Name: 주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 배우세요 주사 투과 전자 단층 촬영법을 이용하여 두꺼운 생물 샘플의 3차원 재구성을 수행하는 방법을 학습하세요. 이 기술은 구조생물학 연구에서 심도 회복을 가능하게 하며 고품질 영상을 제공합니다.

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주의 : 사용하기 전에 각종 시약의 물질 안전 보건 자료 (MSDS에) 참조하십시오. 시료 전처리 과정에 사용되는 화학 물질의 일부 ​​및 / 또는 생식 독성, 발암 성 독성, 돌연변이이다. 샘플을 처리하는 동안 흄 후드 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발) 작업을 사용합니다. 을 Ultramicrotome 시료를 단면 예리한 도구의 사용을 포함하고, 이러한 도구주의 사용은 필수이다. 후술하는 단계에서, 저자는 시료 세포 배양 샘플이라고 가정한다. 프로토콜은 샘플 유형 특히 원심 분리 단계에 따라 수정 될 필요가있다. 버퍼와 혼합물의 제조 1. <ol><li> 인산 완충 용액 (PBS) 용액을 준비한다 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나트륨 2 HPO 4 및 1.76 mM의 KH 2 PO 4). </li><li> 30 %, 50 %, 70 % 등을 함유하는 용액을 준비샘플 탈수 PBS에서 한올. 점차적으로 에탄올 농도를 증가의 샘플을 배양하여 샘플 탈수를 수행합니다. </li><li> (숙신산 무수물 (9 ㎖), 메틸 -5- 노르 보르 넨 -2,3- 디카 르 복실 산 (11 mL)에 2,4,6- 트리스 도데 세닐 비스페놀 A- (에피 클로로 히 드린) (20 ㎖)을 혼합하여 에폭시 수지를 준비 디메틸 아미노 메틸) 페놀 (0.7 ㎖); 다른 혼합 비율은 수지의 원하는 경도에 따라 사용될 수있다. </li><li> 샘플 매립 에탄올 30 %, 50 %, 70 %의 에폭시 수지를 함유하는 용액을 준비한다. 서서히 수지 농도의 증가와 함께 샘플을 배양하여 수지 매립을 수행한다. 주 : 준비된 솔루션의 볼륨이 연구되고있다 샘플의 유형에 따라 달라집니다. 추가 용액을 세포 배양에 비해 조직 필요하다. </li></ol> 샘플 2. 고정 및 착색 <ol><li> g X 5000에서 5 분 동안 세포 배양을 원심 분리기. 동일한 조건을 사용하여 다음 회 원심을 모두 수행한다.</li><li> 뜨는을 취소하고 4 % 파라 포름 알데히드와 2 % 글루 타르 알데히드와 PBS (1 ㎖)에 그것을 재현 탁하여 세포 펠렛을 수정합니다. 30 분 (도 1a)을 실온에서이를 부화. 또한, 야간 또는 주말에 4 ° C에서 세포를 고정합니다. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 완전히 정착 제를 제거하기 위해 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 세척 하였다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 PBS (1 mL) 중에 1 % OSO 4 샘플 포스트 픽스. </li><li> 원심 분리 후, 상층 액을 제거하고 완전히 OSO 4 제거하기 위해 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 반복한다. 석유 및 폐기에 OSO 4를 비활성화합니다. </li><li> 조영제로서 PBS (1 mL) 중 2 % 우라 닐 아세테이트를 첨가하고, 실온 (도 1b)에서 30 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 미 결합 우라 닐 AC를 제거하는 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 세척etate; 우라 닐 아세테이트는 방사성 원소를 포함하고 방사성 폐기물 전용 bin에의 배치해야합니다. 주의 : 샘플의 크기에 따라 배양 시간을 변경할 수있다. 예를 들어, 고정 및 조직 샘플과 같은 두꺼운 샘플 염색의 경우, 더 이상 배양 시간을 필요로한다. 긴 배양 시간은 탈수 및 매립 단계를 더 좋을 수있다. 우라 닐 아세트산 가돌리늄 염을 포함하는 &quot;우라 닐리스&quot;솔루션으로 대체 될 수있다. </li></ol> 3. 