Drosophila 그루밍 행동의 부량

이 방법의 전반적인 목표는 그루밍을 한 상태와 하지 않은 상태의 동물의 몸에 남아 있는 유색 브릴리언트 옐로우 염료의 양을 정량화하고 비교함으로써 초파리(Drosophila)의 그루밍 행동을 측정하는 것입니다. 이 방법은 미세 운동 능력의 조절 및 이와 관련된 분자 조절 인자와 회로와 같이 신경생물학 및 행동 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신속하고 견고하며, 다양한 숙련도의 실험자와 학생들이 쉽게 수행할 수 있다는 점입니다.

본 절차의 시연은 제 실험실의 학생인 Frankie Barradale이 맡게 됩니다. 실험을 시작하기 위해, 살아있는 Drosophila를 배양 바이알에서 그루밍 챔버로 옮길 흡입기를 준비하십시오. 가위를 사용하여 Tygon 튜브를 1.5 feet 길이로 자릅니다.

1 mL 일회용 마이크로 피펫 팁의 끝부분을 최소 1인치 정도 자르고, 1cm 정사각형 크기의 메쉬 조각을 자른 팁의 1/16인치 개구부 위에 대고 고정합니다. 메쉬와 자른 팁 위로 새로운 1 mL 마이크로 피펫 팁을 단단히 끼워 초파리용 유지 챔버를 만듭니다. 새 마이크로 피펫 팁의 맨 끝부분을 잘라 초파리 한 마리가 통과할 수 있을 만큼 개구부를 넓힙니다.

구멍은 그루밍 챔버의 입구 크기와 대략 일치하게 됩니다. 중첩된 팁들을 Tygon 튜브 끝에 딱 맞게 끼우십시오. 진공 압력이 유지될 수 있도록 팁들을 튜브 안으로 밀어 넣어 단단히 고정하십시오.

튜브의 반대쪽 끝에 200 milliliter 마이크로 피펫 팁의 끝부분을 자른 후, 좁게 잘린 끝부분을 튜브에 끼워 흡입기의 입구 쪽을 형성합니다. 분진 분주 튜브를 준비하려면, 칭량지에 brilliant yellow dye 5 milligrams를 잽니다. 이 분말을 8 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 붓고 캡을 단단히 닫습니다.

다음으로, 에탄올 튜브를 준비하기 위해 100% ethanol 1 mL를 15 mL 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 넣습니다. 튜브에 라벨을 붙이고 캡을 닫아 그루밍 분석(grooming assay) 완료 시까지 보관합니다. 또한 음성 대조군을 위해 파리가 없는 에탄올 1 mL만 포함된 공시료(blank sample)를 최소 하나 포함하십시오.

작은 구멍이 있는 슬라이딩 상단 플레이트를 나사로 고정하여 각 그루밍 챔버를 조립하되, 먼지를 추가할 수 있도록 큰 구멍이 있는 하단 플레이트는 제거한 상태로 둡니다. 필요한 각 그루밍 챔버를 상단 면이 아래로 향하게 하여 테이블 위에 평평하게 놓습니다. 원하는 웰 위의 챔버 표면에 튜브를 톡톡 두드려 5 mg의 브릴리언트 옐로우 염료 분취액을 각 챔버에 넣습니다.

챔버를 테이블에 가볍게 두드려 모든 먼지가 메쉬를 통해 플레이트 상단으로 떨어지도록 합니다. 그런 다음, 원뿔형 개구부의 넓은 끝이 바깥쪽을 향하고 구멍이 웰 위에 놓이지 않도록 각 챔버에 바닥 플레이트를 나사로 고정합니다. 바닥 플레이트가 밀려나서 염료가 유출되지 않도록 단단히 고정하십시오.

챔버를 뒤집어 테이블 위에 몇 번 가볍게 두드려 먼지가 메시를 통해 바닥 판으로 떨어지게 합니다. 챔버의 상단 판을 작은 구멍들이 15개의 웰과 일치하는 열린 위치로 밀어 넣어, 개별 웰에 초파리를 넣을 수 있도록 합니다. 빨대를 사용하는 것처럼 흡입기의 한쪽 끝을 통해 부드럽게 빨아들여 초파리 한 마리를 마우스 흡입기에 넣습니다.

