Name: 인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 배우세요 인플루엔자 바이러스 감염 연구를 위한 제브라피시 모델을 활용한 항바이러스 약물 스크리닝 및 면역 세포 반응 분석 방법을. 이 기법은 바이러스-숙주 상호작용 연구에 활용됩니다.

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저자는 제브라피시 관리 및 유지 관리에 대해 Mark Nilan에게 감사를 표하고 NS1-GFP를 전파하고 IAV 역가를 결정한 Meghan Breitbach와 Deborah Bouchard에게 감사를 표합니다. 이 연구는 NIGMS 보조금 NIH P20GM103534와 Maine Agricultural and Forest Experiment Station(발행 번호 3493)의 지원을 받았습니다.

모든 작업은 바이오 안전성 레벨 2 (또는 BSL2) 질병 통제 (CDC) 및 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설립 지시에 따라 미국 센터에 의해 기술 표준을 사용하여 수행해야합니다. 안전 및 규정 준수를 보장하기 위하여 적절한 관리들과 협의하시기 바랍니다. 1. Zebrafish의 관리 및 유지 보수 <ol><li> 제브라 피쉬를 생성하고 실험 배아의 필요한 번호를 수집합니다. 때 Adatto 등의 알에 의해 설명 된 것과 같이 필요한 대량 번식 탱크. 32 발달 스테이지 배아 다수를 수집하는데 이용 될 수있다. </li><li> 배아는 낮은 밀도에서 깊은 배양 접시에 원하는 발달 단계 (지역화, 수영 방광 감염에 대한 전신 IAV 감염 [섹션 3] 또는 오일 후 수정에 대한 48 시간 후 - 수정 [4 장] ()까지 개발할 수 있도록 &lt; (6)을 포함하는 살균 계란 물에 28 ° C에서 100 배아 / 요리)증류수 0 μg의 / ㎖ 바다 소금 (예를 들어, 인스턴트 오션). <ol><li> 플라스틱 전송 피펫과 함께 죽은 태아를 제거하고 최적의 건강과 발전을 보장하기 위해 달걀 물은 매일 변경합니다. </li></ol></li></ol> 재료 및 시약 2. 준비 <ol><li> 증류수와 오토 클레이브에 Tricaine-S의 4 ㎎ / ㎖ 주식 솔루션 (7.0-7.4로 산도를 조정)을 준비합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 마이크로 피펫 풀러 사용하여 필라멘트와 붕규산 유리 모세관을 당겨 (다음과 같은 설정으로 예를 들어 마이크로 피펫 풀러를 : 압력 설정 = 100, 열 = 550, 당겨 = [값 없음], 속도 = 130 시간 = 110). 주 : 앞서 바늘을 트리밍하기 위해 바늘이 바늘의 선단에 테이퍼 시작되는 지점까지의 길이는 약 12-15mm 것이다. 이 환경 설정 및 응용 프로그램을 기반으로하지만, 다를 수 있습니다. 더 긴, 더 점진적으로 테이퍼 때문에 배아를 관통하는 증가 된 능력과 감소 된 리의 더 바람직 할 수있다바늘의 휨이나 파괴의 SK. </li><li> 전자 레인지를 사용하여 100 ㎖ 달걀 물에 아가로 오스 2 g의 용융. 줄과 깊은 페트리 접시에 아가로 오스 용융이 응고 할 수 있도록 부어 배아를 주입하기에 번호판을 확인합니다. </li><li> 클레아없는 물에 자 나미 비르의 10 ㎎ / ㎖의 재고를 확인하십시오. -20 ° C에서 나누어지는 및 동결. </li><li> 배아는 아가로 오스 장착하기 위해 전자 레인지를 사용하여 50 ml의 달걀 물에 0.5 g 아가로 오스를 용융. 촬영하는 동안 사용할 준비가 될 때까지 50 ℃에서 물을 욕조에 유지합니다. </li></ol> 3. 전신 IAV 감염 (48 시간 후 수정) 주의 : 모든 연구 인력 IAV와 함께 작업을 시작하기 전에 예방 접종에 대한 자신의 상사와 의사와상의해야합니다. <ol><li> 수동 # 5 집게를 사용하여 실험 당일 배아 dechorionate. 