샘플 탈수 <ol><li> 원심 분리 후 상층 액을 버리고 30 % 에탄올로 PBS에 39 ° C (1 ㎖) (도 1C)에서 30 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 점차 상승 에탄올 농도 (50 %, 70 %, 100 %까지) 용액을 사용하여 반복 스텝 3.1. 이러한 탈수 단계 동안, 샘플 보존을 위해 4 ℃에서 시료를 유지한다. </li><li> 원심 분리 후, supernat 폐기개미와 순수 에탄올 (1 mL) 중 펠렛을 재현 탁; 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. </li></ol> 4. 수지 퍼가기 <ol><li> 원심 분리 후, 상등액을 버리고 RT (도 1D)에서 30 분 동안 30 %의 에폭시 수지 (1 mL)을 에탄올에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 점차 상승 에폭시 수지 농도의 용액을 사용하여 반복 스텝 4.1 (50 %, 70 %, 100 %까지). </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 버리고 순수 에폭시 수지 (1 mL) 중 펠렛을 재현 탁; RT에서 하룻밤을 품어. 수지의 중합을 실행할 수 DMP-30 경화의 존재; 이 경우, 에폭시 수지의 두 배치, 하나와 DMP-30없이 하나를 준비합니다. </li><li> 원심 분리 후, 순수 에폭시 수지의 200 μL 플라스틱 캡슐 (경화제를 포함)에 펠렛을 재현 탁; 샘플은 플라스틱 캡슐의 바닥에 있어야합니다. </li></ol> 5. 수지 중합 <ol><li> 나는48 시간 동안 60 ℃로 설정된 항온 시료를 함유하는 플라스틱 캡슐 ncubate; 수지의 다른 종류의 서로 다른 설정으로 중합 수 있습니다. </li><li> 인큐베이터에서 캡슐을 제거하고 수지를 중합 있는지 확인; 하드 표면에 누를 경우 수지 열심히해야한다. </li><li> 샘플을 함유하는 중합 된 수지 위에 (경화제 포함) 순수 에폭시 수지를 추가; 수지의이 한층 더 쉽게 샘플을 잘라 만들 것입니다. 48 시간 동안 60 ℃에서 인큐베이션 캡슐. </li></ol> 6. 샘플 단면 <ol><li> 샘플 상단을 향해되도록 시편 홀더의 샘플 거꾸로 장착하고을 Ultramicrotome의 트리밍 블록에 고정합니다. 단단히을 Ultramicrotome에 트리밍 블록을 확보하기 위해 레버를 잠급니다. </li><li> 면도날 또는 유사한 날카로운 절단 공구를 사용하여 중합 된 수지를 분리하는 플라스틱 캡슐을 잘라. 샘플이 포함되도록 수지 컷피라미드의 약 모양 수지 에디션. 전체 플라스틱 캡슐을 제거 할 필요는 없다; 단지 중합 샘플을 덮고있는 부분을 제거합니다. </li><li> 캡슐 및 트리밍 블록의 오프 시편 홀더를 타고을 Ultramicrotome의 이동 팔에 설치합니다. </li><li> 칼 블록에 트리밍 나이프를 설치하고 정확하게 피라미드의 얼굴을 잘라. 쌍안경의 사용은 피라미드에 대한 완벽한 모양을 제공하는 것이 좋습니다; 피라미드 더 나은, 더 나은 부분이 될 것입니다. </li><li> 트리밍 칼을 벗고 두꺼운 0.5 μm의있는 부분을 절단하는 데 사용할 수있는 조직학 나이프로 교체합니다. </li><li> 물의 정확한 양 조직학 칼 큐벳을 충전 한 후, 시료의 표면에 칼의 칼날을 가지고 상기 칼 피라미드 수직 슬라이스되도록 캡슐 피치 각을 조정 망원경을 사용한다. </li><li> 목적에 따른 절삭 속도를 조정섹션 두께는 균일 한 부분을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 물 위에 섹션 플로트를하자 루프와 물고기. </li><li> 여과지 위에 배치 된 전자 현미경 구리 그리드 향해 루프를 이동한다. 주 : 그리드는 친수성을 증가시키기 위해 이전에 처리 된 것이다. 이것은 격자 코팅 펜으로 수행 될 수있다. </li><li> 때문에 여과지로 물 흡수 섹션 그리드에 충실 할 수 있습니다. 전자 현미경에 삽입하기 전에 몇 분 동안은 건조 보자. </li></ol> 관통 초점 기울기 시리즈의 7 디자인 <ol><li> 일정한 초점 간격으로 관통 초점 이미지를 수집합니다. 