Name: 병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 학습하세요 병코돌고래 정자의 채취, 평가 및 동결보존 방법과 소 난자를 이용한 이종 체외수정 기술입니다. 이 프로토콜은 동결보존 정자의 기능성 평가와 수컷 원핵 형성 및 하이브리드 배아 분열을 확인하는 데 활용됩니다.

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그의 작품은 경제와 경쟁력 (AGL2015-70140-R은 D. Rizos), AGL2015-66145R A. 구 티에 레즈-아덴 및 J. F. 페 레 스-구 티에 레즈와 세네카 재단의 무르시아 (그랜트 20040/세균/16 F. 가르시아 바스 케 스에 게) 스페인 정부에 의해 투자 되었다

윤리 성명: 실험 절차를 모두 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 Instituto Nacional de Investigación y 기술과 Agraria y 섬유 (INIA)의 위원회에 의해 승인 했다. 복제의 연구, 그리고 해양 포유 동물의 배려를 위한 동물 복지 행위는 사회에 의해 채택 모든 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 되었습니다.
 1. 돌고래 정자 수집과 Cryopreservation <ol><li>준비 <ol><li>게 페르 매체 (헤 파 린 및 hypotaurine-무료). 페르 TALP 매체와 25mm 중 탄산염, 22 m m 나트륨 젖 산 염, 1 mM 나트륨 pyruvate, 6-mg/mL 지방산 무료 BSA, 10 mg/mL 헤 파 린 (pH 7.4) 보완 준비. 
		참고: 사용 당일이 매체를 준비 하 고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기에 5% CO 2 분위기 아래 38.5 ° C에서 보관.</li>
		<li>준비 TRIS 계란 노 른 자 기반 버퍼입니다. 30.28 g/L 트리 스, 16.75 g/L 구 연산과 당 12.5 g/L, 그리고 초순에 0.5 g/L 스 분해 (pH 7.3, osmolality = 310 mOsm/kg). 추가 20% 계란 노 른 자 (v/v).</li>
	</ol></li> <li>등 recumbence 자발적인 정액 컬렉션에 대 한 수영장의 가장자리 근처에 거짓말을 입증 된 번 식 남성 bottlenose 돌고래 훈련. 
	참고: 남성 돌고래 훈련 되어야 6 개월 이상 긍정적인 보강 하 여 앞에서 설명한 4.</li>
	<li>부드럽게 성 기 groove에서 남근의 자발적인 압출을 유도 하는 돌고래의 생식 기 홈의 두개골 영역에 누르면 다양 한 촉각 stimulations 수행.</li>
	<li>완전 한 발기를 달성 한 후 직접 음 경 끝에 정액을 무 균 용기에.</li>
	<li>분석까지 37 ° C에서 정자 샘플을 유지합니다. 1.3 및 1.4 단계를 반복 하 여 때마다 새로운 프로필 렌 유리를 사용 하 여 연속 사정 컬렉션.</li>
	<li>즉시 수령 후, 37 ° C. 평가 색, pH, 그리고 osmolarity (를 사용 하 여 마이크로-osmometer)는 정액의 이전 예 열 졸업된 유리 실린더를 사용 하 여 볼륨을 결정.</li>
	<li>정액, 정 충의 농도 평가 하는 증류수 90 µ L를 포함 eppendorf 관에 정자 서 스 펜 션의 10 µ L를 추가 합니다. 챔버를 계산 하는 정자를 사용 하 여 정자 농도 결정. 
	참고: 평가, 동안 유지는 정액의 나머지 37 ° c.</li>
	<li>운동 매개 변수 평가.
	<ol><li>정자 샘플의 10 µ L을 미리 데워 진된 정자 챔버에 배치.</li>
		<li>이전 bottlenose 돌고래에 대 한 유효성을 검사 하는 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템을 사용 하 여 정자의 운동 성 2를 객관적으로 평가 하는 운동 성 평가. 
		참고: 필요한 경우, 정자의 운동 성의 적절 한 시각화를 위한 페르 매체 (헤 파 린 및 hypotaurine-프리)와 정자 샘플을 희석. 평가, 중 온수 현미경 무대에서 37 ° C에서 샘플 유지.</li>
	</ol></li> <li>정자 샘플의 20 µ L 고 평가 하는 앞서 설명한 5 생존 능력 및 정자 형태.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 정자 샘플을 전송. 5 분 동안 250 x g에서 정자 샘플 원심 후 세 챔버를 사용 하 여 정자 농도 결정, 400 x 10 6 정 충/mL을 정자 농도 조정. 
	참고: 필요한 경우 원심 분리 (250 x g, 10 분)에 의해 같은 정액의 초과 볼륨에서 고립 된 정액 플라스마와 집중된 ejaculates에서 펠 릿을 희석.
	<ol><li>5 분 동안 천천히 희석 정액 샘플 1:1 (v/v) 1.5% 글리세롤을 포함 하는 트리 스 계란 노 른 자 기반 버퍼. 1 h 30 분 5 ° C에서 정자 현 탁 액을 포함 하는 튜브를 놓고</li>
		<li>수행은 트리 스와 정자의 서 스 펜 션의 두 번째 희석 달걀 노 른 자 기반 버퍼 3% 최종 글리세롤 농도 및 200 x 10 6 정자/mL의 최종 농도 글리세롤을 포함. 10 분 5 ° C에서 정자 현 탁 액을 유지</li>
	</ol></li> <li>0.25 mL 빨 대에 정자 현 탁 액을 로드. 빨 대 heat-seal 랙 10 분에 대 한 액체 질소 위에서 4.5 cm에에서 빨 대 액체 질소에 빨 대를 빠지게 하 고 평가까지 저장.</li>
</ol> 2. Heterologous 체 외에서 수정 사용 하 여 구역 그대로 소 Oocytes <ol><li>준비 <ol><li>준비는 얼룩이 솔루션 및 장착 매체.
		<li>Hoechst의 1 밀리 그램의 1 mL의 증류수에 용 해 하 여 준비 Hoechst 재고 솔루션 <ol>. 30 µ L aliquots를 확인 하 고 계속 그들은 어둠 속에서-20 ° C에서 사용까지. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 1 g/L PVA와 보충의 5 mL에 Hoechst 재고 솔루션의 25 µ L을 추가 하 여 얼룩 솔루션을 준비 합니다. 잘 혼합 하 고 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서 유지.</li>
			<li>준비 글리세롤의 6.25 mL와 Hoechst 재고 솔루션의 6.25 µ L의 PBS 6.25 mL를 혼합 하 여 설치 미디어. 잘 혼합 하 고 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서 유지.</li>
		</ol></li> <li>Oocyte 수집 및 체 외에서 수정에 대 한 매체 준비.
		<ol><li>0.9 %NaCl 증 류 물에 gentamycin의 0.5 mL를 추가 하 여 생리 식 염 수를 준비.</li>
			<li>는 TCM-199의 10 ml 10 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF) 및 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)를 추가 하 여 재고 성숙 매체를 준비 합니다. 38.5 ° c, 5% CO 2, 그리고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기 분위기에서 두 미디어 유지.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>33-35 ° C에서 염 분 해결책에 도살에 난소를 수집 하 고 컬렉션에서 4 h 이내 실험실에 그들을 수송.</li>
