Name: 경유 곰팡이에 의한 신속한 결실 생산 아그로 박테 리움 OSCAR 삭제 구성 요소의 중재 변환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 배우세요 곰팡이에서 정밀한 유전자 결실 돌연변이를 생성하는 OSCAR 방법을 Agrobacterium 매개 변환으로 활용하는 기술입니다. 이 기법은 기능 유전학 연구에 유용합니다.

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저자는 Fusarium verticillioiodes 에서 OSCAR 돌연변이 생성을위한 학부 및 고등학생에게 Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashli ​​Crepsac, Jeff Delong, 크리스 킹, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O&#39;Meara, Lauren (빅토리아) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , 크리스 벤슨, 루니 스토크 스, 한나 이텔, 제인 헐스, 자시 모하메드, 제임스 로긴스, 켈리 러셀, 그레 니 샤 존스, 크리스틴 셰퍼, 마리암 함머디, 에이브 윌슨, 카트리나 바스 모어, 토니 하퍼, 카린 맥기, 모흐메 모민, Thi Ngoc Le와 Angel Pham.

1. 유전자 측면의 PCR 증폭을위한 프라이머 디자인 <ol><li> 오픈 리딩 프레임 (ORF)과 FungiDB 또는 기타 게놈 데이터 자원의 양 측면에있는 유전자 2K 이상을 포함하여 관심 유전자 (GOI)의 게놈 영역을 워드 프로세싱 파일로 다운로드합니다. </li><li> 삭제하고자하는 ORF를 강조 표시하고 코돈을 시작 및 중지합니다. </li><li> 다운로드 된 시퀀스 내에서 인접한 ORF를 식별하고 강조 표시하십시오. </li><li> GOI ORF의 2 kb 5 &#39;말단과 프라이머 디자인 도구 (Materials List 참조)를 사용하여 PCR 프라이머 쌍 O1과 O2를 설계하여 1 kb의 최소 크기의 생성물을 생성하십시오. 인접한 ORF에 영향을 미치지 않도록주의하십시오. <ol><li> 2 kb 5 &#39;측면을 Sequence Entry 창에 붙여 넣습니다. &quot;Show Custom Parameters&quot;상자를 클릭하십시오. 다음 맞춤 설계 매개 변수를 입력하십시오 : primer TM 58 (min), 60 (opt) and 62 (max); 프라이머 GC 40 (min), 50 (opt) 및 60 (max); 프라이머 크기 22 (분), 24 (선택) 및 26(최대); Amplicon 크기 1250 (분), 1500 (선택) 및 2000 (최대). </li><li> ORF에 가장 가까운 역방향 프라이머 (O2)를 배치하는 결과를 선택하십시오. assays의 스크린 샷을 캡처하고 프라이머 시퀀스를 복사하여 워드 프로세싱 문서에 붙여 넣습니다. </li><li> 프라이머 O3와 O4를 생성하기 위해 3 &#39;플랭크에 대해이 과정을 반복한다. 이번에는 타겟 ORF에 가장 가까운 포워드 프라이머 (O3)를 배치 한 결과를 선택한다. </li></ol></li><li> 프라이머 1 ~ 4의 5 &#39;말단에 적절한 부착 사이트를 추가하십시오 ( 표 1 참조). </li><li> 또한 아래 4 절에서 삭제 확인을 위해 ORF 특정 프라이머를 설계하고 주문하십시오. 필요한 경우 Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) 및 1000 (max)의 ORF 길이 조정을 제외한 매개 변수는 1.4.1 단계와 동일해야합니다. 