참고 : 관통 초점 틸트 시리즈는 기울기 시리즈의 각각의 경사 각도에서 수집 관통 초점 이미지 세트로 구성되어 있습니다. 전체 포커스 진폭은 전체 샘플 두께를 커버하기에 충분해야한다. </li><li> 초점 간격의 값을 결정한다. 간격은 D 같으면epth-의 필드, 초점 전체 샘플을 수집; 이 설정은 가능한 가장 높은 샘플링을 나타냅니다. 간격이 심도보다 큰 경우, 샘플의 일부분이 샘플의 일부가 초점이 수집되지 않을 것임을 의미하는 포커스에서 취득되지 않는다. </li><li> 피사계 심도 전자의 파장에서 전자 빔 및 전자 빔의 수렴 반각의 계산. 전자의 파장 직접 가속 전압에 연결되는 반면, 전자 현미경 제조자의 수렴 반각을 사용하거나 공지의 시편 (16)의 회절 패턴으로부터 실험적으로 결정한다. 전자는 파장 λ에서 가속 때문에 전자 현미경에서 α의 수렴 반각으로 샘플 충돌, 피사계 심도 (DOF)를 결정하기 위해 다음 식을 사용 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> 디자인전체 초점 진폭이 최대 명백한 두께의 샘플을 충당 할 수 있도록 초점 시리즈 (즉, 가장 높은 경사에서). 참고 : 초점 크기보다 큰 2.19 μm의를해야합니다 그래서 0.75 μm의 두께 샘플, 70 ° 경사에서 2.19 μm의 겉보기 두께를해야합니다. 상기 결정된 포커스 간격은 50 나노 미터와 동일한 경우,이 시료를 들어, 그것은 최대 겉보기 두께 샘플을 커버 (44)와 이미지 (2.19 μm의 / 50 나노 미터)를 필요로한다. 전체 포커스 진폭은 초점 단계의 수를 곱한 포커스 구간의 값과 같다. 최대 기울기 (θ)에서, 샘플 겉보기 두께는 다음과 같이 정의된다 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> 8. 샘플 영상 참고 :이 STEM 모드에서 전자 현미경을 설정하는 방법을 설명하기 위해이 프로토콜의 범위를 벗어납니다; 이 정보의 대부분은 찾을 수 있습니다 내가n은 레퍼런스 매뉴얼은 전자 현미경 제조업체에서 제공. 그러나, 다음 참고 : I)의 스폿 사이즈는 원하는 배율에 따라 선택되어야한다; ⅱ) Ronchigram은 잘 정렬되어야합니다; 및 ⅲ) BF 모드에서 카메라 길이 검출기의 양호한 조명을 유지하면서 unscattered 전자를 선택하도록 조정되어야한다. 전자 현미경으로 구리 그리드 상에 퇴적 수지 부분 수축을 방지하는 화상 취득 전에 점등한다. 수지의 수축 및 충전 효과는 이미지 수집시 혼동 될 수 있습니다. 충전 효과가 발생 될 때 대물 렌즈의 구경의 사용은 샘플의 안정성을 향상시킬 수있다. 그러나 STEM 셋업의 특정한 경우에, 대물 조리개 HAADF 촬상 모드와 호환되지 않으며, 매우 작은 개구가 대물 BF 촬상 모드와 호환되지 않는다. <ol><li> 낮은 배율 (STEM에 20,000X 약)를 사용하여 샘플을 통해 검색하고 관심 영역을 찾습니다. </li><li> t를 조정샘플을 회전시키면서 관심 영역이 표류하지 않도록 그 높이 (Z 축) eucentric. </li><li> 관심의 대상이 전체 틸트 범위에서 볼 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 때문에 관통 초점 경사 계 중에 획득 된 이미지의 상당한 수에 자동 수집 소프트웨어를 사용한다. 어느 상용 솔루션을 사용하거나 원하는 경우 사용자 정의 데이터 수집 소프트웨어를 설계합니다. 소프트웨어 프로그램은 다음 세 단계를 수행 할 수 있는지 확인합니다 : <ol><li> 추적 및 표준 틸트 시리즈 수집 방식에서와 같이 초점을 맞추고있다. </li><li> 관통 초점 이미지가 샘플의 Z-위치와 중복 있는지 확인합니다. </li><li> 자동으로 각 경사각 관통 초점 일련의 이미지를 획득. </li></ol></li><li> 소프트웨어 프로그램을 관통 초점 경사 계의 주 변수를 제공 (즉, 초점 간격 초점 단계, 최소 경사각의 최대 경사 각도, 경사 공정과, 주사 속도). </li><li> 스타트소프트웨어 프로그램이 완료 될 때까지 화상 수집 처리 및 대기. </li></ol> 9. 이미지 처리 주 :이 프로토콜에서, 관통 초점 경사 계 처리 ImageJ에 플러그 (17)를 사용하여 수행된다. 