제거 / ㎖ Tricaine 솔루션 200 μg의의 과정에서 부상 된 배아를 안락사주의하십시오. </li><li> 준비 오미세 주입을위한 F IAV 주 : 피쉬 태아 감염 도시 된 균주 인플루엔자 A / PR / 8 / 34 (H1N1) (APR8) 인플루엔자 X-31 A / 아이치 / 68 (H3N2) (X-31) 및 형광 리포터있다 인플루엔자 균주 NS1-GFP 33. APR8 및 X-31, 그리고 다른 균주에 대한 자세한 내용은, 인플루엔자 연구 데이터베이스에서 찾을 수 있습니다 <ol><li> 이전 34, 35 설명한 바와 같이 발육 계란에 IAV의 NS1-GFP의 피로를 전파. 수집, 나누어지는 및 -80 ° C에서 뇨 IAV를 포함하는 유체 및 저장을 역가. APR8 사전 역가와 X-31 바이러스는 시중에서 구입할 수 있습니다. <ol><li> 감염 직전 빠르게 장갑을 낀 손에 IAV 나누어지는을 해동 후 빨리 역가의 손실을 줄이기 위해 얼음에 배치합니다. </li></ol></li><li> 바이러스 성 희석 <ol><li> APR8 또는 X-31 바이러스를 사용하는 경우, 3.3 × 10 6 계란 감염 량 50 % (EID50)에 희석 / ㎖ 살균, 얼음처럼 차가운 PBS의 supplem에서0.25 % 페놀 레드 ented은 층류 후드 (시각화에 도움). 동시에 0.25 % 페놀 레드와 멸균 PBS가 포함 된 컨트롤을 설정합니다. </li><li> NS1-GFP 스트레인 (33)를 사용하는 경우, ~ 살균, 얼음처럼 차가운 PBS가 포함 된 0.25 % 페놀 레드 NL 당 1.5 × 10 2 플라크 형성 단위 (PFU)는 층류 후드에 (시각화에 도움)에 희석. 동시에 0.25 % 페놀 레드 멸균 PBS에 바이러스처럼 희석 감염되지 않은 닭 계란의 뇨 유체를 포함하는 제어를 설정합니다. </li><li> 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 IAV을 유지한다. </li></ol></li><li> 사용하기 직전에 microloader 팁을 사용하여 미세 주사 바늘로 피펫 바이러스 솔루션입니다. 사출 장치 (예 MPPI -3- 압입 시스템)의 해당 홀더 미세 주사 바늘을 삽입한다. </li><li> 스테레오 현미경으로 볼 때, 부드럽게 날카로운, 멸균 # 5 집게와 미세 주사 바늘 끝을 클립. 참고 : 그것은 recommen입니다DED 마이크로 인젝션 팁이 점진적으로 잘릴 수있다. </li><li> 가압 주입 시스템의 풋 페달 우울 및 교정 마이크로 미터 슬라이드 현미경 침지 기름 방울로 주입. 드롭의 직경을 측정합니다. 상기 수학 식을 이용하여 방울의 부피를 계산 V = V는 체적 NL이고 R이 μm의 반지름이다 / 3πr 3 4. 주 : 액적 직경이 너무 작은 경우, 추가로 유리 클립핑 될 수 있거나, 압력 및 타이밍 설정을 조정할 수있다. 액적 직경이 너무 크면, 압력 및 타이밍 설정을 조정할 수있다. </li><li> 압력 분사 압력 및 타이밍 설정을 조정하고 /하거나 목적하는 주입량 (일반적으로 1-3 NL)에 도달 할 때까지 바늘 끝을 reclip. 40 및 80 밀리 초 사이에 20, 30 PSI 및 펄스 지속 시간과 설정 압력의 설정은 일반적이다. 이 모세관 압력 카운터하지만 IAV (넷 제로 압력)을 누출되지 않도록 압력을 다시 조정한다. </li></ol></li><li> 주입을위한 배아를 맞 춥니 다 <ol><li> 200 μg의 / ㎖ Tricaine에 dechorionated 배아를 마취. </li><li> 이동이 중단되면, 플라스틱 피펫 (2.3 절에서 제조) 2 % 아가로 오스 판에 10 ~ 20 배아를 전송합니다. 초과 액체를 제거하기 위해 플라스틱 피펫을 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 화재 - 광택 및 밀봉 붕규산 유리 모세관에 미세 주입을 위해 배아를 맞 춥니 다. 퀴비에의 덕트 또는 후방 추기경 정맥은 미세 주사 바늘 (그림 1A)에 부합되도록 부드럽게 동양 배아를 스테레오 현미경을 사용. </li></ol></li><li> IAV 미세 주입 <ol><li> 조심스럽게 퀴비에의 덕트 또는 후방 추기경 정맥에 미세 주사 바늘을 삽입합니다. 배아 (그림 1A)의 순환 시스템에 IAV의 원하는 볼륨을 주입하기 위해 발 페달을 우울. 