Name: 공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및 현장에서 근접 내고 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 공동 면역 침전과 근접 내고 분석을 사용하여 핵 및 세포질에서 단백질 상호 작용을 시각화하는 방법을 HEK293 세포에서. 이 비교 연구는 연구자들이 적절한 실험 방법을 선택하는 데 도움을 줍니다.

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이 연구는 스위스 국립과학재단(SNSF, 31003A_163305)의 지원을 받았습니다.

1. 공동 면역 침전 <ol><li> 씨앗 하나 6 웰 플레이트에 웰 당 2 × 10 5 세포에서 HEK293 세포 2 ㎖의 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 함께 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) 보충 100 U / mL의 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균) . </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 세포를 성장. </li><li> 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 5 분 500 XG에 원심 분리하여 수확 세포. </li><li> 상업 핵 및 세포질 추출 시약을 사용하여 핵 및 세포질 분수를 준비합니다. 일부 수정과 제조업체의 지시 사항을 따르십시오. <ol><li> 하나의 공동 면역 실험 (한 6 웰 플레이트의 3 우물에서 약 90 %의 컨 플루)에 대한 3 × 10 6 세포를 사용합니다. 최고 속도로 15 초 동안 300 μl의 차가운 세포질 추출 용액 (CER의 I)와 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 얼음에 30 분 동안 품어. 배양, vorte 중5 초마다 10 분 동안 X. </li><li> 5 초 동안 16.5 μl의 차가운 세포질 추출 용액 II (CER II), 소용돌이를 추가하고 얼음에 5 분 동안 품어. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 16,000 XG에 5 초 원심 분리기를위한 소용돌이. </li><li> 새로운 사전 냉각 튜브에 뜨는 (세포질 추출물)를 전송하고, 사용까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 때마다 최대 피펫 팅에 의해 5 배 아래로 1 ml의 차가운 PBS와 불용성 펠렛 (포함하는 핵)을 세 번 씻으십시오. 세척 후 PBS를 제거합니다. </li><li> 15 초 동안 150 μl의 차가운 핵 추출 용액 (NER), 소용돌이를 추가하고 얼음에 1 시간을 품어. 배양하는 동안, 15 초 및 피펫 200 μl의 팁 10 시간마다 10 분 동안 소용돌이. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에 15 초 동안 소용돌이와 원심 분리기. </li><li> 새로운 사전 냉각 튜브에 뜨는 (핵 추출물)로 이동시켜 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 각각의 입력으로 핵 및 세포질 추출물의 볼륨의 10 %를 가져 가라. </li><li> 에이1 ml의 최종 용적에 남아있는 추출물을 차가운 PBS를 위해 dd. 얼음에 사용할 때까지 보관하십시오. 주 : 단백질 G 공역 자성 비드를 사용하는 경우 사전 클리어링이 필수적인 것은 아니다. 백그라운드가 높은 경우에는, 40 ㎕의 단백질 G 공역 자성 비드 (50 % 슬러리)와 회 전자에서 30 분 동안 4 ℃에서이 단계에서 해물 희석 한 용액을 배양하여 전 소거를 수행한다. 자기 랙 구슬에서 분리 된 상층 액 (사전 허가 해물). 구슬을 폐기하십시오. </li><li> 단백질 G-복합 자석 구슬 몇 차 항체로, 4 μg의 토끼 다 클론 항 RBM3 항체 또는 토끼의 IgG (음성 대조군) 200 ㎕의 PBS에 플러스 트윈 20 버퍼와 단백질 G - 복합 자석 구슬 (50 % 슬러리) μL (40)을 품어 (PBST, 0.02 % 트윈 20)가 회 40 분 동안 실온 (RT)에서. </li><li> 별도의 자기 랙 구슬과 뜨는 항체를 결합하고, 상층 액을 버린다. 200 μL PBST (0.02 %) 한 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 1 추가용액은 비드 해물을 (또는 필요한 사전 허가 해물 경우)로 희석하고, 밤새 4 ℃에서 회전에 배양한다. </li><li> 다음 날, 자기 랙에 의해 구슬과 상층 액을 분리하고, 상층 액을 버린다. 20 rpm의 고정 된 속도로 회 전자에 4 ° C에서 각각의 튜브 0.5 ml의 PBST (0.02 %)와 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> 40 ㎕의 시료 완충액 (1X 상업용 샘플 버퍼의 50 mM 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT))를 첨가하여 비드로부터 단백질을 용출. 10 분 동안 70 ℃에서 가열한다. 새로운 1.5 ML 튜브에 스핀 다운 및 전송 액체. </li><li> 10 분 동안 70 ℃에서 가열 (1X 상업용 샘플 완충액 50 mM의 DTT, 최종 농도)을 샘플 버퍼에 입력 해물을 희석. 프리 캐스트 4-12% 비스 - 트리스 젤 마지막 단계에서로드 입력과 면역 단백질. 각 웰의 적재 부피는 20 μl를 초과 할 수 없습니다. 35 분 동안 얼음에 1 배 상업 운전 버퍼에 전기 영동을 수행합니다. 