를 접착 테이프에 의해 다발로 결합 하였다. 관심있는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 10 μg의와 PBS의 10 μL의 볼륨은 면도, 제모 크림 처리 된 측면 피부에 배치되었다. 피부 표면 (1cm X 1cm)을 진동 침술 바늘 뭉치를 사용하여 각질층의 케라틴 느슨하게하고, 표면에 적용되는 플라스미드 DNA는 표피에 흡수시켰다. 피부 손상 모니터링하고 최소한의 것으로 밝혀졌다. acufected 피부 형질 감염된 유전자의 발현은 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR) 및 ELISA에 의해 확인 하였다. 피부 염증에 acufection-전달 IL-15ΔE7의 면역 조절 성 효과는 IMQ 처리 된 마우스 모델 (12)을 이용하여 증명되었다. acufection가 증명하는 동안 쉽고 덜 DEMA 수생체 내에서 DNA 전달을위한 방법을 웍 다른 유전자와 피부를 찌를 수있는 시간에 대한 DNA의 최적의 양은 신중하게 재현 가능한 결과를 얻기 위해 최적화되어야한다.

<table><tbody><tr><td>Accu 핸디 니들</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>의료 기기</td></tr><tr><td>NairTM 로션</td><td>교회 & 드와이트</td><td>N/A</td><td>탈모에 사용</td></tr><tr><td>Shandon Xyline 대체품</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Deparaffinization</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>DifcoTM LB broth, Miller</td><td>BD 용해용 용매</td><td>244620</td><td>분자생물학을 위한 E. coli의 번식 및 유지</td></tr><tr><td>마우스 IL-15/IL-15R 복합체 ELISA Ready-SET-Go 키트</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>IL-15 단백질</td></tr><tr><td>측정 Anti-mouse Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>면역조직화학 염색에 사용되는 항체</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>항체 면역조직화학 염색</td></tr><tr><td>단순 염색 마우스 MAXPO(쥐)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>마우스 온 마우스 염색에서 백그라운드 신호를 차단하는 시약</td></tr><tr><td>DAB 과산화효소(HRP) 기판 키트</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>면역조직화학 염색용 과산화효소 기질</td></tr><tr><td>Ultra V 블록</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>비특이적 배경 염색 감소</td></tr><tr><td>메틸 그린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>Vecta MountTM</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>영구 보존 조직 화학 염색</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>세포 용해물에서 프로테아제 활성을 억제</td></tr>합니다 <tr><td>Aldara 크림</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% imiquimod 크림</td></tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>피부 조직 분쇄에 사용</td></tr><tr><td>ABI7900HT cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>정량적 real-time PCR 분석</td></tr><tr><td>캠코더</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>이미지 문서</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>명시야 현미경 검사</td></tr></tbody></table>

&quot;acufection&quot;와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 dna 전달 시스템의 개발

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

피부 면역 반응의 조절 장애는 수많은 인간의 피부 질환과 연관되어 있습니다. 피부 조직에 면역 관련 유전자의 직접 전송은 인간의 질병의 마우스 모델에서 피부 염증의 면역 변조를 조사 할 수있는 매력적인 방법입니다. 여기에서 우리는 마우스의 피부에 벌거 벗은 DNA를 전달 유전자 발현에 이르게 비용 효율적인 프로토콜을 제시한다. 상기 방법은 천공 ACU 매개 DNA 트랜스 fection를 나타내는 &quot;acufection&quot;를 만들어 낸된다. acufection을 수행하려면 마우스 피부 제 인산 완충 용액 (PBS)에 DNA 주입 후 세포 내로의 DNA 및 형질 흡수를 용이하게 침 다발로 가볍게 찔러 하였다. 플라스미드 DNA는 아마도 각화 세포 및 피부의 수지상 세포에 의해 용해 단백질로 발현된다. 바늘 자체와 기계 녀석은 피부 손상을 일으키거나 각질 세포의 활성화를 유도하지 않았다. 표현형질 전환 된 유전자의 2 일간 acufection 다음 전사 및 번역 모두 수준에서 피부에서 발견 된 7 일까지 유지했다. 이 acufection 방법의 개발에 주 목적은 IL-15의 미리 정의 이성체를 조사 하였다. 염증을 유도하기 위해, 피부에 표현하고이어서 수신자 같은 수용체 7 (TLR7) 작용제, 이미 퀴 모드 (IMQ) 처리이있어서, 부분적으로 삭제 엑손 7 (IL-15ΔE7)와 다르게 스 플라이 싱 된 IL-15 이성체이었다 사용. Acufection-전달 피부는 IL-15ΔE7 IMQ 유도 된 피부 염증의 각질 세포 증식, 상피 두께 및 호중구 모집을 억제 하였다. 피부 염증의 조절기구를 식별하는 관심이 증가함에 따라, 프로토콜은 여기에 기재된 생체 내에서 DNA 전달을위한 유전자 총 시스템 또는 microseeding에 비용 효과적인 다목적의 대안을 제공한다. 잠재적으로 새로운 기능의 검색을 허용 할 수있다피부 또는 피부 질환에 대한 새로운 치료법을 조사하는 유전자.