마지막으로 상 동성 재조합 체를 확인하기 위해 염색체 내의 5 &#39;및 3&#39;바깥쪽에 프라이머를 생성한다. 이 &quot;out&quot;프라이머는hygR (210) 및 hygF (850)에 의해 억제되었다 ( 도 2 ). </li><li> 프라이머 주문. </li></ol> 2. OSCAR 구축물 제작 <ol><li> Hi-fidelity Taq을 사용하여 한 반응에서 프라이머 (100 μM) O1과 O2를 사용하고 두 번째 반응에서는 프라이머 O3와 O4를 사용하여 5 &#39;와 3&#39;측면 각각에 대해 두 개의 반응을 수행하십시오. 반응 혼합물은 29.5 μL 멸균 증류수 (SDW), 5 μL 10X LA PCR 버퍼, 8 μL 2.5 MM dNTP 믹스, 5 μL 25 MM MgCl 2 , 1 μL 템플릿 (50 NG / μL), 0.5 μL 하이 - 충실도 Taq , 0.5 μL Primer O1 및 5 &#39;측면 (0.5 μL Primer O3 및 0.5 μL 3&#39;측면에 대한 Primer O4)에 대한 0.5 μL Primer O2 사용 조건은 다음과 같습니다 : 94 ° C에서 1 분, 30 초 동안 94 ℃, 30 초 동안 60 ℃, 2 분 동안 72 ℃에서, 마지막 단계는 72 ℃에서 5 분간 그리고 나서 10 ℃에서 무기한 유지. </li><li> 0.8 % 뛰기제품 크기 및 상대 농도를 결정하기 위해 표준 미니 겔 장치에서 약 125Vh 동안 아가로 오스 1x TAE (40mM 트리스 아세테이트 pH 8.3, 1mM EDTA) 겔 전기 영동을 수행 하였다. 게시물은 제조 업체의 지침에 따라 비 ethidium 얼룩으로 젤을 얼룩. UV 조명기로 시각화하십시오. </li><li> 5 &#39;와 3&#39;측면 제품이 대략 균등 농도 인 경우, 이들을 조합하고 친 화성 칼럼 키트 (또는 PEG 침전물 90 μL 결합 PCR 제품, 240 μL TE 완충액 pH 7.5, 160 μL 30 % 폴리에틸렌 글리콜 PEG8000 30 mM MgCl 2 ) PCR 산물을 제조자의 프로토콜에 따라 동시 정제한다. 이들이 동등한 농도가 아닌 경우, 저농도 생성물 모두를 고 수율 반응으로부터 산출 된 동등한 양의 산물과 결합시킨다. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 정제 된 DNA 농도를 측정하십시오. </li><li> 다음을 혼합하여 BP 반응을 수행하십시오 : 1 μL의 60 ng / μL pOSCAR, 2 μL의 60 ng /μL pA-Hyg-OSCAR, 1 nL / 60 ng / μL 조합 측면, 1 μL의 clonase. 25 ° C에서 16 시간 동안 품어 낸다. 0.5 μL proteinase K를 첨가하고 37 ℃에서 10 분 동안 항온 처리하여 반응을 종결시킨다. </li><li> 높은 역량을 개편 E. 대장균 . 상업적으로 이용 가능한 적격 세포와 집에서 만든 DH5α CaCl2 적격 세포 모두를 제조자의 지시에 따라 수령자로서 성공적으로 사용 하였다. 100 μg / mL spectinomycin (스펙)을 포함하는 낮은 나트륨 (0.5 g / L NaCl) LB 플레이트. </li><li> 위에 생성 된 식민지의 DNA minipreps 10 을 수행하여 올바른 구조를 식별합니다. 다음과 같이 Hin dIII와 Kpn I로 이중 분해를 수행하십시오. 피펫 5 μL DNA, 2 U의 각 효소, 2 μL 적절한 10x 완충액 (SDW 포함)으로 20 μL 총 부피. 이것은 벡터 ( 약 7kb)로부터 인서트 (1.5kb 유전자 옆구리를 갖는 대략 4.5kb)를 방출하고예측 가능한 밴드 크기를 줄 수있는 측면. </li><li> 서열 11 은 적절한 줄무늬 패턴을 나타내는 클론을 선택한다. </li></ol> 3. 