Name: 인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 배우세요 인간 제대혈과 태반에서 중간 엽 기질 세포를 분리하는 방법을. 조직 배양 기법을 활용하여 고품질 줄기세포를 비침습적으로 얻고 특성을 분석하는 과정을 익힐 수 있습니다.

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이 연구는 OU-WB ISCRM, 오클랜드 대학과 미시간 머리와 척추 연구소에 의해 지원되었다. N 비라볼루와 C 맥키 오클랜드 대학에서 학장 대학원 연구 상을 수상했다. 우리는 원고를 검토하는 S 박시 주셔서 감사합니다.

시료 (N = 3)에 의한 동의 한 후, 버몬트 병원 바이오 뱅크, 로얄 오크, MI 및 병원 프로비던스 사우스 필드 통해 건강한 기증자 MI IRB # 820662- HIC- (HIC 번호 2012-101)와 IRB- (이하 3) 각각의 프로토콜을 승인 오클랜드 대학, 로체스터, MI의 IBC (# 2858)에 의해 승인 된 바와 같이 처리된다. 1. 인간 제대 가공 코드, 코드 - 태반 정션 태아 태반 세포 단리 <ol><li> CPJ 접속 6cm 3 - - FP의 4cm 무균는 UC 5 포함한 길이 약 10 ㎝의 샘플을 수집한다. 즉시 수거 컵 함유 배지에서 각각의 샘플을 배치 (DMEM 4,500 ㎎ / ㎖ 글루코스와 항생제 용액 (0.1 % 젠타 마이신 0.2 % 스트렙토 마이신 및 0.12 % 페니실린)으로) 39 ° C에서 저장 그것은하여 실험실로 운반 될 때까지 스티로폼 상자에 얼음에 배치. 콜렉션의 4 시간 - 2에서 4 ° C에서 샘플을 처리합니다. </li><li> 150 mm 배양 접시에 시료를 장소에 보관바이오 안전성 캐비닛에 얼음. 바늘과 주사기를 사용하여 혈전을 제거하기 위해 얼음처럼 차가운 PBS로 여러 번 씻어. 샘플을 처리하는 동안 PBS로 젖은 유지하고 건조하지 않도록합니다. , 불임을 유지 샘플 처리를 통해 멸균 PBS 및 수술 도구를 사용하여 샘플 무균 처리합니다. </li><li> 조심스럽게 다른 해부학 적 영역을 식별하기 위해 샘플을 검사 : UC, CPJ 및 FP를. 먼저 UC를 해부. 집게와 UC의 태아의 끝을 잡고 조심스럽게 바로 가위를 사용하여 CPJ의 상단에있는 첫 번째 컷을합니다. 나 PF에서 - (2.0 cm 1.5)을 CPJ 아래의 두 번째 컷은 CPJ을 분리합니다. 추가 처리를 위해 별도의 배양 접시에있는 분리 UC, CPJ 및 FP를 놓는다. </li><li> 완전히 혈관을 노출하고 상피를 방해하지 않고 WJ 주변, 가위와 집게의 도움으로 길이 방향으로 UC를 잘라. </li><li> 혈관과 subamnion의 내부 상피에서 떨어진 WJ을 다 쳤어요메스를 사용하고 혈관을 제거합니다. 아래 및 혈관 주위에 남아있는 혈관 주위의 WJ를 수집하고 별도의 배양 접시에서 수집 된 WJ를 배치해야합니다. </li><li> 별도의 배양 접시에 남아있는 조직 라이닝 코드 (CL)을 수집한다. </li><li> CL, WJ, CPJ 및 FP를 나타내는 조직을 분리 한 후, (3)으로 PBS를 교체 - 상업용 트립신 용액 5 ㎖와 별도로 가위를 사용하여 2 mm 조각으로 1-에 각 조직을 잘라. </li><li> 샘플의 부분 소화 5 % CO 2 인큐베이터에서 30 분 동안 37 ℃에서 상업용 트립신 용액에 조직 조각을 인큐베이션. 위상차 현미경을 이용한 세포의 분리를 시각화하여 부분 소화를 관찰한다. </li><li> 10 % 사람 혈청 / FBS와 항생제 용액 (0.1 % 젠타 마이신 0.2 % 스트렙토 마이신이 보충 된 4,500 ㎎ / ㎖ 글루코스, 2 mM의 L- 글루타민으로 DMEM 상기 부분적 절단 샘플을, 배양 배지 (CM 동량을 추가 그리고 0.12 %의 Penicillin)) 상용 트립신 용액을 중화한다. 50 mL의 원심 분리 튜브로 콘텐츠를 전송하고, 부분적으로 분해 된 조직 조각을 3 분 동안 정착하자. </li><li> 조심 단셀 (이들이 효과적으로 확장되지 않음)를 포함하는 상등액을 흡인하고, 플레이트 15 - 75 cm 2 조직 배양 플라스크에 20 부분적으로 분해 된 조직 조각과 CM 9 mL를 첨가. 37 ° C에서 품어 2의 배양 플라스크를 방해하지 않습니다 - 조직 조각의 준수 수 있도록 삼일. 주 : 부분적으로 분해 된 조직 샘플의 나머지 부분은 미래 셀 분리 용 냉동 보존 될 수있다. </li><li> 배양 3 일 후, CM을 변경하고 매일의 절편에서 세포의 부산물의 모습을 찾아; 사일 7 - - 십일, 11 - 각각 CPJ, CL / WJ 및 FP, 배양 14 일 세포 성장 3 후 접착 이식편으로부터 명백 할 것이다. 이후이 시점에서, 매 3 일 후 또는 형상을 변경필요했습니다. 참고 : - 열흘 절편에서 초기 셀 파생물 후 세포 성장 7 70 %의 합류에 도달합니다. 그들은 플라스틱을 준수 할 때까지 비 접착 조직 조각 셀 파생물을 초래하지 않습니다. 플라스크가 부착 조직 조각의 분리를 방지하기 위해 방해되지 않도록주의를 기울여야한다. 배양의 처음 3 일 후 부동 조각이있는 경우, 그들은 첨부 파일에 대한 새로운 플라스크로 전송에 의해 구출 될 수 있었다. 참고 : 조직 외식에서 세포 성장이 70 %의 합류에 도달하면, 그들은 계대 배양해야한다. 각각 24 일 - 14 일 14 - - 20일, 17 전술 한 바와 같이, CL / WJ, FP, CPJ에서 중간 엽 줄기 세포는 10에서 합류에 도달한다. </li><li> 외식 능가로부터 세포를 배양하기 위해 하나를 사용하여 세포를 해리 - 상업용 트립신 용액 / 75 cm-2 배양 플라스크 2 ㎖를 3 분 동안 37 ℃에서 배양한다. CM 2 mL의 원심 3 분 동안 1,500 XG 1 - 중화. 하다심지어 전반에 걸쳐 확산 트립신을 추가하는 동안 플라스크를 회전해야합니다. </li><li> 주 : 펠렛 세포 통로 0 (P0)으로 간주되고, CM에 현탁 계산되며, 증폭, 특성화하고, 동결 보존 된 1 × 10 4 / cm 2의 시딩 밀도 계대. 초과 세포는 P0에서 동결 보존 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 분리 된 세포를 특성화 <ol><li> 콜로니 형성 효율 (CFE) 분석 <ol><li> 코트 37 ° C에서 CO 2 인큐베이터에서 100 mm 페트리 접시에서 30 분 동안 0.1 % 젤라틴 (2 60cm의 면적) 및 배치합니다. 참고 : 필요하지, 젤라틴 코팅이 세포 부착을 향상 있지만. </li><li> 과량의 젤라틴을 제거하고 / cm 2 1.63 세포의 농도 P0 세포 도장 판 시드. 3 ㎖ CM의 추가 37 ° C에서 CO 2 인큐베이터에서 배양한다. </li><li> 클론 성장을위한 시드 판을 모니터광 현미경 (LM)에 의해 3 일마다 배지를 변경. </li><li> 이후 10 - 세포 성장을 14 일간 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 PBS로 두 번 페트리 설거지 및 고정. 참고 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 사용하는 동안 장갑과 안경을 착용하여주의를 실천하십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 0.1 % 크리스탈 바이올렛으로 세포를 고정 및 염색 바운드 푸른 기미가 없어까지 수돗물로 헹구어 플레이트. </li><li> LM을 이용하여 적어도 50 개 세포로 이루어지는 콜로니 수를 카운트. </li></ol></li><li> 세포 표면 마커의 발현 <ol><li> 배양은 70 % 합류로 분리 된 세포는 상업적 트립신 용액으로 해리, 3 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 세척하고 펠릿. (2 % FBS와 0.1 % 나트륨 아 지드와 1X PBS) FACS 완충액에 세포를 일시. 참고 : 아 지드 화 나트륨은 독성이있다. 사용하는 동안 장갑과 안경을 착용하여주의를 실천하십시오. </li><li30 분 동안 FACS 완충액&gt; (CD29, CD73 및 CD105 : 대 CD44 및 CD90 또는 APC 접합 된 항체에 대한 FITC - 접합 된 항체) FITC- 또는 APC 표지 MSC 특이 항체 세포 (~ 10 6) 얼룩 어둠 속에서 39 ° C. </li><li> 5 분 동안 670 XG에서 염색 된 세포를 원심 분리하여 상등액을 흡인하고, FACS 완충액 500 μL에 세포를 재현 탁. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 FACS를 이용하여 항체 염색 된 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 차별화 가능성 <ol><li> 지방 세포 분화 <ol><li> 배양은 70 % 합류로 분리 된 세포는 상업적 트립신 용액으로 해리, 3 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 세척하고 펠릿. </li><li> 37 ℃에서 CO2 인큐베이터에서 배양 10 개 세포의 농도로 세포 / 웰의 CM 2 mL를 함유하는 6- 웰 플레이트. </li><li> 24 시간 후, adipog와 CM 교체enic 분화 배지 (0.5 μM 이소 부틸 메틸 크, 1 μM 덱사메타손, 10 μM 인슐린, 200 μM 인도 메타 신)과 배양한다. 3 일마다 차별화 매체를 변경하거나 자주 필요에. </li><li> 배양 3 주 후 지방 세포 분화를 분석하기 위해 지질 소적의 생산을 검출하는 오일 레드 O 실온 얼룩에서 30 분 동안 웰당 4 % 파라 포름 알데히드 2 mL로 세포를 고정한다. 참고 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 사용하는 동안 장갑과 안경을 착용하여주의를 실천하십시오. </li><li> 5 분 동안 60 % 이소프로판올 (6- 웰 플레이트에 2 ㎖ / 웰)와 함께 고정 된 세포를 취급한다. </li><li> 오일 레드 O 염색 2 ㎖ (필터 3 부를 오일 레드 O 염색과 2 부를 증류수)과 이소프로판올을 바꾸고, 실온에서 15-30 분 동안 배양하고, 3 워시 - 어떤 결합되지 않은 얼룩을 제거하는 수돗물로 4 회 . </li><li> , U를 지방 세포 세포의 혈통을 나타내는 빨간색 염색 지질 방울을 시각화LM 노래. </li></ol></li><li> 연골 분화 <ol><li> 70 % 합류에 절연 배양 세포는 상업적 트립신 용액으로 해리하고 PBS로 세척한다. </li><li> 8 분 동안 11,000 XG에서 연골 유도 원심 CM 2 mL를 15 mL의 원심 분리 튜브에서 250,000 세포 펠렛 세포. 밤새 37 ° C에서 펠릿을 인큐베이션. </li><li> 24 시간 후, 부드럽게 펠렛을 방해하지 않고 연골 세포 분화 배지 (TGFβ1 NG 20, 10 ng의 인슐린, 덱사메타손 100 나노 미터, 100 μM 아스코르브 산)과 CM을 대체하고 배양을 계속한다. 3 일마다 차별화 매체를 변경하거나 자주 필요에. </li><li> 배양 3 주 후, 실온에서 30 분 동안 웰당 4 % 파라 포름 알데히드 2 mL로 세포를 고정한다. 1 % 톨루이딘 블루 염색 동결 절단 (Cryosections)과 연골 세포의 분화를 확인하기 위해 세포 외 매트릭스의 존재 또는 생산을 검토한다. 참고 : 아빠raformaldehyde 독성이다. 사용하는 동안 장갑과 안경을 착용하여주의를 실천하십시오. </li><li> 냉동 절편 들어 부드럽게 PBS로 두 번 수확 된 세포 펠렛을 세척하고, 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 1 mL로 고정한다. 참고 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 사용하는 동안 장갑과 보안경을 착용하여주의를 실천하십시오. </li><li> 파라 포름 알데히드를 제거하고, 수 크로스 / 간섭 단층 솔루션에 전송하는 PBS로 두 번 씻어 펠렛 (1 : 2, 20 % 자당 : 2009 년 10 월). 용액을 완전히 세포 펠렛으로 침투 할 수 있도록 24 시간 동안 실온에서 인큐베이션; 이 부드러운 절편을 수 있습니다. </li><li> OCT를 금형에 알약을 전송합니다. 6 시간 및 동결 절단 (Cryosections) 10 - - 톨루이딘 블루 염색을위한 저온 유지 장치를 이용하여 세포 펠렛을 12 미크론 두께의 섹션 4 -20 ° C에서 금형을 고정. </li><li> PBS로 부드럽게 저온부을 씻으십시오; 완전히 슬라이드 펠릿 부 피복 1 % 톨루이딘 블루 염색의 몇 방울을 추가; 및 INC실온에서 1 시간 동안 ubate. </li><li> destain하는 PBS 여러 번에 슬라이드를 씻으십시오. (95 % HCl을 알콜 + 0.5 mL)을 여러 번 결합되지 않은 청색이 멈출 때까지 염산 계 알콜 용액에 침지하여 슬라이드 과잉 스테인을 제거한다. 슬라이드의 장기 보존을위한 솔루션을 장착의 100 μL를 사용하여 스테인드 섹션을 탑재합니다. 참고 : 섹션의 파란색 염색은 글리코 사 미노 글리 칸과 당 단백질의 존재를 표시하고 LM을 사용하여 관찰 할 수있을 것입니다. </li></ol></li><li> 조골 세포의 분화 <ol><li> 또, 배양은 70 % 합류로 분리 된 세포는 상업적 트립신 용액으로 해리, 3 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 세척하고 펠릿. </li><li> 37 ℃에서 CO2 인큐베이터에서 CM 2 mL를 함유하는 세포의 농도 100,000 / 웰의 6- 웰 플레이트에서 세포를 배양. </li><li> 24 시간 후, (골아 세포 분화 배지에 0.1 μ를 CM 대체; M 덱사메타손, 10 μM의-β 글리세로 포스페이트, 50 μM 아스코르브 산 포스페이트) 및 인큐베이션을 계속한다. 3 일마다 차별화 매체를 변경하거나 자주 필요에. </li><li> 배양 3 주 후, 조골 세포 분화를 확인하기 위해 칼슘 침착의 존재를 검출하는 실내 온도 및 알리자린 레드 염색에서 30 분 동안 웰당 2ml의 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다. 참고 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 사용하는 동안 장갑과 안경을 착용하여주의를 실천하십시오. </li><li> 부드럽게 증류수로 두 번 세포를 씻어 고정 2 % 알리자린 레드 염색으로 처리 (2 ㎖ / 웰, 6 웰 플레이트)에서 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 교반 하였다. </li><li> 칼슘 예금이 꺼 내려하지 않도록 부드럽게 수돗물로 세척하여 여분의 얼룩을 제거합니다. </li><li> LM를 사용하여 붉은 염색 칼슘 침전물을 시각화합니다. </li></ol></li></ol> 4. 정량적 역전사 중합 효소 차반응 (QRT-PCR) 분석 <ol><li> 3 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 70 % 합류로 분리 된 세포는, 상용 트립신 용액으로 배양 해리 세정하고 펠릿을 총 세포 RNA를 분리한다. </li><li> PBS로 세포를 씻으 것은 FBS의 흔적을 제거하고 제조업체의 지침에 따라, 상업 RNA 정제 키트를 사용하여 RNA 분리를 진행합니다. </li><li> 열 순환기를 사용하여 30 분 동안 37 ° C에서 DNase를 처리하여 분리 된 총 RNA를 정제 하였다. cDNA를 제조업체의 지침에 따라 상업 키트를 사용하여 합성. </li><li> SYBR 그린 PCR 수퍼 믹스를 5 μL를 각각 포함하는 반응을 96 웰 플레이트에 10 μL 중으로 PCR 반응을 준비한다; 이중 증류수 3 μL; 각 프라이머의 0.5 μL, 순방향 및 역방향 희석 된 (1시 10분)의 cDNA 1 μL. </li><li> 다음과 같은 파라미터에 따라 PCR을 수행하여 (30)의 각각의 44주기 다음에 98 ° C에서 10 분, 98 ℃에서# 176; C, 60 ° C에서 20 초, 72 ℃에서 30 개 초. </li><li> 기준 유전자, GAPDH 및 β 액틴의 표적 유전자의 증폭을 정상화; 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있습니다. </li></ol> 5. 통계 분석 <ol><li> 통계 소프트웨어를 사용하여 모든 분석을 수행합니다. SEM ± 평균으로 데이터를 제시한다. p 형 값 결과 (P ≤ 0.05 ≤ 0.01 * (P)는 **) 통계적으로 유의 한 것으로 간주되었다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