	<li>한번 실험실에서 씻어 난소 세 번 파편을 제거 하 고 이전 37 예 십 분 해결책을 사용 하 여 혈액을 ° C 유지 난소 37 ° C에서 염 과정.</li>
	<li>18 g aspirate 2 ~ 8 mm 낭 바늘 그리고 10 mL 주사기. 50 mL 튜브에 aspirated follicular 액체 수집.</li>
	<li>셀 앙금까지 37 ° C에서 약 15 분 동안 서 서 oocytes를 포함 하는 소 낭 모양 액체 허용. 파스퇴르 피 펫과 튜브의 상쾌한을 제거 하 고 다시 PBS에 펠 릿을 중단.</li>
	<li>90mm 요리는 stereomicroscope 아래에 적 운 oocyte 단지 (COCs)를 복구.</li>
	<li>PBS에 그리고 한 번 성숙 매체에는 COCs 세 번 세척.</li>
	<li>전송 형태학 상으로 정상적인 COCs 4 잘 요리, 각 잘 잘 당 50 COCs의 그룹에서 성숙 매체의 500 mL. 
	참고: 여기, 3 우물 &#8211; 분리 IVF 동종 IVF, 적합 한 제어, 잘만 포함 한 잘 성숙 parthenogenetic 컨트롤로 COCs &#8211; 사용 되었다.</li>
	<li>최대 습도 공기에 5% CO 2의 분위기 아래 38.5 ° C에서 24 h COCs를 품 어.</li>
	<li>매체 및 밀도 그라데이션 준비.
	<li>수정 매체 (페르) 준비, 페르 TALP 매체와 25mm 중 탄산염, 22 m m 나트륨 젖 산 염, 1 mM 나트륨 pyruvate, 6 mg/mL 지방산 무료 BSA, 10 mg/mL 헤 파 린을 보충을 <ol>. 5% CO 2, 그리고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기에서 분위기 아래 38.5 ° C에서 유지.</li>
		<li>밀도 그라데이션 중간 15 mL 튜브 및 솔루션 15 mL 관을 세척 3 mL의 1 mL을 추가 하 여 밀도 그라디언트를 준비 합니다. 1 헤 적어도 38.5 ° C에서 유지</li>
	</ol></li> <li>워시는 체 외에서 성숙 페르 매체에 두 번 oocytes.</li>
	<li>4 잘 요리는 oocytes 전송 각 잘 50 COCs 페르의 250 ml 정자의 수정에 대 한 준비 하는 동안 5% CO 2, 그리고 최대 습도 공기에서 분위기 아래 38.5 ° C에서 4-잘 요리를 유지.</li>
	<li>녹여 냉동된 밀 짚 50 37 ° C에서 물 탕 정 충 돌고래를 포함 미 
	참고: 동종 IVF에 대 한 소 정액 동종 소 IVF에 대 한 표준 프로토콜을 따라 병렬로 처리 해야 합니다.</li>
	<li>걸릴 10 µ L 정자의 샘플 및 챔버 세 미리 데워 진된 정자에. 운동 성 정자 운동 성을 객관적으로 평가를 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템을 이전, 종족에 대 한 유효성 검사를 사용 하 여 평가 합니다. 이 시간 동안 유지 38.5에 정자 샘플 ° c.</li>
	<li>밀도 그라데이션 튜브 (2.10.2 단계)에 정자 샘플을 추가합니다. 250 x g.에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>신중 하 게 상쾌한 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다. 펠 릿을 포함 하는 튜브를 세척 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 다시 부드럽게 혼합 하 여 펠 릿을 중단.</li>
	<li>250 x g.에서 5 분 동안 원심 분리기 제거 300 µ L의 정자 볼륨을 파스퇴르 피 펫과 상쾌한.</li>
	<li>증류수의 95 µ L을 포함 하는 microcentrifuge에 정자 서 스 펜 션의 추가 5 µ L. 38.5에 정자 현 탁 액을 유지 ° C. 채우기 셀 계산 1시 20분의 10 µ L와 챔버 정자 희석 및 측정 농도. 2 x 10 6 정 충/mL를 정자의 100 µ L에 추가 되어야 합니다 페르 매체의 양을 계산.</li>
	<li>15 mL 튜브에 계산된 페르와 정자 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 혼합.</li>
	<li>1 x 10 6 정 충/mL의 최종 농도 성숙된 oocytes와 페르 매체를 포함 하는 4-잘 접시의 각 음에 정자-페르 정지의 추가 250 µ L.</li>
	<li>공동 5% CO 2, 그리고 최대 습도 공기에서 분위기 아래 38.5 ° C에 18 h gametes를 품 어.</li>
	<li>5 %fcs 보충 합성 oviductal 액체에 따라 문화 매체를 준비 합니다. 35 mm 요리 3 mL의 미네랄 오일으로 덮여 합성 oviductal 액체 문화 방울의 25 µ L를 준비 합니다. 5% CO 2, 그리고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기에서 분위기 아래 38.5 ° C에서 유지.</li>
	<li>2.5 h 게시물 공동 보육에서 20 oocytes 접시에서 제거; 동일한 조건 하에서 인큐베이터에서 나머지 oocytes 유지.
	<ol><li>적극적으로 좁은 구멍 파스퇴르 피 펫을 통해 oocytes의 10 배를 pipetting으로 느슨하게 연결 된 정 충을 제거.</li>
		<li>15 분 동안 Hoechst 얼룩 솔루션의 50 µ L에 oocytes 50 µ L 30 분 5 분에 대 한 PBS에 oocytes 전송 세척에 대 한 0.5%도에서 20 oocytes를 해결 하 고 5 분에 대 한 PBS에 oocytes를 세척</li>
		<li>는 슬라이드 당 10 oocytes의 속도로 설치 매체의 2 µ L 방울을 개별적으로 oocytes를 전송. 부드럽게는 coverslip로 커버 하 고 매니큐어와 함께 인감.</li>
		<li>Epifluorescent 광학과 40 x 확대 361 nm 여기 필터 단계 대조 현미경을 사용 하 여 소 oocytes에 연결 하는 정 충의 수를 계산 하.</li>
	</ol></li> <li>후 공동 보육의 12 h 10 추정 zygotes 4-잘 접시에서 제거; 동일한 조건 하에서 인큐베이터에서 나머지 추정 zygotes 유지.
	15 mL 원심 분리기에 <ol><li>전송 10 추정 zygotes 튜브 포함 2 mL PBS와 2 분 동안 부드럽게 소용돌이 적 운 세포를 제거 하. 워시 두 번 PBS, 수정, 및 얼룩, 앞에서 설명한 (단계 2.23.2.)</li>
	</ol></li> <li>18, 20, 22, 및 공동 보육의 24 h 10을 제거 후 4-잘 요리와 소용돌이에서 추정 zygotes 수정, 그리고 그들 앞에서 설명한 (단계 2.23.2) 얼룩. 동일한 조건 하에서 인큐베이터에서 추정 zygotes의 나머지를 유지.
	<ol><li>Hoechst와 얼룩에 의해 pronuclear 형성 및 polyspermy 모두 동종 및 분리 IVF 그룹에서 단계-대비/epifluorescent 현미경 평가.</li>
		<li>샘플 당 10 무작위로 선택한 추정 하이브리드 zygotes pronuclear 형성 평가. 공초점 레이저 현미경 488 nm 아르곤 레이저 여기에서 검색과 515에서 530 nm 탐지에서 pronuclear 형성 확인.</li>