진균의 Agrobacterium tumefaciens 매개 변형 (ATMT) <ol><li> OSCAR 결실 구조로 Agrobacterium tumefaciens AGL1 균주를 형질 전환 12 . </li><li> GOI OSCAR 결실 플라스미드를 함유하는 AGL1로 곰팡이를 형질 전환시킨다. 이렇게하려면 다음 단계를 수행하십시오. <ol><li> 2 x 10 6 포자 / mL의 멸균 수로 곰팡이 포자 현탁액을 준비하십시오. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터에서 포자를 정량. 1.5 ML microcentrifuge 튜브 에이 500 μL를 놓으십시오. 이 셋업은 4 개의 변형 플레이트 용입니다. </li><li> 2 일 2-3 일 오래된 LB - 사양 100 매체에서 AGL1을 포함하는 삭제 플라스미드의 쉽게 보이는 gob (루프 직경의 약 20 %를 커버한다)을 추가하려면 푸른 살균 일회용 루프를 사용하십시오 (Materials List for composition) 플레이트를 포함하고 포자 현탁액에 혼합합니다. 박테리아 세포가 잘 분산 될 때까지 와동 ( 약 5 분 중간 속도). </li><li> 분양 배지가 들어있는 4 개의 6cm 페트리 접시에 셀룰로오스 멤브레인 필터의 중심에 분주 - 아크로 서스펜션 100μL를 피펫으로 넣는다. </li><li> 멤브레인 필터의 전체 표면을 덮기 위해 멸균 유리 비드 (약 4)로 현탁액을 퍼지십시오. 또는 기존 스프레더 도구를 사용하여 서스펜션을 펼칩니다. 멤브레인 필터를 약 10 분 동안 두건에서 건조시키고 파라핀 필름으로 감 쌉니다. 3.2.2 및 3.2.3 단계를 반복하여 여러 변형을 설정합니다. </li><li> 접시를 상온에서 2 일 동안 품어 둔다. </li><li> 하이 그로 마이신 B (Hyg) 150 μg / ML, 200 MM cefotaxime 및 100 μg / ML을 포함하는 6 cm Aspergillus 선택 매체 12 접시에 멤브레인 필터를 전송뜸 락탐. Hyg 내성 콜로니를 분리하기 전에 5-7 일 동안 상온에서 인큐베이션하십시오. </li><li> 멸균 이쑤시개로 150 μg / mL Hyg, 100 μg / mL kanamycin이 들어있는 6 cm Potato Dextrose Agar (PDA) 플레이트에 추정 형질 전환 체를 옮깁니다. </li></ol></li></ol> 4. PCR에 의한 결실 돌연변이 확인 <ol><li> 열 분해로 형질 전환 체로부터 PCR 용 DNA를 추출한다. <ol><li> 형질 전환 체가 3.2.7 단계에서 PDA에 콜로니를 형성하면 멸균 된 이쑤시게를 사용하여 소량 (2mm x 2mm)의 균사체 또는 효모 세포를 식민지에서 100μL의 용해 용액 (50mM 인산 나트륨, pH 7.4, 1mM EDTA, 5 % 글리세롤)을 첨가 하였다. </li><li> 85-90 ° C에서 20-30 분 동안 혼합물을 품는다. 단계 4.2에서 사용까지 -20 ° C에서 게놈 DNA를 포함하는 조잡한 추출물을 저장하십시오. </li></ol></li><li> 형질 전환 체 당 4 개의 PCR 반응 수행선택 가능한 마커 (이 경우 하이 그로 마이신 포스 포 트랜스퍼 라제) 및 GOI ORF에 대해 각각 5 &#39;및 3&#39;측면의 상 동성 재조합을 검출한다. 참고 : 우리는 일반적으로 이러한 반응에 대해 저렴한 충실도의 Taq 를 사용합니다. 반응 조건은 상기 2.1 단계에서 설명한 바와 같으며 SDW 20 μL, 10x Taq buffer 2.5 μL, dNTPS (10 mM) 0.5 μL, 수제 Taq 14 , 0.5 μL, Primer A (100 μM) 0.5 μL, Primer B ) 0.5 μL, 템플릿 0.5 μL. 