보충 자료 1 정렬 단계 (Turboreg)과 세 개의 초점 값으로 설계된 관통 초점 틸트 - 시리즈 - 포커스 정보 (필드의 확장 깊이) 병합에 대한 ImageJ에 매크로를 보여줍니다. <ol><li> 동일한 경사각 (즉, 관통 초점 이미지)에서 수집 된 이미지를 맞 춥니 다. 이미지는 동일 합초 정보를 가지고 있지 않기 때문에, 이들은 정렬 동일한 기능 항구하지 않는다; 이웃 이미지를 두 가지로 두 가지를 정렬하여 정렬을 수행 (즉, 먼저 가장 가까운 초점 값으로 피라미드 계층 구조, 다음) Turboreg 18 ImageJ에 플러그인을 사용합니다. </li><li> 일관 각 경사각 관통 초점 이미지의 정렬을 확인.육안 검사를 개선하기 위해 정렬 관통 초점 이미지를 스택. 참고 : 스택을 통해 탐색하는 동안 만 영역에 초점이 이동해야합니다. 다음 단계는 다른 이미지의 초점이 정보의 복구 구성 때문에 정확한 정렬은 가장 중요하다. </li><li> 필드 (19), ImageJ에 플러그인의 확장 깊이를 사용하여 초점에있는 정보를 병합; 이것은 결국 이미지의 스택에서 하나의 이미지를 생성합니다. 몇몇 설정이 심도를 복구하는 동안 사용되지만, 화상 정보를 보존하는 최고 설정을 사용할 수있다. 주 : 틸트 계 이제 경사각 당 하나의 화상으로 구성되고, 합초 정보를 포함하는 각 이미지는 관통 초점 화상으로부터 회수. </li><li> 데이터를 처리합니다. 참고 : 데이터가 이제 표준 기울기 시리즈로 감소되어 있기 때문에 정렬 및 재건을위한 표준 도구를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 TomoJ 우리를이다ED 데이터 정렬 및 데이터 재구성 (20), (21). TomoJ를 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 해당 출판물 (22)에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 기울기 시리즈의 미세 정렬을 수행합니다. 참고 : 좋은 전략은 정확하게 이미지 사이의 변화를 추적하는 기준 마커로 골드 비즈를 사용하는 것입니다. 골드 비드 샘플에 첨가 할 수없는 경우에 로컬 최소치가 사용될 수있다. </li><li> 정렬 된 데이터의 3 차원 재구성을 수행한다; 여러 가지 알고리즘은 실제 공간이나 푸리에 공간, 장점과 한계 각각의 복원을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 틸트 시리즈의 최종 배향 불량 인 경우, 초기 단계를 최적화하여 약간 개선 할. 최종 3 차원 복원이 흐리거나 변형 나타나는 경우 정렬 단계를 반복; 실제로 수집 초점 평면의 큰 수, 더 나은 콘트라스트 및 3D 재구성 세부. 참고 : 괜찮다veral 소프트웨어 프로그램 관통 초점 경사 계를 처리하기 위해 사용될 수있다. 그러나,이 프로토콜에 사용되는 도구가 선택되었다 때문에, 우리의 경험, 그들은 최고의 수행. Turboreg 18 초점의 구배가 존재하는 경우 이미지를 정렬의 관점에서 더 나은 수행. 자세한 내용은 전용 웹 사이트 (23)에서 찾을 수 있습니다. 다른 도구가 표시 픽셀 수정 결과 반면 필드 플러그인 (19)의 확장 깊이, 서로 다른 이미지에서의 초점 정보를 복구 측면에서 매우 잘 수행. 자세한 내용은, 특히 관련 스크립트 작성이 전용 웹 사이트 (24)에서 찾을 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 글에서, 우리는 관통 초점 단층 촬영 STEM을 사용하여 두께의 생물학적 시료에서 3D 분석을 수행하기위한 단계별 가이드와 함께 기존의 샘플 준비 프로토콜을 제시한다. 생물학적 시료의 수지 매립은 수십 26에 사용되었으며, 시료의 종류에 맞게 다른 프로토콜은 문헌 (27)을 통해 찾을 수있다. 대조적으로, STEM에 영상 두꺼운 표본은 새로운 사업을 통해 초점 방법이다 사용하고 더 광범위한대로 방법이 가장 가능성이 향상 될 것입니다. 이 연구의 목적은 시료 준비 프로토콜을 설명했고, 더욱 상세하게는, 현재 사용 가능한 장비 STEM 틸트 계 취득 포컬 통해 적당한 시간에서 행하는 촬상 조건. 이러한 이유로, 큰 초점 간격이 이용되었다. 사실에 대한 합의가없는 방법 닫기초점 평면은 관통 초점 틸트 - 시리즈 STEM과 두꺼운 시료를 이미징해야합니다. 그것은 일반적으로 STEM 이미지를 수집...