참고 :로드 핵 및 세포질 추출물셀의 동일한 초기 량을 반영 (2) (V / V를) : 1의 비율로 S. </li><li> 4 ° C에서 2 시간 동안 30 V에서 1 배 상업 전송 버퍼에서 PVDF 막에 전달 단백질. </li><li> 5 % 차단 막을 진탕 기에서 40 분 동안 RT에서 우유 PBST (0.1 % 트윈 20)를 미끄러 져. </li><li> 밤새 4 ° C에서 PBST (0.1 %)에서 : 일차 항체와 멤브레인 (1,000 두 1에 희석) 품어. </li><li> 쉐이커에 RT에서 PBST (0.1 %)와 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> 1 시간 동안 RT에서 PBST (0.1 %)에서, (5000 모두 1로 희석) 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)와 함께 막을 인큐베이션 항 - 마우스 또는 항 - 토끼 이차 항체를 π 공역. </li><li> 쉐이커에 RT에서 PBST (0.1 %)와 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> cm 2 막 당 0.2 ml의 강화 된 화학 발광 (ECL) 기판 혼합물을 사용하여, 5 분 동안 실온에서 품어. 빨간 불빛을 제외하고 이후이 단계에서 모든 빛을 피하십시오. </li><li> 액체 버리고 필름 카세트에 X 선 필름에 노출. 자동 필름 홍보를 사용하여 필름 개발ocessing 기계. </li></ol> 2. 면역 세포 화학 및 근접 내고 분석 <ol><li> 시드 0.4 ㎖의 DMEM 한 8 실, 폴리 D 라이신 코팅 된 슬라이드 챔버 당 1.5 × 104 세포의 HEK293 세포는 10 % FBS, 100 U / ㎖ 펜 연쇄상 보충. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 세포를 성장. </li><li> 대기음 매체 및 RT에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정한다. </li><li> 대기음 PFA, 챔버 당 0.5 ml의 PBS로 세척 3 × 10 분. </li><li> Permeabilize 하시려면 1 시간 동안 실온에서 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100, 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 블록 셀. </li><li> 밤새 4 ° C에서 통에 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 및 5 % NGS의 일차 항체와 함께 품어. 마우스 단일 클론 항 NF90 항체 토끼 다 클론 항 RBM3 항체 1을 희석 : PBS 100을 두 번 염색을 위해. 음성 대조군의 경우, 독립적으로 두 일차 항체 중 어느 하나를 생략하고, 제 3 제어 모두 항체 생략. 참고 : 광고 차단 및 희석 시약을 사용하지 마십시오. </li><li> 챔버 당 0.5 ml의 PBS로 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> 면역 세포 또는 근접 내고 분석 프로토콜에 따라 <ol><li> 면역 세포 화학 <ol><li> 부화 1 : 500 희석 된 녹색 형광 염료가 결합 된 항 - 마우스 및 적색 형광성 염료 결합 항 - 토끼 이차 항체를 실온에서 1 시간 동안. 이후이 단계에서 빛을 피하십시오. </li><li> 10 분 동안 실온에서 PBS로 5,000 : 4 &#39;, 6-diamidin -2- phenylindol (DAPI)로 Counterstain과 핵 (1) 희석 하였다. </li><li> 챔버 당 0.5 ml의 PBS로 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> 유리 슬라이드 건조에서 챔버를 제거합니다. 슬라이드 당 매체를 장착, 250 μ으로 마운트합니다. </li></ol></li><li> 근접 내고 분석 <ol><li> 근접 내고 분석 프로브를 준비합니다. 믹스와 일을 결찰 수있는 다른 올리고 뉴클레오티드로 연결된 두 개의 근접 내고 분석 프로브 (항 - 마우스 및 안티 - 토끼 보조 항체를 희석하나 8 챔버 슬라이드 (cm 2 당 약 40 ㎕를 320 ㎕의 총 부피로 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 5 5 % NGS) 다른 두 연결 용액의 올리고 뉴클레오티드)을 모두 한 거친 첨가 . 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> 유리 슬라이드에서 챔버를 제거하고 희석 프로브를 추가 할 수 있습니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 습도 인큐베이터에서 인큐베이션. </li><li> 연결 용액을 준비합니다. 8 리가 ㎕를 혼합 64 μl를 5 × 결찰 재고 및 248 μL의 H 2 O </li><li> 슬라이드에서 액체를 누른 1X 세척 버퍼 (A)에 2 × 5 분을 씻어 (키트와 함께 제공). </li><li> 라이 게이션 용액을 첨가하고 30 분 동안 37 ℃에서 습도 인큐베이터에서 배양한다. </li><li> 증폭 솔루션을 준비합니다. 이후이 단계에서 빛을 피 4 μL 중합 효소, 64 ㎕의 5 배 증폭 재고 및 252 μL의 H 2 O를 섞는다. </li><li> 슬라이드에서 액체를 누른 1X 세척 버퍼 A에 2 × 2 분을 씻어 </li><li> 앰프 추가lification 용액을 100 분 동안 37 ℃에서 어두운 습도 인큐베이터에서 배양한다. </li><li> 슬라이드에서 액체를 누른 1X 세척 버퍼 B에 2 × 10 분을 씻어 (키트와 함께 제공). 0.01x 세척 버퍼 B.에서 1 분 동안 세척 </li><li> 슬라이드를 건조 및 슬라이드 당 (DAPI)와 상업 장착 매체의 250 μl를 마운트. </li></ol></li></ol></li><li> 10 배의 접안 렌즈와 20 배 대물 렌즈를 사용하여 현미경 형광 신호를 검사합니다. CCD 카메라에 의해 화상을 취득. </li></ol>