줄기 세포 연구의 최근 발전은 기본 개발 프로세스에 대한 이해를 향상뿐만 아니라 생명 공학, 제약, 세포 치료, 재생 의학 및 조직 공학 응용 프로그램을 18, 19, 20에서 줄기 세포의 사용을 위해 유망한 기회를 제공뿐만 아닙니다. 초기 배아에서 분리 한 만능는 ESC가 가장 유망한 있지만, 그들은 기술적 인 문제와 윤리적 딜레마 21, 22, 23에 직면 해있다. 성인 세포에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 대안을 제공하지만, 그들도 비슷한 기술 및 안전 문제 (23)에 직면 해있다. 또한, iPSCs 유 전적으로 안정되지 않거나, 따라서 그들의 치료 용도를 제한 후의 유전 적 변화를 가질 수있다. 줄기 세포는 출생 후 TIS의 다양한보고되었다고소 및 기관. 이들의 ASC의 가장 일반적인 소스는 골수, 지방 및 근육 조직이다. 그러나 출생 후 소스로부터의 ASC 성장과 분화 가능성 24, 25 제한됩니다. 또한 인한 노화 및 환경 스트레스에 노출 고통 때문에 항상 치료 응용 프로그램을 26, 27, 28에 대한 효능이 없습니다. 이것은의 ASC보다 더 순진 줄기 세포의 새로운 소스를 검색 할 우리와 다른 사람들을 주도하고있다. 우리의 ASC의 대안으로 원시 줄기 세포에 대한 주 산기 소스를 조사 하였다. 이 보고서에서 우리는 코드 / 태반 샘플에서 인간 중간 엽 줄기 세포를 분리 할 수있는, 신뢰할 수있는 강력하고 간단한 방법을 제공합니다. 의 ASC의 분리에 사용되는 다른 소스와 방법에 비해,이 방법은 HIG를 대량으로 분리하는 효율적이고 비 침습적 방법을 제공한다H-품질의 중간 엽 줄기 세포. 더 나아가 같은 BM 등 성인 소스에서 중간 엽 줄기 세포에 비해 주 산기 중간 엽 줄기 세포의 높은 성장과 분화 가능성을 강조한다. 태반 태아 부착 UC 두 동맥, 정맥, CL 포함한 독특한 해부학 적 영역으로 큰 장기이며, WJ (혈관 주위 조직). 여러 연구 변수 성장 전체 코드는 WJ, 또는 태반에서 중간 엽 줄기 세포의 분리를,보고 및 차별화, 29 (25)에서, 전위. 그럼에도 불구하고, 지금까지 어떤 연구는 효율적으로 조사하지 않고 코드 / 태반 샘플의 다른 해부학 적 영역에서 세포를 비교했다. 우리는 여기에 UC, CPJ의 해부에 대한 체계적이고 간단한 방법을 제공하고, 중간 엽 줄기 세포의 분리를 위해 FP를 연결. 우리는 또한 확산 capabil를 결정하여 특성과 분리 된 세포의 품질을 평가하는 종합적이고 간단한 프로토콜을 보여시달,뿐만 아니라자가 재생과 분화 잠재력. 이 방법은 재현성 및 우수한 품질의 중간 엽 줄기 세포를 대량 산출한다. 우리는 하나의 세포로 조직의 완전한 소화가 분리 된 세포의 가난한 수율을 가지고있는 반면 크기의 조직 조각 1-2mm의 부분 소화, 외식에서 상용 트립신 솔루션을 재현성있게 산출 세포를 사용하는 것을 발견했다. 그러나 한 연구는 UC의 큰 조직 절편은 대략 크기가 10mm 세포 분리 (30)에 대한 최적이라고보고했다. 반대로, 다른 연구는 조직 절편 방법은 효소 분해 방법 (31)에 비해 더 긴 문화주기 및 세포의 낮은 수율 결과 제안했다. 이전의보고에서, 코드의 처리 및 콜라게나 제 II 히알루로, 개별적으로 또는 트립신을 다음과 같이 조직 코드 셀들 (32, 33)를 분리하기 위해 수행 된 <sup&gt; 34. 뿐만 아니라 이전의 배양에 코드 조직의 소화 방법의 변화의 큰 거래는이뿐만 아니라 분리 된 세포는 이종 것으로 나타났다. 더 긴 시간 기간 동안 열악한 효소의 사용은 세포 부착 및 증식에 영향을 미치는, 세포막을 저하시킬 수있다. 이 방법의 결과는 부분적으로 분해 된 조직 이식편 산기 광범위한 세포 손상을 유발하지 않고 세포의 생장을 제공하는 것으로 밝혀 생존을 유지하고, 중간 엽 줄기 세포의 동종 개체군의보다 많은 양을 얻었다. 외식에서 세포의 해부 및 절연을위한 프로토콜은 간단하지만, 일부 단계는 쉬운 일이 있습니다. 먼저, 배양 플라스크의 표면에 그 부착시킴으로써 이식편 부착을 보장한다. 이것은 단지 배양의 처음 2 시간 동안 조직 조각을 피복하고 신중 나머지 매체 추가 매체 소량을 사용하여 용이하게 할 수있다. 에스econd, T75 플라스크 당 15 개 이하로 이식편의 수를 제한한다. 조각 또는 플라스크 당 너무 많은 조각 사이의 공간이 너무 작은 세포 생장 억제 용이다. 배양 3 일 후에 배양 플라스크의 표면에 충실하지 않는 셋째, 조직 조각 준수 및 배양을위한 새로운 플라스크에 전송해야합니다. 넷째, 조직 조각 부착을 억제 세포 파편, 없어야 배양한다. 다섯째, 큰 조각의 배양 배지가 더 필요하고 세포 생장 효율이 향상되지 않는다. 세포가 빠르게 합류되고 티슈 소스에 따라 구분할 수 있으므로 마지막으로, 특히 세포 생장의 출현 후에, 가깝게 이식편 배양 물을 모니터. 기술의 몇 가지 제한은 CL, WJ, CPJ 및 FP를 분리하는 샘플을 해부에 대한 전문 지식의 부족을 포함한다; WJ 낮은 수율로 생성 된 작은 샘플 크기; 지연 - 처리 샘플을 수집하는 아보 2-4 시간 내에 처리 할 필요ID 세포 복구의 손실. 중간 엽 줄기 세포의 특성 분석을위한 황금 표준은 플라스틱을 고수 섬유 모세포 표현형을 형성하고, 여러 계통으로 분화 할 수있는 능력이다. 이들은 또한 ISCT 35 바와 같이 중간 엽 줄기 세포를 정의하기위한 일반적으로 사용되는 기준이다. 본 연구에서는 네 개의 소스에서 분리 된 세포는 플라스틱을 부착했다 및 MSC 마커 (CD29, CD44, CD73, CD90, 및 CD105)하지만 조혈 마커 CD45에 대한 부정적인 표현을위한 긍정적 인 표현을했다. 또한, 그들은 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I을 발현하지만 HLA 클래스 II에 대한 음성이었다. BM-MSC들에 비해 WJ- CPJ 및 유래 세포는 높았다. 이러한 결과는 이전의보고와 일치하는 중간 엽 줄기 33, 36, 37, 38 UC 유래. 또한, 이러한 결과는 CL-가 WJ-가 CPJ-는 FP-엽 줄기 세포가 발현 pluri되었습니다이러한 OCT4, NANOG와 같은 효능 SOX2 유전자; 이전 39보고하지만, 그 표현은,는 ESC보다 낮았다. 이러한 결과는 주 산기 - 유래 세포 (40)의 만능 마커의 발현을보고 이전 연구와 일치도 있었다. 흥미롭게도,이 만능 마커의 발현이 다른 소스에서 분리 된 세포보다 CPJ-중간 엽 줄기 세포에서 더 높은 것을 관찰되었다. 또한 UC-중간 엽 줄기 세포는 BM-중간 엽 줄기 세포 (41)보다 더 큰 자기 갱신 잠재력을 전시 것을 발견했다. 흥미롭게도, 표현형 특성의 유사성에도 불구하고, 네 개의 소스에서 고립 된 세포는 변수 CFE 값을했다. 그러나, FP-MSC를 제외하고, 그들은 모두 BM-중간 엽 줄기 세포보다 더 CFE 값을했다. 다른 모든 중간 엽 줄기 세포에 비해 CPJ-중간 엽 줄기 세포는 증식의 가장 높은 CFE 값과 속도를 가지고 있었다. 또한 WJ- CPJ-및 중간 엽 줄기 세포는 BM-MSC들보다 분화 잠재력을 표시. CL-중간 엽 줄기 세포는 최소한의 차별화를 보여 주었다CPJ-중간 엽 줄기 세포 반면 세 계보 (즉, 지방 세포, 연골 및 골 형성)에 가능성이 가장 높은 trilineage 차별화 가능성이 있고 FP-중간 엽 줄기 세포는 적어도 지방 세포 분화 잠재력을 표시. 결론적으로, 우리의 결과는 고립 된 중간 엽 줄기 세포의 질과 양이 코드 / 태반 샘플의 4 개 소스 사이에 차이가 있음을 보여 주었다. CPJ-중간 엽 줄기 세포보다 증식 능력과 더 큰 자기 갱신 잠재력을했다. 그들은 또한 trilineage의 세포 유형으로 분화에서 강력한했다. 때문에 낮은 배가 시간에, CPJ-중간 엽 줄기 세포는 빠르게 수 1,000 배 확대 및 높은 처리량 약물이나 생체 재료 검사에 사용 할 수있다. 이 세포는 세포 치료와 재생 의학 응용 프로그램에 대한 더 유망한 원천이 될 수 있습니다.

