Name: 쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: 학습하세요 쥐 눈에 망막 안료 상피 세포를 안전하게 이식하는 경공막 하망막 주사 기법을. 최소 침습으로 재현 가능한 줄기세포 치료법을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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패티 Lederman RPE 세포 준비에 대 한 수술과 수잔 보든에 그녀의 지원에 대 한 감사 하 길. 우리는 또한이 프로젝트에 대 한 자금에 대 한 NYSTEM C028504를 인정 합니다. 저스틴 디 밀러 NIH에서 지원 되는 F32EY025931를 부여 합니다.

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 뉴욕 주립 대학의 알바 니에 의해 승인 되었습니다.
1. 사전 사출 준비
<ol><li>
HRPESC-RPE 세포 현 탁 액의 준비 참고: 모든 다음 단계 살 균 조직 문화 후드에서 수행 됩니다 및 기본적인 살 균 기술 가진 친밀 필요 합니다.<ol>
<li>기본 hRPE 세포 격리 인간 기증자에서 눈 세 50-90 년과 24-잘 접시12문화 셀. 통로 1에 셀 cryopreserve, 필요에 따라 해 동 및 문화 통로 2 (P2) 세포 주입에 대 한 4-5 주 (그림 1A).</li>
		<li>12 문화 매체 제거 하 고 부드럽게 린스 우물 500 µ L로 두 번 미리 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 칼슘 및 마그네슘 없이 X 1을 예 열 (1 DPBS CMF x) 1을 추가 하 여 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 고 진공을 사용 하 여 그것을 제거 하는 것은 우물에 X DPBS CMF.</li>
		<li>각 우물에 300 µ L 트립 신/DNAse를 추가 합니다. 트립 신/DNAse (4 구 0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL 당 DNase) 셀 해리를 37 ° C에서 4 분에 hRPESC-RPE 세포를 품 어.</li>
		<li>그들은 반올림 있는지 현미경 셀을 확인 합니다. 계속 그들은 아직 둥근 하지 경우 트립 신/DNase를 추가 2 분 동안에 세포를 품 어.</li>
		<li>셀 반올림 됩니다, 일단 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 triturate 우물에서 분리 된 세포를 트립 신/DNase 비활성화를 미리 데워 진된 문화 매체의 동일한 볼륨 15 mL 원뿔 튜브로 분리 된 셀을 포함 하는 트립 신/DNase 전송.</li>
		<li>미리 데워 진 1 우물 린스 부드럽게 위아래로 잘;의 가장자리의 주위에 특히 pipetting으로 X DPBS CMF 그런 다음 이전 원뿔 관에 이러한 셀을 추가 합니다.</li>
		<li>286 x g 작은 셀을 4 ° C에서 5 분에 원뿔 튜브 원심</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 1 mL 문화 매체와 셀 resuspend.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>작은 셀을 4 ° C에서 5 분에 대 한 286 x g에서 원심.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 셀에 살 균 균형 소금 솔루션 (BSS) 50, 000 셀 / µ L에서 (subretinal 주입 중 1 µ L 볼륨에 50, 000 셀을 제공)을 resuspend.</li>
		<li>1.7 mL microcentrifuge 튜브와 얼음 물 혼합물에 주입 사용까지 최종 세포 현 탁 액 (CS)를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 인젝터의 준비
	<ol>
<li>주입 주사기와 인젝터를 밀접 하 게 나사에 메 마른 33-게이지 경사진된 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>5-6 번 100% 에탄올과 인젝터를 플러시.</li>
		<li>5-6 번 70% 에탄올과 인젝터를 플러시.</li>
		<li>플러시 BSS와 인젝터 5-6 시간.</li>
		<li>인젝터 바늘 메 마른 검은 마커 펜 (그림 1B) 해 현미경 바늘의 팁에서 600 µ m의 위치에 표시 합니다.</li>
		<li>인젝터 주입 micromanipulator 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. subretinal 주입
<ol><li>
외과 영역 및 동물 준비
	<ol>
