인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성
2017년 4월 3일
여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 4개의 뚜렷한 주산기 조직 공급원, 탯줄 내벽, 와튼 젤리, 탯줄-태반 접합부 및 태아 태반에서 중간엽 기질 세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 비침습적으로 특별한 품질의 중간엽 줄기세포를 획득함으로써 줄기세포 생물학, 대체 의학 분야를 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 뚜렷한 주산기 조직 공급원에서 많은 수의 고품질 균질한 세포 집단을 생산적으로 산출한다는 것입니다.
이 기술에서 유래한 다강력 탯줄 중간엽 기질 세포는 성체 조직에서 분리된 중간엽 줄기세포보다 원시적이기 때문에 다양한 질병 및 장애를 치료하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 탯줄과 태반의 다양한 분절과 특정 틈새에서 중간엽 기질 세포의 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 먼저 바이오 안전 캐비닛의 얼음 위에 150mm 페트리 접시에 샘플을 넣고 바늘과 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 PBS로 조직을 여러 번 헹굽니다.
모든 혈전이 제거되면 샘플을 주의 깊게 검사하여 다른 해부학적 영역을 식별합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 탯줄의 태아 끝을 잡고 가위를 사용하여 탯줄-태반 접합부 상단을 조심스럽게 절개합니다. 탯줄-태반 접합부와 태반을 분리하기 위해 접합부 아래를 두 번째로 절개합니다.
그리고 분리된 조직을 개별 페트리 접시로 나눕니다. 다음으로, 탯줄을 세로로 잘라 상피를 방해하지 않고 혈관과 주변 와튼 젤리를 완전히 노출시킵니다. 메스를 사용하여 와튼 젤리를 양막하의 혈관과 상피에서 긁어냅니다.
그런 다음 혈관을 제거하고 혈관 아래 및 주변에 남아 있는 혈관 주위 젤리를 Wharton's 젤리 접시로 옮기고 남은 탯줄 내벽 조직을 자체 접시에 넣습니다. 모든 조직을 해부한 후 각 접시의 PBS를 3-5밀리리터의 트립신으로 교체하고 가위를 사용하여 각 조직 샘플을 1-2밀리미터 조각으로 잘라 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 30분 동안 배양합니다. 위상차 현미경을 사용하여 조직에서 세포의 방출을 시각화하여 부분 소화를 관찰합니다.
부분 분해 기간이 끝나면 동일한 부피의 배양 배지로 트립신을 중화하고 샘플을 개별 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 조직 조각이 3분 동안 가라앉도록 합니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 흡인하고 샘플당 부분적으로 소화된 조직 조각 15-20개를 개별 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크에 플레이트합니다.
다음으로, 섭씨 37도에서 2-3일 동안 배양하기 위해 9ml의 배양 배지를 추가합니다. 3일 후 배양 배지를 변경하고 세포 성장에 대한 위상차 현미경으로 xplants를 검사합니다. 세포 성장이 70% 농도에 도달하면 플라스크당 1-2밀리리터의 트립신 용액으로 세포를 해리하고 플라스크를 회전시켜 효소 용액으로 균일하게 코팅한 다음 섭씨 37도에서 3분 동안 배양
물을 배양합니다.그런 다음 1-2 밀리리터의 배양 배지로 반응을 중화하십시오. 원심 분리에 의하여 세포를 모으고, subculture를 위한 배양 매체에 있는 펠릿을 1 곱하기 10 센티미터 제곱한 파종 조밀도 당 4번째 세포에 재현탁시키. 탯줄 내벽과 Wharton's jelly culture의 세포는 각각 59 및 80 콜로니의 콜로니 형성 효율 값을 나타냅니다.
그러나 탯줄-태반 접합 세포의 집락 형성 효율 값은 골수 중간엽 줄기 세포에서 관찰된 것과 유사하여 탯줄-태반 접합 유래 세포가 더 높은 증식 및 자가 재생 능력을 가지고 있음을 시사합니다. 이러한 주산기 조직에서 분리된 단일 세포 현탁액의 메트릭 분석은 4가지 조직 공급원 모두에서 특정 중간엽 줄기 세포 마커에 대한 양성 세포의 비율이 표준 골수 유래 중간엽 세포에 의해 발현되는 비율과 유사하다는 것을 나타냅니다. 그러나 형광 강도 비율의 중앙값은 Wharton's jelly and cord-placenta junction derived cells(와튼 젤리와 탯줄-태반 접합 유래 세포)가 태아 태반 유래 세포의 탯줄 내벽(code lining)과 매우 유사하거나 더 높다는 것을 나타냅니다.