		<li>광학 추정 zygotes 순차적으로 섹션 (2mm) 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 수집 하 고. 3D 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 시각화.</li>
		<li>공동 보육의 24 h 후 씻고 50 추정 zygotes 4 회 PBS에 문화 매체에 두 번.</li>
	</ol></li> <li>이전 준비 및 equilibrated 문화 매체의 microdroplets에 25의 그룹에서 그들을 전송.</li>
	<li>5% / 5% O 2의 분위기 아래 38.5 ° C에서 유지 CO 2 및 최대 습도 공기.</li>
	<li>후 26 고 공동 보육의 28 h 10 추정 zygotes 요리와 소용돌이, 수정, 제거 하 고 얼룩, 앞에서 설명한 (단계 2.23.2).</li>
	<li>문화의 48 h 후 관찰 한 stereomicroscope 아래 분열.</li>
	<li>5 mg/mL protease 솔루션에 배아를 전송 하 여 zona pellucida (ZP) 제거.</li>
	<li>는 개별적으로 씻어 각 배아 세 번 PBS에. 스냅-동결 그들 0.2 mL microcentrifuge 튜브에 액체 질소. 분석까지-80 ° C에 저장.</li>
</ol> 3. PCR <ol><li>재료 및 시 약 참고: PCR 프로토콜을 수행 하는 데 사용 하는 장비, 재료, 시 약 재료의 테이블에 자세히 나와 있습니다 및 PCR 튜브 랙 및 micropipettes (P2, P20, P200, P1000) 집합이 포함 1.5 mL microcentrifuge 튜브, PCR 튜브 및 cap, 열 cycler는 자외선 조명 기, agarose 젤, 고 버퍼 (Tris Borate EDTA (TBE)).
	<ol><li>부드럽게 녹여 얼음에 모든 시 약. 실험을 통해 얼음에 그들을 유지 합니다. Deoxynucleotides를 사용 하 여 (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP), 돌고래 18 S ribosomal 단백질 (DQ404537.1);에 대 한 참조 유전자 코딩에 뇌관을 대상 R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG 및 f 2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA 중 합 효소, DNA 중 합 효소, DNA 템플릿, 메 마른 물 및 염화 마그네슘 (MgCl 2 5.0 m m의 최종 농도에) 5 X 버퍼.</li>
		<li>Agarose 젤과 샘플 준비입니다.
		<ol><li>준비 돌고래와 소 정자 DNA 샘플.
			<ol><li>Thaw 37 ° C에서 물 욕조에 각 종족의 언된 빨 대 50 미 세척 솔루션 3 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 250 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 제거 합니다. 30 µ L의 STES 세포의 용 해 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 8; 20 m m NaCl; 그리고 1 mM 0.1 %SDS), 추가 2 µ L의 성분 K (20 mg/mL), 및 dithiothreitol (DTT);의 5 µ L 최종 농도: 150 mM. 초순의 55 ° C. 추가 200 µ L에서 하룻밤 유지 합니다. 5 분에 대 한 250 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 유지. 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 측정.</li>
			</ol></li> <li>초순 PCR 조건 수 확인으로 돌고래 정 충 (즉, 40, 4, 및 0.4 ng/mL)에서 DNA의 직렬 희석을 수행 적은 양의 돌고래 DNA 검출.</li>
			<li>초순 PCR 조건 소 DNA의 작은 금액을 감지 할 수 있다 확인 하와 소 정자 DNA (즉, 4000, 400, 40, 및 4 ng/mL)의 직렬 희석 수행.</li>
			<li>는 돌고래와 소 배아를 준비합니다. 배아를 얼음에 녹여 100 µ g/mL 가수분해 K의 8 µ L을 추가 하 고 밤새 55 ° c.에 유지 반응을 중지 하려면 96 ° c 5 분에 대 한 샘플 배치</li>
			<li>2 %agarose 젤 TBE 버퍼를 준비 하 고 추가 하는 표준 기술을 사용 하 여 핵 산 얼룩의 20 µ L.</li>
		</ol></li> <li>PCR 준비.
		<ol><li>레이블 PCR tube(s): 돌고래 직렬 희석 (40, 4, 및 0.4 ng/mL), 소 직렬 희석 (4000, 400, 40, 및 4 ng/mL), 동종 소 냉동 배아, 2 셀 추정 heterologous 배아, 그리고 부정적인 제어.</li>
			<li>반응 당 25 µ L의 최종 볼륨을 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 마스터 섞어를 준비합니다.
			<li>5 X DNA 중 합 효소 flexi 버퍼, (10mm) 1.5 dNTPs의 0.5 µ L의 추가 5 µ L <ol>µ L MgCl 2 (25 m m), 앞으로 역 뇌관 (10 µ M), DNA 템플렛 (정자)의 1.5 µ L 또는 DNA 템플렛 (냉동 배아)의 8 µ L의 0.5 µ L의 0.07 µ L Taq 중 합 효소, 및 살 균 증류수 25 µ L 최종 볼륨까지. 잘 믹스.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>증폭 프로토콜 <ol><li>열 cycler에 튜브를 놓습니다. 다음 프로그램을 선택: 3 분;에 대 한 94 ° C 15 94 ° C의 40 주기 s, 59 ° C 25에 대 한 s, 20 72 ° C s; 그리고 프로그램 시작 5 분을 위한 72 ° C.</li>
		<li>2 %agarose 젤의 우물에 혼합물의 4 ° C와 부하 15 µ L에서 각 PCR 제품에 버퍼를 로드의 4 ° C. 추가 2.5 µ L에서 튜브를 저장 합니다. DNA 사다리 마커를 사용 하 여 PCR 파편의 정확한 크기 추정.</li>
		<li>DNA 마이그레이션 수 있도록 15 분에 대 한 수행 법. 밴드는 자외선 조명 기를 사용 하 여 시각.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+JP+%22The+Bottlenose+dolphin%22">The Bottlenose dolphin</a>. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).</li>
<li>Madeddu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cooling+rate+on+the+survival+of+cryopreserved+rooster+sperm%3A+Comparison+of+different+distances+in+the+vapor+above+the+surface+of+the+liquid+nitrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen.</a> Anim Reprod Sci. , (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