필요한 경우 배아 번 이상 삽입 될 수있다. 참고 : 주입 루스는 순환과 DISTRIB에 휩쓸한다몸 전체 uted. 주입 부피가 주사 부위에서 수집하는 경우, 실험과 안락사에서 배아를 제거합니다. </li><li> 선택 바이러스의 변형에 특정 제어 솔루션을 다른 배아에 주사를 반복합니다. APR8 및 X-31의 경우, 섹션 3.2.2.1에 설명 된 컨트롤을 사용; NS1-GFP를 들어, 섹션 3.2.2.2에 설명 된 컨트롤을 사용합니다. </li></ol></li><li> 33 ° C에서 인큐베이터에서 살균 계란 물과 장소를 포함하는 라벨이 배양 접시로 전송 배아. 참고 : 감염된 태아는 향상된 바이러스 복제를 지원하기 위해 33 ° C에서 성장한다. 또한 33 ° C에서 배양보다 자세히 IAV 감염이 발생 여기서, 외부 환경의 낮은 온도에 밀착하고있는 사람 상기도의 온도를 모방. 배아는 넓은 온도 범위 (34)에 적응 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 지역화, Tg가에서 수영 방광 IAV 감염 (MPX : mCherry) </EM&gt; 형질 전환 제브라 피쉬 (5 일 후 수정) <ol><li> 미세 주입을위한 IAV의 준비 <ol><li> 3.2 절에 설명 된대로 NS1-GFP 변형 및 제어 주입 솔루션을 희석. </li><li> 2.2 절에 설명 된대로 바늘을 준비합니다. </li><li> Tg는 (MPX : mCherry)을 맞 춥니 다음을 제외하고 3.3 절에 설명 된대로 팽창 수영 방광을 포함하는 35 애벌레. 바늘이 부레 관통하고 이전 36 (도 2a)에 기술 된 바와 같이 바이러스, 부레의 후방에 증착 될 수있는 방식으로 정렬 유충. </li></ol></li><li> IAV 미세 주입 <ol><li> 조심스럽게 부레에 미세 주사 바늘을 삽입하고 구조 (그림 2A)의 후방을 향해 원하는 볼륨 (예 : 5 NL)를 주입. 주 : 주입 덩어리가 후방으로 수집해야하고, 부레의 공기 방울은 ㄱ한다전자는 앞으로 변위. GFP 발현은 3 시간의 주입 후 관찰되기 시작한다. </li><li> 섹션 3.4.2에 설명 된대로 선택 바이러스의 변형에 특정 제어 솔루션을 반복 주사. </li></ol></li><li> 33 ° C에서 인큐베이터에서 살균 계란 물과 장소를 포함하는 배양 접시에 애벌레를 전송합니다. </li></ol> 5. 항 바이러스 약물 치료 주 : 프로토콜은 아래 이전에 가보 등에 도시 된 자 나미 비르 치료에 대해 설명합니다. 19. 이 프로토콜은, 다른 항 바이러스 약물을 스크리닝 수정 96 웰 플레이트, 고 스루풋 포맷 여러 화합물을 선별하도록 변형 될 가능성이있다 할 수있다. <ol><li> 3 시간 게시물 감염에서, 0, 16.7 또는 33.3 NG / ㎖ 자 나미 비르를 포함하는 살균 계란 물과 계란 NS1-GFP-의 물과 제어에 감염된 물고기를 교체합니다. 주 : 이러한 농도는 fo를 달성 생리적 수준을 복제하도록 시도하기 위해 선택되었다인간의 명 (하루에 두 번 100, 200, 또는 600 ㎎, IV, 하루에 두 번 또는 흡입 10 ㎎,)에서 나미 비르의 llowing 관리. 인간 환자의 혈청 농도는 9.83에서 45.3 NG / ㎖ 36였다. </li><li> 오일의 과정 동안, 달걀 물마다 12 시간을 변경하고 자 나미 비르의 적절한 양을 포함하는 살균 계란 물을 교체합니다. </li><li> 감염의 과정을 추적 할 수 있습니다. <ol><li> 200 μg의 / ㎖ Tricaine에 제브라 피쉬를 마취. 시각적으로 IAV 감염 및 제어 물고기 사이의 약물의 다른 농도에 몰입 물고기 중 감염 패턴의 차이를 관찰 스테레오 형광 현미경으로 GFP 발현을 모니터링합니다. </li><li> 오일의 과정을 통해 이환율과 사망률을 추적 할 수 있습니다. <ol><li> 혼수의 증상과 부종의 증거, 색소 침착의 차이, 안구 및 두개 안면 기형, 그리고 전만 포함하여 질병 병리학 관련 감염의 역학에 대한 기록 관찰. 질병 병리학일반적으로 주입 된 바이러스의 양에 따라 24 ~ 48 시간의 후 분사에 제어 감염된 물고기에서 분명해진다. 