Name: 내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 학습하세요 단일 세포 유전자 발현 프로파일링 방법을 통해 FACS 및 qPCR을 이용하여 포유류 세포를 분류하고 최대 96개 유전자의 발현을 정량화하는 기술입니다. 내부 기준을 활용하여 절대 전사체 수를 정확히 추정할 수 있습니다.

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우리는이 프로토콜의 개발 과정에서 셀 정렬을 수행하는 그녀의 도움에 대해 CCR ETIB 유동 세포 계측법 코어에서 V. 카푸어에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한이 프로토콜의 개발하는 동안 qPCR에를 수행에서의 원조 M. Raffeld과 CCR LP 분자 진단 장치 및 J. 주홍 및 NHLBI DNA 시퀀싱 및 유전체학 코어 감사합니다. 이 연구는 NIH의 교내 프로그램에 의해 지원되었다.

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</ol>

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우리는 배양에서 성장 부착 세포 집단에서 개별 포유 동물 세포를 분리하는 각 셀에서 약 96 유전자의 발현을 분석하기위한 방법을 제시하고있다. 이 방법은 잘 작동하는 좋은 사전 준비는 매우 중요하다. 프라이머는 단일 셀 측정의 품질을 결정으로서 특히 주목 사체 (1.2~1.3 단계) 특정 설계 및 테스트 프라이머 쌍은, 시간 소모적이지만 중요한 단계이다. 신뢰할 수있는 프라이머 쌍을 얻을되고 나면, 그들은 관심의 성적에서의 cDNA를 증폭하는 데 사용됩니다; 앰플 리콘은 표준 (1.4 단계) 할 몰량에 함께 결합됩니다. 표준 절대 성적 계수를 추정하기 위해 필요하므로이 단계는 매우 중요하다; 표준 한번 만들어 분주하고, 세포 선별 유전자 발현 측정의 모든 후속 라운드를 사용한다. 마찬가지로, 세포 분류되어있는 날에, 그것은 특히 importan 인t은 용해 버퍼의 판 (3.7 및 3.11 단계) 할 때 신중하게 낮은 결합 피펫 팁과 마이크로 원심 튜브를 사용하여 표준을 희석합니다. (단계 4.2) 셀 소터를 목표로 또 다른 중...

