공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및 현장에서 근접 내고 분석

이 실험의 전반적인 목표는 서로 다른 세포 구획에서 단백질 단백질 상호 작용을 시각화하는 데 있어 co-immunoprecipitation(co-ip)과 근접 결찰 분석(pla)의 장점과 단점을 비교하는 것입니다. 여기에 제시된 두 가지 방법에 대한 비교는 과학자들이 세포핵과 세포질에서 단백질 단백질 상호 작용의 분포 패턴을 조사할 때 특정 목적에 더 적합한 방법을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. co-ip의 주요 장점은 진정한 단백질 단백질 상호 작용을 감지하는 것입니다.

대조적으로, pla의 이점은 단일 세포 수준에서 신속하게 연구소 단백질 단백질 상호 작용을 분석하는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 hex293 세포를 성장 및 수확한 후 6번째 세포에 3 곱하기 10까지 300마이크로리터의 저온 세포질 추출 용액을 첨가하고 15초 동안 최고 속도로 세포를 와류화합니다. 추출물을 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 배양 중에는 10분마다 5초 동안 샘플을 소용돌이

그런 다음 16.5마이크로리터의 저온 세포질 추출 용액을 넣고 5초 동안 소용돌이치고 얼음에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 추출물을 5초 동안 볼텍스하고 16, 000 x g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 새 미리 냉각된 튜브에 옮기고 사용할 때까지 얼음 위에 보관한 다음 1ml의 차가운 PBS를 사용하여 위아래로 피펫팅하고 세척할 때마다 PBS를 제거하여 불용성 펠릿을 세 번 세척합니다.

다음으로, 150마이크로리터의 차가운 핵 추출 용액을 넣고 15초 동안 와류를 치고 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 중 10분마다 15초 동안 샘플을 볼텍스하고 200마이크로리터 팁을 사용하여 용액을 10회 피펫팅합니다. 15 초 동안 관을 와류로 치고, 16, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 000 x g에 표본을 원심 분리하고, 그 후에 새로운 precooled 관으로 핵 추출물을 포함하는 상등액을 옮기고 사용까지 얼음에 유지하십시오.

핵 및 세포질 추출물의 각 부피를 10%씩 입력으로 제거한 다음 나머지 추출물에 저온 PBS를 추가하여 최종 부피 1ml를 만듭니다. 사용할 때까지 얼음에 넣어 보관하십시오. 필요한 경우 protein g conjugated magnetic bead를 preclearing한 후, 40μl의 protein g conjugated magnetic beads를 4μg의 rapid polyclonal anti-RBM3 항체 또는 rapid IGG를 200μl의 PBST에서 negative control로 결합합니다.

회전기에서 실온까지 40분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 supernatent를 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 PBST로 비드를 한 번 씻습니다.

비드에 1ml의 희석된 리세이트를 첨가하고 섭씨 4도의 로테이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 supernatent를 흡인합니다. 비드에 0.5ml의 PBST를 넣고 섭씨 4도의 회전기에서 10분 동안 20rpm의 고정 속도로 3회 세척합니다.

40마이크로리터의 샘플 버퍼를 추가하여 비드에서 단백질을 용리한 다음 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 가열합니다. 구슬을 회전시킨 후 액체를 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 면역세포 화학을 수행하기 위해 HEK293 세포를 8개의 챔버 폴리델리신 코팅 슬라이드에 있는 챔버당 4개의 세포에 1.5배 10으로 시딩합니다.

0.4 밀리리터의 DMEM에 10% FPS와 100 밀리리터의 펜스트렙이 추가되었습니다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 48시간 동안 배양한 다음 배지를 흡인하고 4% PFA를 사용하여 층류 후드에서 10분 동안 실온에서 세포를 고정합니다. 그런 다음 PFA를 흡인하고 챔버당 0.5ml의 PBS를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다.