줄기 세포는 여러 기관과 신체 조직에 존재한다. 그들은 재생 잠재력을 보유하고 인간의 삶 1, 2의 범위에 걸쳐 몸에 손상된 조직을 복구에 중요한 역할을한다. 이것은 특히 이후 성체 줄기 세포 (ASC를) 관심의 큰 거래를 생성 한 배아 줄기 세포 (는 ESC) 달리의 ASC의 사용은 도덕적, 윤리적 딜레마를 제기하지 않습니다. 몇몇 연구는 중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포) 등의 ASC의 고립을보고, 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포); 및 지방 조직 (AT) 및 치과 펄프 3, 4, 5, 골수 (BM)에 이르기까지 다양한 성인 출처 등 다양한 조상. 그러나, 성인 틈새 시장의 대부분은 제한되고있어 존재의 ASC의 수는 자신의 분리는 일반적으로 가능한 기증자와 침략 고통스러운 과정을 포함한다사이트 이환율. 또한, 기증자의 나이와 환경 스트레스 또한 절연 세포 6, 7, 8의 품질과 생물학적 활성을 결정하는데 중요한 역할을 할 수있다. 의 ASC는 체외 배양시 증식 및 제한된 분화 잠재력을 표시. 현재의 ASC의 이러한 단점을 극복하기 위해 새로운 소스는 줄기 세포를 분리하기 위해 추진되고있다. 이러한 노력은 제대혈, 코드 조직, 태반, 유체 9 양수를 포함한 주 산기 소스로부터 줄기 세포의 분리로 이어졌다. 이 소스 때문에 쉽고 풍부한 가용성 10, 11, 12, 13의 관심을 얻고있다. 이들로부터 유도 된 또 산기 조직을 비 침습적으로 얻어진 줄기 세포 수는성인 소스 (14), (15)에서 분리의 ASC보다 더 원시적. 그들은 출생시 얻은 조직에서 분리되어 인해 노화 및 환경 스트레스 (16)에 게놈에 최소한의 변경을받은 것으로 간주됩니다. 그러나보고 된 주 산기 소스에서 줄기 세포의 특성과 그들의 잠재적 인 자기 갱신뿐만 아니라 차별화하는 17 널리 11 다릅니다. 이는 인간의 탯줄 (UC)는 복잡한 기관이다는 사실에 부분적으로있을 수 있습니다. 우리는 주 산기 조직의 분리 된 영역이 변화 및 비 산기 소스에서 파생 된의 ASC에 비해 이러한 줄기 세포의 원시적 특성에 대한 책임을 특정 틈새 시장을 만드는 것이 가설을 세웠다. UC, 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 본 연구는 세 영역으로 이산 해부학 코드 / 태반 샘플의 박리를 설명태반 태아 D (FP). UC 추가로 두 개의 영역으로 해부했다 : 코드 라이닝 (CL)과 와튼의 젤리 (WJ). CL, WJ, CPJ 및 FP에서 분리 된 세포의 분석은 모든 fibroblastoid 형태를 전시하고 MSC 마커를 표현 시연,하지만 그들은 자신의자가 재생과 분화 가능성 달랐다. 이들 세포 치료, 재생 의학 및 조직 공학을위한 유망한 소스 만들기, UC-및 FP-유래 세포에 비해 CPJ-유래 세포는 증식과 자기 갱신 가능성의 높은 비율을 보였다.