흥미롭게도, 다양한 콜로니 형성 효율 값에도 불구하고, 서로 다른 주산기 출처의 모든 세포는 테스트된 모든 다능성 마커에 대해 가장 높은 수준의 발현을 나타내는 코드-태반 접합부 유래 중간엽 기질 세포를 제외하고 정량적 RTPCR 분석에 의해 유사한 수준의 다능성 마커를 발현합니다. 또한, 모든 주산기 공급원에서 분리된 중간엽 기질 세포는 지방형성(adipogenic), 연골형성(chondrogenic) 및 골형성 세포(osteogenic cell type)로 쉽게 분화할 뿐만 아니라 입증된 삼계통 분화(trilineage differentiation)를 제공합니다. 분화 가능성은 중간엽 기질 세포 공급원에 따라 다릅니다.
이 기술을 숙달하면 효율적으로 수행한다면 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 측면 기술을 연습하고 조직 소스 간의 교차 오염을 피하는 것이 중요합니다. 이 기술은 연구자들이 주산기 조직에 있는 줄기세포 틈새의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
개요
본 프로토콜은 외식편 배양법(explant culture technique)을 이용하여 중간엽 기질 세포(MSCs)를 분리하기 위한 인간 제대 및 태아 태반의 해부 과정을 설명합니다. 이 방법은 서로 다른 주산기 조직 nguồn에서 유래한 MSCs의 특성 분석을 가능하게 하여, 줄기세포 생물학의 발전에 기여합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 줄기세포 생물학
- 재생 의학
- 세포 배양 기술
배경
- 중간엽 기질세포(MSCs)는 다분화 능력을 통해 치료적 잠재력을 가집니다.
- 주산기 조직은 원시 MSCs의 풍부한 공급원입니다.
- 본 프로토콜은 탯줄과 태반으로부터 고품질 MSCs의 수득률을 높이는 것을 목적으로 합니다.
- 다양한 조직 공급원 유래 MSCs의 특성을 이해함으로써 임상 적용에 활용할 수 있습니다.
연구 목적
- 제대관 라이닝, 와튼 젤리, 제대-태반 접합부 및 태아 태반으로부터 MSC를 분리하기 위함입니다.
- 이러한 조직에서 유래한 MSC의 품질과 특성을 평가하기 위함입니다.
- 연구 및 치료 목적으로 MSC를 얻기 위한 비침습적 방법을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 탯줄과 태반을 서로 다른 해부학적 영역으로 분리하는 해부 과정.
- 조직 샘플의 부분 소화를 위한 trypsin 사용.
- 분리된 조직을 특정 배지 조건에서 배양.
- 현미경 관찰 및 유세포 분석을 통한 세포 성장 평가 및 특성 분석.
주요 결과
- Wharton's jelly 및 제대-태반 접합부 세포에서 높은 콜로니 형성 효율이 관찰되었습니다.
- 모든 MSC는 발현 수준의 차이는 있었으나, 유사한 다능성 마커를 발현했습니다.
- MSC는 여러 계통으로 분화할 수 있는 능력을 보여주었습니다.
- 해당 기술은 2~3시간 내에 효율적으로 완료할 수 있습니다.
결론
- 이 프로토콜은 주산기 조직에서 고품질의 MSC를 분리하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 다양한 기원의 MSC 특성을 이해하면 치료적 응용 분야를 확대할 수 있습니다.
- 주산기 조직 내 줄기세포 니치(niche)에 대한 추가적인 탐구를 권장합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 프로토콜은 다양한 주산기 조직원으로부터 중간엽 기질 세포(MSCs)를 분리하는 방법을 제공하며, 이는 골수 유래 MSCs를 대체할 수 있는 비침습적이고 윤리적으로 유리한 대안이 됩니다. 탯줄-태반 접합부(CPJ), 와튼 젤리(WJ), 탯줄 내피(CL) 및 태아 태반(FP)과 같은 해부학적 영역을 비교함으로써, 본 방법은 재생 의학 파이프라인의 타겟 검증 및 기전적 리스크 감소를 지원합니다. CPJ 유래 MSCs에서 관찰되는 더 높은 콜로니 형성 효율과 다능성 마커 발현은 세포 치료 적용에 대한 예측 신뢰도를 제공하여, 리드 물질 식별 및 포트폴리오 선별에 도움을 줍니다.