농도가 더 낮은 프라이머 스톡 (10 μM)도 똑같이 사용할 수 있습니다. </li><li> PCR 제품의 아가 로즈 젤 ( 예 : 0.8 %)을 실행하십시오. 삭제 돌연변이 체는 Hyg 밴드를 생성하지만 ORF 생성물은 생성하지 않습니다. 이소 트로픽 적분기는 두 가지 밴드 모두를 보여줄 것입니다. 와일드 타입은 ORF 밴드 만 생성합니다. </li><li> 차후의 사용을 위해 결실 돌연변이 체 (및 대조를위한 이소성 형질 전환 체 또는 2 개)를 영구 보존한다. 참고 : 15 % 글리세롤은-80 ° C에서 장기적으로 우리의 변종을 찢어 냈습니다. </li></ol>

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Agrobacterium의 한 단계 건설 - 재조합 준비 - 플라스미드 (OSCAR)는 지속적으로 증가하는 자낭 균 (Ascomycota) 균류에 성공적으로 사용되었습니다. 이 방법은 Basidiomycota 및 Agrobacterium 매개 형질 전환 및 상동 재조합이 가능하다고 가정하고 다른 진균 성 phyla의 종 (선택 마커 유전자를 유도하는 적절한 프로모터와 함께)에도 쉽게 적용 할 수 있어야한다. 항 곰팡이 화합물의 선택을 다양 화하고 이중 및 고차 돌연변이 체의 생성을 허용하기 위해 추가 마커 벡터가 생성되었습니다. 여기에는 G418, nourseothricin 및 최근에 제초제 인 glufosinate 암모늄과 chlorimuron ethyl 4 에 대한 내성이 포함됩니다. 이 방법은 여기에 제시된 이미지가 주로 파생 된 Verticillium dahliae 와 함께 사용하기 위해 만들어...

유전 적 해부는 개인 또는 유전자 조합의 기능적 중요성을 결정하는 강력한 방법입니다. 특정 유전자의 역할을 이해하기위한 표준 접근법은 다른 유전자에서 변경되지 않은 단일 유전자 돌연변이의 생산이다. 가장 강력하고 최소한의 혼란을주는 접근법은 다른 유전자 기능에 손상을주지 않으면 서 관심 유전자의 오픈 리딩 프레임 (GOI ORF) 유전자를 완전하고 정확하게 삭제하는 것입니다. 삭제 플라스미드 생성을위한 표준 라이 게이션 접근법은 여러 단계가 필요하기 때문에 OSCAR 1 에 대한 합리적인 방법은보다 신속한 시험 관내 접근법을 생산하는 것이 었습니다. 그림 1 은 OSCAR 방식의 어셈블리 프로세스를 보여줍니다. 여기에 설명 된 방법은 이후의 Agrobacterium tumefaciens 매개 transfo와 결합하여 단일 multipart 반응에서 개별 유전자 삭제 벡터의 빠른 건설을 결합의 장점이 있습니다(ATMT). OSCAR는 매우 신속하며 효모 2 에서 Gibson assembly 사용과 같은 다른 전략과 잘 비교됩니다. OSCAR 방법은 여러 종류의 진균류와 함께 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 종은 다음을 포함한다 : Fusarium verticillioides (미공개), Verticillium dahliae 3 , Setospaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 및 Dothistroma septosporum 9 및 Sarocladium zeae (미공개) . 이 프로토콜은 프라이머 디자인, 플랭크 PCR 증폭, OSCAR BP 반응, 결실 구조 구조 확인, 변형을 포함한 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다이온으로 구성 하고, 결실 구조를 곰팡이 세포로 ATMT에 옮기고, 최종적으로 균류 결실 돌연변이를 돌연변이 적으로 결실 된 결실 구조물과 차별화시킨다.