<table><tbody><tr><td>4,500mg/mL 포도</td>당 <td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Aleken Biologicals</td><td>FBSS500</td><td></td></tr><tr><td>Isobutyl-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879-250mg</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Sigma</td><td>D4902-100mg</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Prospec</td><td>CYT-270</td><td></td></tr><tr><td>인도메타신</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>TGF&베타; 1</td><td>Prospec</td><td>CYT-716</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td>, <td>Sigma</td><td>A-7631</td><td></td></tr>, <tr><td>아스코르브산염, 2-인산</td>염, <td>Sigma</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-글리세로인산</td>염, <td>Sigma</td><td>G-6251</td><td></td></tr>, <tr><td>TrypLE</td>, <td>Invitrogen</td><td>50591419</td><td></td></tr>, <tr><td>GeneJET RNA 정제 키트</td><td>, Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>iScript 키트</td><td>Biorad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit</td><td>Biorad</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>STORO100</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine 블루</td><td>Thermo Scientific</td><td>S71363</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>시그마</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin 레드 스테인</td><td>Thermo Scientific</td><td>S25131</td><td></td></tr><tr><td>APC 마우스 안티-휴먼 CD29</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>559883</tr><tr><td>APC 마우스 안티 휴먼 CD34</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>555824 FITC 마우스 안티-휴먼 CD44</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>555478 FITC 마우스 안티 휴먼 CD45</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>555482</tr><tr><td>APC 마우스 안티 휴먼 CD73</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>560847</tr><tr><td>FITC 마우스 안티-휴먼 CD90</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>561969 APC 마우스 안티-휴먼 CD105</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>562408</tr><tr><td>원심분리기</td><td>IEC</td><td>93522M-2</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hera Cell 150i</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경(LM)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Thermo Scientific</td><td>0267151B</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II 및 Diva Software</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>칸토 II&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>MJ 리서치 Inc.</td><td>PTC-100</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR 시스템&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td>CFX96</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

인간의 탯줄 (UC) 및 태반은 어떤 윤리적이나 도덕적 문제를 제기하지 않기 때문에 점점 더 관심을 얻고있다 중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포)의 비 침습적 원시적이고 풍부한 소스입니다. UC에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하기위한 현재의 방법은 가변 확산 전위와 소량의 세포를 얻었다. UC가 복잡한 해부학 기관이므로 MSC 특성의 차이는 분리 영역의 해부학 적 차이에 기인 할 수있다. UC, 코드 - 태반 접합부 (CPJ), 태반 및 태아 (FP) : 본 연구에서는 처음 세 이산 해부 영역에 코드 / 태반 샘플 해부. 둘째로, 두 개의 구별되는 영역이, 코드 라이닝 (CL)과 왓슨의 젤리 (WJ)를 분리 하였다. 체외 이식편 배양 기술은 다음 네 개의 소스로부터 세포를 분리하는 데 사용되었다. 체외 이식편의 세포의 일차 배양에 필요한 시간은 조직의 소스에 따라 변할. (4) 다 - 세포의 증생 (3) 내에서 발생한각각 CL / WJ 및 FP 이식편로부터 14 일 - 십일 11 - 7 성장 후에 관찰 된 반면 CPJ 외식 YS. 분리 된 세포를 플라스틱에 대한 접착 성이었고 마찬가지로 골수 유래 중간 엽 줄기 세포로, 예컨대 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105과 같은 fibroblastoid 형태 및 표면 마커를 표시. 그러나 CPJ-엽 줄기 세포 및 중간 엽 줄기 세포와 WJ-변화 세포의 콜로니 형성 효율은 BM-MSC들보다 더 높은 효율을 나타내는. 네 개의 소스에서 중간 엽 줄기 세포들은 다 능성했다 나타내는, 지방 세포, 연골 및 골 형성 계보로 분화. CPJ-중간 엽 줄기 세포는 다른 MSC 소스에 비해보다 효율적으로 차별화. 이러한 결과는 CPJ 가장 유력한 해부학 영역이고, 시험 관내에서 더욱 증식 및자가 재생 능력을 가진 세포의 수를 높게 수율 제안. 결론적으로, 네 개의 소스로부터 중간 엽 줄기 세포의 비교 분석 CPJ 세포 요법 용 중간 엽 줄기 세포 regenerativ보다 유망한 소스 인 것으로 나타났다전자 의학 및 조직 공학.