<li>그리고 4-5 주 오래 된 RCS 쥐 (60-100 g)를 무게 isoflurane 증기 전달 시스템을 사용 하 여 anesthetize. 참고: 유도 마 취 5%에서 isoflurane 유량을 유지 합니다. 발을 눌러 마 취의 깊이 확인 하 고 수술 시 마 취 유지 보수에 대 한 2-3% 유량을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>메 마른 외과 영역을 설정 해 현미경의 스테이지 밑,가 열 패드와 멸 균 수술 드 레이프를 놓습니다.</li>
		<li>외과 영역에 쥐를 전송 및 마 취 유지 isoflurane 시스템에 연결 된 코 콘 쥐 장소.</li>
		<li>거 즈와 쥐의 시체를 커버. 전체 마 취를 확인 하는 쥐의 발가락을 꼬집어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
트랜스 scleral subretinal 주사 현미경
	<ol>
<li>쥐의 unoperated 눈에 한 방울 눈 윤 활 유를 적용 합니다.</li>
		<li>주입, 외과 의사의 오른손 쪽으로 그것의 머리 및 외과 의사를 향해 다시 천장에 직면 하는 왼쪽된 눈과 쥐의 오른쪽 면에 위치.</li>
		<li>작은 위로 눈을 커버 하는 어떤 수염을 잘라 주세요.</li>
		<li>왼쪽된 눈의 시간적 측면에서 눈 세척의 작은 금액을 똑 똑 하 고 눈을 씻어 하 면 주걱으로 비 강 측에 초과 수집 합니다.</li>
		<li>각각의 한 방울을 적용 하 여 주입 후 10 월 시험에 대 한 1 %tropicamide 및 2.5 %phenylephrine (갓 수술 당일 무 균 0.9% 식 염 수에 희석 하 여 10 %phenylephrine 만든)와 학생 같은데요.</li>
		<li>4-6 시간 눈 주위의 피부를 살짝 당겨 눈은 약간 proptosed 지역에서 limbus 후부에 쉽게 액세스할 수 있도록 눈 꺼 풀을 열고.</li>
		<li>눈 세척의 방울을 적용 하 고 눈을 촉촉한 유지.</li>
		<li>부드럽게 (준비 단계 1.1.12) CS를 triturate 하 고 1.2 µ L CS와 인젝터를 로드 합니다. 여분의 0.2 µ L 주입 역류에 대 한 보상 하는 데 사용 됩니다. 참고: 에 대 한 우리의 측정에 따라 5000-8000 셀 50, 000 셀 / µ L 셀 손실의 약 10-16%에 그의 주사와 역류에 손실 됩니다 및 0.2 µ L CS의 추가이 셀 손실 보상을 주입 했다.</li>
		<li>인젝터는 micromanipulator에 CS로 가득 놓습니다 (또는 그것을 잡고 보조) 세로로 RPE 세포에에서 쉽게 침 몰 경향이.</li>
		<li>눈에 방울 0.5 %proparacaine (지역 국 소 마 취 제)를 적용 하 고 초과 면 주걱으로 제거. 참고: 이 단계는 각 막 반사를 억제 하 고 깜박이 후속 단계에서 눈을 방지 해야 합니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여를 후부는 limbus 결 막, 눈 nasally, 회전 리프트 "텐트"를 만들려고 결.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 결 막에 작은 개통을 확인 하 고 기본 sclera를 노출 하는 "천막"의 상단을 잘라.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 나머지 결 한계는 limbus 옆의 가장자리 회전 눈 nasally 동 공 축 테이블 위쪽 (그림 1C)을 기준으로 약 30도의 각도에서를. 결 막의 지속적인 창과 바늘 삽입 하는 동안 카운터 힘을 제공 하 고 최적의 각도에서 눈을 유지 하기 위해 필요 합니다.</li>
		<li>세포 주입 안내 하는 구멍을 향하도록 팁의 개막과 함께 limbus를 후부 1200-1500 µ m에서 메 마른 경사진된 31 게이지 인슐린 바늘의 끝을 놓습니다.</li>
		<li>그것은 10-15도 sclera (의도 된 주사 사이트에서 가상 평면에 접선) 위에 인슐린 바늘의 각도 조정 합니다. 천천히 sclera 맥락 막 복잡 한 약 500 µ m의 바늘 깊이 침투. 색칠 한 쥐에서 바늘 끝 사라질 것 이다 '' 안료 맥락 막 아래. 여기에서 사용 하는 인슐린 바늘의 브랜드에 대 한 경사에 바늘 끝에서 거리 500 µ m입니다.</li>
		<li>신중 하 게 철수 인슐린 바늘 (혈액의 아주 작은 유출을 볼 수 있습니다).</li>
		<li>과도 한 출혈, 지적 필요한 경우 눈 창 구멍, 취소를 적용할 수 있습니다. 지속적인 출혈 후 창 응용 프로그램 나타냅니다 선박 수 있습니다 손상 되었을.</li>
		<li>오프닝, 그리고는 공 막의 지역 표면에 상대적으로 약 10-15도 각도 직면 하 고 안내 하는 구멍으로 RPE 세포 로드 인젝터 바늘을 안내.</li>