<table><tbody><tr><td>FungiDB</td><td></td><td></td><td>데이터베이스/</td></tr> <tr><td>http://fungidb.org/fungidb/ IDT PrimerQuest</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer 설계 온라인 소프트웨어/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>Microsoft Word</td><td></td><td></td><td>시퀀스 파일 조작</td></tr><tr><td>Low Na LB Spec 100 medium</td><td></td><td></td><td>E. coli 형질전환체 선택, 구성: 1% 트립톤, 0.05% NaCl, 0.5% 효모 추출물, 1.5% 한천 고형 배지</td></tr><tr><td>공동 배양 배지</td><td></td><td></td><td>ATMT 형질전환 유도(참고 12)</td></tr><tr><td>Aspergillus 최소 배지 with Hygromycin</td><td></td><td></td><td>Fungal transformant selection</td></tr><tr><td>PDA 배지</td><td>Acumedia</td><td>7149A</td><td>단일 포자 경사 튜브</td></tr><tr><td>PDA-Hyg-Kan 배지</td><td></td><td></td><td>곰팡이 ransformant 분리, 150 &mu를 함유하는 PDA; g/mL 하이그로마이신 B 및 100 &mu; g / mL Kanamycin</td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>Genlantis</td><td>C400100</td><td>플레이트 확산</td></tr><tr><td>니트로 셀룰로오스 필터 (47mm)</td><td>Fisher</td><td>09-719-555</td><td>ATMT를위한 공동 배양</td></tr><tr><td>다양한 원심 분리기 튜브</td><td></td><td></td><td>다중 준비</td></tr><tr><td>페트리 플레이트 (다양한)</td><td></td><td></td><td>박테리아 및 곰팡이</td></tr><tr><td>배양 pA-Hyg OSCAR</td><td>Addgene</td><td>29640</td><td>선택 가능한 마커 벡터</td></tr><tr><td>pOSCAR</td><td>Addgene</td><td>29639</td><td>어셈블리 벡터</td></tr><tr><td>DH5&#945; One Shot Competent E. coli cells</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12297-016</td><td>BP 반응 변환</td></tr><tr><td>ccdB 생존 대장균 세포</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A10460</td><td>pOSCAR</td></tr><tr><td>목재 이송 스틱</td><td></td><td></td><td>유지 보수 식민지 줄무늬</td></tr><tr><td>이쑤시개</td><td></td><td></td><td>식민지 채취</td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기</td><td></td><td></td><td>펠릿 박테리아, etc.</td></tr><tr><td>예비 원심 분리기</td><td></td><td></td><td>곰팡이 포자 수집</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td>단일 포자 격리</td></tr><tr><td>자동화 세포 카운터</td><td></td><td></td><td>포자 현탁액 계산</td></tr><tr><td>복합 현미경</td><td></td><td></td><td>혈구계 세포 계산</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR 유전자 측면 생산 정제</td></tr><tr><td>TaKaRa LA Taq&nbsp;</td><td>Takara Bio USA</td><td>RR002A</td><td>Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR 측면 생성</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-5</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>22189-32-8</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime</td><td>TCI America</td><td>C2224</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td></td><td>11815032</td><td></td></tr><tr><td>Moxalactam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43963</td><td></td></tr><tr><td>젤레드</td><td>&nbsp; Phoenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>염색 후 아가로스 젤</td></tr><tr><td>Qiagen QIAquick PCR 정제 키트(Cat. 제28104호)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OneShot_ Mach1TM T1R 또는 OmniMAX Shot_ 1개, Invitrogen의 T1R 2개)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C862003</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II 효소 혼합물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>pOSAR에서 결실 구조를 조립하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

경유 곰팡이에 의한 신속한 결실 생산<em&gt; 아그로 박테 리움</em&gt; oscar 삭제 구성 요소의 중재 변환

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

게놈의 나머지 부분을 그대로두고 관심있는 유전자를 정확하게 삭제하면 살아있는 유기체에서 특정 유전자의 기능을 결정하는 이상적인 제품을 제공합니다. 이 프로토콜에서 정확하고 신속한 삭제 플라스미드 구성의 OSCAR 방법이 설명됩니다. OSCAR는 관심 유전자의 정제 PCR 증폭 5 &#39;및 3&#39;측면과 두 개의 플라스미드, pA-Hyg OSCAR (마커 벡터) 및 pOSCAR (조립체)를 포함하는 단일 재조합 효소 반응이 수행되는 클로닝 시스템에 의존한다 벡터). 올바르게 조립 된 결실 벡터의 확인은 제한 효소지도 작성과 시퀀싱에 의해 수행됩니다. Agrobacterium tumefaciens 는 곰팡이 포자 (ATMT)에 결실 구조의 도입을 매개하는데 사용된다. 마지막으로, PCR 분석은 상 동성 또는 비 상 동성 재조합에 의해 결실 된 결실 구조가 유전자 결실을 나타내는 지 또는이소성 통합. 이 접근법은 Verticillium dahliae 와 Fusarium verticillioides 에서 수많은 종의 유전자를 삭제하는데 성공적으로 사용되었습니다.

