Name: 편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 배우세요 E. coli 편모 모터의 실시간 회전 측정 기법을 통해 기계생물학적 특성을 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 환경 신호에 대한 모터 리모델링 반응을 정밀하게 추적할 수 있습니다.

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저자는 Howard Berg에게 구슬 추적 현미경/광전자 증배관을 기증한 것에 대해 감사를, 기금에 대해 Texas A&M Engineering Experiment Station에 감사를 표합니다.

1. 셀 준비 <ol><li> 10 mL의 신선한 TB 100 희석 : 1에 접종 한 다음 트립 톤 국물 (TB, 1 % 펩톤, 0.5 % 염화나트륨)에 대립 유전자 15, 22 끈적 끈적한 플릭를 들고 원하는 균주의 야간 문화를 성장. OD 600 = 0.5까지 진탕 배양기에서 33 ° C에서 문화를 성장. </li><li> 1,500 XG에서 세포 펠렛 5-7 분, 재 분산 펠렛 적극적으로 필터 살균 운동 버퍼의 10 ㎖의 (MB를 10 mM의 인산 완충액 : 0.05-0.06 M 염화나트륨, 10-4 M EDTA, 1 μm의 메티오닌, pH가 7.0). </li><li> 단계를 반복 1.2 두 번 더 1 ML의 MB의 마지막 펠릿을 재 분산. </li><li> (- 12cm 길이, 0.58 mm 내경 7) 폴리에틸렌 튜브로 연결된 21 ~ 23 게이지 어댑터와 함께 두 주사기 사이에 앞뒤로 ~ 75 번 전달하여 정지 전단. 45 초 - (30) 전단의 총 시간을 제한합니다. </li><li> 5-7 분 동안 1,500 XG에서 전단 된 세포를 원심 분리하여 다시 분산MB의 500 μL - 100 펠렛. </li></ol> 2. 슬라이드 준비 <ol><li> 커버 슬립 현미경 슬라이드 사이에 두 개의 양면 접착 테이프를 개재하여 촬상 챔버를 준비한다. 화성 분석을 위해, MB, 화학적 자극의 교환을 가능하게하는 미세 유체 챔버를 사용합니다. </li><li> 챔버에서 0.01 % 폴리 -L- 라이신 솔루션을 추가하고 5 분 후 부드럽게 MB와 표면 세척 (80-100 μL)를. </li><li> 챔버 내로 세포 현탁액 40 μL의 추가, 유리 표면에 부착을위한 충분한 시간이 허용 (7-8 분). 다른 측면에서 여과지로 용액을 심지하면서 상기 챔버의 일측에 100 μL를 첨가하여 MB 떨어진 세포를 흐른다. </li><li> 챔버로 라텍스 구슬 15 μL와 비즈를 정착 세포에 부착 할 충분한 시간 수 - 10 추가 (7-8 분). 구슬 떨어진 제거하는 단계 2.3에 설명 된대로 조심스럽게, MB의 100 μL 씻어. 비드 실리콘의 범위를 사용하여좋은 대비를 사용할 정도로 오랫동안 실험 ZES. </li></ol> 3. 비드 추적 <ol><li> 현미경 스테이지에 샘플을 놓고 모터에 연결된 구슬 위해 표면을 검사합니다. 위상 현미경이 필요하지 않지만 관측을 만들기 위해 40X 위상 목적을 사용합니다. 또한, 너무 오래 충분한 대비가 명확하게 어두운 배경에 밝은 구슬을 구분하기 위해 유지되는 밝은 - 필드 이미징을 사용한다. </li><li> 비드가 선택되면,도 1b에 도시 된 바와 같이 소정의 모서리에 비드를 위치 시키도록 측 방향으로 상기 스테이지를 이동. 같은 코너에 위치 구슬은 구슬의 회전 방향이 제대로 알려져 있는지 확인합니다. 이상적인 비드 궤도는 대략 원형이지만, 타원형 궤도가 허용됩니다. </li><li> 에일리어싱과 연관된 에러를 방지하기 위해 모터의 회전 주파수의 두 배 이상의 샘플링 주파수를 높게 유지. 본 연구에서는으로 회전 된 모터를 사용10 시간 이상 (500 Hz에서)했다 주파수 50 Hz의 시료는 평활 한 신호를 획득한다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 23 필요한 경우 센터는 아핀 변환과 궤적의 PMT 출력 전압과 정확한 타원의 크기를 조절합니다. 회전 속도 (17)를 결정하기 위해 전력 스펙트럼 분석을 사용한다. </li><li> 극 각도 θ (t) = ATAN (Y (t) / X (t))를 결정합니다. 모터 속도의 변화를 확인하고 ω를 계산하여 시간이 지남에 따라 전환 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li> 모터 속도 데이터를 부드럽게 중앙값 필터를 사용한다. 이 전체 회전을 통해 필터 창 (23, 24)를 권장합니다. </li></ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
<li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li>
<li>Kao, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+among+bacterial+motility+and+virulence+factors+in+different+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).</li>
<li>Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rotary+motor+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The rotary motor of bacterial flagella.</a> Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).</li>
<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+Dynamometer+Controls+Swarmer+Cell+Differentiation+of+V.+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li>
<li>Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mechanosensing+in+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li>
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<li>Silverman, M., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+rotation+and+the+mechanism+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility.</a> Nature. 249, 73-74 (1974).</li>
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<li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).</li>
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<li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+of+the+bacterial+flagellar+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Switching of the bacterial flagellar motor near zero load.</a> J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).</li>
<li>Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+Relationship+of+the+Na%2B-driven+Flagellar+Motor+of+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus.</a> J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).</li>
<li>Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+relationship+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).</li>
<li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
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<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