이미지를 24 시간 후 분사를 수집합니다. </li><li> 오일 후 감염에 대한 모든 24 시간은, 죽은 병적 인, 건강한 유생의 수를 기록한다. 사망은 심장 박동 식별의 부재에 의해 정의된다. 원하는대로 데이터를 플롯. 예를 들어, 건강 병태 또는 죽은 물고기의 백분율 누적 막대 그래프로 플롯 된 데이터는, 상기 X 축, Y 축 및 처리 군에 플롯. (19) 참고 : 사망률은 카플란 - 마이어 생존 추정에 의해 획득 할 수있다. 응용에 따라, 상기 병리학 적 관찰 기능에 따라 병적 상태의 정도를 수치화 할 수있다 스코어링 매트릭스를 포함 채점 물고기 이환율 대한 대안 적 방법을 개발하는 것이 적절할 수있다. </li><li> 적절한 통계 분석을 적용 할 통계에 문의하십시오. </li></ol></li></ol></li></ol> 6. 호중구 마이그레이션 참고 :이 프로토콜은 아래의 지역화, 상피 IAV 감염 다음 부레에 호중구의 이동을 추적하는 방법을 설명합니다. 기재된 방법은 유전 적 및 화학적 조작의 효과를 테스트하기 위해 수정 될 수있다. 이 기술을 사용하여, IAV 감염 동안 호중구 동작의 기초가되는 메카니즘을 특성화하는 것이 가능할 것이다. <ol><li> 이미징을위한 Zebrafish의 장착 <ol><li> 애벌레를 마취하는 200 μg의 / ㎖ Tricaine에 이미지화한다. </li><li> 계란 물 (~ 50 ~ 100 μL)의 작은 방울에 잘 (24)의 웰에 NS1-GFP에 감염된 유충, 유리 바닥 판 : 개인의 Tg (mCherry MPX)을 전송합니다. 다른 IAV 감염 및 제어 물고기와 반복합니다. </li><li> 천천히 큰 거품을 소개 않도록주의하면서, 각 웰 (섹션 2.5) 1 % 아가로 오스 배아 설치 미디어를 추가 할 수 있습니다. <ol><li> 그것의 측면 상에 장착되도록 부드럽게 유충의 위치를 ​​조정한다.케이크와 헨리 (37)는 필라멘트와 붕규산 유리 모세관에 장착 제자리에 superglued하는 곤충 핀을 사용하여이 응용 프로그램에서 잘 작동 프로브를 확인하는 방법에 대해 설명합니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스가 경화되면, 부드럽게 200 μg의 / ㎖ Tricaine을 포함 달걀 물을 각각의 우물을 입력합니다. </li><li> 공 초점 현미경으로 20 배 대물 렌즈를 사용하여 시야 및 형광 이미지의 스택 시리즈 아리조나 캡처 수영 방광에 초점을 맞추었다. <ol><li> 그들은 모든 가시적 관찰 녹색 및 적색 형광을 포착하도록 상한 및 하한을 설정한다. </li><li> ≤ 4 μm의입니다 단계 2.0 마이크로 초 / 픽셀의 캡처 이미지. 픽셀 당 시간 증가 및 단계 사이의 거리 감소 (예 : 0.5-1.0 μm의 것은) 사진 해상도 및 품질이 향상됩니다. </li><li> 층들을 병합하여 2 차원 화상을 생성한다. </li><li> MPX-mCherry 양성 호중구 본 난의 수를 비교N IAV 감염 및 제어 주입 제브라 피쉬의 수영 방광. </li></ol></li></ol></li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

인간 숙주 병원체 상호 작용을 모델링하기 위해 작은 동물을 사용하여 얻은 효과를 최대화하기 위해, 상기 모델 시스템의 고유의 장점을 활용할 연구 질문 테스트 프레임 가설하는 것이 중요하다. 인간의 IAV 감염의 모델로, 제브라 피쉬는 높은 생산력, 광학 선명도, 약물 검사에 복종 할 의무 및 호중구 등의 면역 세포를 라벨 유전자 변형 라인의 가용성 등 여러 가지 장점을 가지고 있습니다. 제브라 피쉬는 염증과 선천성 면역 연구에 대한 마우스 모델 시스템에 대한 더욱 강력한 대안으로 개발되었다. 그들이 개발의 첫 번째 4-6주 동안 작동 적응 면역 반응이 부족하기 때문에, 제브라 피쉬의 부상과 감염 (37)에 대해 보호하는 선천성 면역 반응을 탑재합니다. 개발 초기 기간 동안, 분리 단독 선천성 면역 반응으로 인한 바이러스 반응의 메커니즘을 연구하는 것이 가능하다. 티빨간색 형광 단백질로 호중구 레이블 :의 작업은 Tg는 (mCherry MPX)와 같은 형...