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</ol>

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두 방법에 대한 몇 가지 장점뿐만 아니라 단점이있다. 비교적 새로운 기술로서, 인접 결찰 분석법의 명백한 이점은 단일 세포 수준 대신 이기종 셀 배치의 단백질 - 단백질 상호 작용을 규명 할 수있는 가능성이다. 높은 크기 및 (공 초점 현미경으로 예) 해상도의 이미지는 하나의 형광 반점을 계산하여 정량화에 대한 가능성을 제공합니다. 대조적으로, 웨스턴 블랏과 공동 면역 침전 기술의 통상적 인 조합은 단지 적절한 로딩 컨트롤 IP 샘플에 대해 결정하기 곤란하기 때문에, 주로 단백질 밴드를 반 정량 할 수있다. 또한, 단백질 - 단백질 상호 작용은 공 면역 침전 또는 융합 태그 인공 과발현 시스템에 필요한 생체 물질, 예를 들어, 세포 또는 조직, 다량의 상호 작용을 검출 할 수있는 기회를 향상시키기 위해 적용되며, 약하거나 과도 때 . 또한, 검출 t이러한 질량 분석법 등의 고감도 echniques 실험의 품질을 향상시킬 수있다. 그러나, 원료의 양에 대하여 근접 결찰 정량법 명확한 이점을 갖는다...