많은 다른 포유류 종에 대 한 동결-해 동 정자를 사용 하 여 다양 한 장점이 있다. 이 귀중 한 유전 물질, 전세계 유통에 대 한 가능성, 오염, 낮은 위험 그리고 수십 년 동안 남성 gametes를 보존 하는 기능을 전송 하는 기능을 포함 합니다. Cryopreserved의 사용이이 종 부록 II의 인용, 전송 및 다른 수 중 공원 사이 동물의 교류를 제한 하는 보호 때문에 bottlenose 돌고래에 대 한 필수적입니다. 돌고래 수송 물류 문제 및 위험 위험을 생성 하는 활동 이다. 그러나, 그들을 수송에서 자제 족 동물의 포로 인구를 도입의 위험 같은 결과 또한 있다. 하나의 솔루션은 정자의 cryopreservation입니다. 일부 저자 매우 돌고래 정자5,7,,89와 cryopreserved...

보조 생식 기술 해양 포유류를 포함 하 여 야생 동물에 가난 하 게 개발 된다. 정자 기름 성공 평가에 중요 한 방법의 부족 느린 돌고래 종에서 생식 기술 개발에 기여 한다. 그것은 아니었다 최근까지 bottlenose 돌고래 (Tursiops truncatus)의 기본 정액 매개 변수 보고1,2했다. 그러나, 운동 성 및 형태학, 같은 변수 널리 사용 되 고 있지만 생식 효율성에 제한 된 정보 제공. 정자 품질 최고의 지표는 기름 잠재력의 평가.
최근, 우리의 그룹 돌고래 정자 남성 pronuclear 형성 및 zona 그대로 소 oocytes3를 사용 하 여 분리 IVF 후 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 잠재적인 비 옥 평가 메서드를 사용 합니다. 돌고래 소 분리 IVF 사용 하 여 중요 한 이점이 동종 IVF, 돌고래 oocytes를 얻기의 어려움 극복으로 있으며 소 oocyte 성숙 시스템 잘 테스트 체 외에서 사용을 용이 하 게. 종 특이성을 피하려면 분리 수정 ZP의 부재에서 일반적으로 수행 됩니다. Vitelline 막으로 융합 acrosome 반응 정 충의 능력의 평가 대 한 수 있습니다, 하지만 그것은 수정에 관련 된 다른 기능 평가 손상 한다. 설명 하는 절차 zona 그대로 oocytes를 사용 하 고 다음 매개 변수 평가: 정자 zona 바인딩 및 첨부 파일, 침투, polyspermy, pronuclear 형성 및 하이브리드 배아 분열.
여기, 우리가 현재 정자 컬렉션, 기본 정자 분석, 정 충 동결 뿐만 아니라 돌고래 정자 기능 평가 대 한 여러 가지 프로토콜 heterologous 체 외 수정 후 남성 pronuclear 및 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 zona 그대로 사용 하 여 소 oocytes입니다.