단일 반응에서 OSCAR 방법은 선별 마커 카세트를 둘러싼 삭제 대상 유전자의 플랭크를 포함하는 플라스미드를 생성한다. OSCAR을 사용하여 삭제 구문을 생성하는 것은 매우 효율적입니다. 그러나 시스템은 세 가지 단편 (두 개의 유전자 측면과 선별 마커)이 아닌 일부를 포함하는 부분 구조를 생성 할 수 있습니다. 일반적으로 대부분의 대장균 형질 전환 체는 정확한 OSCAR 구조를 포함하고있다. 예를 들어, 그림 2 는 Verticillium dahliae 유전자 VDAG_06812에 대한 OSCAR 결실 구조를 묘사합니다. 이 경우 VDAG_06812의 측면에는 HindIII 또는 KpnI 부위가 없으므로 4,247 bp의 플라스미드 삽입물이 방출되어야합니다. 그림 3 은 비정상적인 구조를 나타내는 레인 5와 11을 제외한 정확한 플라스미드 구조의 HindIII- Kpn...

상 동성 재조합을 통해 생성 된 유전자 결실 돌연변이는 유전자 기능 연구의 황금 표준이다. 결실 구조물의 신속한 생성을위한 OSCAR (Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids의 One Step Construction) 방법이 기술되어있다. 아그로 박테 리움 매개 곰팡이 형질 전환이 이어진다. 마지막으로, 곰팡이 형질 전환 체에서 PCR을 이용한 유전자 결실 확인 방법을 제시한다.

경유 곰팡이에 의한 신속한 결실 생산<em&gt; 아그로 박테 리움</em&gt; OSCAR 삭제 구성 요소의 중재 변환

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

이 절차의 전반적인 목표는 진균에서 정밀한 유전자 결손 돌연변이체를 생성하는 것입니다. 이 방법은 특정 표적 유전자가 진균의 질병 유발 능력에서 어떤 역할을 하는지와 같은 진균 기능 유전학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정밀한 결손을 유도하기 위한 플라스미드를 매우 빠르게 구축할 수 있다는 점입니다.이 방법을 통해 효율적인 상동 재조합 시스템을 갖춘 모든 진균에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 또한 원생생물이나 선충 세포와 같은 다른 시스템에도 잠재적으로 적용될 수 있습니다. 저희는 Oscar와 관련이 있지만 아그로박테리움이 아닌 원형질체 형질전환에 사용되는 DelsGate 시스템을 개발했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다.최적화되었거나 직관적이지 않은 단계들이 다수 포함되어 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 실험 절차의 시연은 My Laboratory의 테크니션인 Nicole Crenshaw가 진행하겠습니다. 이 프라이머 설계 전략을 위해서는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함한 목적 유전자의 게놈 영역과 유전자 양옆으로 최소 2 kb의 인접 서열이 포함된 워드 프로세서 파일이 필요합니다.먼저 결실시키고자 하는 open reading frame을 강조 표시하고, 개시 코돈과 종지 코돈을 표시합니다. 다운로드한 서열 내에서 인접한 open reading frame들을 찾아 강조 표시합니다. 다음으로 프라이머 설계 도구를 사용하여, 목적 유전자 open reading frame의 5' 말단 플랭크(flank)를 위한 PCR 프라이머를 설계합니다.관심 유전자의 open reading frame 5' 방향으로 2kb 영역을 사용하여, 최소 1kb 크기의 산물을 생성할 수 있는 PCR 프라이머 쌍 O1 및 O2를 설계하십시오. 리버스 프라이머 O2가 open reading frame에 가장 가깝게 배치되는 결과물을 선택하십시오. 이때 인접한 open reading frame이 영향을 받지 않도록 주의하십시오.어세이의 스크린샷을 캡처하고, 프라이머 서열을 복사하여 워드 프로세싱 문서에 붙여넣으십시오. 