0.5%tritonX100과 5%NGS 및 PBS를 첨가하여 세포를 투과화 및 차단하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 항 NF90 단클론 및 항 RBM3 다클론 1차 항체를 1에서 100까지 희석한 후 웰에 1차 항체를 추가하고 섭씨 4도의 쉐이커에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 0.5ml의 PBS를 사용하여 챔버를 각각 10분씩 세 번 세척합니다.

면역세포화학을 수행하기 위해 세포에 1:500 희석된 녹색 형광 염료 결합 항마우스 및 적색 형광 염료 결합 항토끼 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 5에 1개, 핵을 counterstaini에 두고 10 분 동안 실내 온도에 외피하기 위하여 DAPHE NBPS의 000 희석을 추가하고, 그 후에 PBS로 표본을 전에 것과 같이 세척하십시오. 유리 슬라이드에서 챔버를 제거하고 건조시킨 후 슬라이드당 250마이크로리터의 장착 매체를 사용하여 장착하십시오.

튜브 근접 결찰 분석 프로브를 준비하기 위해 세포와 1차 항체를 배양하고 방금 설명한 대로 세척한 후 미리 만들어진 프로브를 0.1%tritonx100 및 5%NGS 및 PBS에서 1-5로 희석하여 하나의 8챔버 슬라이드에 대해 총 320개의 마이크로콜리터를 만듭니다. 용액을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 유리 면에서 챔버를 제거하고 희석된 프로브를 추가한 다음 섭씨 37도의 습도 인큐베이터에서 1시간 동안 챔버를 배양합니다.

8마이크로리터의 리가아제, 64마이크로리터의 5x 라이게이션 스톡, 248마이크로리터의 물을 혼합하여 결찰 용액을 준비합니다. 슬라이드에서 액체를 두드리고 onex 세척 버퍼 A를 사용하여 샘플을 각각 5분씩 두 번 세척합니다. 검체에 결찰 용액을 첨가하고 섭씨 37도의 습도 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.

4마이크로리터의 중합효소, 64마이크로리터의 5x 증폭 스톡, 252마이크로리터의 물을 혼합하여 증폭 용액을 준비하고 튜브를 호일로 감싸 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 슬라이드에서 액체를 두드리고 1 x 세척 버퍼 A를 사용하여 샘플을 각각 2분씩 두 번 세척합니다. 샘플에 증폭 용액을 추가하고 섭씨 37도의 어둡고 습한 인큐베이터에서 100분 동안 배양합니다.

그 때 이전과 같이 액체를 두드리기 후에, 0.1 x 세척 완충기 B.Finally에서 한 번 그(것)들을 세척하기 전에 세척 완충기 B에서 각각 10 분 동안 표본을 두번 세척하고, 활주를 말리고 DAPHE를 가진 상업적인 설치 매체의 250 마이크로리터로 표본을 거치하고, 현미경의 밑에 형광을 시험하고, CCD 사진기를 가진 이미지를 취득하십시오. RBM3를 미끼 단백질로 사용한 동시 면역침전 실험에서 NF90-RBM3 상호 작용은 주로 핵에 존재하고 소수는 세포질에서 발견되는 것으로 나타났습니다. 이 면역형광 실험에서 NF90과 RBM3는 모두 핵에서 볼 수 있습니다.

두 단백질 모두 C2의 세포질에서도 발견되며, 두 단백질 모두 각 구획에서 완벽한 공동 국소화를 보여줍니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이 근접 결찰 분석은 NF90-RBM3 상호 작용의 패턴을 보여주었으며, 이는 대부분의 세포에서 핵에서 가장 많은 상호 작용인 기존 면역세포 화학과 매우 유사합니다. 소수의 세포만이 NF90-RBM3 상호 작용의 우세한 세포질 분포를 보여주었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 PLA가 더 편리하기는 하지만 단백질 단백질 상호 작용을 직접 반영하지 않는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 대신 co-ip는 지시된 상호 작용을 감지합니다. 또한 1차 항체의 특이도에 따라 결과의 품질이 결정됩니다.

이 비디오를 시청한 후에는 자신의 실험 목적에 따라 다양한 세포 구획에서 단백질 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 적절한 방법을 선택하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.