일부 붉은 침술 바늘로 찌르는 후 첫 시간 이내에 분명 동안, 피부는 하루 2 지워지고 7 일까지 불리한 피부 반응 (그림 2A)를 따끔 따끔 후 관찰되지 않았다. 바늘 찌름 미처리 피부 (도 2b)과 비교하여 H &amp; E 분석 표피 orthokeratosis 최소한의 피부 침투를 매우 낮은 수준의 유도. 표피 두께 (도 2C) 및 Ki67 + 세포 수 (도 2d)는 그 침 바늘이 꽂힌 피부 표피에 띄는 조직 파쇄 또는 세포 증식을 일으키지 않았다 보여주는 바늘이 꽂힌 미처리 피부와 비슷 하였다. 침과 CXCL 케모카인의 발현 유도의 감소 레벨을 샤프트 주사기 바늘에 비해 (직경 1.067 mm) 12...

이 프로토콜은 마우스의 피부에 벌거 벗은 플라스미드 DNA를 표현하기위한 비용 효율적인 대안이다. 프로토콜의 전반적인 목표는 피부 염증의 특정 유전자의 기능적 역할을 묘사하기 위해 피부 조직에 면역 관련 유전자를 제공하는 것입니다.

&quot;Acufection&quot;와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 면역 관련 유전자를 피부 조직에 전달하여 피부 염증에서 특정 유전자의 기능적 역할을 규명하는 것입니다. 이 방법은 피부 내 새로운 유전자의 기능을 발견하는 데 도움이 될 수 있으며, 건선과 같은 피부 질환의 새로운 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 마우스 피부에서 플라스미드 DNA를 발현시키는 비용 효율적인 방법을 제공한다는 것입니다. 플라스미드 DNA를 준비하려면, 이전에 형질전환 및 선택된 세균 콜로니를 항생제가 첨가된 LB 배지 3 mL에 접종하십시오. 배양액을 쉐이커에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양하십시오.하룻밤 동안 배양한 후, 배양 규모를 확대하기 위해 항생제가 첨가된 250 밀리리터의 LB 배지로 박테리아 배양액을 희석하십시오. 37 °C에서 흔들어주며 하룻밤 동안 배양하십시오. 고품질의 endotoxin free 플라스미드 준비 키트를 사용하여 대량의 DNA를 준비하십시오.획득한 플라스미드 DNA를 멸균된 PBS로 희석하여 최종 농도를 1 mg/mL로 맞춥니다. 마우스를 마취시킨 후, 안구 건조를 방지하기 위해 안과용 연고를 도포합니다. 그다음 동물의 등 부위 피부를 제모합니다.그리고 제모 크림을 도포하여 남은 모간의 케라틴 단백질을 용해합니다. 제모 후에는 물에 적신 솜으로 크림을 닦아냅니다. 70% ethanol에 적신 멸균 면봉을 사용하여 피부 표면을 소독하고, 미리 준비한 템플릿으로 표적 피부 영역을 표시합니다. 10 µg의 plasmid DNA가 포함된 DNA 용액 10 µL를 원하는 피부 영역에 도포합니다.마우스에 침 치료를 하려면, 침 기구를 피부에 수직으로 잡고 지정된 표면을 반복적으로 찌릅니다. 30초 동안 100회 또는 피부에 도포한 용액이 흡수될 때까지 수행합니다. 피부 조직에서 성공적인 플라스미드 DNA 발현을 달성하려면, 피부를 너무 깊게 베지 않도록 주의하고 DNA 용액이 충분히 흡수되도록 하는 것이 중요합니다.절차를 완료한 후, 마취에서 회복될 때까지 체온을 유지할 수 있도록 처치한 마우스를 가열 패드 위에 둡니다. 마우스가 충분히 의식을 회복하면 케이지로 돌려보내고 물과 먹이를 제공합니다. 절차 후 처음 48시간 동안 행동 변화나 비정상적인 외형을 포함하여 불편함의 증상이 있는지 마우스를 면밀히 관찰하십시오.IL-15deltaE7가 이전에 처리된 2cm x 2cm 영역의 옆구리 피부를 표시합니다. 그런 다음 면봉을 사용하여 지정된 표면 영역에 Imiquimod 크림을 국소적으로 도포합니다. Imiquimod가 처리된 등 피부의 매일의 변화를 모니터링하기 위해, 한 연구자가 마우스를 단단히 잡고 처리된 부위가 고해상도 캠코더에 보이도록 노출시키는 동안 다른 연구자가 기록합니다.처치된 피부에 은백색 인설, 판 또는 홍반과 같은 변화가 있는지 관찰합니다. 설명된 대로 마우스를 안락사시킨 후, 혈청학적 가위를 사용하여 꼬리 기저부에 수평 절개를 가하고, 각 뒷다리 기저부를 향해 양측으로 절개 부위를 넓힙니다. 그런 다음 측면과 일치하도록 수직 절개를 하여 네 다리의 각 기저부까지 도달하게 합니다.동물의 꼬리 쪽에서 머리 쪽 방향으로 피부를 하부 조직으로부터 조심스럽게 벗겨냅니다. 가위를 사용하여 등 쪽 피부를 절제하고, 얻은 샘플을 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. 메스를 사용하여 대상 피부의 적절한 샘플을 절제합니다.그런 다음 즉시 액체 질소에 넣어 동결시킵니다. 피부 조직을 분쇄하려면, 냉각된 손잡이와 절구가 장착된 2구 조직 분쇄기의 중앙에 동결된 샘플을 넣고 유발에 납 망치를 사용하여 분쇄합니다. 분쇄된 조직을 이후 분석에 적합한 시약이 들어 있는 새 튜브로 즉시 옮깁니다.텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로 준비된 포르말린 고정 파라핀 임베딩 피부 절편 슬라이드를 65 °C에서 15분 동안 가열하여 염색 과정을 시작합니다. 슬라이드를 자일렌에 5분 동안 두 번 담급니다. 그 후 에탄올 농도 구배를 통해 슬라이드를 재수화합니다.마지막으로, 염색 전 슬라이드를 수돗물로 3분 동안 세척합니다. 면역조직화학 염색의 경우, 먼저 방수펜으로 조직 주변에 원을 그린 후 비특이적 배경 염색을 배제하기 위해 블로킹 용액으로 절편을 배양합니다. 블로킹 후, 슬라이드를 PBS로 세척합니다.다음으로 희석된 1차 항체를 절편 위에 피펫으로 분주하고 실온에서 60분 동안 배양합니다. 슬라이드를 TBST로 5분씩 3회 세척합니다. 그 다음, 표지된 폴리머 한 방울을 절편 위에 덮고 실온에서 40분 동안 슬라이드를 배양합니다.그 후, TBST로 슬라이드를 5분 동안 3회 세척하며, 매 세척 시마다 용액을 교체합니다. 그런 다음 조직 절편 위에 DAB 용액 100 µL를 첨가하고 실온에서 반응시킵니다. 현미경 하에서 갈색 생성물이 관찰될 때까지 진행합니다.그 후 슬라이드를 물로 세척하여 peroxidase 활성을 중단시킵니다. DNA에 특이적으로 결합하는 Methyl Green 용액으로 단면을 5초 동안 대조 염색합니다. 슬라이드를 PBS로 5분씩 3회 세척합니다.염색된 절편 위에 8 µL의 영구 봉입제를 도포하고 커버슬립으로 덮습니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 슬라이드를 촬영합니다. 여기에는 대조군 마우스와 사진 촬영 전 1시간, 2일, 5일 또는 7일 동안 침술 처리를 받은 마우스가 표시되어 있습니다.여기에서 보는 바와 같이, acufection 과정은 눈에 띄는 피부 손상을 일으키지 않았습니다. 또한, acufection은 피부 두께나 Ki67 양성 세포 수에 영향을 주지 않았습니다. 이는 해당 과정이 조직 파괴나 표피 세포 증식을 유발하지 않음을 추가로 확인시켜 줍니다.qRT-PCR을 사용하여 측정한 CXCL-1 및 IL-6의 발현 정도입니다. 이는 acufection 하에서 관찰된 각질 세포의 활성화가 미미함을 확인해 줍니다. 반면, qRT-PCR 및 ELISA 결과, IL-15 유전자로 acufection을 실시한 마우스의 피부에서 IL-15의 뚜렷한 발현이 나타났습니다.최종적으로, acufection을 통한 피부 조직으로의 IL-15deltaE7 유전자 전달은 Imiquimod 처리된 마우스에서 각질성 피부의 발생과 호중구 침윤을 방지합니다. 이 절차를 숙달하면 적절히 수행했을 때 12분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 매번 acufection을 위해 새로운 바늘 묶음과 고품질의 플라스미드 DNA 배치를 준비해야 함을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차 이후에, 새로운 유전자가 항바이러스 면역 반응을 조절하는 기능과 같은 추가적인 의문에 답하기 위해 바이러스 감염과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 방법의 개발은 면역학 분야의 연구자들이 피부의 면역 반응을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 비용 효율적인 방식으로 마우스 피부에서 플라스미드 DNA의 발현을 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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유기형 3D 피부 배양: 무세포 진피에서 인간 표피를 재생하는 카세트 기반 체외 배양 기술

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면역 관련 유전자를 마우스 피부 조직으로 전달하는 Acufection-Mediated Delivery

피부 문신은 intradermally 배달 DNA 백신에 대한 강력한하고 안전한 방법입니다. 여기 DNA 플라스미드 인코딩 EGFP는 실험실 쥐의 피부에 문신으로 전달되고 피부 세포에서 EGFP의 표현 그 다음 공 촛점 현미경으로 검사합니다.

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학습하세요 플라스미드 DNA를 마우스 피부에 경제적으로 전달하는 Acufection 방법을 통해 면역 관련 유전자의 기능을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 피부 염증 및 건선 치료 개발에 활용됩니다.

"Acufection"와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

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