핵 인자 90 (NF90)은 인터루킨 -2 후 전사 및 miRNA의 생합성 1-3의 규제의 바이러스 감염에 대한 반응 조절 등 다양한 기능을 가진 멀티 이소 단백질이다. RBM3는 RNA 결합 단백질 번역 및 miRNA의 생합성에 관여 저체온증 저산소증 4-6을 포함하는 다양한 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 최근에, 우리는 단백질 복합체 7 NF90 및 RBM3를 발견했다. NF90 RBM3과의 상호 작용은 단백질 펼친 응답 7 단백질 키나제 RNA 같은 소포체 키나제 (PERK) 활성을 조절하는 것이 필수적이다. NF90 및 RBM3 모두 핵하지만 세포질에 작은 NF90의 비율과 RBM3 셔틀에 주로 위치하며, PERK 활동을 조절하는 특정 기능을 위해 서로가 예를 결합한다. 따라서, 어느 것을 나타낼 수 있고, 세포 내 구획에서-NF90 RBM3 상호 작용의 분포를 시각화하는 것이 중요각각의 구획에서의 다양한 역할. 수십 년 전에, 효모 두 하이브리드 (Y2H)는 두 단백질 (8) 사이의 상호 작용을 검출하기 위해 개발되었다. 그러나, 융합 단백질의 인공 건설, 거짓 양성 결과는이 방법의 적용을 제한하고있다. 오랫동안, 공동 면역 침전 특히 내인성 조건 9, 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하는 주요 기술이다. 최고 감도 및 정밀도가 요구되는 경우, 질량 스펙트럼에서 사용되는 동안에 공동 면역 침전 된 단백질 복합체를 분석, 웨스턴 블롯, 가장 편리한 기술이다. 최근, 근접 결찰 분석은 동일계 10,11 모두에서 세포 및 조직에서의 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 신규 한 방법으로 개발되었다. 여기서는 NF9 캡처에서 가장 인기있는 공동 면역 침전 법 및 비교적 신규 근접 결찰 분석 방법에 비해세포 내 분수에 0 RBM3 상호 작용. 우리는 또한 장점과 두 가지 기술의 한계를 논의했다.

<table><tbody><tr><td>둘베코의 변형된 독수리' s Medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>High glucose 4,500 mg/L</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (PenStrep)</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908.3</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>DRBP76 (NF90/NF110) 항체</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612154</td><td>WB의 경우 1:1,000, ICC/PLA</td></tr> RBM3 항체의 경우 1:100 사용 <tr><td></td><td>ProteinTech</td><td>14363-1-AP</td>는 <td>WB의 경우 1:1,000, ICC/PLA</td></tr><tr><td>Lamin A/C 항체</td>의 경우 1:100 사용 <td>세포 신호 전달 기술</td><td>#2032</td>는 <td>WB에 1:1,000을 사용합니다.</td></tr><tr><td>항-GAPDH 항체</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>는 WB&nbsp에 대해 1:1,000을 사용합니다;</td></tr><tr><td>일반 토끼 IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>항토끼 IgG, HRP 연계 2차 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>#7074</td>는 <td>WB&nbsp에 대해 1:5,000을 사용합니다;</td></tr><tr><td>항-마우스 HRP 2차 항체</td><td>Carl Roth</td><td>4759.1</td>은 <td>WB&nbsp에 대해 1:5,000을 사용합니다.</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL 블로팅 기질</td><td>Bio-Rad</td><td>#1705060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 시료 버퍼(4x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer(20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 전송 버퍼(20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hypond P 0.2 PVDF 멤브레인</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 8웰 배양 슬라이드</td><td>Corning BioCoat</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-mouse IgG (H+L 항체), Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L 항체), Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>듀올링크 PLA&nbsp; 프로브 안티 래빗 MINUS</td><td>시그마</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>듀올링크 검출 시약 레드</td><td>시그마</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>듀올링크 세척 버퍼 형광</td><td>시그마</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>DAPI가 있는 듀오링크 장착 매체</td> 시<td>그마</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>시그마</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>올림푸스</td><td>AX-70</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>SPOT</td><td>Insight 2MP Firewire</td><td></td></tr><tr><td>X선 필름</td><td>Fujifilm</td><td>Super RX</td><td></td></tr><tr><td>필름 가공기</td><td>Fujifilm</td><td>FPM-100A</td><td></td></tr></tbody></table>