집단 내의 개별 셀은 균일 생리적 자극 1,2,3,4 널리 상이한 응답을 표시 할 수있다. 인구의 세포의 유전 적 변이는 응답이 다양한 한기구이지만, 심지어 세포의 클론 인구에서, 응답의 변동성을 증가시킬 수있는 몇 가지가 아닌 유전 적 요인도 있습니다. 예를 들어, 각각의 단백질과 다른 중요한 신호 분자의 농도는 하류의 유전자 발현 프로파일의 변동을 초래하는, 셀별로 달라질 수있다. 또한, 유전자 활성화 버스트 7, 8, 9 당 사체 비교적 적은 수로 제한 될 수있다 사체 (5), (6)의 짧은 지속 기간의 버스트에서 발생할 수있다. 이러한유전자 활성화에 확률 성이 크게 생물학적 반응의 다양성에 기여하고, 생리 학적 자극에 반응하는 미생물 (10) 및 포유 동물 세포 (1)에 2 선택적인 이점을 제공 할 수있다. 인해 변형 모두 유전 및 비유 전적 소스, 자극에 대한 응답에서 특정 셀의 유전자 발현 프로파일은 벌크 응답의 측정으로부터 구한 평균 유전자 발현 프로파일과 크게 다를 수있다. 개별 세포가 자극에 응답하여 변화 표시되는 범위를 결정하는 개별 세포의 분리를위한 기술을 필요로 관심 사체에 대한 발현 수준을 측정하고, 얻어진 발현 데이터의 계산 분석. 비용의 넓은 범위를 덮고, 단일 세포에서의 유전자 발현을 분석하기위한 몇 가지 방법이 있으며, 전 사체의 수 프로브 및정량의 정확성. 예를 들어, 단일 셀 RNA-SEQ은 전사 따르면 개별 셀에서 가장 높은 발현 유전자 고유 사체 수천 정량화하는 능력의 다양한 깊이를 구비하고; 비용 감소를 계속하지만 그러나, 이러한 시퀀싱 깊이와 관련된 비용이 엄청날 수있다. 반대로, 현장 하이브리드 (smRNA의 FISH)에서 단일 분자 RNA의 형광에 대한 성적 증명서의 정확한 정량을 제공에도 낮은 발현 관심의 유전자에 따라 합리적인 비용으로 유전자; 그러나, 표적 유전자의 소수만이 방법에 의해 주어진 셀에서 분석 될 수있다. 이 프로토콜에 설명 된 정량 PCR 기반의 분석은, 이러한 기술 사이의 중간을 제공합니다. 이 분석은 96 개의 셀을 한 번에 관심 96 사체까지 정량화하는 마이크로 유체 실시간 PCR 기계를 사용한다. 상기 한 방법들의 각각은 필요한 하드웨어 비용이 있지만, 개별의 qPCR 분석의 비용은 상대적이며낮은. 이 프로토콜은 마이크로 유체 실시간 PCR 기기의 제조업체 (프로토콜 ADP 41, 플루)에 의해 제안 된 하나에서 적응된다. PCR을 기반 접근 방식의 각 증명서의 절대 수의 추정을 가능하게하기 위해, 우리는 여러 실험을 통해 사용할 수있는 준비된 표적 유전자의 증폭의 내부 통제의 사용을 할 수있는 프로토콜을 확장했다. 이 기술의 일례로서, MCF-7 인간 유방암 세포에서 p53 유전자에 의해 조절 유전자 발현의 정량화 11를 설명한다. 세포는 DNA 이중 가닥 휴식을 유도하는 화학 제로 도전. 이전의 연구는 DNA 이중 가닥 나누기에 p53의 응답이 모두 p53의 수준 (12)의 측면에서 별개의 표적 유전자 (11)의 활성화에 개별 셀의 이질성의 큰 거래를 나타내는 것으로 나타났습니다. 또한, p53의 100 개 이상의 발현을 조절세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 13, 14을 포함한 다수의 다운 스트림 경로에 관여 표적 유전자를 잘 특성화. 각 세포에서 p53에 매개 반응은 복잡하고 변수 모두이기 때문에, 접근법에서 시스템 이익 분석은 거의 100 표적 유전자는 예컨대 이하에 설명하는 개별 세포를 동시에 탐색 할 수있다. (예 : 단일 셀 분리 및 용해를위한 대안의 방법)를 약간의 수정 프로토콜 용이 포유 동물 세포 유형 성적 및 세포 반응의 다양한 연구에 적용 할 수 있습니다. 적절한 사전 준비로, 세포 선별 유전자 발현 측정 라운드는 3 일 동안이 프로토콜에 따라 수행 될 수있다. 다음 타이밍 제안 : 사전에 관심있는 성적표를 선택 파악하고 그 transcr에서의 cDNA를 증폭 프라이머 쌍을 확인IPTS, 그리고 표준과 그 프라이머를 이용하여 프라이머 믹스를 준비합니다. 1 일에, 세포 치료, 수확을 다음과 세포를 분류, 역전사 및 특정 대상 증폭을 수행하고, 비법 인 프라이머를 제거하는 엑소 뉴 클레아 제와 샘플을 취급합니다. 제 2 일에, qPCR에를 사용하여 정렬 세포에 대한 품질 관리를 수행합니다. 마지막 3 일에 qPCR에 미세 유체를 이용하여 정렬 세포에서 유전자 발현을 측정한다. 그림 1은 관련된 단계를 요약 한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제가 포함된 고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT 고감도 dsDNA 분석 키트</td><td>써모피셔</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2.0ml 저접착 미세 원심 분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA 현탁액 버퍼</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0.2ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR 튜브</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 동적 어레이 DNA 결합 염료 샘플 및 분석 로딩 시약 키트</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 배지</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 인증(미국)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제 솔루션</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatin</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect 원스텝 qRT-PCR 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal 밀봉 필름, 멸균</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.05%</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>엑소뉴클레아제 I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (loading machine)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark 또는 BioMark HD(미세유체 qPCR 기계)</td><td>플루이다임</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실시간 PCR 분석 소프트웨어&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 소프트웨어</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

