내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

이 절차의 전반적인 목표는 내부 표준물질과 함께 미세유체 qPCR을 사용하여 개별 세포의 mRNA 수준을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 세포의 세포 집단이 특징적으로 다른 방식으로 자극에 반응하는지 여부와 같은 단일 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포에서 RNA-Seq보다 저렴한 비용으로 RNA FISH보다 더 많은 유전자의 발현을 측정할 수 있다는 것입니다.

우리는 미세유체 qPCR에 의해 단일 세포에서 유전자 발현을 측정하기 위한 프로토콜을 탐색했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 가졌습니다. 우리는 단일 세포에서 서로 다른 전사체의 절대 수를 보다 정확하게 추정하기 위해 기존 방법을 수정하고 싶었습니다. 세포 분류 절차를 시연하는 사람은 제 연구실에서 사용하는 유세포 분석 시설의 관리자인 William Telford입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 관심 유전자에서 앰플리콘을 생성하고 정제한 후, 2.0 밀리리터 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 각 정제된 앰플리콘 18 마이크로리터를 결합한 다음 각 앰플리콘의 농도가 마이크로리터당 6번째 분자의 5 곱하기 10이 되도록 DNA 현탁액을 최대 1, 800 마이크로리터까지 추가합니다. 5e6 표준물질을 완전히 와류로 가열하고 결합력이 낮은 PCR 튜브에서 20마이크로리터 분취량으로 나눕니다. 텍스트 프로토콜에 따라 MCF7 p53-Venus 세포를 도금한 후 세포에 네오카르지노스타틴 1밀리리터당 400나노그램을 첨가하고 3시간, 8.5시간, 14시간 또는 24시간 동안 처리합니다.

용해 버퍼를 만들려면 이 표에 나열된 시약을 결합하십시오. 92.4 μl의 완충액을 별도의 튜브로 전달하여 앰플리콘 표준물질에 대한 용해 완충액 역할을 합니다. 나머지 용해 버퍼는 세포용입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 E.coli DNA를 준비하고 세포의 용해 버퍼에 추가합니다. 표준물질을 준비하려면 결합력이 낮은 원심분리 튜브 6개에 라벨을 부착합니다. 90마이크로리터의 DNA 현탁액을 5e5 튜브에 추가합니다.

E.coli DNA가 마이크로리터당 6.2피코그램을 함유한 90마이크로리터의 완충액을 다른 5개의 튜브 각각에 추가하고 모든 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 보관에서 5e6 표준의 부분 표본을 제거한 후 튜브를 잠시 소용돌이친 다음 회전시켜 액체가 튜브 바닥에 있는지 확인한 다음 결합이 낮은 피펫 팁을 사용하여 5e6 표준 10마이크로리터를 5e5 튜브에 추가합니다. 소용돌이치고, 회전하고, 튜브를 얼음 위에 다시 올려놓으세요.

다음으로, 5e5 튜브에서 5e4 튜브로 10마이크로리터를 피펫팅한 다음 튜브를 잠시 와류로 회전시키고 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다. 각 튜브에 대해 직렬 희석을 반복하여 모든 튜브가 표준의 희석을 가질 때까지 이전 튜브에서 10마이크로리터를 받습니다. 용해 완충액이 있는 PCR 튜브를 준비한 후 12채널 피펫을 사용하여 PCR 튜브 열에서 9마이크로리터의 세포 용해 완충액을 PCR 플레이트의 처음 7개 열의 각 웰로 분배합니다.

7마이크로리터의 표준 용해 완충액을 플레이트의 마지막 행의 각 웰에 분배한 다음 낮은 결합 피펫 팁을 사용하여 플레이트 맵에 따라 하단 행의 각 웰에 2마이크로리터의 표준 용액을 추가합니다. E.coli DNA 마이크로리터당 3.1피코그램 2마이크로리터를 10개의 세포 웰과 100개의 셀 웰에 추가한 다음 E.coli DNA의 마이크로리터당 6.2피코그램 2마이크로리터를 무세포 웰에 추가합니다. 플레이트 맵에 따라 96웰 플레이트로 분류하도록 형광 활성화 세포 분류기를 프로그래밍한 후 기계를 조준하기 위해 빈 PCR 플레이트를 밀봉하고 테스트 스트림을 사용하여 빈 플레이트의 밀봉에 있는 방울과 PBS를 분류합니다.

방울이 올바른 위치에 떨어지지 않으면 밀봉 표면에서 방울을 닦아내고 기계 제조업체의 지침에 따라 세포 분류기를 재보정한 다음 분류 스트림의 방울이 올바르게 침전될 때까지 반복합니다. 트립신화(trypsinization)를 통해 세포를 채취하고 2%FBS가 포함된 0.5ml의 PBS에 다시 현탁시킨 다음 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 세포를 분류하려면 세포 현탁액이 있는 튜브를 세포 분류기에 삽입하고, 용해 완충액 플레이트의 씰을 열고, 플레이트 맵에 따라 관심 세포를 플레이트로 조심스럽게 분류합니다.