		<li>부드럽게 subretinal 공간에 액세스를 약 500 µ m의 깊이를 안내 하는 구멍에 인젝터 바늘을 삽입 합니다. 검은 펜 마크의 가장자리와 바늘 (그림 1C 및 1d) 안료 맥락 막에 의해 덮여 있다 지점 사이의 100 µ m 여백에 대 한 이어야 한다.</li>
		<li>부드럽게 셀 (약 1.2 µ L)의 적절 한 볼륨을 주입 하는 인젝터 주사기의 플런저를 우울 하 게 보조를 요구 하십시오. 플런저 프레스는 조수로 일부 카운터 힘을 제공 하기 위해 준비가 되어있습니다. 참고: 도우미와 사전 모의 연습 의사와이 단계는 필요한 경험을 가진 보조를 제공할 수 있습니다.</li>
		<li>시각적으로 펜에 집중 하는 동안 가장자리를 표시, 인젝터 25-30에 대 한 장소에서를 누른 다음 천천히 인젝터를 철회 합니다. 역류의 작은 금액은 일반적으로 관찰 된다. 참고: 없는 혈 류 관찰 되는 경우 수 있었다 intravitreal 주사. 인감 또는 공 막 엔 아래 작성 하는 셀을 통해 역류 하십시오 경우 주사 너무 얕은 했다.</li>
		<li>3 번에 메 마른 눈 세척과 사출 사이트에서 셀 경과 헹 구 고 면 주걱으로 초과 수집 합니다.</li>
		<li>운영된 눈에 한 방울 눈 윤 활 유를 적용 하 고 10 월 역 이식된 세포의 위치와 subretinal bleb의 크기를 검사 하는 쥐를 전송.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 포스트 주입 치료
<ol><li>
항 염증 및 통증 진통제 치료
	<ol>
<li>고통을 감소를 피하 염 분에 0.1 mg/kg 몸 무게에서 buprenorphine 주사.</li>
		<li>염 분에 1.6 mg/kg 몸 무게에서 dexamethasone 염증 제어용 복 주사 (I.P.) 주사.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동물 복구
	<ol>
<li>체온을 유지 하기 위해 열 램프 아래 복구 케이지를 쥐를 반환 합니다.</li>
		<li>출혈의 징후에 대 한 운영된 눈을 관찰 합니다.</li>
		<li>마 취 나올 수 있도록 쥐를 관찰 합니다.</li>
		<li>신선한 케이지를 복구 된 동물을 반환 하 고 수술 카드 케이지를 플래그 조 난, 안구 출혈, 또는 각 막 불투명도의 어떤 표시 든 지를 위한 매일 모니터링. 문제가 있다면 수 의사를 즉시 통보.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 기사에서 묘사 된 subretinal 주입 기술은 트랜스 scleral 통로, 인젝터 바늘 신경 망막 손상 또는 유리 구멍을 방해 하지 않고 눈 벽의 바깥 레이어 (sclera-맥락 막-RPE 복잡 한)를 침투를 통해 이다. 대체 트랜스-vitreal 접근 설치류 렌즈 유리 구멍의 대부분을 차지 하는 때문에, 백 내장, 이어지는 렌즈 손상의 잠재적인 위험이 있다. 이 방법에 비해, 우리의 기술 덜 위험 하 고 인젝터 바늘 subretinal 공간을 도달 하는 전체 유리 캐비티를 통해 갈 필요가 없습니다으로 최소한의 외상의 원인. 사실, 우리의 연구에서 10 월 시험 행사, 매우 드문 망막 침투 것 고, 동물에 따라 시험에는 없는 영구적인 망막 분리. 또한, 사출 사이트는 매우 작은 (< 200 µ m 직경에서) 때 33-게이지 인젝터를 사용 하 여 바늘 sclera 맥락 막 RPE 복잡 한 구조적 장애는 매우 제한 된 그래서. 바늘 철회 후 주입 구멍 자체 자동으로 그렇게 스티치 물개 또는 조직 접착제 필요 하다.
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인간의 망막 눈 기능 뒤 가벼운 감각 조직으로 있으며 비전 인식에 중요 한 역할을 한다. 망막 세포 역 기능 또는 세포 죽음 따라서 시력 문제 또는 영구적인 실명을 발생합니다. 변성 또는 망막의 다른 층에 있는 세포의 기능 장애와 관련 된 장애 퇴행 성 망막 질환, 중 AMD는 가장 일반적인 유형 및 선진국 노인에 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인으로 알려져 있습니다. 1,2. AMD의 병 적인 과정은 관련 RPE 레이어와 차례로 손상의 포토 리셉터 생리학, 신경 망막 위축 및 비전 손실3, RPE 지원 기본 Bruch 막 사이 "드루" 축적 된 4,5. 지금까지, 치료법은 고급 건조 (비 신생) AMD. 재생 의학의 새로운 패러다임으로 줄기 세포 치료의 출현 줄기 세포 유래 건강 한 세포 기능 장애 또는 죽은 RPE 세포 교체의 희망을 제공 합니다. 실제로, 이식의 광범위 한 전 임상 연구 줄기 세포 (예를들면, 인간 배아 줄기 세포)-RPE 퇴행 성 동물 모델에 파생 된 RPE 세포 수행된6,7, 일부는에 진행 되었습니다 임상 시험8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). 최근, 줄기 세포 인간의 RPE 레이어, 인간의 RPE 줄기 세포 (hRPESCs)에서의 대안 소스 우리의 실험실에 의해 확인 되었다와 amd hRPESC 파생 된 RPE 세포 (hRPESC-RPE) 이식 치료의 임상 연구에서 현재 사용 되 고 10 , 11 , 12 , 13.