내부 기준에 facs 및 qpcr에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

세포의 벌크 집단에서 유전자 발현을 측정하면 해당 집단 내에서 개별 세포의 상당한 전사체 변이를 모호하게 할 수 있습니다. 단일 세포 유전자 발현 측정은 유전자 발현에서 잡음의 역할을 평가하고, 유전자 쌍 발현의 상관 관계를 식별하고, 자극에 다르게 반응하는 세포의 하위 집단을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 조직 배양에서 성장하는 집단에서 분리된 단일 포유류 세포에서 최대 96개의 유전자 발현을 측정하는 절차를 설명합니다. 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 용해 완충액으로 분류되며, 관심 mRNA 종은 역전사 및 증폭됩니다. 그런 다음 한 번에 최대 96개의 샘플에 대해 최대 96개의 qPCR 분석을 수행하는 미세유체 real-time PCR 기계를 사용하여 유전자 발현을 측정합니다. 또한 각 전사체의 절대 수를 추정할 수 있도록 PCR 앰플리콘 표준물질의 생성 및 사용에 대해서도 설명합니다. 단일 세포에서 유전자 발현을 측정하는 다른 방법과 비교하여, 이 접근법은 RNA-Seq보다 저렴한 비용으로 RNA FISH보다 더 뚜렷한 전사체를 정량화할 수 있습니다.

프로토콜의 일반적인 개요는 세포 치료, FACS에 의해 단일 세포를 분리하는 단계를 포함한도 1에 도시 된 생성 및 단일 세포 용 해물, 단일 세포의 cDNA 라이브러리 확인의으로부터의 cDNA 라이브러리의 프리 앰프 정렬 웰 및 qPCR에 의한 유전자 발현의 측정. 단일 셀 분리 및 유전자 발현 분석을위한 준비에있어서, 먼저 각각의 관심 대상 유전자 유효 올리고 뉴클레오티드 프라이머 쌍을 식별 할 필요가있다. 그림 2는 프라이머 품질 관리 방법의 두 가지 예를 보여줍니다. 용융 곡선은 프라이머 쌍은 테스트중인과 qPCR에 다음 생성됩니다. 유효한 프라이머는 단일 피크 (도 2A, 녹색 곡선)과 용융 곡선을 초래한다. 여러 봉우리 (그림 2A,</stron...

우리는 단일 포유류 세포를 분류하고 각 세포에서 최대 96개의 관심 대상 유전자의 발현을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법에는 절대 전사체 수를 추정할 수 있도록 내부 qPCR 표준을 사용하는 것이 포함됩니다.