세 번째 프라이머 플랭크(prime flank)에 대해 동일한 과정을 반복하여 O3 및 O4 프라이머를 생성한 후, 4종의 모든 프라이머의 5' 말단에 적절한 부착 부위(attach sites)를 추가하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 결실 확인 및 상동 재조합 확인에 사용할 프라이머를 설계하십시오.5' 플랭크(flank)용과 3' 플랭크용으로 두 가지 PCR 반응을 설정하며 본 절차를 시작합니다. 두 반응 혼합물 모두에 멸균 증류수 29.5 µL, 10x LA PCR buffer 5 µL, 2.5 mM dNTP mix 8 µL, 25 mM magnesium chloride 5 µL, 템플릿 1 µL, 그리고 hi-fidelity Taq 0.5 µL를 첨가합니다. 5' 플랭크 반응액에는 Primer O1 0.5 µL와 Primer O2 0.5 µL를 첨가합니다. 3' 플랭크 반응액에는 Primer O3 0.5 µL와 Primer O4 0.5 µL를 첨가합니다. 다음과 같은 반응 조건으로 PCR을 수행합니다: 94 °C에서 1분간 처리한 후, 94 °C에서 30초, 60 °C에서 30초, 72 °C에서 2분간 처리하는 과정을 30회 반복하며, 마지막 단계로 72 °C에서 5분간 처리한 뒤 10 °C에서 무기한 보관합니다.생성물의 크기와 상대적 농도를 결정하기 위해, 표준 미니 겔 장치에서 1x TLE 겔의 0.8% agar 상에 PCR 생성물에 대한 전기영동을 약 125 volt hours 동안 수행합니다. 제조사의 지침에 따라 non-ethidium 염색약으로 겔을 후염색하고, UV 조사기에서 시각화합니다. 5' 및 3' 플랭크의 농도가 대략적으로 균일하다면, 이를 혼합합니다.농도가 동일하지 않은 경우, 저농도 생성물을 수율이 더 높은 반응에서 얻은 추정상 동일한 양의 생성물과 혼합합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 infinity column kit를 사용하여 PCR 생성물을 공동 정제합니다. 다음으로, 어셈블리 벡터 1 µL, 마커 벡터 2 µL, 혼합된 flank 1 µL, 그리고 clonase 1 µL를 섞어 BP clonase 반응을 수행합니다.25°C에서 16시간 동안 배양합니다. 0.5 µL의 proteinase K를 첨가하고 37°C에서 10분 동안 배양하여 반응을 종료합니다. BP 반응물을 E.coli 세포에 형질전환시키고 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 DNA를 분리한 후, HindIII와 KPN I으로 이중 제한효소 절단을 수행하여 정확한 컨스트럭트를 확인합니다.더블 다이제스팅 시퀀싱(double digesting sequencing)을 통해 OSCAR 결손 컨스트럭트를 확인한 후, 해당 컨스트럭트를 agrobacterium tumefaciens strand AGL1에 형질전환합니다. 다음 단계는 OSCAR 결손 컨스트럭트가 포함된 AGL1을 사용하여 진균을 형질전환하는 것입니다. 먼저 멸균수를 사용하여 2 × 10⁶ spores/mL 농도의 진균 포자 현탁액을 준비하십시오.포자를 희석한 후, 진균 포자 현탁액 500 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 멸균된 파란색 일회용 루프를 사용하여 AGL1을 포함하는 결실 플라스미드 덩어리를 눈에 보일 정도로 적당량 취해 포자 현탁액에 추가합니다. 박테리아 세포가 잘 분산될 때까지 볼텍싱합니다.공동 배양 배지가 담긴 6cm 페트리 접시 4개 각각에 셀룰로오스 멤브레인 필터를 놓고, 접시당 약 4개의 멸균 유리 비드를 추가합니다. 분생포자 현탁액 100 µL를 각 멤브레인 필터 중앙에 피펫으로 분주하고, 비드를 이용하여 현탁액을 멤브레인 필터 전체 표면에 펴 바릅니다. 비드를 제거한 후, 후드 내에서 멤브레인 필터를 약 10분 동안 건조시킨 다음 페트리 접시를 파라핀 필름으로 감쌉니다.배양 접시를 뒤집어 상온에서 2일 동안 배양합니다. 2일 후, 각 멤브레인 필터를 Hygromycin B와 kanamycin이 포함된 6cm agar gel 선택 배지 플레이트로 옮깁니다. 상온에서 5~8일 동안 배양합니다.Hygromycin 저항성 콜로니를 분리하려면, 멸균된 이쑤시개를 사용하여 추정 형질전환체를 Hygromycin과 kanamycin이 포함된 6cm 감자 덱스트로스 한천 배지로 옮깁니다. 