Subretinal 주입 기술은 우리의 그룹을 포함 하 여 여러 그룹에 의해 위에서 언급 한 전 임상 연구에 적용 됩니다. 동물에서 subretinal 주입을 위한 일반적인 방법은 두 가지: 트랜스 vitreal 및 트랜스 scleral. 트랜스-vitreal 접근 앞쪽 눈 침투, 십자가 전체 vitreal 구멍 렌즈에 인접 하 고 침투는 subretinal 도달 하 눈 뒤에 망막 바늘 끝을 직접 관찰할 수 있는 외과 의사의 이점이 있다 공간14,,1516. 그러나, 그것은 렌즈, 손상의 위험 전달 하 고 바늘을 철회 하는 때 유리 체로 셀의 역류에서 발생할 수 있습니다 (앞쪽에 및 사후), 두 개의 위치에 망막을 방해를 요구 한다. 반면, 트랜스 sclera 접근의 원칙, 망막 및 유리 체의 관련을 방지 하 고 역류 눈을 종료 합니다. 안료 설치류에서 외과 의사 처음 sclera의 침투를 관찰할 수 있다 하지만 안료 맥락 막에 통로, 후 바늘 끝은 더 이상 표시. 직접 관찰 없이 망막 위배 일반적 이며 망막 해 부 및 세포 혈액의 유리 체에 배달 될 수 있습니다. 또한, 눈 표면 곡선 때문에 그것은 매우 어떤 바늘 각도 깊이 트랜스 scleral 주사에 대 한 가장 효과적인 알고 어렵다.
이 시각화 된 문서에서 정보를 가진 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 사출 사이트의 상세한 검사를 수 있는 수술 후 평가의 사용에 의해 트랜스 scleral subretinal 주입 방법을 소개 합니다. 우리의 트랜스 scleral 주입 기술 정의 위치, 각도, 그리고 매우 낮은 수술 외상 및 높은 신뢰성을 주사 바늘에 대 한 깊이 사용 합니다. 여기, 우리가 구체적으로 RCS 쥐, 인간의 AMD의 전 임상 모델의 subretinal 공간으로 hRPESC-RPE 세포의 주입을 보여 줍니다. 이 주입 방법으로 우리가 성공적으로 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐 눈 매우 높은 성공률의 subretinal 공간으로. 세포의 주입 이전13주입 후 최소 2 개월 RCS 대뇌의 보존을 발견 했다. 이 절차는 해 현미경 아래 수행 되 고 배우기 쉽습니다. 그것은 두 사람 (한 의사와 보조) 주사를 수행 요구 하 고 각 동물에 대 한 주입의 평균 시간은 5 분 미만 이다. 정의 된 각도 깊이 주사 바늘에 대 한 실험실, 10 월은 성공적인 subretinal 주입을 달성 하기 위해 사용할 수 없습니다에 대 한 가능 하 게. 그것은 높은 재현성 subretinal 액세스를 허용 하 고 세포 이식, 뿐만 아니라 약물 전달 및 유전자 치료에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA (1x)</td><td>라이프 테크놀로지스</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>시그마</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>1xDulbecco' 칼슘 & 마그네슘 (1xDPBS-CMF)</td> <td>Corning Cellgro</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>멸균 균형 염 용액 (BSS)</td> <td>Alcon</td><td>00065079550</td><td></td></tr><tr><td>멸균 안세</td><td>Moore Medical</td><td>75519</td><td></td></tr><tr><td>멸균 0.9 % 식염수</td><td>Hospira</td><td>488810</td><td></td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride 안과 용액 (0.5 %)</td> <td>Akorn</td><td>17478026312</td><td></td></tr><tr><td>트로피카미드 점안액, USP(1%)</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208058559</td><td></td></tr><tr><td>Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) 주식</td><td>Bausch & Lomb</td><td>42702010305</td><td>이것은 2.5% 페닐에페린</td></tr><tr><td>부프레넥</td>스 <td>패터슨</td><td>433502</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>APP 