쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

이 비디오의 전반적인 목표는 재현 가능한 경공막 망막하 주사 기술을 도입하여 인간 망막 색소 상피 또는 RPE 세포를 망막 손상 위험을 최소화하면서 설치류 눈의 망막하 공간으로 전달하는 것입니다. 이것은 먼저 변연 뒤쪽의 측두결막을 작게 절개하여 밑에 있는 공막을 노출시킴으로써 이루어집니다. 그런 다음 비스듬한 31게이지 인슐린 바늘을 사용하여 500미크론 또는 팁의 약 절반 바늘을 비스듬한 면이 위를 향하도록 조직에 삽입하여 파일럿 구멍을 만듭니다.

다음으로, 주사기에 부착된 비스듬한 33게이지 주사 바늘을 파일럿 구멍으로 안내하고 특정 각도와 깊이로 삽입하며, 바늘이 들어가고 스티치나 조직 접착제가 필요하지 않은 후 주입 구멍이 자체 밀봉됩니다. 퇴행성 망막병증은 다양한 망막 세포 유형과 관련된 광범위한 질병으로 구성됩니다. 전 세계적으로 가장 흔한 질병인 노화 관련 황반변성(AMD)은 노인들 사이에서 발생하며 영구적인 실명으로 이어집니다.

AMD에서 발생하는 병리학적 변화는 망막 색소 상피 세포(RPE)의 초기 퇴행과 관련이 있습니다. RPE 손실은 망막 형광수용체 기능 장애 또는 사망으로 이어집니다. 초기 단계의 AMD에 대한 현재 약물 치료는 진행을 늦추거나 증상을 완화하는 데 국한되어 있습니다.

이는 망막의 제한된 재생 가능성과 결합되어 시력을 회복하기 위한 효과적인 치료법이 없다는 것을 의미합니다. 신경줄기세포연구소(Neural Stem Cell Institute)는 최근 RPE 세포 집단에서 성체 줄기세포 집단을 확인했습니다. 이 세포는 줄기 세포 대체 요법의 원료로 사용할 수 있습니다.

현재 본 연구소는 RPE 퇴행성 쥐 동물모델에서 RPE 줄기세포 이식 요법의 효능 및 안전성을 조사하기 위한 전임상 연구를 진행하고 있습니다. 이 연구에서는 경경 경막, 망막하 주사 기술을 사용하여 RPE 줄기 세포를 망막층과 RPE 층 사이의 쥐 눈에 전달합니다. 우리의 방법은 세포를 망막하 공간으로 성공적으로 전달할 수 있는 쉽고 신뢰할 수 있는 수단입니다.

다음과 같은 시약과 장비가 필요합니다. 10%페닐에프린으로 갓 만든 1%트로피카미드와 2.5%페닐에프린을 수술 당일 멸균 0.9%식염수로 희석하여 동공을 확장하는 데 사용합니다. 안약은 눈을 헹구고 수술하지 않은 눈을 촉촉하게 유지하는 데 사용됩니다.

수술 중 수술하지 않은 오른쪽 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 눈 윤활제가 사용됩니다.0.5%프로파라카인은 국소 마취제로 사용됩니다. OCT 스캔 중 수술한 왼쪽 눈에 눈 윤활제가 사용됩니다.

이 기술에는 최소한의 재료와 장비가 필요합니다. 이 기술에 사용되는 장비 및 시약에 대한 자세한 정보는 프로토콜에 요약되어 있습니다. 10마이크로리터 주사기는 세포를 주입하는 데 사용됩니다.

주입하기 전에 먼저 주입기를 조립하고 에탄올로 살균합니다. 멸균된 33게이지 베벨 바늘을 주사기에 삽입하고 단단히 조여 인젝터를 조립합니다. 인젝터를 100% 에탄올, 70% 에탄올, 탈이온수 증류수로 각각 5-6회 순차적으로 세척합니다.

바늘 끝에서 600미크론 떨어진 위치에 멸균된 검은색 마커 펜으로 주입기 바늘을 표시합니다. 주입 사용을 위해 인젝터를 마이크로 매니퓰레이터에 올려 놓으십시오. 인간 RPE 세포는 수술 당일에 준비하여 얼음물 혼합물에 보관합니다.

세포 현탁액을 부드럽게 분쇄하고 인젝터에 1.2 마이크로 리터를로드하면 추가 0.2 마이크로 리터를 사용하여 주입 역류를 보상하여 1 마이크로 리터 주입의 부피를 보장합니다. 마이크로매니퓰레이터의 세포 현탁액으로 채워진 주입기를 교체하거나 RPE 세포가 용액에서 쉽게 가라앉는 경향이 있으므로 보조자가 수직으로 잡도록 합니다. 해부 현미경의 무대 아래에 발열 패드가 있는 멸균 수술 패드를 배치하여 멸균 수술 부위를 준비합니다.

동물을 대상으로 하는 모든 절차는 올버니에 있는 뉴욕주립대학교(State University of New York at Albany)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 동물의 무게를 측정하고 여기에 표시된 대로 isoflurane 증기 전달 시스템을 사용하여 마취합니다. 마취가 끝나면 쥐를 수술 부위로 옮기고 이소플루란 시스템에 연결된 콧방울에 넣어 마취를 유지합니다.

쥐의 몸을 거즈로 덮고 쥐의 발가락을 꼬집어 완전한 마취를 확인합니다. 쥐의 오른쪽 눈에 눈 윤활제를 한 방울 바르고, 쥐의 왼쪽 눈은 주사를 맞을 천장을 향하게 하고, 머리는 외과 의사의 오른손 쪽으로, 다시 외과 의사를 향하게 합니다. 눈을 덮고 있는 수염을 모두 잘라냅니다.