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 내부 표준물질을 이용한 미세유체 qPCR을 통해 개별 세포 내의 mRNA 수준을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 세포 집단이 자극에 대해 특성적으로 서로 다른 방식으로 반응하는지 여부와 같이 단일 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포에서 RNA-Seq보다 낮은 비용으로 RNA FISH보다 더 많은 유전자의 발현을 측정할 수 있다는 점입니다.우리는 먼저 마이크로플루이딕 qPCR을 통해 단일 세포의 유전자 발현을 측정하는 프로토콜을 탐구하던 중 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 우리는 기존 방법들을 수정하여 단일 세포 내 서로 다른 전사체의 절대적인 수를 더 정확하게 추정하고자 했습니다. 세포 분류 절차의 시연은 저희 연구실에서 사용하는 유세포 분석 시설의 담당자인 William Telford가 진행하겠습니다.텍스트 프로토콜에 따라 표적 유전자의 앰플리콘을 생성하고 정제한 후, 각 정제된 앰플리콘 18 µL를 2.0 mL low binding 미세원심분리 튜브에 혼합하고, 각 앰플리콘의 농도가 5×10⁶ molecules/µL가 되도록 DNA suspension buffer를 1,800 µL까지 추가합니다. 5e6 표준액을 충분히 볼텍싱한 후, 20 µL씩 low binding PCR 튜브에 분주합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 MCF7 p53-Venus 세포를 플레이팅한 후, 세포에 400 ng/mL의 neocarzinostatin을 첨가하고 3, 8.5, 14 또는 24시간 동안 처리합니다.용해 버퍼를 만들려면 이 표에 나열된 시약들을 혼합하십시오. 92.4 µL의 버퍼를 별도의 튜브로 옮겨 앰플리콘 표준물질용 용해 버퍼로 사용하십시오. 나머지 용해 버퍼는 세포용으로 사용됩니다.텍스트 프로토콜에 따라 E.coli DNA를 준비하여 세포 용해 버퍼에 첨가합니다. 표준 물질을 준비하려면, 6개의 저흡착 원심 분리 튜브에 라벨을 붙입니다. 5e5 튜브에 DNA 현탁 버퍼 90 microliters를 넣습니다.6.2 pg/µL의 E.coli DNA가 포함된 완충액 90 µL를 나머지 5개의 튜브에 각각 넣고 모든 튜브를 얼음 위에 둡니다. 보관 중인 5e6 표준물질 분취액을 꺼낸 후, 튜브를 짧게 볼텍싱하고 원심분리하여 액체가 튜브 바닥에 모이게 합니다. 그 다음 저흡착 피펫 팁을 사용하여 5e6 표준물질 10 µL를 5e5 튜브에 추가합니다. 볼텍싱하고 원심분리한 후 튜브를 다시 얼음 위에 둡니다.다음으로, 5e5 튜브에서 10 µL를 취해 5e4 튜브에 넣은 후, 튜브를 짧게 볼텍싱하고 원심분리한 뒤 다시 얼음에 놓습니다. 모든 튜브에 표준액 희석액이 들어갈 때까지 이전 튜브에서 10 µL씩 옮기며 연속 희석을 반복합니다. 용해 버퍼(lysis buffer)가 담긴 PCR 튜브를 준비한 후, 12채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트의 처음 7개 행의 각 웰에 PCR 튜브 열에서 세포 용해 버퍼 9 µL를 분주합니다.플레이트의 마지막 행의 각 웰에 7 µL의 표준 용해 버퍼(standard lysis buffer)를 분주한 다음, 저결합 파이펫 팁을 사용하여 플레이트 맵에 따라 마지막 행의 각 웰에 표준 시료 2 µL를 추가합니다. 10 cell 및 100 cell 웰에 3.1 pg/µL 농도의 E.coli DNA 2 µL를 넣고, no cell 웰에는 6.2 pg/µL 농도의 E.coli DNA 2 µL를 넣습니다. 형광 활성 세포 분류기(fluorescence activated cell sorter)가 플레이트 맵에 따라 96-웰 플레이트로 분류하도록 프로그래밍한 후, 기기를 조준하기 위해 빈 PCR 플레이트를 밀봉하고 테스트 스트림을 사용하여 빈 플레이트의 밀봉 부위로 액적과 PBS를 분류합니다.드롭렛이 정확한 위치에 떨어지지 않는 경우, 씰 표면에서 드롭렛을 닦아내고 장비 제조사의 지침에 따라 셀 소터를 재교정한 후, 소트 스트림의 드롭렛이 정확하게 증착될 때까지 이 과정을 반복하십시오. 트립신화를 통해 세포를 회수하여 2% FBS가 함유된 PBS 0.5 milliliters에 재현탁한 후, 유세포 분석용 튜브로 옮깁니다. 세포를 소팅하려면 세포 현탁액이 담긴 튜브를 셀 소터에 삽입하고, 용해 버퍼 플레이트의 씰을 연 다음, 플레이트 맵에 따라 표적 세포를 플레이트에 조심스럽게 소팅하십시오.단일 세포가 최대 순도로 분리되도록 하려면, 장비를 단일 세포 모드로 작동시키고 전방 산란광 및 측방 산란광을 기반으로 한 표준 유세포 분석 게이팅을 사용하십시오. 