<table><tbody><tr><td>FERT-TALP 매체</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCM-199</td><td>Sigma</td><td>M-4530</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B-2261</td><td></td></tr><tr><td>4-well dish</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>밀도 구배 BoviPure</td><td>Nidacon International</td><td>BP-100</td><td></td></tr><tr><td>세척 용액 Boviwash</td><td>Nidacon International</td><td>BW-100</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Promega</td><td>A35.1H</td><td></td></tr><tr><td>멸균수</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 트리스 붕산염 EDTA</td><td>시그마</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>MB 아가로 스</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>5X GoTaq 플렉시 버퍼</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>MB 아가로 스</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>Taq 중합효소</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SafeView</td><td>NBS Biologicals Ltd.</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>Makler 계수 챔버</td><td>Sefi Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thoma 챔버</td><td>Hecht-Assistant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmeter MicropH 2000</td><td>Crison Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>삼투압 온도계 고급 마이크로 삼투압 계 3300</td><td>Norwood</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터 보조 정자 분석 시스템</td><td>Projectes y Serveis R + D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실체현미경 MZ 95</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent optics Eclipse Te300</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal assistant 4.02 software</td><td>Bio-Rad</td><td>3D analysis software</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscopy</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 조명기</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 열 순환기 Primus 96 Plus</td><td>MWG AG Biotech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

병 코 돌고래 (tursiops truncatus) 정 충: cryopreservation, 수집과 heterologous 체 외에서 수정

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Cryopreserved 돌핀 정 충의 사용 수 중 공원 사이 유전 물질의 교환을 용이 하 게 하 고 정 충은 해양 포유 동물 복제에 대 한 우리의 이해를 심화 하기 위해 연구 실험실에 액세스할 수 있습니다. 분리 IVF, 동종 IVF에 대 한 대체 잠재적인; 정자 비 옥을 테스트 하는 수단을 제공할 수 있습니다. 연구 생식 체 생리학 및 초기 배아 발달; 그리고 얻기 어려운 귀중 한 돌고래 oocytes의 사용을 피하기 위해. 여기, 우리는 성공적으로 수집 하 고 돌고래 정 충 cryopreserve 사용 된 프로토콜을 제시. 정액의 컬렉션은 훈련 된 돌고래에 수동 자극에 의해 수행 됩니다. Cryopreservation은 글리세롤과 트리 스 달걀 노른자위 기반 extender를 사용 하 여 수행 됩니다. 또한, 우리는 분리 IVF 돌고래 정 충와 소 oocytes를 사용 하 여 설명 하 고는 PCR를 사용 하 여 결과 배아의 하이브리드 성격을 확인 하는 프로토콜을 제시. 분리 수정 수정에 대 한 질문을 제기 하 고 생식 체 생리학과 초기 배아 발달을 공부 하는 도구로 사용 될 수 있습니다. 또한, 분리 IVF의 성공 테스트 돌고래 정자 비 옥 하 게 용량을 추가 검사의 가치가이 기술의 잠재력을 보여 줍니다.