1970 년대 초반 이후 단층 널리 생물학적 시료 1, 2, 3의 구조적 특성에 사용 된 투과형 전자 현미경 (TEM)에 접근한다. 투과형 전자 단층의 매력이 전지의 구조 및 고분자 복합체 단백질의 구조 내 소기관의 미세 구조에서, 나노 스케일에서 생체 구조의 광범위한 연구하는 데 사용할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 투과형 전자 단층은 매우 두꺼운 샘플 (이상이 0.5㎛)을 연구하기 위해 이용 될 수 없었다. 실제로 두께 시험편 낮은 신호대 잡음비 (SNR)의 이미지를 생성하는 너무 많은 산란 전자를 생성한다. 또한, 단층의 경사각 증대 시료의 겉보기 두께, 기울어 진 시험편의 이미지의 컬렉션을 포함한다. 심지어 비탄성 산란을 필터링 할 수 있습니다하지만에너지 필터를 사용하여, 높은 SNR 이미지에 필요한 전자의 임계량 거의 TEM에 도달한다. 따라서, 생물학적 시료의 두께는 단지 4 절편하여 연구되어왔다. 들이 절단 될 때 약간 저하 될 수도 있고, 다른 복잡성을 이해하기 위해 그 전체 연구 할 필요 일부 샘플은 분리 될 수 없다. 다른 방법은 스캔 모드 5, 6, 7, 8의 TEM을 사용하는 것이다. 투과 전자 현미경 (STEM)를 스캐닝, 전자의 광로가 종래의 TEM에서 다르다. 탄성 산란 그는 어두운 필드 (DF) 탐지기와 광축으로부터 소정의 각도에서 수집 될 수있는 반면 산란없이 샘플을 통과하는 전자는 밝은 필드 (BF) 검출기 (9)의 광축 상에 수집 될 수있다.STEM의 또 다른 장점은 집속 전자 빔 이미지의 픽셀 별 수집을 가능하게 시료의 표면에 주사되어있다. 시료 (10)를 통과하면서 전자빔이 넓어진 경우에도 특정 컬렉션 기법은 종래의 TEM 비탄 성적으로 산란 전자보다 덜 민감하다. 또한, TEM에 따라서 발생할 수있는 색수차 회피 STEM에는 렌즈 후의 시험편 없다. BF 검출기는 주로 unscattered 전자를 검출하도록 카메라 길이를 조정할 수있다. 두꺼운 샘플을 연구하기 위해 DF 검출기를 사용 때문에 부정확 한 이미지를 생성 다중 산란,하지 않는 것이 좋습니다. 대신, BF 검출기 (11)를 사용할 수있다. STEM 높은 SNR 이미지를 생성 할 수 있지만, 두께로부터 회수 될 수 깊이있는 정보의 양이 감소하기 때문에 TEM에 비하여 상대적으로 높은 광 수렴 비교적 낮은 심도를 갖고표본. 초점이 정보가 몇 나노 미터의 초점면에서 유래되도록 수렴 각도가 30 MRAD만큼 높을 수있는 수차 보정 STEM 현미경의 경우, 피사계 심도는 충분히 낮을 수있다 . 병렬 모드에 전자선을 설정하면 심도 전자빔의 해상도 (12)의 손해를 향상시킨다. 그러나,이 설정이 항상 가능한 것은 아니다. 이 수속 전자빔을 사용하는 것이 필요할 때마다, 하나의 두꺼운 샘플을 연구 할 때 심도 전자빔의 향상 기술을 사용한다. 최근 연구의 초점 정보 (13), (14)의 최대 양을 복구하는 시료에 걸쳐 다양한 초점 평면에서 다수의 이미지의 취득을보고 하였다. 두 연구에서 상이한 초점 평면의 정보를 처리하는 다양한 방법을 설명한다. Hovden 등은.다양한 초점 평면에서 수집 된 이미지는 푸리에 공간에서 결합하고 최종 재구성 13 변형 차원 역 푸리에로부터 직접 얻었다. 이에는 DAHMEN 외. 실 공간의 다양한 초점 평면 (14)로부터의 3 차원 볼륨을 재구성 수렴 빔 복원 엔진을 개발했다. 본 연구실은 두꺼운 생물학적 시료를 이미징하는 방법을 개발 하였다. 우리의 전략은 우리가 다양한 초점 평면에서 초점이 정보를 병합하고, 평행 광선 조사 장치 (15)를 이용하여 실 공간에서의 최종 3 차원 볼륨을 복원한다는 점에서 상기 한 두 방법과 다르다. 우리의 목표는 쉽게 전자 현미경 실험실에서 수행 될 수있는 방법을 개발 하였다. 이를 위해 종래의 단층 실험의 시간 프레임에 필적 ​​제한된 시간에 촛점 이미지를 수집 할 목적. 또한, 제안 된 방법 C정렬 및 재구성 소프트웨어의 종류와 사용하기 위해 적응 될 울드. 2015 15 우리 출판물의 맥락에서, 우리는 시각화와 피사계 심도의 회복을 특성화하고 싶었다, 그래서 우리는 25 MRAD의 큰 수렴 반 각도를 사용했다. 여기서는 2015 년 15 실험실에서 개발 된 방법에 따라 STEM에 관통 초점 촬상 행하는 단계별 프로토콜을 제공하고, 우리는 2015에서의 데이터 처리 방법을 제시 하였다. 이 방법은, 두께 (750 ㎚) 생물학적 샘플에 걸쳐 여러 초점 평면에서 초점 정보를 복구하고 고품질의 3D 재구성을 가능하게한다. 어디 관련, 다른 그룹에서 사용하는 방법에 비해이 방법의 차이도 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염</td>수 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 수지</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>약 60°C. 에서 가열된 PBS에 파라포름알데히드 분말을 추가하고 PFA 분말이 보이지 않을 때까지 1N NaOH를 첨가하여 pH를 높입니다.</td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5882&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록시드</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 캡슐</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>트리밍 및 히스토 나이프</td><td>LFG 분포</td><td>디아톰 다이아몬드 나이프</td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경 구리 그리드</td><td>LFG 분포</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>그리드 코팅 펜</td><td>LFG 분포</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>표본 홀더</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

