인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

이러한 절차의 전반적인 목표는 제브라피시를 인플루엔자 모델로 사용하여 바이러스 감염에 대한 숙주 면역 반응을 연구하고 항바이러스 화합물을 스크리닝하는 것입니다. 이러한 방법은 감염 중 면역 및 염증에서 식세포가 수행하는 역할과 잠재적인 항바이러스 요법의 효능과 같은 인플루엔자 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인플루엔자에 대한 제브라피시 모델은 개발 중인 제브라피시의 광학적 선명도와 중간에서 높은 처리량 분석을 수행할 수 있는 능력으로 인해 이전에 답하지 못했던 질문을 해결할 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 레이건트를 준비하고 배아를 원하는 단계로 올린 후, 실험 당일에 5번 집게를 사용하여 배아를 탈척합니다. APR-8 또는 X31 바이러스를 사용하는 경우, 층류 후드에서 바이러스를 3 점 3 배 10 6 개의 계란 감염 용량 50 %로 희석하고 제로 포인트 2 5 % 페놀 레드가 보충 된 멸균 얼음 차가운 PBS에서. NS1-GFP 균주를 사용하는 경우 바이러스를 약 1점으로 희석하여 10을 곱하여 나노리터당 두 번째 PFU를 생성합니다.

동시에 바이러스와 유사하게 희석된 감염되지 않은 닭고기 달걀의 알란토성 액체를 포함하는 대조군을 설정합니다. 그런 다음 마이크로 로더 팁을 사용하여 바이러스 용액을 마이크로 주사 바늘에 피펫하고 마이크로 주사 바늘을 주사 장치의 적절한 홀더에 삽입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 바늘을 자른 후 압력 주입기의 압력 및 타이밍 설정을 조정하고 원하는 주입량에 도달할 때까지 바늘 끝을 다시 자릅니다.

배아를 마취한 후 플라스틱 피펫을 사용하여 10-20개의 배아를 2% 아가로스 플레이트와 피펫으로 옮겨 과도한 액체를 제거합니다. 실체 현미경 아래에서 화염 광택 및 밀봉된 붕규산 유리 모세관을 사용하여 큐비에 관 또는 후방 추기경 정맥이 미세 주입 바늘과 일직선이 되도록 배아를 부드럽게 정렬하고 방향을 지정합니다. IAV의 미세주입을 수행하려면 미세주입 바늘을 큐비어 관 또는 후방 원맥에 부드럽게 삽입하십시오.

그런 다음 풋 페달을 밟아 원하는 양의 IAV를 배아의 순환계에 주입합니다. 전신 감염을 일으키기 위해서는 주사 덩어리가 순환계로 쓸려 올라가 몸 전체에 분포되는 것이 중요합니다. 감염 부위에 덩어리가 모이면 실험에서 배아를 제거하고 안락사시킵니다.

수정 후 5일 후, 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 바늘을 준비합니다. 바늘이 부풀어 오른 부레를 포함하는 TG MPX mCherry 유충을 방금 설명한 대로 정렬하되, 바늘이 부풀어 오른 부레를 뚫고 바이러스가 부풀어 오른 부레를 뚫고 바이러스가 부풀어 오를 수 있도록 유충을 배치합니다. 미세 주입 바늘을 수영 방광에 부드럽게 삽입하고 원하는 부피를 장기 뒤쪽으로 주입합니다.

주사 용액은 뒤쪽으로 모여야 하고 수영 부레의 기포는 앞으로 이동해야 합니다. 수영 방광염을 일으키기 위해서는 주입 덩어리가 수영 방광의 뒤쪽으로 모여 기포가 앞으로 이동하도록 하는 것이 중요합니다. GFP 발현은 주사 후 3시간 이내에 관찰되기 시작해야 합니다.

대조 용액을 포함한 주입을 완료한 후 유충을 멸균 난수가 담긴 페트리 접시로 옮기고 섭씨 33도에서 물고기를 부화시킵니다. 항바이러스제 치료를 수행하려면 감염 후 3시간 후에 NS1-GFP의 난수를 교체하고 감염된 물고기를 자나미비르 밀리리터당 0, 16.7 또는 33.3나노그램을 함유한 멸균수로 대조합니다. 주사 후 24-48시간부터 무기력 징후 및 부종의 증거, 색소 침착의 차이, 안구 및 두개골 안면 기형, 전만을 포함하여 질병 병리학과 관련된 감염 역학에 대한 관찰을 기록하기 시작합니다.

감염 후 5일 동안 24시간마다 죽은 유충, 병적 유충 및 건강한 유충의 수를 기록합니다. 데이터를 Y축에 건강한 물고기, 병적인 물고기 또는 죽은 물고기의 백분율이 표시되고 X축에 치료 그룹이 표시된 누적 막대 그래프로 플롯합니다. 이미징을 위해 제브라피시를 장착하려면 NS1-GFP에 감염된 개별 형질전환 MPX mCherry 유충을 24웰 유리 바닥판의 우물과 작은 계란 물 방울로 옮깁니다.

다른 IAV에 감염된 사람에 대해 반복하고 물고기를 통제합니다. 각 웰에 1%의 아가로스 배아 장착 배지를 천천히 추가하고 큰 거품이 생기지 않도록 주의합니다. 유충의 위치를 부드럽게 조정하여 각각이 옆으로 장착되도록 합니다.

아가로스가 겔화되면 트리카인 1리터당 200마이크로그램이 함유된 달걀 물을 사용하여 개별 웰을 부드럽게 채웁니다. 컨포칼 현미경과 부레에 초점을 맞춘 20배 대물렌즈를 사용하여 명시야 및 형광 이미지의 z 스택 시리즈를 캡처합니다. IAV에 감염된 제브라피시 및 대조군 제브라피쉬의 부레에 존재하는 MPX mCherry 양성 호중구의 수를 정량화하고 비교합니다.

다음은 제브라피시의 전신 IAV 감염이 약물 효능을 테스트하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여주는 데이터입니다. 48 HPF의 배아에는 퀴비에 관을 통해 APR8, X31 또는 NS1-GFP를 주입하여 바이러스 감염을 시작했습니다. 바이러스 감염에 대한 대조군 역할을 하는 배아를 48 HPF에 주입했습니다.

감염 후 48시간이 지났을 때, IAV를 주입한 제브라피시는 심낭 전체에 존재하는 적혈구와 함께 심낭부종과 순환 정지의 증거를 보였습니다. Zanamivir에 노출되지 않은 감염된 물고기는 전신 GFP 발현에서 부종의 특징을 보였습니다. Zanamivir에 노출된 NS1-GFP 감염 유충에서 GFP 개화의 감소된 총 병리학이 관찰되었습니다.

국소 제브라피시 수영 방광 감염 모델에 대한 이 실험에서 NS1-GFP 바이러스를 수정 후 5일 후 형질전환 MPX mCherry 유충의 수영 방광에 주입하고 mCherry 표지된 호중구가 수영 방광으로 동원되는 것을 추적했습니다. 감염 후 20시간 후, PBS 주입 대조군에 비해 IAV에 감염된 물고기의 부레로 호중구가 상당히 이동하는 것이 관찰되었는데, 이는 IAV가 인간의 폐에 호중구를 모집하는 것처럼 부레로 호중구를 모집할 수 있음을 나타냅니다. 이러한 기술의 의미는 궁극적으로 임상으로 전환될 수 있는 숙주 인플루엔자 A 바이러스 또는 IAV 상호 작용에 대한 중요한 통찰력을 드러낼 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 항바이러스 요법으로 확장됩니다.

인플루엔자와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 접종 및 적절한 PPE 착용을 포함한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.