단일 세포가 최대 순도로 분류되도록 하려면 단일 세포 모드에서 기계를 실행하고 전방 및 측면 산란을 기반으로 하는 표준 유세포 분석 게이팅을 사용하십시오. 실행 후 새로운 멸균 열 밀봉을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 400회 g에서 섭씨 4도 동안 1분 동안 원심분리한 다음 플레이트를 열 순환기에 넣고 이전에 준비된 RT-STA 프로그램을 실행합니다. 완성된 RT-STA 플레이트를 회전시킨 후 12채널 피펫을 사용하여 3.6마이크로리터의 묽은 엑소뉴클레아제 I을 플레이트의 각 웰에 분배합니다.

플레이트를 밀봉하고 잠시 회전시킨 다음 플레이트를 열 순환기에 넣고 exo I 프로그램을 실행합니다. 각 샘플에서 하우스키핑 유전자 발현을 측정하기 위해 선택한 하우스키핑 유전자 중 하나의 프라이머를 사용하여 96회 반응에 대한 900마이크로리터의 DNA 결합 염료 qPCR 마스터 믹스를 준비합니다. 96 웰 PCR 플레이트의 모든 웰에 9마이크로리터의 마스터 믹스를 분배한 다음 샘플 플레이트에서 PCR 플레이트의 해당 웰에 1마이크로리터의 샘플을 추가합니다.

마스터 믹스 제조업체가 제안한 열 사이클링 프로토콜을 사용하거나 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 기계에서 플레이트를 실행한 다음 샘플을 분석하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플 믹스 플레이트 맵을 만듭니다. 플레이트 샘플 혼합물에 라벨을 붙인 다음 8채널 피펫을 사용하여 3.3마이크로리터의 마스터 믹스 샘플 로딩 시약 혼합물을 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 샘플의 각 PCR 플레이트에 대해 플레이트를 10초 동안 소용돌이치고 10초 동안 500회 g로 회전시킵니다.

덮개를 제거하고 각 양성 1 세포 샘플의 2.7 마이크로 리터를 플레이트 맵에 표시된 1 세포 웰에 대한 샘플 믹스 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 새로운 미세유체 qPCR 칩의 바닥에서 스티커를 떼어낸 다음 캡을 씌운 상태에서 제어 라인 유체 주사기를 사용하여 각 어큐뮬레이터 스프링을 아래로 눌러 풀고 각 어큐뮬레이터에 100-200마이크로리터의 제어 라인 유체를 주입합니다. 로딩 기계에 칩을 삽입하고 프라임 스크립트를 실행한 다음 8채널 피펫을 사용하여 각 분석 혼합물 4.5마이크로리터를 미세유체 qPCR 칩의 왼쪽으로 옮깁니다.

우물 바닥에 기포가 생성되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이로 인해 로딩 문제가 발생합니다. 이를 방지하려면 피펫 팁을 웰 측면에 터치한 다음 첫 번째 정지에만 피펫을 터치하십시오.

각 샘플 믹스 4.5마이크로리터를 미세유체 qPCR 칩의 오른쪽으로 옮긴 다음 칩을 로딩 기계에 삽입하고 로드 믹스 스크립트를 실행합니다. 로드 믹스 스크립트가 완료되면 칩 건너편에 로딩 문제를 나타내는 선이 없는지 확인한 다음 테이프를 사용하여 칩에서 먼지 입자를 조심스럽게 제거한 다음 칩을 미세유체 실시간 PCR 기계에 삽입하고 데이터 수집 스크립트를 실행합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다.

이 그림은 어떤 웰이 단일 세포를 받았는지 결정하기 위해 qPCR로 측정한 하우스키핑 유전자의 발현 수준을 보여줍니다. 세포를 받은 샘플은 CT 값이 낮습니다. 세포가 없는 샘플은 CT 값이 훨씬 더 높습니다.

앰플리콘 표준물질에 대한 웰은 균일한 간격의 증폭 곡선을 보여야 합니다. 또한 no cell, 10 cell 및 100 cell wells에 대한 곡선에서 명확한 분리가 있어야 합니다. 실제 세포를 나타내는 seed DNA 샘플은 여러 개의 정렬된 96웰 플레이트에서 선별된 후 단일 플레이트에 결합되어 미세유체 qPCR을 준비합니다.

이 히트 맵은 미세유체 qPCR 결과를 요약합니다. 각 열의 색상 변화는 서로 다른 세포 간의 각 유전자 발현의 가변성을 보여줍니다. 나머지 행보다 훨씬 어두운 두 행은 잘못된 샘플을 나타낼 가능성이 높습니다.

이 절차를 시도하는 동안, 특히 표준물질 및 용해 버퍼를 만들 때 작업 영역 RNase와 DNA를 사용하지 않는 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 pre-PCR 부분은 오염에 민감합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 개별 세포에서 관심 있는 여러 유전자의 발현을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차에 따라 단일 분자 RNA FISH와 같은 다른 방법을 수행하여 단일 세포의 mRNA 풍부도 측정을 검증할 수 있습니다.