이 보고서는 주사 투과 전자 현미경을 사용하여 추가 관찰을 위해 두꺼운 생물학적 표본을 준비하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 투과 전자 단층 촬영을 주사하여 두꺼운 생물학적 표본의 3D 구조를 연구하는 이미징 방법을 설명합니다. 시료 전처리 프로토콜은 화학 작용제를 사용하여 시료를 고정하고, 중원자 염 대조제로 처리하고, 일련의 에탄올 수조에서 탈수하고, 수지에 내장하는 기존 방법을 기반으로 합니다. 그런 다음 주사 투과 전자 현미경으로 두꺼운 샘플을 관찰하기 위한 구체적인 이미징 조건에 대해 설명합니다. 샘플의 단면은 다양한 초점면에서 여러 이미지를 수집하는 것과 관련된 스루 포커스 방법을 사용하여 관찰됩니다. 이를 통해 시료 전체의 다양한 높이에서 초점이 맞는 정보를 복구할 수 있습니다. 이 특정 수집 패턴은 단층 촬영 데이터 수집 중 각 기울기 각도에서 수행됩니다. 그런 다음 단일 이미지가 생성되어 모든 다른 초점면의 초점이 맞춰진 정보를 병합합니다. 그런 다음 고전적인 기울기 시리즈 데이터 세트가 생성됩니다. 이 방법의 장점은 표준 도구를 사용하여 틸트 시리즈 정렬 및 재구성을 수행할 수 있다는 것입니다. through-focal 이미지 컬렉션을 통해 초점이 맞춰진 샘플의 모든 구조적 세부 사항을 포함하는 3D 볼륨을 재구성할 수 있습니다.

