연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

이 자기 세포 응집 및 동적 성숙 방법의 전반적인 목표는 중간엽 기질 세포 또는 MSC의 체외 연골 형성을 개선하는 것입니다. 세포 응축으로 연골 형성 대신 줄기 세포의 자기 응집은 연골 재생 과정의 초기 핵심 단계입니다. 줄기세포가 골격에 갇힌 후, 골격은 세포의 동적 성숙을 평가하기 위해 세포 생물반응기로 이동할 수 있습니다.

중요한 역학 방법은 근육, 심장 또는 혈관 복구와 같은 다른 생체 시스템에 적용될 수 있습니다. 그러나 보시다시피 연골이 재생되는 데 매우 적합합니다. 실제 생물반응기를 사용한 자기 세포 파종(magnetic cell seeding)과 동적 세포 성숙(dynamic cell maturation)을 시각적으로 시연하는 것은 이 두 가지 기술이 텍스트 지침만으로는 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

응집체 형성을 위한 마이크로자석 장치를 구성하려면 먼저 6mm 두께의 알루미늄 판에 있는 각 3cm 구멍에 750마이크로미터 직경의 자기 팁을 삽입하고 플레이트를 영구 네오디뮴 자석 위에 놓습니다. 비계 파종 장치를 구성하려면 먼저 경질 폴리스티렌을 2.4 평방 센티미터 정사각형으로 자르고 1.6 평방 센티미터 표면에서 동일한 거리에 직경 3mm, 6mm 길이의 자석을 삽입합니다. 그런 다음 장치를 영구 네오디뮴 자석 위에 놓습니다.

인간 MSC를 라벨링하려면 먼저 줄기세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소가 90% 합류할 때까지 완전한 MSC 성장 배지에서 배양합니다. 글루타민이 없는 혈청 3 RPMI 배지로 세포를 흡인 후 헹구고, 150제곱센티미터 배양 플라스크당 10ml의 산화철 나노 입자 용액을 첨가하여 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 글루타민이 없는 Serum 3 RPMI 배지로 세포를 5분 동안 헹구어 원형질막에 여전히 부착된 나노 입자를 내부화합니다.

그런 다음 각 플라스크의 RPMI를 25ml의 완전한 MSC 성장 배지로 교체하고 세포를 밤새 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 다음 날 아침, 플라스크당 8ml의 05%Trypsin-EDTA로 자기 세포를 분리합니다. 그리고 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집합니다.

우리는 계산을 위해 펠릿을 매달고 각 자기 장치 위에 유리 바닥 35mm 세포 배양 페트리 접시를 놓습니다. 응집체를 자기적으로 형성하려면 각 페트리 접시에 3 밀리리터의 연골 생성 배지를 추가하고 응집체 당 5 번째 표지 된 세포에 2.5 곱하기 10의 8 마이크로 리터 이하를 부드럽게 증착합니다. 세포가 너무 느리거나 너무 빠르지 않게 증착되는 것이 중요합니다.

그리고 자기에서 너무 가깝지도 너무 멀지도 않습니다. 모든 응집체가 배치되면 방해 없이 20-30분 동안 스페로이드가 형성되도록 합니다. 그런 다음 응집체를 세포 배양 incubator로 옮깁니다.

같은 날, 1.5ml의 연골형성 배지가 있는 15ml 원추형 튜브에 2.5배 10에서 5번째 표지된 줄기세포를 원심분리하여 응집체를 형성합니다. 자기적으로 파종하기 위해 골격은 페트리 접시 당 하나의 건조 된 pullulan / dextran polysaccharide 다공성 골격을 배치하고 TGFbeta3가없는 연골 생성 배지의 350 마이크로 리터에 2 배 10에서 6 번째 표지 된 세포를 희석합니다. 세포를 골격에 조심스럽게 피펫으로 삽입하고 세포가 완전히 침투할 수 있도록 섭씨 37도에서 구조를 배양합니다.

