주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

이 절차의 전반적인 목표는 수렴 빔 주사 투과 전자 단층 촬영을 사용하여 두꺼운 생물학적 표본의 피사계 심도 복구와 함께 3차원 재구성을 얻는 것입니다. 이 방법은 두꺼운 생물학적 표본의 전자 단층 촬영에 대한 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수렴 비트 모드에서 이미지를 획득할 수 있고 대부분의 단층 촬영 전용 소프트웨어에서 데이터 처리를 수행할 수 있다는 것입니다.

세포 배양 시료 준비를 시작하려면 5000 x g에서 5분 동안 시료를 원심분리합니다. 시료 전처리 전반에 걸쳐 이러한 원심분리 파라미터를 사용하십시오. 상등액을 버리고 4%파라포름알데히드와 2%글루테알데히드가 풍부한 PBS 1ml에 세포를 재현탁시킵니다.

실온에서 30분 동안 현탁액을 배양합니다. 혼합물을 원심분리하고 상층액을 버리고 PBS 1밀리리터로 펠릿을 세 번 세척합니다. 동일한 배양 조건 및 세척 절차를 사용하여 1% 테트록사이드 오스뮴이 농축된 PBS 1밀리리터와 2% 우라닐 아세테이트가 농축된 PBS 1밀리리터에서 펠릿을 배양합니다.

그런 다음 샘플을 섭씨 4도로 냉각합니다. 점점 더 농축되는 에탄올 용액에서 연속적인 배양으로 펠릿을 탈수합니다. 배양, 원심분리 및 세척 전반에 걸쳐 시료 온도를 섭씨 4도로 유지합니다.

탈수된 펠릿을 1ml의 순수 에탄올에 재현탁시키고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 샘플을 실온으로 데우고 샘플을 원심분리합니다. 펠릿을 실온에서 점점 더 농축된 에폭시 수지 용액에 배양합니다.

최종 세척 후 펠릿을 1ml의 순수 에폭시 수지에 다시 현탁시키고 실온에서 밤새 배양합니다. 샘플을 원심 분리하고 상등액을 제거한 다음 펠릿을 200 마이크로 리터의 에폭시 수지와 경화제에 재현탁시킵니다. 현탁액을 캡슐로 옮깁니다.

플라스틱 캡슐을 섭씨 60도에서 48시간 동안 배양하여 수지를 중합합니다. 인큐베이터에서 캡슐을 제거하고 수지 중합을 확인합니다. 포함된 샘플 위에 에폭시 수지와 경화제 층을 추가하고 동일한 조건에서 캡슐을 다시 배양합니다.

레진에 박힌 샘플을 표본 홀더에 거꾸로 장착합니다. 샘플을 초박 절편기의 트리밍 블록에 단단히 고정합니다. 수지의 샘플에서 플라스틱 캡슐을 잘라냅니다.

노출된 수지를 피라미드 모양으로 만듭니다. 그런 다음 캡슐과 표본 홀더를 초박 절편기의 움직이는 암으로 옮깁니다. 트리밍 나이프를 설치하고 현미경의 안내에 따라 피라미드 모양을 다듬습니다.

트리밍 나이프를 조직학 나이프로 교체하십시오. 현미경으로 캡슐 피치 각도를 조정하여 피라미드가 나이프 가장자리에 수직이 되도록 합니다. 절단 속도를 설정하고 샘플을 절단합니다.

샘플을 절편화한 후 선택한 절편을 여과지 위의 처리된 구리 그리드로 옮깁니다. 샘플을 건조시킨 다음 샘플을 전자 현미경에 넣습니다. Through Focal Tilt 시리즈를 설계하려면 먼저 전자빔 피사계 심도와 샘플의 최대 겉보기 두께를 계산하십시오.

이러한 값을 기반으로 초점 간격을 선택하고 최대 겉보기 두께에서 전체 샘플을 이미지화하는 데 필요한 초점 단계 수를 결정합니다. 그런 다음 낮은 배율에서 샘플 내에서 관심 영역을 찾습니다. 샘플이 회전할 때 ROI가 이동하는 것처럼 보이지 않도록 유센트릭 높이를 조정합니다.

기울기 범위 전체에서 ROI가 계속 보이는지 확인합니다. 자동화된 이미지 수집을 위해 Through Focal Tilt Series 매개변수를 입력하고 이미지를 획득합니다. 이미지 시리즈를 이미지 처리 프로그램으로 가져오고, 피라미드 계층 구조에서 동일한 기울기 각도로 수집된 이미지를 정렬합니다.

정렬된 이미지를 쌓아 각 기울기 각도에서 정렬을 찾습니다. 스택을 탐색하여 초점이 맞춰진 영역만 이미지에서 이미지로 이동하는지 확인하고 필요에 따라 이미지를 다시 정렬합니다. 샘플 전체에서 정렬이 확인되면 높은 설정에서 초점이 맞는 정보를 병합하여 기울기 각도당 단일 이미지로 시리즈를 생성합니다.

로컬 최소값 또는 기준 마커를 기반으로 tilt 시리즈의 정렬 찾기를 수행합니다. 3차원 복원을 수행하고 결과 이미지를 검사합니다. 재구성이 흐리거나 변형된 것처럼 보이면 원본 이미지 시리즈를 다시 정렬합니다.

T. brucei의 샘플은 이 방법을 사용하여 이미지화되고 분석되었습니다. 0도 기울기 각도에서 편모 주머니의 여러 세부 사항을 볼 수 있습니다.

70도의 더 높은 기울기 각도에서는 투시 초점 시리즈에 수집된 각 이미지의 일부만 초점이 맞춰집니다. 이 위치는 시리즈 전반에 걸쳐 바뀝니다. 초점이 맞는 섹션을 병합하면 초점이 맞는 영역이 더 큰 단일 이미지가 생성됩니다.

이 효과는 Through focal tilt series의 고주파 영역이 강조 표시될 때 더욱 두드러집니다. 고주파 정보는 결합된 이미지의 대부분에 걸쳐 있으며, 이는 Through Focal Tilt 시리즈가 잘 처리되었음을 나타냅니다. 일단 마스터하면 이미지 처리 부분은 선택한 정렬 및 재구성 매개변수에 따라 약 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 최종 재구성의 품질은 이전 정렬 테스트의 품질에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Through focal tilt series의 컬렉션 및 이미지 처리 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.