우리의 연구에서, 전자는 전계 방출 총 투과형 전자 현미경 200 kV의 가속되었다. 이미지는 20 μs의 지속 시간을 사용하여 줄기 BF 모드로 수집되었다. 관통 초점 틸트 시리즈의 디자인에 관해서는, 우리는 750 nm 두께의 생물학적 샘플도 전자빔의 피사계 심도가 있었지만 단지의 미세 구조 연구에 대한 만족스러운 결과를 준 내지 150 nm의 초점 간격을 발견 3 nm의 때문에 우리는 25 MRAD 매우 큰 수렴 반각을 사용했다. 이 보고서에서 분석 샘플은 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei, 그 편모이 세포 기관이 현저하게 포유 동물 (25)에 원생 생물에서 보존되기 때문에 집중적으로 공부하는 단세포 진핵 생물이다. 세포 (샘플 준비 프로토콜에 제시로 취급하고, 우리는 T....

이 보고서는 두꺼운 생물학적 표본의 주사 투과 전자 단층 촬영을 수행하기 위한 샘플 준비 프로토콜과 특정 이미징 조건을 설명합니다.

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

이 절차의 전반적인 목표는 수렴 빔 주사 투과 전자 단층 촬영을 사용하여 두꺼운 생물학적 표본의 피사계 심도 복구와 함께 3차원 재구성을 얻는 것입니다. 이 방법은 두꺼운 생물학적 표본의 전자 단층 촬영에 대한 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수렴 비트 모드에서 이미지를 획득할 수 있고 대부분의 단층 촬영 전용 소프트웨어에서 데이터 처리를 수행할 수 있다는 것입니다.세포 배양 시료 준비를 시작하려면 5000 x g에서 5분 동안 시료를 원심분리합니다. 시료 전처리 전반에 걸쳐 이러한 원심분리 파라미터를 사용하십시오. 상등액을 버리고 4%파라포름알데히드와 2%글루테알데히드가 풍부한 PBS 1ml에 세포를 재현탁시킵니다.실온에서 30분 동안 현탁액을 배양합니다. 혼합물을 원심분리하고 상층액을 버리고 PBS 1밀리리터로 펠릿을 세 번 세척합니다. 동일한 배양 조건 및 세척 절차를 사용하여 1% 테트록사이드 오스뮴이 농축된 PBS 1밀리리터와 2% 우라닐 아세테이트가 농축된 PBS 1밀리리터에서 펠릿을 배양합니다.그런 다음 샘플을 섭씨 4도로 냉각합니다. 점점 더 농축되는 에탄올 용액에서 연속적인 배양으로 펠릿을 탈수합니다. 배양, 원심분리 및 세척 전반에 걸쳐 시료 온도를 섭씨 4도로 유지합니다.탈수된 펠릿을 1ml의 순수 에탄올에 재현탁시키고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 샘플을 실온으로 데우고 샘플을 원심분리합니다. 펠릿을 실온에서 점점 더 농축된 에폭시 수지 용액에 배양합니다.최종 세척 후 펠릿을 1ml의 순수 에폭시 수지에 다시 현탁시키고 실온에서 밤새 배양합니다. 샘플을 원심 분리하고 상등액을 제거한 다음 펠릿을 200 마이크로 리터의 에폭시 수지와 경화제에 재현탁시킵니다. 현탁액을 캡슐로 옮깁니다.플라스틱 캡슐을 섭씨 60도에서 48시간 동안 배양하여 수지를 중합합니다. 인큐베이터에서 캡슐을 제거하고 수지 중합을 확인합니다. 포함된 샘플 위에 에폭시 수지와 경화제 층을 추가하고 동일한 조건에서 캡슐을 다시 배양합니다.레진에 박힌 샘플을 표본 홀더에 거꾸로 장착합니다. 샘플을 초박 절편기의 트리밍 블록에 단단히 고정합니다. 수지의 샘플에서 플라스틱 캡슐을 잘라냅니다.노출된 수지를 피라미드 모양으로 만듭니다. 그런 다음 캡슐과 표본 홀더를 초박 절편기의 움직이는 암으로 옮깁니다. 트리밍 나이프를 설치하고 현미경의 안내에 따라 피라미드 모양을 다듬습니다.트리밍 나이프를 조직학 나이프로 교체하십시오. 현미경으로 캡슐 피치 각도를 조정하여 피라미드가 나이프 가장자리에 수직이 되도록 합니다. 절단 속도를 설정하고 샘플을 절단합니다.샘플을 절편화한 후 선택한 절편을 여과지 위의 처리된 구리 그리드로 옮깁니다. 샘플을 건조시킨 다음 샘플을 전자 현미경에 넣습니다. Through Focal Tilt 시리즈를 설계하려면 먼저 전자빔 피사계 심도와 샘플의 최대 겉보기 두께를 계산하십시오.이러한 값을 기반으로 초점 간격을 선택하고 최대 겉보기 두께에서 전체 샘플을 이미지화하는 데 필요한 초점 단계 수를 결정합니다. 그런 다음 낮은 배율에서 샘플 내에서 관심 영역을 찾습니다. 샘플이 회전할 때 ROI가 이동하는 것처럼 보이지 않도록 유센트릭 높이를 조정합니다.기울기 범위 전체에서 ROI가 계속 보이는지 확인합니다. 자동화된 이미지 수집을 위해 Through Focal Tilt Series 매개변수를 입력하고 이미지를 획득합니다. 이미지 시리즈를 이미지 처리 프로그램으로 가져오고, 피라미드 계층 구조에서 동일한 기울기 각도로 수집된 이미지를 정렬합니다.정렬된 이미지를 쌓아 각 기울기 각도에서 정렬을 찾습니다. 스택을 탐색하여 초점이 맞춰진 영역만 이미지에서 이미지로 이동하는지 확인하고 필요에 따라 이미지를 다시 정렬합니다. 샘플 전체에서 정렬이 확인되면 높은 설정에서 초점이 맞는 정보를 병합하여 기울기 각도당 단일 이미지로 시리즈를 생성합니다.로컬 최소값 또는 기준 마커를 기반으로 tilt 시리즈의 정렬 찾기를 수행합니다. 3차원 복원을 수행하고 결과 이미지를 검사합니다. 재구성이 흐리거나 변형된 것처럼 보이면 원본 이미지 시리즈를 다시 정렬합니다.T. brucei의 샘플은 이 방법을 사용하여 이미지화되고 분석되었습니다. 0도 기울기 각도에서 편모 주머니의 여러 세부 사항을 볼 수 있습니다.70도의 더 높은 기울기 각도에서는 투시 초점 시리즈에 수집된 각 이미지의 일부만 초점이 맞춰집니다. 이 위치는 시리즈 전반에 걸쳐 바뀝니다. 초점이 맞는 섹션을 병합하면 초점이 맞는 영역이 더 큰 단일 이미지가 생성됩니다.이 효과는 Through focal tilt series의 고주파 영역이 강조 표시될 때 더욱 두드러집니다. 고주파 정보는 결합된 이미지의 대부분에 걸쳐 있으며, 이는 Through Focal Tilt 시리즈가 잘 처리되었음을 나타냅니다. 일단 마스터하면 이미지 처리 부분은 선택한 정렬 및 재구성 매개변수에 따라 약 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 최종 재구성의 품질은 이전 정렬 테스트의 품질에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Through focal tilt series의 컬렉션 및 이미지 처리 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