5분 후 3ml의 연골형성 배지를 페트리 접시에 부드럽게 첨가하고 세포가 골격 공극을 통해 이동할 수 있도록 4일 동안 골격을 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 같은 날, 시연된 대로 2배 10에서 6번째 표지된 줄기세포를 가진 또 다른 골격 세트를 파종하고 자석 없이 세포를 배양하여 균일하게 파종된 골격을 양성 대조군으로 얻습니다. 골격으로의 연골 형성을 위해 5일째에 모든 골격에서 자기 장치를 제거하고 정적 골격을 25일까지 세포 배양 인큐베이터에 되돌려 주에 두 번 배지를 교체합니다.

동적 세포 배양을 위해 5일차에도 제조업체 지침에 따라 실리콘 튜빙을 적절한 길이로 절단하고 튜빙, 500ml 배양 챔버, 양방향 회전기 및 케이지를 멸균 미생물 안전 스테이션에 넣습니다. 제조업체 지침에 따라 튜브를 배양 챔버의 양방향 회전기에 연결합니다. 그런 다음 멸균 주걱을 사용하여 두 개의 셀룰러화된 골격을 각 케이지에 조심스럽게 옮깁니다.

모든 비계가 옮겨지면 뚜껑의 바늘을 통해 케이지를 삽입하여 회전 중에 움직이지 않도록 합니다. 그리고 연골 생성 매체로 배양실을 채웁니다. 도구나 비계의 오염을 방지하기 위해 챔버를 준비할 때 멸균 소독 기술을 사용하십시오.

다음으로, 케이지를 챔버에 삽입한 다음 챔버를 닫고 연동 펌프를 켜서 튜브를 연골 생성 매체로 채우고 기포를 제거합니다. 채워진 챔버를 바이오리액터의 모터 내에 놓고 고정하고 암과 챔버의 회전을 제어하는 컴퓨터를 켭니다. 그런 다음 암과 챔버 모두에 분당 5회 회전의 회전 속도를 적용하고 세포화된 골격의 지속적인 공급을 위해 연동 펌프를 분당 10회 회전의 유속으로 조정합니다.

스캐폴드가 없는 3D 골재 구조를 생성하려면 8일째에 연골 생성 매질에 접촉하는 두 개의 골재를 배치하여 융합을 시작합니다. 그런 다음 11일째에 2개의 듀블릿을 병합하여 4개의 사중핏을 형성하고 15일째에 4개의 사중핏을 융합하여 최종 구조를 형성합니다. 자기 융합에 의해 형성된 조직은 원심분리에 의해 얻어진 펠릿에 비해 콜라겐 II 발현이 크게 증가한 것으로 나타났습니다.

응집적 표현의 증가 추세와 함께. 세포화된 정적 골격의 경우 자기력 없이 파종된 골격과 비교하여 자기 시딩을 사용할 때 응집 및 콜라겐 II 발현이 관찰됩니다. 흥미롭게도, 콜라겐 II의 발현은 자기 파딩(magnetic seeding)이 동적 분화(dynamic differentiation)와 결합될 때 훨씬 더 높습니다.

톨루이딘 블루를 사용한 조직학적 분석은 16개 응집체의 순차적인 자기 융합이 글루코사민 글라이칸의 풍부한 침착을 나타내는 것을 보여줍니다. 또한, 자기적으로 파종된 골격에서 글루코사민 글리칸 함량은 골격이 정적으로 배양될 때보다 생물반응기에서 분화될 때 더 높습니다. 일단 숙달되면 자기 세포 응집은 적절하게 수행되면 2시간 내에 완료될 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때, 응집체 형성을 용이하게 하기 위해 라벨링된 세포를 가능한 한 작은 부피로 재현탁하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 골격의 자기 파종(magnetic seeding) 후, 실제 생물반응기를 사용한 동적 성숙을 수행하여 새로 합성된 연골세포의 발현을 개선할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 재생 의학 분야의 연구자들이 인간의 관절 연골 재생을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 자기 장치를 구성하고, 줄기 세포를 라벨링하고, 줄기 세포 응집체를 형성하고, 자기적으로 시드 골격을 형성하고, 실제 생물 반응기를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간의 세포와 조직을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로 항상 장갑, 실험복, 보호 안경을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.