입구를 대상 방향으로 향하게 한 뒤 가볍게 불어 초파리를 넣습니다. 웰에 초파리를 넣은 후, 상단 플레이트를 밀어 초파리가 챔버 안에 갇히게 하고, 다른 웰에 초파리를 넣는 동안 초파리가 탈출하지 않도록 웰 입구를 테이프로 막습니다. 만약 한 웰에 여러 마리의 초파리가 들어갔다면, 초파리가 한 마리만 남을 때까지 해당 입구를 덮지 않고 둡니다.

필요한 모든 웰에 파리를 채운 후, 하단 플레이트가 위로 향하게 챔버를 뒤집어 가루가 메쉬를 통해 떨어지며 파리에 도포될 수 있도록 합니다. 나사를 조여 상단 및 하단 플레이트를 단단히 고정한 다음, 챔버를 4초 동안 볼텍싱하여 파리에 가루를 입힙니다. 챔버의 상단 플레이트가 테이블 바닥을 향하게 하여 두 번 가볍게 두드려 염료가 반대편으로 떨어지게 합니다.

그다음, 상단 플레이트가 위로 오도록 챔버를 뒤집고 챔버를 두 번 두드려, 상단 챔버에 고정된 초파리로부터 떨어져 염료가 하단 챔버 바닥에 가라앉도록 합니다. 그루밍을 허용하지 않는 대조군 초파리의 경우, 즉시 시료 준비 단계로 진행하십시오. 초파리가 그루밍을 할 수 있도록 상단 플레이트가 위를 향한 상태로 챔버를 테이블이나 작업대 위에 30분 동안 평평하게 놓아둡니다.

모든 그루밍 실험 환경을 일정하게 유지하기 위해, 챔버를 소음과 진동이 없는 공간에 배치하십시오. 챔버를 수평으로 유지하고 상단 플레이트가 위를 향하게 한 상태에서, 염료를 흘리지 않도록 주의하며 하단 플레이트를 조심스럽게 풀어 챔버에서 분리하십시오. 파리가 마취될 때까지 공기 흐름이 낮은 CO2 패드 위에 챔버를 올려두십시오.

챔버에서 상판을 돌려 분리한 다음, 핀셋을 사용하여 조심스럽게 다리 부분을 잡아 각 챔버에서 가루가 묻은 초파리를 한 마리씩 꺼내 에탄올이 들어 있는 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 각 마이크로 원심분리 튜브에 초파리가 한 마리씩 들어가면 캡을 닫고 튜브를 세 번 뒤집어 염료와 에탄올 용액이 섞이도록 흔들어 줍니다. 초파리와 에탄올이 담긴 튜브를 실온에서 5시간 동안 배양하여 초파리의 염료가 용액으로 완전히 제거되도록 합니다.

5시간 후, 각 튜브를 2초간 짧게 볼텍싱하여 파리로부터 염료가 완전히 제거되었는지 확인합니다. 실험용 1.5 milliliter 튜브의 내용물 중 50 microliters를 96-well 플레이트의 웰에 분주하고, 플레이트 내 각 샘플의 위치를 기록합니다. 가루가 과도하게 묻은 파리로 인한 밀봉 효과나 큰 그루밍 결함을 방지하기 위해, 에탄올 200 microliters를 첨가하여 샘플을 5배 희석합니다.

플레이트 리더를 사용하여 각 샘플을 397 nanometers에서 분석하십시오. 플레이트 리더를 통해 샘플을 기록하고, 플레이트 상의 기록된 샘플이 포함된 스프레드시트를 저장하십시오. 저희는 강한 하이포모프(hypomorph) 및 null DopR 돌연변이체와 야생형 균주의 그루밍 성능을 비교함으로써 DopR을 연구하기 위해 이 방법을 사용했습니다.

DopR 돌연변이체는 야생형 또는 구조된 대조군에 비해 염료가 훨씬 더 많이 남아 있었으며, 이는 DopR 돌연변이체의 그루밍 행동 효율이 더 낮음을 나타냅니다. Rutabaga 초파리를 이용한 병행 실험에서 돌연변이체는 DopR 돌연변이체보다 더 높은 염료 축적 수준을 보였으며, 이는 그루밍 행동에서 DopR의 중요한 역할을 시사합니다. 이 영상을 시청하고 나면 행동 분석을 위한 초파리 취급 방법과 그루밍 행동의 측정 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.