왼쪽 눈의 측두 쪽에 소량의 안약을 떨어뜨리고 면 어플리케이터로 코 쪽의 여분을 모아 눈을 헹굽니다. 주입 후 광간섭 단층 촬영 또는 OCT 검사를 위해 각각 1방울씩 적용하여 1%트로피카미드, 2.5%페닐에프린으로 동공을 확장합니다. 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 안약 한 방울을 바르십시오.

프로파라카인 한 방울을 눈에 바르고 화장솜 어플리케이터로 여분을 제거합니다. 눈 주위의 피부를 4-6회 부드럽게 마사지하여 눈꺼풀을 열어 눈구멍에서 일시적으로 약간 튀어나와 주사기가 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 힘으로 결막을 엿가장자리 뒤쪽으로 잡고 안구 근육을 손상시키지 않고 수술을 받을 수 있는 더 나은 지점을 찾기 위해 눈을 회전시킵니다.

결막을 부드럽게 들어 올려 텐트를 만들고 눈을 코로 돌립니다. 그런 다음 가위를 사용하여 텐트 상단을 잘라 결막에 작은 구멍을 만들고 공막을 노출시킵니다. 다음으로, 집게를 사용하여 윤부 옆에 있는 결막 구멍의 가장자리를 잡고 눈을 비강 방향으로 회전하여 동공 축이 지면을 기준으로 약 30도 각도가 되도록 합니다.

멸균 베벨 31게이지 인슐린 바늘을 사용하여 비스벨이 위를 가리키고 팁의 절반 또는 약 500미크론이 조직에 삽입되어 공막 코어 복합체를 관통하여 주입을 위한 파일럿 구멍을 만듭니다. 인슐린 주사를 조심스럽게 빼내면 소량의 피가 흘러나오는 것을 볼 수 있습니다. 필요한 경우 구멍을 뚫고 출혈을 멈추기 위해 눈 창을 적용할 수 있습니다.

500미크론 길이의 바늘을 조직에 완전히 삽입하고 조직으로 덮인 바늘의 지점과 바늘의 검은색 마커 지점 사이에 100마이크로 거리를 남겨두어 공막의 국소 표면에 대해 약 10-15도 각도로 RPE 세포 장전 주사 바늘을 파일럿 구멍에 도달하도록 유도합니다. 조수에게 주사기의 플런저를 눌러 적절한 양의 세포를 주입하도록 지시합니다. 주입 후 25-30초 동안 주입기를 제자리에 고정한 다음 주입기를 천천히 집어넣습니다.

주입 구멍은 자동으로 밀봉되며 소량의 약 0.2마이크로리터의 역류가 일반적으로 관찰됩니다. 멸균 안약으로 주사 부위를 세 번 헹구고 면 어플리케이터로 여분을 모으십시오. 수술한 눈에 윤활유 한 방울을 바르고 쥐를 OCT 스테이션으로 옮겨 이식된 세포의 위치와 망막하 기포의 크기를 검사합니다.

OCT가 끝나면 쥐의 체온을 유지하기 위해 쥐를 열 램프 아래의 회복 케이지로 되돌립니다. 쥐가 마취에서 나왔는지 관찰하고 고통의 징후가 있는지 매일 모니터링하십시오. 우려 사항이 있는 경우 즉시 수의사에게 알리십시오.

우리의 기술을 사용하여 우리는 인간 RPE 세포를 망막하 공간으로 일관되고 성공적으로 전달했습니다. 이식 직후, 이식된 세포에 의해 생성된 주사 부위와 망막하 기포를 관찰하기 위해 OCT 검사를 실시했습니다. 이것은 주사의 품질과 망막 손상 또는 출혈의 정도를 평가하기 위한 좋은 선별 도구 역할을 합니다.

주사 부위 주변의 밝은 빛 반사와 세포 현탁액으로 채워진 망막하 블립(subretinal bleb)이 OCT 스캐닝에서 볼 수 있습니다. 성공적인 주사에서 주사 부위 또는 유리체강 내 공간 주변에서 볼 수 있는 출혈, 안액 누출 또는 망막 박리가 없어 주사로 인한 외상이 최소화되었음을 보여줍니다. 수술된 쥐의 안구는 이식 후 7일째에 면역조직학적 분석을 위해 핵을 형성하고, 고정하고, 절편화했습니다.

이식된 세포를 검출하기 위해 인간 핵 마커인 Hunu와 RPE 세포 마커인 OTX2를 사용했습니다. 두 마커의 긍정적인 진술은 이식된 인간 RPE 세포가 쥐 눈의 망막하 공간에 위치한다는 것을 보여주었습니다. 이 경공막하 주사 기술은 간단하고 배우기 쉽습니다.

그것은 수술 외상을 덜 일으키고 신경 망막을 파괴하지 않고 주사 바늘을 안벽의 바깥층을 통과시켜 망막을 온전하게 유지합니다. 파일럿 바늘과 주사 바늘이 조직 안으로 들어가기 위한 정량화된 방울과 주입 중에 사용되는 각도는 훨씬 더 높은 정확도와 성공률로 세포를 망막하 공간으로 안정적으로 전달할 수 있도록 합니다. 이 주입 방법을 통해 인간 RPE 줄기세포 유래 RPE 세포를 RCS 쥐의 망막하 공간으로 일관되고 성공적으로 전달했습니다.

이 절차는 비디오를 보는 사람이라면 누구나 쉽게 반복할 수 있습니다.