제약</td><td>63323051610</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Thermo Scientific</td><td>615090040</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>2546.70-5</td><td></td></tr><tr><td>멸균 GenTeal 윤활제 아이 젤</td><td>을 만드는 데 사용됩니다.Novartis</td><td>78042947</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops</td><td>Alcon</td><td>00065143105</td><td></td></tr><tr><td>hRPESC-RPE cells</td><td>시판되지</td><td></td> 않음 <td>세포 분리 및 유지 보수에 대해서는 "Reference #12"를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td>, <td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>코니컬 튜브(15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62554002</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 캡, O-링 LPS</td><td>inc</td><td>L233126</td><td></td></tr><tr><td>캡리스 마이크로 원심분리기 튜브(1.7 ml),</td> <td>LPS inc</td><td>L233041</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>멸균 알코올 닦아내</td><td>기McKesson</td><td>58-204</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면 팁 애플리케이터</td><td>McKesson</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>멸균 Weck-Cel 창</td><td>Beaver-Visitec International&nbsp;</td><td></td><td></td>0008680</tr><tr><td>멸균 수술용 드레이프&nbsp;</td><td>McKesson</td><td>25-515</td><td></td></tr><tr><td>거즈</td><td>McKesson</td><td>16-4242</td><td></td></tr><tr><td>나노필 주사기(10ul)</td><td>세계 정밀 기기</td><td>Nanofil</td><td></td></tr><tr><td>나노필 비스듬한 33게이지 바늘</td><td>세계 정밀 기기</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기 바늘 31게이지</td><td>Becton Dickinson</td><td>328418</td><td></td></tr><tr><td>쥐 이빨 집게</td><td>세계 정밀 기기</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>순환수 T 펌프&nbsp;</td><td>스트라이커</td><td>TP700</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-814</td><td></td></tr><tr><td>동물 마취 시스템</td><td>세계 정밀 기기</td><td>EZ-7000</td><td></td></tr><tr><td>밸런스</td><td>오하우스</td><td>PA1502</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>현미경 광원</td><td>Schott</td><td>ACE 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>Bioptigen Envisu 스펙트럼 도메인 안과 이미징 시스템</td><td>Bioptigen</td><td>R2210</td><td></td></tr><tr><td>멸균 블랙 마커 펜</td><td>Viscot Industries</td><td>1416S-100</td><td></td></tr><tr><td>미니어처 측정 스케일</td><td>Ted Pella Inc</td><td>13623</td><td></td></tr><tr><td>적외선 바스킹 스포트 램프&nbsp;</td><td>EXO-TERRA</td><td>PT2144</td><td>이것은 수술 후 회복 단계에서 동물을 위한 난방 램프로 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