해부와 인간의 탯줄, 코드 - 태반 접합 및 태아 태반에서 세포의 분리 주 산기 조직은 세 개의 분리 된 해부학 적 영역으로 구성되어 있습니다. CL (코드의 외측 내벽) 및 WJ (코드 안쪽 혈관 주변의 젤리 형상 재료) : 처음 두 동맥 및 하나 개의 정맥뿐만 아니라, 두 개의 별개의 영역을 포함하는 상기 UC이다. 둘째 CPJ (탯줄 및 태반의 접속)이고, 세 번째는 (코드가 모체의 자궁 벽에 부착 된 태반에 삽입)을 CPJ 직후 FP이다. 산기 조직으로부터 세포를 분리 프로토콜의 개략도는도 1에 도시되어있다. 네 소스-CL, WJ, CPJ하고 명확하게 식별은 FP-하고도 2에 도시 된 바와 같이, 체외 이식편에서 세포를 분리하기 위해 분리 하였다. 티절편 문화에서 세포 부산물의 그 모습은 정기적으로 모니터링하고 LM에 의해 기록되었다. 자기편 fibroblastoid 세포는 CPJ 외식을 배양 3-4 일 후에 관찰되었다. 비슷한 형태를 가진 세포는 각각 WJ, CL, 및 FP 외식를 배양 한 후 7 ~ 8, 9 ~ 10, 및 11-14일 나타났다. 다양한 소스 (CL, WJ, CPJ 및 FP)을 나타내는 이식편에서 세포의 생장은도 3a에 도시되어있다. 이 세포는 P0으로 간주되었다. P0 세포를 계대 배양했을 때, 그들은 BM-중간 엽 줄기 세포와 유사한 fibroblastoid 형태를 표시, 클론 적 성장을 보였다. 그러나,도 3b 및 C에 도시 한 바와 같이, 32 시간 내지 CPJ 및 FP 세포로부터 94 시간까지 다양한 집단 배가 시간의 변동을 나타내었다. WJ 및 CL의 세포가 유사한 두 배로 시간이 CPJ 및 FP에 내측했다. P0에서 세포의 추가의 분석은도 16에서 92에 이르는 콜로니의 CFE 변할 것으로 나타났다.FP 세포가 낮은 (16) CFE 있었다 동안 CPJ에서 세포는 가장 높은 (92)를 가졌다. CL 및 WJ에서 세포를 59 개, 80 콜로니를 각각 (도 4A-C)의 값을 CFE했다. CL에서 세포는 BM-중간 엽 줄기 세포와 유사한 CFE 값을했다. 이러한 결과는 CPJ-유래 세포가 이상 증식과 자기 갱신 능력을 가지고하는 것이 좋습니다. 분리 된 세포의 Immunoprofile CL, WJ, CPJ 및 FP에서 분리 된 세포는 세포 특이 마커의 발현을 조사 하였다. P3-5 세포는 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105 (도 5A와 B) 등 중간 엽 줄기 세포 마커의 양성 발현을 표시. 이 세포는 내가, 마커 HLA-ABC, 계급에게 II 마커, HLA-DR (3)를 표현하지 않는 주요 조직 적합성 클래스를 표현하는 것으로 알려져있다. 제 양성 세포의 백분율네 소스에서 선택된 마커 표준 BM-MSC들에 의해 표현 된 것과 유사 하였다 ESE. 그러나, MFI 비율은 WJ- CPJ 및 유래 세포는 거의 유사하며 CL- FP 및 유래 세포 (도 5c)보다 더 높은 것을 나타낸다. 흥미롭게 CFE 값을 변화에도 불구하고, 다른 소스로부터의 모든 세포는 MSC 마커 비슷한 수준을 나타냈다. 세포 표면 마커의 결과를 바탕으로, 네 개의 소스에서 분리 된 세포가 중간 엽 줄기 세포로 간주되었다. 이러한 세포의 추가의 분석은도 5d에 도시 된 바와 같이, 그들은 또한, 다 능성 유전자, OCT4, NANOG, KLF4 및 SOX2 표현 것으로 나타났다. CPJ-중간 엽 줄기 세포는 WJ-, CL-와 FP-중간 엽 줄기 세포 다음 만능 마커의 가장 높은 표현을했다. 고립 된 중간 엽 줄기 세포의 분화 가능성 중간 엽 줄기 세포의 특성을위한 황금 표준은 diffe 할 수있는 능력이다여러 계통으로 rentiate. 우리의 결과는 주 산기 모든 소스로부터 고립 된 중간 엽 줄기 세포는 쉽게, 지방 세포 연골 및 골 형성 세포 유형으로 분화 된 것으로 나타났다. 지방 세포 유도체는도 6a에 도시 된 바와 같이, 양, 오일 레드 O로 염색 된 지방 방울을 일으켰다. 중간 엽 줄기 세포의 연골 유도체의 톨루이딘 블루 염색이 세포 외 기질 (도 6b)의 제조에 도움 프로테오글리칸 및 당 단백질의 존재를 보였다. 그림 6 (C)에 도시 된 바와 같이 긍정적 인 알리자린 레드 염색 중간 엽 줄기 세포의 골 형성 유도체는 뼈 광물에 포함 된 칼슘 침전물의 존재를 나타냅니다. 예상대로, 모든 소스로부터의 고립 된 중간 엽 줄기 세포의 전사 분석 trilineage 차별화 (그림 6D -F)을 보여 주었다. 그러나, 냄비분화 ential는 중간 엽 줄기 세포의 근원에 따라 다양. WJ-엽 줄기 세포의 지방 세포 유도체 CPJ-MSC들에 비해 선택된 지방 세포 유전자 (CEBPβ, FABP4 및 PPARγ)의 발현 수준보다 2 배이었다. CL- 및 FP-중간 엽 줄기 세포는 유전자의 가장 낮은 표현했다. 연골 분화의 경우 CPJ-MSC들 유도체는 WJ- 및 FP-MSC들 유도체보다 50 배 연골 유전자 (SOX9 및 COL2)를 선택 나타냈다. CL-중간 엽 줄기 세포의 가난한 지방 세포의 분화와 마찬가지로, 그들은 연골 유전자의 가장 낮은 발현에 의해 분명로서, 낮은 연골 잠재력을했다. 조골 선택된 유전자 (COL1, OPN과 OCN)의 2 배 이상 전사 수준으로 나타낸 바와 같이 CPJ-엽 줄기 세포는 가장 높은 골 세포 분화 잠재력을 보였다. 그러나, 전구 마커 RUNX2의 발현이 세포 분화 조건에 응답에 느린했다 나타내는, WJ-중간 엽 줄기 세포의 골 형성 파생 상품에서 가장 높았다. 다시, CL-중간 엽 줄기 세포는 가난한 보여 주었다골 형성 혈통으로 차별화. 이러한 결과는 CPJ-중간 엽 줄기 세포와 WJ-중간 엽 줄기 세포가 CL- 및 FP-중간 엽 줄기 세포보다 분화 잠재력을 표시하는 것이 좋습니다. CL-중간 엽 줄기 세포는 trilineage 유도체로 분화 할 수있는 가장 가능성이 있었다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig1.jpg" /> 도 1 : 인간 제대 코드, 코드 - 태반 정션 태아 태반 세포의 분리의 개략도. 수집 된 샘플을 검사하고 해부를 진행합니다. 1. 수동 해부 세 이산 영역에 코드 / 태반 샘플을 별도의 단계 : 탯줄 (UC), 코드 - 태반 접합부 (CPJ), 태반 및 태아 (FP). 코드 라이닝 (CL)과 왓슨의 젤리 (WJ) 가위 집게를 사용 UC로의 별개의 두 영역을 분리한다. 2 단계. 1- t에 별도로 해부 조직의 각 컷O 2 mm 조각 가위를 사용하여 부분적으로 소화 편. 3 단계 문화를 조직 조각. 단계 4. 트립신 처리하여 이식편에서 세포를 분리. 하위 문화와는 분리 된 세포를 특징. 5 단계 절연 및 특징 세포를 증폭 및 다양한 애플리케이션에 사용할 수 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig2.jpg" /> 그림 2 : 인간 제대 코드, 코드 - 태반 접합 및 태아 태반에서 해부와의 Explants의 문화. UC (CL하게 분할하고 WJ로) CPJ 및 FP뿐만 아니라 연결된 동맥과 정맥의 세 가지 서로 다른 해부학 코드 / 태반 샘플의 영역은 제시된. CL, WJ, CPJ,및 FP는 이식편에서 세포를 분리하기 위해 수동 절개에 의해 분리 하였다. 해부 영역 각각 별도로 CM 9 mL로하여 2 판을 작은 조각으로 절단하고 75 cm 배양 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig3.jpg" /> 그림 3 : 인간 제대 코드, 코드 - 태반 접합 및 태아 태반에서 분리 된 세포의 형태학. LM 시각화 같이 CL, WJ, CPJ 및 FP의 이식편에서 (A) 세포 생장. CL, WJ, CPJ 및 FP 이식편으로부터 분리 된 세포의 (B) 계대 fibroblastoid 형태를 보였다. 스케일 바는 100 ㎛의 (: 4X의 배율)를 나타낸다. (C) 인구 t의 배가 시간그는 CL, WJ, CPJ 및 FP로부터 세포를 격리합니다. BM-중간 엽 줄기 세포는 표준으로 사용되었다. 오차 막대는 삼중 측정치의 평균의 표준 오차를 나타낸다 (** P ≤ 0.05 0.01 ≤ P *). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig4.jpg" /> 도 4 : 콜로니 형성 인간 제대 코드, 코드 - 태반 정션 태아 태반 세포의 효율. 1.63 세포 / ㎠의 밀도로 도금 클론 CL, WJ, CPJ 및 FP 분리 세포 (P0)의 (A)의 성장이, LM에 의해 가시화 하였다. (B) 크리스탈 바이올렛은 콜로니 형성 능력을 표시로 염색 된 세포의 현미경 사진. (C) 세포 염색 재치 단일 콜로니H 크리스탈 바이올렛. 