모든 결과, 표 및 그림 (1 및 2) 여기에 제시 된 권한3으로 재현 했다.
돌핀 정 충 중지 및 재개 후 높은 운동 성을
냉동-해 동 돌고래 ejaculates 84.5 ± 5.3 총 운동 및 69.1 ± 5.1 진보적인 운동 정 충의 백분율 (% ± SD) 보여주었다. 운동 성 측면에서이 숫자는 높은-품질 cryopreserved 정 충의 대표.
돌핀 정 충 관통 zona 그대로 소 oocytes 그리고 생산 하이브리드 배아의 할 수 있다
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여기, 우리는 돌고래 정 충, cryopreservation, 수집과 소 oocytes를 사용 하 여 분리 IVF 성능을 위해 성공적으로 사용 된 프로토콜을 제시.

병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

이 기술의 전반적인 목적은 동결 보존된 돌고래 정자와 투명대(zona pellucida)가 온전한 소 난자를 이용한 이종 간 체외 수정을 통해, 동결 보존된 돌고래 정자의 기능을 평가하는 것입니다. 본 영상에서는 돌고래 정자를 수집, 평가 및 동결 보존하는 방법을 보여드리겠습니다. 그다음 정자와 난자의 상호작용 및 투명대까지의 침투 여부를 평가하겠습니다.수컷 전핵 형성 및 잡종 배아 분할. 보조 생식 기술 개발의 한 가지 중요한 쟁점은 정자의 수정 능력을 통해 가장 잘 나타나는 정자 기능의 평가입니다. 정자 기능 평가에는 일반적으로 동종 IVF 기술이 사용되지만, 돌고래 난자를 얻는 것은 매우 어렵습니다.이종 인체 외 수정의 주요 장점은 그 간편함에 있습니다. 소 난모세포는 쉽게 얻을 수 있으며, 검증된 프로토콜을 통해 체외에서 처리할 수 있습니다. 또한, 액체 질소 증기를 이용해 돌고래 정자를 동결 보존하는 방법을 시연하겠습니다.고도의 전문 동결 장비가 필요하지 않은 간단한 기술입니다. 이 절차를 위해 수컷 돌고래는 긍정 강화 학습을 통해 6개월 동안 사전 훈련을 받아야 합니다. 동물을 수영장 가장자리 근처에서 배측 와위(dorsal recumbency) 상태로 눕힙니다.생식 홈의 두개 부위를 부드럽게 눌러 다양한 촉각 자극을 가함으로써 음경의 자발적 돌출을 유도합니다. 완전한 발기가 이루어지면 음경 끝을 멸균 용기로 향하게 합니다. 분석 전까지 사정액을 37 °C로 유지하십시오.필요에 따라 매번 새로운 폴리프로필렌 유리관을 사용하여 연속적인 정액 수집을 위한 촉각 자극을 반복합니다. 수집 직후 정액을 평가하며, 전 과정 동안 37 °C로 유지합니다. 정액의 부피, 색상, pH 및 삼투압을 측정합니다.그런 다음 10 µL 분취액을 사용하여 계수기에서 정자 농도를 측정합니다. 사출액을 37 °C로 가열된 현미경 스테이지 위의 슬라이드에 놓습니다. 컴퓨터 보조 분석 시스템을 사용하여 정자의 운동성을 평가합니다.필요한 경우, 관찰이 용이하도록 정자를 수정 배지로 희석하십시오. 다음으로, 사출액 20 µL 분취물을 사용하여 Eosin Nigrosin 및 Spermac을 이용한 일반적인 염색법으로 정자의 생존율과 형태를 평가하십시오. 냉동 보존을 위해 먼저 정자 샘플을 원심분리관으로 옮기십시오.그다음 정자를 250 G에서 5분 동안 원심 분리하여 펠릿화합니다. 이제 5분에 걸쳐 1.5% glycerol이 포함된 trace egg yolk 기반 완충액으로 정자 샘플을 1:1로 천천히 희석합니다. 이후 샘플을 5°C에서 1.5시간 동안 냉각합니다.1시간 후 동일한 완충액을 사용하여 1:1 희석을 반복한 다음, 정자 현탁액을 5 °C에서 10분 동안 유지합니다. 다음으로 현탁액을 0.25 mL 스트로에 넣고 열 밀봉합니다. 스트로를 랙에 넣고 랙을 액체 질소 위 4.5 cm 높이에 10분 동안 띄워 둡니다.그 후, 장기 보관을 위해 스트로를 액체 질소에 급속 냉각시킵니다. 본 프로토콜에서는 최근 3시간 이내에 수집하여 따뜻한 식염수에 보관된 소의 난소를 사용하십시오. 먼저 난소를 식염수로 3회 세척하는 것으로 시작합니다.항상 37 °C를 유지하십시오. 다음으로 18 gauge 바늘과 주사기를 사용하여 2 mm에서 8 mm 크기의 모든 난포를 흡입합니다. 50 mL 튜브로 옮긴 후 난모세포가 가라앉을 때까지 15분 동안 둡니다.그런 다음 상층액을 제거하고 난포를 PBS에 재현탁합니다. 실체 현미경 하에서 90 mm 접시에 COCs를 회수합니다. 세포질이 균일하고 적어도 3층의 난구 세포층으로 둘러싸인 1등급 및 2등급 난자를 선택합니다.이 난자들을 35mm 디시에 담긴 PBS로 옮깁니다. 