세계 보건기구 (WHO)에 따르면, 인플루엔자 바이러스는 성인의 5 ~ 10 % 매년 어린이의 20 ~ 30 %를 감염 심각한 질병의 3~5,000,000가지 경우가 발생할 전세계 1 최대 50 만 명이 사망. 독감에 대한 연간 예방 접종은 질병을 예방하는 가장 좋은 옵션이 남아있다. 세계 보건기구 (WHO) 행동 계획 등의 노력은 질병률 및 계절 인플루엔자 발병 2와 연관된 사망률을 감소시키기 위해 더 강력한 백신 전략에 사용 계절 백신 백신 생산 능력 및 연구 개발이 증가하고있다. 뉴 라미니다 아제 억제제 (예 : 자 나미 비르와 오셀 타미 비르 (Oseltamivir)) 같은 항 바이러스 약물은 일부 국가에서 사용할 수 있으며, 발병 3, 4, 5의 첫 48 시간 내에 투여시, 완화 증상에 효과가 입증하고있다. 글로벌 노력에도 불구하고, 계절 인플루엔자의 봉쇄 OU인플루엔자 바이러스 항원 드리프트 종종 바이러스 (6)의 게놈 변화에 적응하기 위해 현재의 능력을 초과하는 tbreaks이 시점에서 강력한 도전 남아있다. 바이러스의 새로운 균주를 대상으로 백신 전략을 미리 개발해야하고 때로는 인해 결국 독감 시즌에 우세 균주의 종류에 예상치 못한 변화에 최적의 효과보다 렌더링됩니다. 이러한 이유로, 감염을 함유 사망률을 감소시키기위한 대안적인 치료 전략을 개발되어야 할 필요가있다. 호스트 바이러스 작용의 더 나은 이해를 달성함으로써, 신규 항 인플루엔자 의약품 및 치료 보조제 (7, 8)를 개발하는 것이 가능하다. 인간의 호스트 인플루엔자 바이러스 (IAV) 상호 작용은 복잡하다. 인간 IAV 감염의 여러 동물 모델을 포함하여, 숙주 바이러스의 상호 작용에 대한 통찰력을 얻기 위해 개발되어왔다마우스, 기니아 피그, 면화, 쥐, 햄스터, 흰 족제비와 원숭이 9 보내고. 호스트 IAV 역학의 이해를 개선 한 중요한 데이터를 제공하는 한편, 각각의 모델 생물은 인간 의학에 결과를 해석 할 때 고려해야 할 중요한 결점을 가지고있다. 인간 인플루엔자 9 분리 감염 예를 들어, 가장 널리 사용되는 모델이다 생쥐는 쉽게 IAV 유도 감염 증상이 없다. 마우스는 마우스 상피 세포 대신 인간 상피 세포 (10) 상에 표현되는 α-2,6- 시알 산 결합의 α-2,3- 결합 시알 산을 발현 때문에 인간 인플루엔자에 대한 자연 친 화성 균주 부족하기 때문이다. 인간 IAV에 존재하는 헤 마글 루티 닌 단백질은 바람직하게는, 결합하여 수용체 - 매개 엔도 시토 시스 9, 11 내지 α-2,6- 시알 산 결합을 함유하는 숙주 세포를 입력 균주 </s12, 13&gt;까지. 결과적으로, 이제 인간 인플루엔자 마우스 모델을 개발주의 인간 질병의 양상 요점을 되풀이 질환 표현형을 달성하기 위해 인플루엔자 적합한 균주 마우스의 적절한 변형을 짝 수행되어야 함을 허용한다. 반면, 흰 족제비의 상기도의 상피 세포가 인간 세포 (14)과 유사 α-2,6- 시알 산 결합을 갖는다. 감염된 흰 족제비는 인간과 조류 인플루엔자 바이러스 (14)의 병원성 및 전달 특성, (15)을 포함하여 인간의 질병에서 관찰되는 병리 및 임상, 많은 기능을 공유 할 수 있습니다. 또한 백신 유효성 시험에 매우 의무가 있습니다. 그럼에도 불구하고, 인간 인플루엔자의 흰 족제비 모델은 통계 signifi의 획득을 주로 크기와 사육 비용에 관한 몇 가지 단점이있다캔트 데이터 도전은. 또한, 흰 족제비 이전 테스트 효율이 어려워 약물 동력학, 생체 이용률 및 독성에 차이를 표시하고있다. 예를 들어, 흰 족제비는 M2 이온 채널 억제제 아만타딘 (16)에 독성을 나타낸다. 따라서, 인간 IAV 감염에 대한 질문을 연구하는 동물 모델을 선택하는데, 그것의 고유의 장점과 한계 및 조사하에 호스트 바이러스의 상호 작용의 측면을 고려하는 것이 중요하다 분명하다. 제브라 피쉬, 다니오 레 리오는 &lt;면역 반응을 호스팅 미생물 감염을 조사하는 독특한 기회를 제공 동물 모델, 잠재적 약물 치료 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23이며SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 24, 25, 26, 27, 28. 제브라 피쉬 세포의 표면 상에 α-2,6- 연결된 시알 산의 존재는 감염 연구에서 부담 및 IAV (19)의 형광 리포터 균주를 사용하여 생체 내에서 촬상 된 IAV에 감수성을 제시 하였다. IAV 감염 제브라에서 바이러스 ifnphi1 및 MXA 사체의 발현 증가는 선천성 면역 반응을 자극되었다는 것을 지시하고, 부종 및 조직 파괴를 포함 IAV 감염 제브라 의해 표시되는 병리는 인간 인플루엔자 감염에서 관찰되는 것과 유사 . 또한, IAV 바이러스 뉴 라미니다 아제 억제제 자 나미 비르 제한 사망률과 제브라 피쉬 (19)의 감소 바이러스 복제. 이 보고서에서, 시스템을 시작하기위한 프로토콜제브라 피쉬 배아에서 IC IAV 감염 설명한다. 증명의 원리와 같은 임상 적 투여 량 나미 비르를 사용하여, 항 바이러스 작용에 대한 심사 화합물이 제브라 피쉬 IAV 감염 모델의 유용성이 입증된다. 또한, 상기 제브라 지역화 상피 IAV 감염을 발생시키기위한 프로토콜, 해부학 적 및 기능적으로 유사한 포유류의 폐 21, 29, 30, 31 인 것으로 간주되는 기관을 블래 수영 설명한다. 이 국부 IAV 감염 모델을 이용하여, 감염 부위에 호중구 모집 IAV 감염 및 염증 호중구 생물학의 역할에 대한 연구를 가능하게 추적 될 수있다. 이 모델은 인간 제브라 IAV 감염 기존 동물 모델을 보완 소분자 때문에 개선의 가능성의 면역 세포 반응을 시험하는데 특히 유용tatistical 전력, 높은 처리량 분석에 중등도 용량 및 능력이 빛을 현미경과 면역 세포의 행동과 기능을 추적 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>인스턴트 오션</td><td>스펙트럼 브랜드</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 25 mm 멸균 일회용 페트리 접시&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>이송 피펫&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td><td>웨스턴 케미컬</td><td></td><td></td></tr><tr><td>보로실리케이트 유리 모세혈관과 필라멘트;</td><td>셔터 기기&nbsp;</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>플레밍/브라운 마이크로피펫 풀러&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>AK