바이오제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 증식 및 자가 재생 능력이 다양한 개별 주산기 틈새(perinatal niches)로부터 MSC를 분리함으로써 치료적 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 지방세포성, 연골세포성 및 골세포성 계통에 걸친 다분화능의 기능적 검증을 통해 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 과학적 가치: CPJ가 우수한 콜로니 형성 효율과 다분화능 마커 발현을 가진 강력한 MSC 공급원임을 확인함으로써 표적에 대한 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 운영적 가치: 정의된 표면 마커 프로필(CD29, CD44, CD73, CD90, CD105)을 가진 균질한 부착성 MSC 집단을 생성함으로써, 후속 워크플로우를 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 과학적 가치: 일관된 조직 외식 배양 기술과 콜로니 형성 효율 및 유세포 분석 지표와 같은 정량적 결과물을 통해 분석의 표준화와 재현성 문제를 해결합니다.
- 운영적 가치: 2~3시간 내에 완료되는 프로토콜을 통해 스크리닝 준비도와 확장성을 강조하며, 전임상 스크리닝 단계에서 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 전임상 검증의 핵심 기능적 읽기 값인 삼계분화 능력을 입증함으로써 질병 관련성 및 중개 바이오마커 일치성을 논의합니다.
- 운영적 가치: 골수 유래 MSC와 유사한 부착성 섬유아세포 유사 형태 및 표면 마커 발현을 유지하는 MSC를 제공하여 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 설명합니다.
- 과학적 가치: CPJ-MSC가 다른 기원보다 더 효율적으로 분화함을 보여줌으로써 예측 가능한 리스크 감소 가치에 집중하며, 리스크 조정 기반의 추진 결정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 발견 단계부터 선도 물질 확인 및 전임상 단계에 이르는 발견 연속체에 통합되어, 해부학적으로 분해된 MSC 분리를 통해 가설 검증, 경로 규명 및 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 발견 생물학: 탯줄 라이닝, 워튼 젤리, 탯줄-태반 접합부 및 태아 태반 전반의 MSC 특성 비교를 가능하게 하여, 본 방법이 가설 검증 및 경로 규명을 어떻게 지원하는지 설명합니다.
- 스크리닝: 분석 준비도, 재현성 및 콜로니 형성 효율(CL 59, WJ 80, CPJ는 BM과 유사)과 유세포 분석 기반의 마커 발현 분석과 같은 정량적 결과물을 서술합니다.
- 분석학: 콜로니 형성 효율, 형광 강도 비율 및 다능성 마커에 대한 정량적 RTPCR과 같은 측정치를 강조하여, 연구팀이 조건을 비교하고 예측 가치를 평가하는 데 도움을 줍니다.
- 중개 연구: MSC가 지방분화, 연골분화 및 골분화 계통으로 분화됨을 입증함으로써 본 방법을 전임상 연속성과 연결하며, 바이오마커 일치 및 기능적 검증을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 본 방법을 단회성 기술이 아닌 재사용 가능한 역량으로 설정하여, 재생 의학 프로그램에서 일관된 MSC 공급을 위해 주산기 조직원 전반의 표준화를 가능하게 합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 해부학적으로 분해된 MSC 분리 및 기능적 특성 분석을 통한 예측 신뢰도 향상, 타겟 검증, 기전적 모호성 감소.
- 운영적 가치: 외식편 배양, 정의된 소화 파라미터 및 일관된 파종 밀도(1×10⁴ cells/cm²)를 통한 표준화, 재현성 및 확장성 확보.
- 전략적 가치: 발견 초기 단계에서 CPJ와 같은 고효능 MSC 소스를 식별함으로써 더 나은 go/no-go 결정, 자본 효율성 증대 및 후기 단계의 생물학적 리스크 감소.
- 포트폴리오 영향: 주산기 MSC 소스 간의 증식, 자기 재생 및 분화 효율의 차이에 기반한 리스크 조정 우선순위 지정 및 추진 결정.
실행 시 고려 사항
- 조직 절제, 무균 세포 배양 및 마커 분석을 위한 유세포 분석법에 관한 과학적 전문 지식이 필요합니다.
- 기기 및 분석 인프라 요구 사항으로는 위상차 현미경, 원심분리기, 배양기(37°C, 5% CO₂), 그리고 CD 마커 및 형광 강도 평가를 위한 유세포 분석기가 포함됩니다.
- 팀 간 표준화 요구 사항으로는 실험실 간 재현성을 보장하기 위해 일관된 조직 절제 프로토콜, 트립신 중화 및 파종 밀도 설정이 필요합니다.
- 모델 시스템 간 적응 고려 사항으로는 조직원별로 외성장 시기가 다르므로(CPJ의 경우 3–4일, CL/WJ의 경우 7–10일, FP의 경우 11–14일), 조직원에 따라 외식편 크기와 소화 시간을 조정해야 합니다.
- 공급 재료에 따른 실제적 제약으로는 조직 절제 중 조직원 간의 교차 오염 방지가 필요하며, 해부학적 부위에 따라 콜로니 형성 효율과 외성장 시기에 변동성이 있음을 고려해야 합니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