다음으로 COC를 PBS에서 3회, 성숙 배지에서 1회 세척합니다. 그런 다음 각 웰당 50개의 COC와 500milliliters의 성숙 배지를 4-웰 디시에 넣고, COC를 24시간 동안 배양합니다.난모세포의 투명대 주위 세포(cumulous cells)가 팽창하면 성숙한 상태입니다. 이후 수정 배지(fert medium)로 두 번 세척한 다음, 웰당 250 milliliters의 수정 배지가 담긴 4-웰 플레이트에 50개씩 나누어 옮깁니다. 이제 COC를 다시 인큐베이터에 넣고 수정에 사용할 정자를 준비합니다.돌고래 정자가 들어 있는 냉동 스트로와 소 정자가 들어 있는 스트로를 37 °C의 항온수조에서 50초 동안 해동합니다. 그 후 위상차 현미경을 사용하여 정자의 운동성을 주관적으로 평가합니다. 다음으로 정자 샘플을 밀도 구배 튜브로 옮기고 250 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거합니다.그리고 세척액 3 mL를 다시 첨가합니다. 그런 다음 부드럽게 섞어 정자를 재현탁시킵니다. 이제 튜브를 다시 원심 분리하고 상층액의 대부분을 제거하여 정자를 300 µL에 남깁니다.이제 정자의 수를 세고 정자 농도를 배양액으로 희석하여 mL당 200만 개가 되도록 조정합니다. 난자가 들어 있는 각 웰에 현탁액 250 µL를 첨가하여 최종 정자 농도가 mL당 100만 개가 되도록 합니다. 입체 현미경 하에서 운동성이 있는 소 또는 돌고래 정자에 둘러싸인 팽창된 성숙 난자를 관찰합니다. 돌고래 정자는 소 정자보다 크기가 작습니다.생식세포를 18시간 동안 공동 배양합니다. 투명대와 정자의 상호작용을 평가하기 위해, 공동 배양 시작 2.5시간 후에 디쉬에서 난자 20개를 꺼냅니다. 좁은 구경의 파스퇴르 피펫으로 강하게 피펫팅하여 느슨하게 부착된 정자들을 제거합니다.다음으로, 3342를 사용하여 난모세포를 고정하고 염색합니다. 염색된 난모세포를 개별적으로 2 µL의 마운팅 용액 방울로 옮긴 후, 위상차 현미경을 사용하여 난모세포에 부착된 정자의 수를 측정합니다. 공동 배양 18시간째부터 10개의 추정 접합자를 2 mL의 PBS가 들어 있는 15 mL 원심 분리 튜브로 옮기고, 3분 동안 부드럽게 볼텍싱하여 누적세포를 제거합니다.PBS로 두 번 세척한 후, 앞서 설명한 대로 고정 및 염색합니다. 또한, 공동 배양 18시간 후에 배양용으로 접합자 50개를 수집합니다. 이를 PBS 내에서 3분 동안 볼텍싱한 후 PBS로 두 번 세척합니다.세척 후 세포질이 균일한 접합자를 선택하여 배양합니다. 선택한 접합자를 25개씩 그룹으로 나누어 5% fetal calf serum이 첨가된 25 µL의 인공 난관액 방울로 옮깁니다. 그다음 추정 접합자를 48시간 동안 배양하고 실체 현미경을 사용하여 난할률을 평가합니다.이후 텍스트 프로토콜에 따라 PCR로 이들의 유전적 구성을 추가로 평가합니다. 냉동 해동된 돌고래 사정액의 정자는 약 85%의 운동성과 70%의 전진 운동성을 보였습니다. 이러한 수치는 고품질의 냉동 보존 정자를 나타냅니다.돌고래 정자는 소의 투명대에 부착시키기 위해 2.5시간 동안 공동 배양했을 때 소 정자보다 더 높은 비율로 부착되었습니다. 돌고래 정자는 투명대가 온전한 소의 난자를 관통할 수 있었으며, 이는 전핵 형성 및 난할로 이어졌습니다. 이종 간 체외 수정 군에서는 다정자 침입이 관찰되지 않았습니다.전핵 형성은 24시간째에 가장 높은 비율에 도달했습니다. 동종 집단에서 전핵 형성이 더 빠르게 일어났습니다. 48시간째의 난할률은 동종 수정보다 이종 수정에서 더 낮게 나타났습니다.PCR을 통해 하이브리드 배아 내 돌고래 유전 물질의 존재가 확인되었습니다. 190 bp 크기의 산물을 생성하는 돌고래 18 s 리보솜 유전자 프라이머를 사용하여 테스트를 진행하였습니다. 1번부터 30번 레인은 돌고래-소 하이브리드입니다.대조군은 S 레인의 돌고래 DNA와 C 레인의 소 배아 두 개였습니다. 자가 체외 수정법에 대해 제시된 프로토콜은 큰돌고래가 손상되지 않은 소의 난자를 수정시켜 하이브리드 배아를 형성할 수 있음을 보여주었습니다.이 기술의 추가적인 개발과 최적화는 돌고래 정자의 기능성 평가를 용이하게 할 것입니다. 액체 질소 증기를 이용한 돌고래 정자의 동결 보존은 저렴하고 신속하며 간단한 방법으로, 우수한 심층 운동성 파라미터를 도출하며 성공적인 이종 체외 수정을 가능하게 합니다. 돌고래 정자가 소의 난자를 수정시킬 수 있다는 관찰 결과는 돌고래 및 다른 해양 동물의 번식 연구를 위한 새로운 가능성을 열어줍니다.또한 여전히 상당 부분 해결되지 않은 수정 메커니즘에 대한 의문을 제기합니다.