Scientific</td><td>G939</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>현미경 침지 오일</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>현미경 스테이지 보정 슬라이드&nbsp;</td><td>AmScope</td><td>MR095</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 압력 분사기&nbsp;</td><td>응용 과학 계측</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>올림푸스</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>배압 장치</td><td>응용 과학 계측</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 홀더 키트</td><td>응용 과학 계측</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>풋 스위치</td><td>응용 과학 계측</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>적용된 과학 계측</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>자기 기반</td><td>적용된 과학 계측</td><td>자기 기반</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P-4758</td><td></td></tr><tr><td>저온 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조명기</td><td>Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>콜드 라이트 소스</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>CL6000 LED</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 멀티웰 플레이트, 24 웰</td><td>Mattek</td><td>P24G-0-13-F</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus IX-81 FV-1000 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism v6</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인플루엔자 A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스&nbsp;</td><td>찰스 리버&nbsp;</td><td>490710</td><td></td></tr><tr><td>인플루엔자 A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)&nbsp;</td><td>찰스 리버&nbsp;</td><td></td><td></td>490715</tr><tr><td>Influenza NS1-GFP</td><td></td><td></td><td>Manicassamy et al. 2010</td></tr><tr><td>Tg(mpx:mCherry)</td><td></td><td></td><td>Relation in Lam et al. 2013에서 참조</td></tr></tbody></table>

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

매년 계절성 독감 발병은 전 세계 사회에 큰 영향을 미칩니다. 전 세계적인 노력에도 불구하고 인플루엔자는 여전히 다루기 힘든 의료 부담으로 남아 있습니다. 감염을 줄이기 위한 기본 전략은 매년 백신 접종을 하는 것입니다. 인플루엔자에 걸린 사람의 경우 항바이러스제는 증상을 완화할 수 있습니다. 인플루엔자와 싸우기 위한 대체 전략을 개발해야 할 분명하고 충족되지 않은 필요성이 있습니다. 숙주와 인플루엔자의 상호작용을 모델링하기 위해 여러 동물 모델이 만들어졌다. 여기에서는 전신 및 국소 인간 인플루엔자 A 바이러스(IAV) 감염에 대한 제브라피시 모델을 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 전신 IAV 감염 모델을 사용하여 잠재적인 항바이러스 활성을 가진 작은 분자를 스크리닝할 수 있습니다. 원리 증명으로, IAV에 감염된 제브라피시에서 항바이러스제 자나미비르(Zanamivir)의 효능을 입증하는 프로토콜이 설명됩니다. 이는 IAV에 감염된 제브라피시에서 잠재적인 항바이러스제의 상대적 효능을 점수화하기 위해 질병 표현형을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 최근 몇 년 동안 인플루엔자 감염에 대한 인간 숙주 반응에서 호중구가 수행하는 중요한 역할에 대한 인식이 높아졌습니다. 제브라피시는 인간 의학에 직접적인 영향을 미치는 호중구 생물학 연구에 없어서는 안 될 모델임이 입증되었습니다. 국소 바이러스 감염의 맥락에서 호중구 생물학을 연구하기 위해 Tg(mpx:mCherry) 제브라피시 계통에서 국소 IAV 감염을 생성하는 프로토콜이 설명됩니다. 국소 감염 부위에 대한 호중구 동원은 치료 응용이 있을 수 있는 실험적 조작을 평가하기 위한 추가적인 정량화 가능한 표현형을 제공합니다. 설명된 두 제브라피시 프로토콜은 인간 IAV 감염의 측면을 충실하게 요약합니다. 제브라피시 모델은 높은 생산력, 광학적 선명도, 약물 스크리닝에 대한 편의성, 호중구와 같은 면역 세포가 형광 단백질로 표지되는 계통을 포함한 형질전환 계통의 가용성 등 수많은 고유한 이점을 가지고 있습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 이러한 장점을 활용하고 궁극적으로 임상으로 전환될 수 있는 숙주-IAV 상호 작용에 대한 중요한 통찰력을 드러낼 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

여기서, 피쉬 전신성 감염 IAV는 약효 (도 1A)를 테스트하는 방법을 나타내는 데이터를 제공한다. 48 시간의 후 수정에 배아는 바이러스 감염을 시작 퀴비에의 덕트를 통해 APR8 (도 1C, 1 층), X-31 (도 1D, 1G), 또는 NS1-GFP (그림 1H-1I)로 주입된다. 48 시간의 후 수정에 배아의 또 다른 집단은 바이러스 감염 (도 1B, 1E)에 대한 제어 역할을 주입 하였다. 48 시간 후 감염, IAV는 심낭 부종 (도 1C, 1D)과 심낭 (그림 1G)에 걸쳐 존재하는 적혈구와 순환 정지 (그림 1 층)의 증거를 전시 주입 제브라 피쉬으로. NS1-GFP, 빠르면 3 시간 포스트 감염이 관찰되었다로서 ...