분석 후, 새로운 멸균 열 밀봉 씰을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 4 °C에서 400 ×g로 1분 동안 원심 분리한 다음, 플레이트를 열 순환기에 넣고 이전에 준비한 RT-STA 프로그램을 실행하십시오. RT-STA가 완료된 플레이트를 원심 분리한 후, 12채널 피펫을 사용하여 희석된 exonuclease I 3.6 µL를 플레이트의 각 웰에 분주하십시오.플레이트를 밀봉하고 짧게 원심분리한 후, 플레이트를 서멀 사이클러에 넣고 exo I 프로그램을 실행합니다. 각 샘플의 하우스키핑 유전자 발현을 측정하기 위해, 선택한 하우스키핑 유전자 중 하나의 프라이머를 사용하여 96회 반응분량의 900 µL DNA 결합 염료 qPCR 마스터 믹스를 준비합니다. 96웰 PCR 플레이트의 모든 웰에 마스터 믹스 9 µL를 분주한 다음, 샘플 플레이트의 샘플 1 µL를 PCR 플레이트의 해당 웰에 추가합니다.마스터 믹스 제조사가 권장하는 열 순환 프로토콜 또는 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 기기에서 플레이트를 가동한 후, 샘플을 분석하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플 혼합 플레이트 맵을 작성하십시오. 플레이트에 'sample mixes'라고 표시한 다음, 8채널 파이펫을 사용하여 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 샘플 로딩 시약 혼합물 3.3 µL를 분주하십시오. 각 샘플 PCR 플레이트를 10초 동안 볼텍싱하고 500 ×g에서 10초 동안 원심 분리하십시오.커버를 제거하고, 각 양성 단일 세포 샘플 2.7 µL를 플레이트 맵에 표시된 단일 세포 웰에 해당하는 샘플 혼합 플레이트의 웰로 옮깁니다. 새 마이크로플루이딕 qPCR 칩 바닥의 스티커를 제거한 다음, 캡이 씌워진 상태의 컨트롤 라인 액체가 든 시린지를 사용하여 각 어큐뮬레이터 스프링을 눌러 푼 뒤, 각 어큐뮬레이터에 컨트롤 라인 액체 100~200 µL를 주입합니다. 칩을 로딩 머신에 삽입하고 프라이밍 스크립트를 실행한 후, 8채널 피펫을 사용하여 각 어세이 혼합물 4.5 µL를 마이크로플루이딕 qPCR 칩의 왼쪽에 옮깁니다.웰 바닥에 기포가 생기지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 기포가 생기면 시료 로딩 과정에서 문제가 발생할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 피펫 팁을 웰의 벽면에 대고, 1단(first stop)까지만 피펫팅하십시오.각 샘플 믹스 4.5 µL를 마이크로플루이딕 qPCR 칩의 오른쪽에 옮긴 후, 칩을 로딩 기기에 삽입하고 로드 믹스 스크립트를 실행하십시오. 로드 믹스 스크립트가 완료되면 칩 전체에 로딩 문제가 있음을 나타내는 선이 없는지 확인한 다음, 테이프를 사용하여 칩에서 먼지 입자를 조심스럽게 제거하십시오. 그 후 칩을 마이크로플루이딕 실시간 PCR 기기에 삽입하고 데이터 수집 스크립트를 실행하십시오. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석하십시오.이 그림은 단일 세포가 포함된 웰을 결정하기 위해 qPCR로 측정한 하우스키핑 유전자의 발현 수준을 보여줍니다. 세포가 포함된 샘플은 CT 값이 낮습니다. 세포가 없는 샘플은 CT 값이 훨씬 더 높습니다.앰플리콘 표준물질(amplicon standard)을 위한 웰들은 균등한 간격의 증폭 곡선을 보여야 합니다. 또한 세포 없음(no cell), 10개 세포 및 100개 세포 웰의 곡선들이 명확하게 구분되어야 합니다. 실제 세포를 나타내는 시드 DNA(Seed DNA) 샘플들은 여러 개의 분류된 96-웰 플레이트에서 선택적으로 추출되어 마이크로플루이딕 qPCR 준비를 위해 단일 플레이트로 통합됩니다.이 히트맵은 마이크로플루이딕 qPCR 결과를 요약한 것입니다. 각 열의 색상 변화는 서로 다른 세포 간의 각 유전자 발현 변동성을 나타냅니다. 다른 행보다 훨씬 어두운 두 개의 행은 좋지 않은 샘플일 가능성이 높습니다.이 절차를 수행하는 동안, 특히 표준물질과 용해 버퍼(lysis buffer)를 제조할 때 작업 구역을 RNase 및 DNA가 없는 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 PCR 전 단계들은 오염에 민감합니다. 이 영상을 시청한 후에는 개별 세포 내에서 여러 표적 유전자의 발현량을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차에 따라, 단일 세포에서의 mRNA 풍부도 측정을 검증하기 위해 단일 분자 RNA FISH와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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