bottlenose-dolphin-tursiops-truncatus-spermatozoa-collection

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상 기사에서 우리는 하이 포스트 - 해동 서바이벌 속도로 햄스터 oocytes를 수집하고 cryopreserve하는 방법에 대한 단계별 데모를 제시한다. 동일한 절차도 성공적으로 동결과 preimplantation 개발의 다른 단계에 마우스 배아를 해동 적용할 수 있습니다.

수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation

이것은 zebrafish에 대한 높은 처리량 정자 cryopreservation 프로토콜입니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 이후의 체외 수정에 25 % 다산의 평균을 가지고 있으며, 수년 동안 안정 cryopreserved.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

마우스 배아의 에틸렌 글리콜 기반 vitrification 방법이 설명되어 있습니다. 그것은 단순하고 낮은 배아 독성의 다른 방법에 유리하고, 따라서 근친과 유전자 - 수정된 생쥐를 포함하여 마우스의 여러 변종에 광범위하게 적용하실 수 있습니다.

에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

여기 마우스 정자 cryopreservation을 위해 새로 개발된 I • Cryo 키트를 보여줍니다. 냉동 - 해동 정자와 두 개의 세포 단계의 배아 개발이 키트의 사용 5 마우스 종자에 지속적으로 개선되었다. 1.5 년 동안, 49 유전자 변형 마우스 라인 전 • Cryo 키트와 정자 cryopreservation에 의해 보관했다 나중에 성공적으로 IVF로 회복되었습니다.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

제브라피쉬는 고등 척추동물과의 유전적 유사성으로 인해 발생 생물학 및 인간 질병 연구를 위한 강력한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 초기 배발생에 필수적인 유전자의 열성 돌연변이를 식별하기 위한 전방 스크리닝 전략에 활용할 수 있는 반수체 제브라피시 배아를 만드는 방법론을 설명합니다.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

배수성 조작 수정 된 프로토콜은 초기 배아 세포질 분열에 한 사이클 실속을 유도하는 열 쇼크를 사용한다. 이 프로토콜은 제브라에서 설명되지만, 다른 종에도 적용 할 수있다.

열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

생선 정자 평가 소프트웨어를 사용 하 여 및 냉각 장치

유럽 장 어 성숙 및 정자 cryopreservation 프로토콜 지난 수 년에 걸쳐 개선 되었습니다. 이 문서는 성숙과 메탄올 cryoprotectant로 유도 대 한 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)을 사용 하 여 사용할 수 있는 최상의 프로토콜을 설명 합니다.

처리와 치료의 남성 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 호르몬 성숙 및 정자 Cryopreservation

이 프로토콜은 멸종 위기에 처한 산호 종의 정자 처리 및 냉동 보존의 효율성과 용량을 개선하기 위한 반자동 경로를 설명하여 유전적 다양성을 확보하고 산호초 복원 노력을 지원하는 것을 목표로 합니다.

바이오뱅킹 및 양식업을 지원하기 위한 산호 정자의 냉동 보존을 위한 반자동 워크플로우

이 프로토콜은 냉동 보존된 말 정액에서 생존 가능한 체세포(SCs)를 분리하는 간단한 미세 흡인 기법을 제시합니다. 전통적인 방법과 달리, 이 기술은 장기간 시험관 배양을 피하고 정자 오염을 극복하여 체세포 클로닝에 즉각적으로 활용할 수 있게 합니다.

클로닝을 위한 핵 기증자로서 냉동 보존된 말 정액에서 체세포를 분리하는 간단한 미세 흡기 기법

학습하세요 병코돌고래 정자의 채취, 평가 및 동결보존 방법과 소 난자를 이용한 이종 체외수정 기술입니다. 이 프로토콜은 동결보존 정자의 기능성 평가와 수컷 원핵 형성 및 하이브리드 배아 분열을 확인하는 데 활용됩니다.

병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

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