인간 인플루엔자 A 바이러스에 대한 전신 및 국소 제브라피시 감염 모델을 보여줍니다. 전신 감염 모델을 사용하여 제브라피시를 사용하여 항바이러스제를 스크리닝할 수 있습니다. 국소 감염 모델을 사용하여 제브라피시를 사용하여 숙주 면역 세포 반응을 특성화할 수 있습니다.

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Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

본 절차의 전반적인 목표는 제브라피시를 인플루엔자 모델로 사용하여 바이러스 감염에 대한 숙주 면역 반응을 연구하고 항바이러스 화합물을 스크리닝하는 것입니다. 이러한 방법은 감염 중 면역 및 염증에서 식세포가 수행하는 역할과 잠재적 항바이러스 치료법의 효능과 같이 인플루엔자 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제브라피시 인플루엔자 모델은 성장 중인 제브라피시의 광학적 투명성과 중급에서 고급 수준의 고속 스크리닝 분석 수행 능력을 통해 이전에는 해결되지 않았던 질문들을 다룰 수 있게 해줍니다.텍스트 프로토콜에 따라 시약을 준비하고 배아를 원하는 단계까지 성장시킨 후, 실험 당일에 5번 핀셋을 사용하여 배아의 난막을 제거합니다. APR-8 또는 X31 바이러스를 사용하는 경우, 층류 후드 내에서 0.25% phenol red가 첨가된 멸균된 차가운 PBS를 사용하여 바이러스를 3.3 × 10⁶ EID₅₀ 농도로 희석합니다. NS1-GFP 균주를 사용하는 경우, 바이러스를 nL당 약 1.5 × 10² PFU 농도로 희석합니다.동시에, 바이러스와 비슷하게 희석한 감염되지 않은 계란의 요막액을 포함하는 대조군을 설정합니다. 그런 다음, 마이크로로더 팁을 사용하여 바이러스 용액을 미세주입 바늘에 피펫팅하고, 미세주입 바늘을 주입 장치의 적절한 홀더에 삽입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 바늘을 커팅한 후, 원하는 주입량이 달성될 때까지 압력 주입기의 압력 및 타이밍 설정을 조정하거나 바늘 팁을 다시 커팅합니다.배아를 마취시킨 후, 플라스틱 피펫을 사용하여 10~20개의 배아를 2% agarose 플레이트로 옮기고 피펫으로 과잉 액체를 제거합니다. 실체현미경 하에서, 화염 연마 후 밀봉된 붕규산 유리 모세관을 사용하여 cuvier 관 또는 후주정맥이 미세주입 바늘과 일직선이 되도록 배아를 조심스럽게 정렬하고 방향을 잡습니다. IAV 미세주입을 수행하려면, 미세주입 바늘을 cuvier 관 또는 후주정맥에 조심스럽게 삽입합니다.그 다음, 풋 페달을 눌러 원하는 부피의 IAV를 배아의 순환계에 주입합니다. 전신 감염을 유도하려면 주입된 볼루스가 순환계로 휩쓸려 들어가 전신에 분포되는 것이 매우 중요합니다. 만약 볼루스가 감염 부위에 뭉쳐 있다면, 해당 배아를 실험에서 제외하고 안락사시킵니다.수정 후 5일째에, 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 바늘을 준비합니다. 방금 시연한 것처럼 팽창된 부레를 가진 TG MPX mCherry 치어를 정렬하되, 바늘이 부레를 관통하여 바이러스가 부레의 후방에 주입될 수 있도록 치어의 위치를 잡습니다. 미세주입 바늘을 부레에 조심스럽게 삽입하고, 해당 기관의 후방을 향해 원하는 부피를 주입합니다.주입액은 후방으로 모여야 하며, 부레의 기포는 전방으로 밀려나야 합니다. 부레 감염을 유도하기 위해서는 주입된 액체 덩어리가 부레의 후방으로 모여 기포가 전방으로 밀려나게 하는 것이 중요합니다. GFP 발현은 주입 후 이르면 3시간부터 관찰되기 시작합니다.대조군 용액을 포함한 주입을 완료한 후, 유충을 멸균 난수(sterile egg water)가 담긴 페트리 접시로 옮기고 물고기를 33 °C에서 배양합니다. 항바이러스제 처리를 수행하기 위해, 감염 후 3시간에 NS1-GFP 및 대조군 감염 물고기의 난수를 0, 16.7 또는 33.3 ng/mL의 Zanamivir가 포함된 멸균수로 교체합니다. 