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

단백질-단백질 상호 작용은 수천 개의 세포 과정에 관여하며 뚜렷한 공간적 맥락에서 발생합니다. 전통적으로 공동 면역침전법(co-immunoprecipitation)은 단백질과 단백질의 상호작용을 검출하는 데 널리 사용되는 기법입니다. 후속 웨스턴 블롯 분석은 공동 면역침전된 단백질을 시각화하는 가장 일반적인 방법입니다. 최근에는 근접 결찰 분석법이 in situ 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하는 강력한 도구가 되었으며 이 방법으로 단백질-단백질 상호 작용을 정량화할 수 있는 가능성을 제공합니다. 기존의 면역세포화학과 유사하게, 근접 결찰 분석 기법은 항원에 대한 1차 항체의 접근성을 기반으로 하지만, 이와 대조적으로 근접 결찰 분석법은 롤링 서클 PCR을 포함하는 고유한 기법으로 단백질-단백질 상호 작용을 검출하는 반면, 기존 면역세포화학은 단백질의 공동 국소화만 보여줍니다.
핵 인자 90 (NF90) 및 RNA 결합 모티프 단백질 3 (RBM3)은 이전에 상호 작용 파트너로 입증되었습니다. 이들은 주로 핵에 국한되어 있지만 세포질로 이동하여 세포질 구획의 신호 전달 경로를 조절하기도 합니다. 여기에서는 공동면역침전(co-immunoprecicipation) 및 근접 결찰 분석(proximity ligation assay)을 통해 핵과 세포질 모두에서 NF90-RBM3 상호작용을 비교했습니다. 또한 공간 분포 및 단백질-단백질 상호 작용의 특성과 관련하여 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하는 데 있어 이 두 기술의 장점과 한계에 대해 논의했습니다.

도 1 및 NF90 RBM3 모두 핵 단백질과 작은 부분이 세포질에 존재하는 것을 보여준다. 특히, RBM3에 대한 긍정적 인 스테인드 세 가지 밴드가 있습니다. 20 kDa의 아래 작은이 RBM3의 정확한 크기를 반영 (RBM3의 예측 분자량이 17 kDa의)입니다. 다른 두 밴드의 기원은 조사가 남아있다. 미끼 단백질로 RBM3와 공동 면역 침전 실험 NF90-RBM3 상호 작용은 핵 및 세포질에서 소수 민족에 주로 존재하는 것으로 나타났습니다. 공동 면역 침전 데이터는 각각의 단일 단백질의 현지화를 지원합니다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, NF90 및 RBM3 주로 핵하지만 시튜 세포질에 위치한다. 두 단백질 모두 구획에 완벽한 공동 현지화을 보여줍니다. 근접 내고 분석은 패...