플레이트를 실온에서 배양하십시오. 형질전환체가 플레이트 상에서 콜로니를 형성하면, 멸균된 이쑤시개를 사용하여 콜로니의 균사체 또는 효모 세포의 소량을 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 100 µL의 용해액으로 옮깁니다.혼합물을 85~90°C에서 20~30분 동안 배양하십시오. genomic DNA가 포함된 조추출물은 PCR을 수행하기 전까지 -20°C에서 보관하십시오. 결실 돌연변이체를 식별하려면, 먼저 각 형질전환체에 대해 목적 유전자의 open reading frame과 선택 표지자를 검출하는 PCR을 수행하십시오.OSCAR 제작 시 동일한 반응 조건을 사용하십시오. 단일 포자 분리 및 열 용해 후, 오픈 리딩 프레임(open reading frame)과 Hygromycin에 대한 PCR을 반복하고, 5' 및 3' 플랭크(flank)의 상동 재조합을 검출하기 위한 PCR을 수행하십시오. 그 후, PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하십시오.OSCAR 방법은 삭제하려는 표적 유전자의 양 끝단을 둘러싼 선택 마커 유전자를 포함하는 플라스미드를 생성하며, 본 예시에서는 Verticillium dahliae 유전자가 이에 해당합니다. 이중 제한효소 절단 시, 본 사례에서는 4,247 base pair 크기의 삽입편이 방출되어 5번 및 11번 레인을 제외한 모든 레인에서 플라스미드 구조가 올바르게 형성되었음을 확인해 줍니다. 결실 여부는 PCR 방식으로 확인합니다.이 예시는 다섯 개의 *Fusarium verticillioides* 형질전환체 분석 결과를 보여줍니다. 위쪽 젤에서 2번에서 6번 레인은 5' 플랭크 증폭 결과이며, 7번에서 11번 레인은 오픈 리딩 프레임 증폭 결과입니다. 아래쪽 젤에서 2번에서 6번 레인은 선택 마커 유전자 증폭 결과이며, 7번에서 11번 레인은 3' 플랭크 증폭 결과입니다.5' 플랭크(five-prime flank), 3' 플랭크(three-prime flank) 및 선택 마커 유전자 증폭에서 밴드가 나타나고, 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 증폭에서 밴드가 나타나지 않은 것을 통해 스트랜드 1131, 1132 및 1133이 결실 형질전환체임을 확인할 수 있습니다. 오픈 리딩 프레임과 선택 마커 유전자 증폭에서 밴드가 나타나고, 5' 플랭크 및 3' 플랭크 증폭에서 밴드가 나타나지 않은 것은 스트랜드 1134 및 1135가 이소성(atopic) 형질전환체임을 나타냅니다. 유전자 결실은 서던 블롯(Southern blot)으로도 확인할 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 시퀀싱 시간을 제외하고 이틀 만에 진균 형질전환에 사용할 수 있는 Oscar 결손 플라스미드를 제작할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 고충실도(hi-fidelity) Taq 중합효소를 사용해야 하며, 인접한 유전자가 영향을 받지 않는지 반드시 확인하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 유전자가 약물 민감성 또는 내성과 같은 특정 과정에서 중요한 역할을 하는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 돌연변이 표현형을 테스트하는 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.아그로박테리움(Agrobacterium)이나 곰팡이와 같은 살아있는 유기체를 다루는 것은 특히 면역력이 저하된 개인에게 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 따라서 본 절차를 수행할 때는 취급 후 손 씻기와 같은 예방 조치를 항상 실시해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

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