연령 관련 황 반 변성 (AMD) 등 퇴행 성 망막 질환 전세계 돌이킬 수 없는 시력 상실의 주요 원인입니다. AMD는 기능적으로 지원 하 고 해부학 신경 망막 주위 세포의 단층 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 변성에 의해 특징입니다. 비 신생 AMD (건식 AMD)에 대 한 현재 약물 치료는 질병의 진행을 느리게만 겨냥 한 새로운 치료 전략을 식별 하는 연구를 필요로 하는 비전을 복원할 수 없습니다. 건식 AMD를 미래에 치료 건강 한 세포 파악 약속 퇴행 성 RPE 세포를 교체. AMD에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 광범위 한 전 임상 연구 참여 subretinal 사출 기술을 적용 동물 모델의 subretinal 공간으로 줄기 세포 유래 RPE 세포의 이식. 이러한 전 임상 동물 연구에서 가장 자주 사용 하는 접근 어려운 바늘 끝의 직접적인 시각화의 부족에 의해 만들어지고 종종 망막 손상 될 수 있습니다 트랜스 scleral 경로입니다. 유리 체를 통해 다른 접근 바늘 끝 위치의 직접 관찰에 대 한 수 있지만 더 많은 눈 조직 방해로 수술 외상의 높은 위험을 운반. 덜 위험 하 고 재현할 수 수정된 트랜스 scleral 주입 방법 정의 바늘 각도 깊이 사용 하 여 성공적으로 하 고 일관 되 게 쥐 subretinal 공간으로 RPE 세포를 제공 하 고 과도 한 망막 손상을 방지를 개발 했습니다. 이 방식으로 전달 하는 세포는 2 개월 이상에 대 한 외과 의사의 왕 대학 (RCS) 쥐에 효능 되도록 이전 입증 되었습니다. 이 기술은 세포 이식 뿐만 아니라 작은 분자 또는 유전자 요법의 배달을 위해 사용할 수 있습니다.