스케일 바는 100 ㎛의 (: 4X의 배율)를 나타낸다. (D) CL, WJ, CPJ 및 FP 유래의 세포로부터 형성된 콜로니 수의 그래픽 표시. BM-중간 엽 줄기 세포는 표준으로 사용되었다. 오차 막대는 삼중 측정치의 평균의 표준 오차를 나타낸다 (** P ≤ 0.05 0.01 ≤ P *). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig5.jpg" /> 그림 5 : 인간 제대 코드, 코드 - 태반 접합 및 태아 태반에서 분리 한 세포에 의해 표현 MSC 마커의 분석. 제지 같은 (A) CL, WJ, CPJ 및 FP에서 세포에 의한 중간 엽 표면 마커 (CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105)의 발현유동 세포 계측법에 의해 채취. (B 및 C) 상기 선택된 중간 엽 표면 마커에 대한 양성 세포의 비율 및 평균 형광 강도 (MFI) 비율의 그래픽 표시. MFI 비율은 이소 타입의 MFI 값으로 (게이트 된 세포 집단의 형광 강도에 기초하여 상기 소프트웨어에 의해 생성 된) 상기 마커의 MFI 값을 나누어 계산 하였다. 오류 막대는 세중의 측정의 평균의 표준 오차를 나타냅니다. QRT-PCR에 의해 결정되는 바와 같이 CL, WJ, CPJ 및 FP에서 세포로 다 능성 유전자 (OCT4, NANOG, KLF4 및 SOX2)의 (D) 식. (** P ≤ 0.01 및 0.05 ≤ P *). 유전자 발현은 GAPDH와 β - 액틴에 정상화되었고, 오차 막대는 세중의 측정의 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 6 : 인간 탯줄, 코드 - 태반 접합 및 태아 태반에서 분리 한 중간 엽 줄기 세포의 Multilineage 차별화. (A) 세포 지질 방울의 존재를 나타내는 3 주 동안 지방 세포 분화 배지에서 배양 및 오일 레드 O로 염색 하였다. (B) 세포 펠렛을 3 주 동안 연골 분화 배지에서 배양 하였다. 펠렛 문화의 조직 학적 저온부는 글리코 사 미노 글리 칸의 존재를 표시, 톨루이딘 블루 염색 하였다. (C) 세포는 뼈 광물을 제안 칼슘 침전물의 생성을 표시하는 3 주 동안 골 형성 분화 배지에서 배양 및 알리자린 레드 염색 하였다. 모든 이미지는 LM에 의해 얻어졌다. 스케일 바는 100 ㎛의 (: 4X의 배율)를 나타낸다. BM-중간 엽 줄기 세포 우리표준으로 재사용. (DF) 선택된 유전자의 발현 (CEBPβ, FABP4 및 PPARγ; SOX9, ACAN 및 COL2 및 COL1, RUNX2는, 지방 세포, 연골 세포, 각각 조골 세포 계통으로 중간 엽 줄기 세포의 분화를 나타내는 OPN과 OCN)는 결정된 QRT-PCR 분석에 의해 (** P ≤ 0.05 0.01 ≤ P *). 유전자 발현은 GAPDH와 β - 액틴에 정상화되고, 오차 막대는 세중의 측정의 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 유전자 </td><td> 프라이머 시퀀스 </td><td> 제품 길이 </td></tr><tr><td> OCT4 </td><td> 앞으로-CCCCTGGTGCCGTGAA </td><td> 97 </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </td><td> &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> NANOG </td><td> 포워드 AAAGAATCTTCACCTATGCC </td><td> (110) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 GAAGGAAGAGGAGAGACAGT </td><td></td></tr><tr><td> KLF4 </td><td> 포워드 CGAACCCACACAGGTGAGAA </td><td> (94) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC </td><td></td></tr><tr><td> SOX2 </td><td> 포워드 TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA </td><td> (75) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 CTGGGGCTCAAACTTCTCTC </td><td></td></tr><tr><td> SOX9 </td><td> 포워드 AGCGAACGCACATCAAGAC </td><td> (85) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 CTGTAGGCGATCTGTTGGGG </td><td></td></tr><tr><td> COL2 </td><td> 포워드 CTCGTGGCAGAGATGGAGAA </td><td> (252) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 CACCAGGTTCACCAGGATTG </td><td></td></tr><tr><td> 수 </td><td> 포워드 AGCCTGCGCTCCAATGACT </td><td> (103) </td></tr><tr><td></td><tD&gt; 리버스 GGAACACGATGCCTTTCACC </td><td></td></tr><tr><td> COL1 </td><td> 포워드 AAGGTCATGCTGGTCTTGCT </td><td> (114) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 GACCCTGTTCACCTTTTCCA </td><td></td></tr><tr><td> RUNX2 </td><td> 포워드 TGCTTCATTCGCCTCACAAA </td><td> 111 </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 AGTGACCTGCGGAGATTAAC </td><td></td></tr><tr><td> OPN </td><td> 포워드 CATACAAGGCCATCCCCGTT </td><td> (112) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 TGGGTTTCAGCACTCTGGTC </td><td></td></tr><tr><td> OCN </td><td> 포워드 TAAACAGTGCTGGAGGCTGG </td><td> (191) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 CTTGGACACAAAGGCTGCAC </td><td></td></tr><tr><td> CEBPβ </td><td> 포워드 TATAGGCTGGGCTTCCCCTT </td><td> (94) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 AGCTTTCTGGTGTGACTCGG </td><td></td></tr><tr><td> FABP4 </td><td> 포워드 TTAGATGGGGGTGTCCTGGT </td><td> (158) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 GGTCAACGTCCCTTGGCTTA </td><td></td></tr><tr><td> PPARγ </td><td> 포워드 GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC </td><td> (74) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG </td><td></td></tr><tr><td> GAPDH </td><td> 포워드 ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG </td><td> (101) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 GCCATCACGCCACAGTTTC </td><td></td></tr><tr><td> 액틴 </td><td> 포워드 AATCTGGCACCACACCTTCTAC </td><td> (170) </td></tr><tr><td></td><td> 리버스 ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1 : 본 연구에 사용 된 인간 프라이머 시퀀스의 목록.