여기에서, 우리는 주사 전자 현미경 검사법 (SEM)를 사용하여 섬세한 조직 견본을 화상 진찰을 위한 상세한 처리 프로토콜을 제시합니다. 세 가지 다른 처리 방법, 즉, hexamethyl disilazana (HMDS) 화학 건조, 간단한 공기 건조 및 임계 점 건조는 각각 경질 계란 껍질, 초기 발달 단계에서 배아 및 곰팡이 배양을 준비하기 위해 설명됩니다.

전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리

우리는 스캐닝 전자 현미경의 자동화 된 이미징 절차와 함께 배열 단층 촬영 샘플로 사용하기 위해 대형 전송 지원에 직렬 섹션의 리본과 컬렉션의 준비를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 로컬, 희귀 한 이벤트의 스크리닝, 검색 및 표적 이미징및 대량 데이터 볼륨을 수집 할 수 있습니다.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

집속 이온빔 밀링을 사용하여 극저온 전자 단층 촬영을 위한 급락 동결 생물학적 샘플에서 유리질 그리드 상의 라멜라를 생성합니다.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

극저온 전자 단층 촬영에서 대규모 데이터 수집에 대한 수요가 증가함에 따라 처리량이 높은 이미지 수집 루틴이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 지형 데이터 수집의 시간 효율성과 처리량을 최대화하기 위한 고급 인수 전략의 최근 개발을 구현하는 프로토콜입니다.

극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

배우세요 주사 투과 전자 단층 촬영법을 이용하여 두꺼운 생물 샘플의 3차원 재구성을 수행하는 방법을 학습하세요. 이 기술은 구조생물학 연구에서 심도 회복을 가능하게 하며 고품질 영상을 제공합니다.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

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