단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

본 실험의 전반적인 목표는 서로 다른 세포 내 구획에서 단백질-단백질 상호작용을 시각화하는 데 있어 공침강법(co-immunoprecipitation, co-ip)과 근접 결찰 분석법(proximity ligation assay, pla)의 장단점을 비교하는 것입니다. 여기에 제시된 두 가지 서로 다른 방법의 비교는 연구자가 세포의 핵과 세포질 내 단백질-단백질 상호작용의 분포 패턴을 조사할 때, 자신의 특정 목적에 더 적합한 방법이 무엇인지 결정하는 데 도움을 줄 수 있습니다. co-ip의 주요 장점은 실제의 단백질-단백질 상호작용을 검출할 수 있다는 것입니다.이와 대조적으로, PLA의 장점은 단일 세포 수준에서 단백질-단백질 상호작용을 신속하게 분석할 수 있다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 Hex293 세포를 배양하고 수확한 후, 3 × 10⁶개의 세포에 차가운 세포질 추출액 300 µL를 첨가하고 최고 속도로 15초 동안 볼텍싱합니다. 추출물을 얼음 위에서 30분 동안 배양하며, 배양하는 동안 10분마다 샘플을 5초 동안 볼텍싱합니다.그런 다음 차가운 세포질 추출 용액 16.5 µL를 첨가하고, 5초 동안 볼텍싱한 후 시료를 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 추출물을 5초 동안 볼텍싱하고, 16,000 x g, 4 °C에서 5분 동안 시료를 원심분리합니다. 상층액을 미리 냉각시킨 새 튜브로 옮겨 사용 전까지 얼음 위에 보관하며, 차가운 PBS 1 mL를 사용하여 불용성 펠릿을 피펫팅으로 섞어준 후 PBS를 제거하는 과정을 3회 반복하여 세척합니다.다음으로, 차가운 핵 추출 용액 150 µL를 첨가하고 15초 동안 볼텍싱한 후, 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 10분마다 샘플을 15초 동안 볼텍싱하고, 200 µL 팁을 사용하여 용액을 10회 파이펫팅합니다. 튜브를 15초 동안 볼텍싱하고, 4 °C에서 16,000 x g로 10분 동안 샘플을 원심분리한 후, 핵 추출물이 포함된 상층액을 미리 냉각된 새 튜브로 옮겨 사용 전까지 얼음 위에 보관합니다.입력물로 사용할 핵 및 세포질 추출물 부피의 10%를 각각 제거한 후, 남은 추출물에 차가운 PBS를 추가하여 최종 부피를 1 mL로 맞춥니다. 사용 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 필요에 따라 protein g 접합 자성 비드를 프리클리어링한 후, 200 µL의 PBST 내에서 40 µL의 protein g 접합 자성 비드와 4 µg의 rapid polyclonal anti-RBM3 항체 또는 음성 대조군으로 rapid IGG를 혼합합니다.로테이터에서 40분 동안 상온까지 배양합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 올린 후, 상층액을 제거하여 버립니다. 그다음 200 µL의 PBST로 비드를 한 번 세척합니다.희석된 용해물 1 mL를 비드에 첨가하고, 4 °C의 로테이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 상층액을 흡입하여 제거합니다. 비드에 0.5 mL의 PBST를 첨가하고, 4 °C의 로테이터에서 20 rpm의 고정 속도로 10분 동안 세 번 세척합니다.40 µL의 샘플 버퍼를 첨가하여 비즈로부터 단백질을 용출시킨 다음, 샘플을 70 °C에서 10분 동안 가열합니다. 비즈를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 액체를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 면역세포화학 분석을 수행하려면, 폴리리신(polydelysine)이 코팅된 8챔버 슬라이드의 각 챔버에 HEK293 세포를 1.5 × 10⁴ cells/chamber 밀도로 분주합니다.10% FPS와 100 units/mL의 penstrep이 첨가된 0.4 mL의 DMEM에 넣습니다. 세포를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양한 후, 배지를 흡입 제거하고 층류 후드 내에서 4% PFA를 사용하여 실온에서 10분 동안 세포를 고정합니다. 그 다음 PFA를 흡입 제거하고 챔버당 0.5 mL의 PBS를 사용하여 세포를 3회 세척합니다.세포를 투과성 있게 만들고 블로킹하기 위해 0.5%tritonX100, 5%NGS 및 PBS를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, anti NF90 단클론 항체와 anti RBM3 다클론 1차 항체를 1:100으로 희석하여 웰에 넣고 4°C의 쉐이커에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 0.5 mL의 PBS를 사용하여 챔버를 10분씩 3회 세척합니다.면역세포화학 염색을 수행하려면, 1:500으로 희석한 녹색 형광 염료 결합 항마우스 항체와 적색 형광 염료 결합 항토끼 항체를 세포에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 핵의 대비 염색을 위해 1:5,000으로 희석한 DAPHE NBPS를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양한 후, 이전과 같이 PBS로 샘플을 세척합니다. 유리 슬라이드에서 챔버를 제거하여 건조시킨 후, 슬라이드당 250 µL의 마운팅 용액을 사용하여 마운팅합니다.튜브 근접 결찰 분석(proximity ligation assay) 프로브를 준비하려면, 세포와 1차 항체를 반응시킨 후 앞서 시연한 대로 세척하고, 기제작된 프로브를 0.1% tritonx100, 5% NGS 및 PBS 혼합액으로 1:5 비율로 희석합니다. 이때 8개 챔버 슬라이드 하나당 총 부피는 320 µL가 되도록 합니다. 해당 용액을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 유리면에서 챔버를 분리하고 희석된 프로브를 첨가한 후, 37 °C의 습도 유지 배양기에서 1시간 동안 챔버를 배양합니다.ligase 8 µL, 5x ligation stock 64 µL, 그리고 물 248 µL를 혼합하여 라이게이션 용액을 준비합니다. 슬라이드에서 액체를 털어내고, onex wash buffer A를 사용하여 샘플을 5분씩 두 번 세척합니다. 샘플에 라이게이션 용액을 추가하고, 37 °C의 습도 배양기에서 30분 동안 배양합니다.폴리머라제 4 µL, 5x 증폭 스톡 64 µL, 물 252 µL를 혼합하여 증폭 용액을 준비하고, 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그 다음, 슬라이드에서 액체를 털어내고, 1x 세척 버퍼 A를 사용하여 샘플을 2분씩 두 번 세척합니다. 샘플에 증폭 용액을 첨가하고 암실 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 100분 동안 배양합니다.이전과 동일하게 액체를 털어낸 후, 세척 버퍼 B로 샘플을 10분씩 2회 세척하고, 이어서 0.1 x 세척 버퍼 B로 1회 세척합니다. 마지막으로 슬라이드를 건조시킨 후 DAPHE가 포함된 상용 봉입제로 250 microliters를 사용하여 샘플을 봉입하고, 현미경으로 형광을 관찰하며 CCD 카메라로 이미지를 획득합니다. RBM3를 미끼 단백질로 사용한 공침강 실험 결과, NF90-RBM3 상호작용은 주로 핵에서 나타나며 소수는 세포질에서 발견되는 것으로 밝혀졌습니다. 본 면역형광 실험에서 NF90과 RBM3는 모두 핵에서 관찰됩니다.두 단백질 모두 C2의 세포질에서 발견되었으며, 두 단백질은 각 구획에서 완벽한 공동 국소화를 보입니다. 이 이미지들에서 볼 수 있듯이, 근접 결찰 분석(proximity ligation assay)을 통해 NF90-RBM3 상호작용 패턴이 밝혀졌으며, 이는 대부분의 세포에서 핵 내에 상호작용이 집중된 전통적인 면역 세포 화학법과 매우 유사합니다. 오직 소수의 세포만이 NF90-RBM3 상호작용이 주로 세포질에 분포하는 양상을 보였습니다.이 절차를 수행할 때, PLA가 더 편리하기는 하지만 단백질-단백질 상호작용을 직접적으로 반영하지는 않는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 반면, co-ip는 직접적인 상호작용을 검출합니다. 또한, 1차 항체의 특이성이 결과의 품질을 결정합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 자신의 실험 목적에 따라 서로 다른 세포 구획 내의 단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 적절한 방법을 선택하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