여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

이 프로토콜의 전체적인 목표는 탯줄 내막, 와튼 젤리(Wharton's jelly), 제대-태반 접합부 및 태아 태반의 네 가지 서로 다른 주산기 조직원으로부터 중간엽 기질 세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 비침습적으로 특수한 품질의 중간엽 줄기세포를 얻음으로써 줄기세포 생물학 및 대체 의학 분야의 발전에 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 서로 다른 주산기 조직원으로부터 고품질의 균질한 세포 집단을 대량으로 효율적으로 생성할 수 있다는 점입니다.이 기술로 유도된 다능성 제대 유래 중간엽 기질 세포는 성인 조직에서 분리한 중간엽 줄기세포보다 더 원시적인 특성을 가지므로 다양한 질병과 장애를 치료하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 제대와 태반의 서로 다른 분절 및 특정 틈새(niche)에서 유래한 중간엽 기질 세포의 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 먼저 생물안전 작업대 내의 얼음 위에 150 millimeter 페트리 접시에 샘플을 놓은 다음, 바늘과 주사기를 사용하여 ice cold PBS로 조직을 여러 번 헹굽니다.모든 혈전이 제거되면, 시료를 주의 깊게 살펴 서로 다른 해부학적 영역을 확인합니다. 그런 다음 핀셋으로 탯줄의 태아 쪽 끝을 잡고, 가위를 사용하여 탯줄-태반 접합부의 상단에 조심스럽게 절개선을 만듭니다. 접합부 아래쪽에 두 번째 절개선을 만들어 탯줄-태반 접합부를 태반에서 분리합니다.분리된 조직들을 각각의 페트리 접시에 나누어 담습니다. 다음으로, 상피 조직을 손상시키지 않으면서 혈관과 주변의 와튼 젤리(Wharton's jelly)가 완전히 노출되도록 탯줄을 세로 방향으로 절개합니다. 메스를 사용하여 혈관과 하양막 상피 사이에서 와튼 젤리를 긁어내어 제거합니다.그 다음, 혈관을 제거하면서 혈관 아래와 주변에 남아 있는 모든 혈관주변 젤리를 Wharton's jelly 접시로 옮기고, 남은 탯줄 내벽 조직은 별도의 접시에 담습니다. 모든 조직의 해부가 완료되면, 각 접시의 PBS를 3~5 mL의 trypsin으로 교체하고 가위를 사용하여 각 조직 샘플을 1~2 mm 크기로 자른 후, 37 °C 및 5% CO₂ 조건에서 30분 동안 배양합니다. 위상차 현미경을 사용하여 조직으로부터 세포가 방출되는 것을 시각화함으로써 부분 소화 상태를 관찰하십시오.부분 소화 단계가 끝나면, 동일한 부피의 배양액을 넣어 트립신을 중화시키고 각 샘플을 개별 50 milliliter 원심 분리 튜브(conical tube)로 옮깁니다. 조직 조각들이 가라앉을 때까지 3분 동안 기다립니다. 그 후 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 샘플당 15에서 20개의 부분 소화된 조직 조각을 개별 75 square centimeter 조직 배양 플라스크에 분주합니다.다음으로, 37°C에서 2~3일 동안 배양하기 위해 9mL의 배지를 첨가합니다. 3일 후 배지를 교체하고 위상차 현미경으로 외식편의 세포 성장을 관찰합니다. 세포 밀도가 70% 합류도(confluency)에 도달하면, 플라스크당 1~2mL의 트립신 용액을 넣어 세포를 해리시키며, 이때 효소 용액이 골고루 도포되도록 플라스크를 회전시킨 후 37°C에서 3분 동안 배양합니다.그 후 1~2 mL의 배양액으로 반응을 중화합니다. 원심분리를 통해 세포를 수집하고, 1 × 10⁴ cells/cm²의 파종 밀도로 계대 배양하기 위해 펠렛을 배양액에 재현탁합니다. 탯줄 내피 및 와튼 젤리(Wharton's jelly) 배양 세포의 콜로니 형성 효율 값은 각각 59 및 80 콜로니로 나타납니다.그러나 탯줄-태반 접합부 세포의 집락 형성 효율 값은 골수 중간엽 줄기세포에서 관찰된 값과 유사하며, 이는 탯줄-태반 접합부 유래 세포가 더 높은 증식 및 자기 재생 능력을 갖추고 있음을 시사합니다. 이러한 주산기 조직에서 분리한 단일 세포 현탁액의 유세포 분석 결과, 4가지 조직원 모두에서 특정 중간엽 줄기세포 마커에 대한 양성 세포 비율은 표준 골수 유래 중간엽 세포에서 발현되는 비율과 유사한 것으로 나타났습니다. 하지만 중앙 형광 강도 비율을 보면, Wharton's jelly 및 탯줄-태반 접합부 유래 세포는 태아 태반 유래 세포의 탯줄 내벽과 매우 유사하거나 더 높음을 알 수 있습니다.흥미롭게도, 군락 형성 효율 값의 차이에도 불구하고, 정량적 RTPCR 분석 결과 탯줄-태반 접합부 유래 중간엽 기질 세포를 제외한 서로 다른 주산기 기원 세포들은 모두 유사한 수준의 다능성 마커를 발현하였으며, 탯줄-태반 접합부 유래 세포는 테스트한 모든 다능성 마커에서 가장 높은 발현 수준을 보였습니다. 또한, 모든 주산기 기원에서 분리된 중간엽 기질 세포는 지방세포, 연골세포 및 골세포 유형으로 쉽게 분화되었으며 삼분화 분화 능력을 입증하였습니다. 다만, 분화 잠재력은 중간엽 기질 세포의 기원에 따라 차이가 있습니다.이 기술에 숙달되면 효율적으로 수행했을 때 2~3시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 측면 기술(lateral technique)을 연습하고 조직 공급원 간의 교차 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 이 기술은 연구자들이 주생식 조직 내 줄기세포 니치(stem cell niches)의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소 뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

인간의 탯 (UC) preterm, 용어, 결과로 perinatal 기간 동안 얻을 수 있습니다 하 고 postterm 배달. 이 프로토콜에서 우리 기술 분리와 UC 유래 중간 엽 줄기 세포 (UC-MSCs)의 태아/유아에서 임신 19-40 주.

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

우리는 인간 탯줄 조직으로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하고 골격근 혈통으로의 분화를 위한 프로토콜을 기술한다.

인간 탯줄 조직에서 중간엽 줄기 세포의 생성과 골격근 계보로의 분화

이 연구는 Wharton's jelly(WJ)의 무결성을 보존하기 위한 고유한 둔부 해부 절차를 제시하여 WJ가 덜 손상되고 수확된 중간엽 줄기 세포(MSC)의 양과 생존력을 높입니다. 이 방법은 기존의 날카로운 해부 방법에 비해 우수한 수율과 증식 능력을 보여줍니다.

Exclusion Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage(높은 수율과 낮은 손상의 탯줄 유래 중간클립 줄기세포의 분리)

이질적인 인간 UC-MSC를 구성하는 세 가지 주요 하위 그룹 중 하나인 BAMBI높은MFGE8높은 MSC의 분리는 특정 질병에 대한 임상 효능을 개선하기 위한 향후 적용을 위해 이 하위 유형의 특성과 기능을 완전히 이해하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 BAMBIhighMFGE8high UC-MSC를 분류하는 방법을 제시합니다.

Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells의 분리

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

인간 지방 유래 기질 세포 내의 전사 이질성은 세포 표면 마커와 골 형성 유전자를 사용하여 단일 세포 수준에서 정의할 수 있습니다.  우리는 골형성 잠재력이 증가된 세포 하위 집단의 분리를 위해 유세포 분석을 활용하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 두개안면 골격 재건을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

이 프로토콜은 9 주 된 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리에 대해 설명합니다. 근육은 다른 아가미 아치에서 시작. 이어서, 위성 세포 분화를 연구하기 mm 크기의 스폿 코팅에 배양했다. 이 접근 방법은 위성 세포의 팽창 및 계대를 피한다.

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

배우세요 인간 제대혈과 태반에서 중간 엽 기질 세포를 분리하는 방법을. 조직 배양 기법을 활용하여 고품질 줄기세포를 비침습적으로 얻고 특성을 분석하는 과정을 익힐 수 있습니다.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

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