주입 후 24~48시간부터 무기력증 징후 및 부종 증거, 색소 침착의 차이, 안구 및 두개안면 기형, 척추후만증을 포함하여 질병 병리와 관련된 감염 역학에 대한 관찰 기록을 시작합니다.감염 후 5일 동안 24시간마다 사망, 병적 상태 및 건강한 유충의 수를 기록합니다. Y축에는 건강한, 병적 상태의 또는 사망한 물고기의 백분율을, X축에는 처리군을 표시하여 데이터를 누적 막대 그래프로 그립니다. 이미징을 위해 제브라피시를 고정하려면, NS1-GFP에 감염된 개별 transgenic MPX mCherry 유충을 24웰 유리 바닥 플레이트의 웰에 옮기고 소량의 난수(egg water)를 첨가합니다.다른 IAV 감염어 및 대조군 물고기에 대해서도 동일하게 반복합니다. 큰 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 웰에 1% agarose 배아 마운팅 매질을 천천히 추가합니다. 치어가 각각 옆으로 누운 상태로 고정되도록 위치를 조심스럽게 조정합니다.아가로스가 굳으면 L당 200 µg의 tricaine이 포함된 난수를 사용하여 각 웰을 조심스럽게 채웁니다. 공초점 현미경과 부레에 초점을 맞춘 20배 대물렌즈를 사용하여 명시야 및 형광 이미지의 z-stack 시리즈를 캡처합니다. IAV 감염군과 대조군 주입 제브라피시의 부레에 존재하는 MPX mCherry 양성 중성구의 수를 정량화하고 비교합니다.여기 제시된 데이터는 제브라피시의 전신 IAV 감염이 약물 효능 테스트에 어떻게 활용될 수 있는지를 나타냅니다. 48 HPF의 배아에 APR8, X31 또는 NS1-GFP를 큐비에관(duct of cuvier)을 통해 주입하여 바이러스 감염을 유도했습니다. 바이러스 감염 대조군으로 사용된 배아는 48 HPF에 주입되었습니다.감염 후 48시간까지 IAV를 주입한 제브라피시는 심낭 부종과 혈액 순환 정지의 증거를 보였으며, 심낭 전체에서 적혈구가 관찰되었습니다. Zanamivir에 노출되지 않은 감염된 물고기는 전신 GFP 발현에서 부종의 특징을 나타냈습니다. Zanamivir에 노출된 NS1-GFP 감염 유생에서는 GFP 형광의 육안적 병리 소견이 감소한 것이 관찰되었습니다.국소 제브라피쉬 부레 감염 모델을 이용한 본 실험에서는, 수정 후 5일 된 transgenic MPX mCherry 치어의 부레에 NS1-GFP 바이러스를 주입하고 mCherry로 표지된 호중구가 부레로 모집되는 과정을 추적하였습니다. 감염 20시간 후, PBS를 주입한 대조군과 비교하여 IAV에 감염된 물고기의 부레로 상당한 양의 호중구가 이동하는 것이 관찰되었으며, 이는 IAV가 인간의 폐에서 호중구를 모집하는 것과 마찬가지로 부레로도 호중구를 모집할 수 있음을 나타냅니다. 이러한 기술의 함의는 항바이러스 치료법으로 확장될 수 있는데, 이는 궁극적으로 임상에 적용될 수 있는 호스트와 인플루엔자 A 바이러스(IAV) 간의 상호작용에 대한 결정적인 통찰을 제공할 잠재력이 있기 때문입니다.인플루엔자 바이러스 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 백신 접종 및 적절한 개인 보호구(PPE) 착용을 포함한 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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호스트 병원체 상호 작용의 분석을 위한 아스퍼질러스 포자를 가진 얼룩말 물고기 애벌레의 감염

배우세요 인플루엔자 바이러스 감염 연구를 위한 제브라피시 모델을 활용한 항바이러스 약물 스크리닝 및 면역 세포 반응 분석 방법을. 이 기법은 바이러스-숙주 상호작용 연구에 활용됩니다.

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

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