이 문서에서 설명 하는 기술을 사용 하 여, 우리가 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐의 subretinal 공간으로 정확 하 게 위치, 각도, 그리고 조직 (그림 1B-D에 인젝터 바늘 삽입의 깊이 조절 하 여 ). 즉시 다음 이식, 10 월 시험 사출 사이트와 이식된 세포에 의해 만들어진 subretinal bleb을 수행 했다. 수술 후 10 월 평가 주사 및 망막 손상이 나 출혈에 대 한 모니터링의 품질을 평가 하기 위한 검사 도구 역할을 합니다. 모두 subretinal bleb (그림 2A, C 및 D)과 사출 사이트 (그림 2A , B) 스캔 하는 10 월에서 명확 하 게 볼 수 있었다. Subret...

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

이 영상의 전반적인 목표는 망막 손상의 위험을 최소화하면서 설치류 눈의 망막하 공간으로 인간 망막 색소 상피 또는 RPE 세포를 전달할 수 있는 재현 가능한 경공막 망막하 주입 기술을 소개하는 것입니다. 이는 먼저 각막 주변부 뒤쪽의 측두 결막에 작은 절개를 만들어 아래에 있는 공막을 노출시킴으로써 수행됩니다. 그런 다음, 31-gauge 베벨 인슐린 바늘을 사용하여 바늘 끝의 500 microns 또는 약 절반 정도를 조직에 삽입하고 베벨 면이 위를 향하게 하여 공막 핵심 복합체를 관통함으로써 가이드 구멍을 생성합니다.다음으로, 시린지에 연결된 33게이지의 베벨형 주사 바늘을 가이드 구멍으로 안내하여 특정 각도와 깊이로 삽입하며, 바늘을 뺀 후에는 주사 구멍이 자동으로 폐쇄되어 봉합이나 조직 접착제가 필요하지 않습니다. 퇴행성 망막병증은 서로 다른 망막 세포 유형이 관여하는 광범위한 질환군으로 구성됩니다. 전 세계적으로 가장 흔한 질환인 연령 관련 황반변성(AMD)은 노년층에서 발생하며 영구적인 실명으로 이어집니다.AMD에서 발생하는 병리적 변화는 망막 색소 상피 세포(RPE)의 초기 퇴행을 포함합니다. RPE의 손실은 망막 광수용기 기능 장애 또는 세포 사멸로 이어집니다. 초기 단계 AMD에 대한 현재의 약물 치료는 진행 속도를 늦추거나 증상을 완화하는 수준에 국한되어 있습니다.이는 망막의 제한적인 재생 능력과 결합되어 시력을 회복시키기 위한 효과적인 치료법이 없음을 의미합니다. Neural Stem Cell Institute는 최근 RPE 세포군 내에서 성체 줄기세포 집단을 확인하였습니다. 이 세포들은 줄기세포 대체 요법의 기원으로 활용될 수 있습니다.현재 본 연구소에서는 RPE 퇴행성 쥐 동물 모델을 통해 RPE 줄기세포 이식 치료의 효능과 안전성을 조사하기 위한 전임상 연구를 진행하고 있습니다. 본 연구에서는 경공막 하망막 주사 기술을 이용하여 RPE 줄기세포를 망막층과 RPE 층 사이의 쥐 안구 내로 전달합니다. 본 방법은 하망막 공간으로 세포를 성공적으로 전달할 수 있는 쉽고 신뢰할 수 있는 수단입니다.다음의 시약과 장비가 필요합니다. 동공을 확장시키기 위해 1%tropicamide와, 수술 당일 10%phenylephrine을 멸균 0.9%saline으로 희석하여 갓 제조한 2.5%phenylephrine을 사용합니다. 안구 세정액은 눈을 헹구고 수술하지 않는 쪽의 눈을 촉촉하게 유지하는 데 사용

development-refined-protocol-for-trans-scleral-subretinal

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

세포 이식은 광수용체 손실을 특징으로 하는 망막 변성의 치료를 위한 전략을 나타낸다. 여기에서 우리는 이식 가능한 광수용체의 농축 및 성인 마우스로그들의 감하 이식을 위한 방법을 기술합니다.

성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

망막 색소 상피 (RPE) 대체 전략 및 유전자 기반 치료는 여러 망막 퇴행성 조건이 고려된다. 임상 번역, 큰 눈 동물 모델은 환자에 적용 할 수있는 수술 기법을 연구해야합니다. 여기에서 우리는 다양하고 비용 효율적인 RPE 이식에 맞 망막 수술 토끼 모델을 제시한다.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

여기서는 인간 만능줄기세포(hPSC) 유래 망막 조직을 대형 동물 모델의 망막하 공간에 이식하는 수술 기법을 제시합니다.

고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

비인간 영장류 (NHP)는 해부학적 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 망막 세포 치료법을 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 원고는 NHP 눈의 망막 색소 상피 세포의 피하 학적 이식 방법과 황반 조작과 관련된 수술 내 합병증을 방지하기위한 전략을 설명합니다.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

망막 색소 상피(RPE)의 망막하 이식은 퇴행성 망막 질환 치료를 위한 가장 유망한 접근법 중 하나입니다. 그러나 큰 눈 동물 모델에 대한 전임상 연구의 성과는 여전히 도전적입니다. 이 보고서는 세포 운반체에 대한 RPE의 망막하 이식을 미니피그로 하기 위한 지침을 제시합니다.

Minipigs의 캐리어에 RPE의 망막하 이식: 수술 전 준비, 수술 기술 및 수술 후 관리에 대한 지침

이 프로토콜은 망막 변성이 있거나 없는 마우스 수용자에서 수술 합병증 발생률이 낮은 망막하 세포 이식편을 안전하고 정확하게 전달하기 위한 동공 시야 유도 경공막 접근법을 제시합니다.

망막 변성 마우스 모델에서 망막하 이식편의 Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

학습하세요 쥐 눈에 망막 안료 상피 세포를 안전하게 이식하는 경공막 하망막 주사 기법을. 최소 침습으로 재현 가능한 줄기세포 치료법을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

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