이 동영상은 선충 세포에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다. 관심 단백질의 근접성은 2차 항체에 부착된 PLA 프로브의 도움으로 원형 DNA 템플릿을 생성합니다. 프로브는 긴 단일 가닥 DNA를 생성한 후 검출기 프로브의 혼성화를 생성하는 증폭 용액을 사용하여 추가로 증폭되어 세포 내 단백질-단백질 상호 작용의 국소화를 가능하게 합니다.

In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.

근접 결찰 분석에 의한 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 내인성 세포 기관 내 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화

단백질-단백질 상호작용은 표적 단백질의 기능을 규명하는 데 중요하며, co-IP(co-immunoprecipitation)를 통해 PPI를 쉽게 확인할 수 있습니다. 에피토프 태그 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 HEK-293 세포에 임시로 transfection하고 두 타겟 단백질의 결합을 쉽게 확인할 수 있는 면역침전 방법을 개발했습니다.

단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 Anti-Epitope Tag Affinity Gel을 사용한 면역침전

배우세요 공동 면역 침전과 근접 내고 분석을 사용하여 핵 및 세포질에서 단백질 상호 작용을 시각화하는 방법을 HEK293 세포에서. 이 비교 연구는 연구자들이 적절한 실험 방법을 선택하는 데 도움을 줍니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및

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