테더 비드 추적 모터 토크의 정확한 추정을 용이하게하기 위해, 다음과 같은 정보가 검토되어야한다. flagellated 세포 이러한 측정을 수행 할 때, 전단은 중요한 단계입니다. 전단시켜 상기 모터의 점성 부하가 비드에 주로 기인하고 10 %의 오차 (16)에서 추정 될 수 있도록, 단순한 스터브로 편모 필라멘트를 감소시킨다. 양털 깎기도 밀접하게 분산 기행 (&lt;비드 직경 14)와 원형 궤적을 찾는 기회를 향상시킨다. 추적 및 점성 드래그를 계산할뿐만 아니라 열악한 신호 대 잡음비의 결과에 오류를 화합물 제멋대로 궤적 부적절한 전단 결과. 오실로스코프의 사용은 이러한 데이터를 신속하게 제거 할 수 있습니다. 편모 필라멘트의 생체 역학적 특성은 종에 따라 다양 할 것으로 예상되기 때문에, 전단 방법 가능성 t에 충분한 전단력을 보장하도록 구성 될 필요그는 관심의 박테리아. 셔링과 연관된 에러를 감소시키는 효과적인 방법은 필라멘트 단백질을 인코딩하는 유전자를 결여 세포에서 작동한다. ...

편모 모터는 나선형 외 필라멘트를 회전하여 수영을 셀 수 있습니다. 모터가 편모 (즉, 점성 부하)의 소정 기간 동안 생성 할 수있는 토크의 양이 수영 속도를 결정한다. 한편, 회전 방향을 전환 할 수있는 능력은 화학 약품, 화학 주성으로 공지 된 과정에 응답하여 세포 이동을 제어한다. 화성과 운동성되는 독성은 1-3, 편모 모터는 년 4로 잘 특성화 된 요인. 증거 확보 해주기 모터가 mechanosensor 역할을 제안 - 그것은 기계적 고체 기판 -5,6-의 존재를 검출한다. 이 기능은 가능성이 표면 식민지 및 감염 5,7 트리거링에 도움이됩니다. 결과적으로, 모터의 표면과 동수 신호를 감지하여 그에 메커니즘의 중요성 8,9이다. 편모 모터는 쉽게 flagell를 테 더링으로 공부하실 수 있습니다UM 기판에 세포 회전을 관찰. 이러한 테 더링이 먼저 안티 - 후크 항체 (10)와 유리 기판에 polyhook의 대장균에서 돌연변이 성공적으로 연결된 후크와 협력 실버 사이먼에 의해 달성되었다. 속박 세포 분석은 화학 자극의 다양한 모터 스위치의 반응을 연구 연구 할 수 있었다. 예를 들어, Segall와 동료들은 화학적으로 이온 영동 피펫의 도움으로 닿는 세포를 자극. CW 바이어스에 해당 변경 화성 네트워크 (11, 12)에서 적응의 반응 속도를 측정하기 위해 그들을 사용 (시간 모터의 비율은 CW, 시계 방향으로 회전). 닿는 세포 분석은 스위치 응답을 공부에 효과적이지만, 단지 점성로드 (13)의 제한된 범위에서 모터 역학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있었다. 이 문제를 극복하기 위해 류와 동료들은 표면에 붙어있는 세포 스텁 필라멘트 구면 라텍스 비즈 닿는. 비드이었다다음 약한 광 트랩 (14) 백 초점 간섭을 사용하여 추적. 서로 다른 크기의 구슬과 협력함으로써, 연구진은 부하의 훨씬 넓은 범위에 걸쳐 모터를 연구 할 수있다. 이 분석법 후에 레이저 암시 야 조명과 결합 된 광전자 계 비드 추적 기술을 개발 위안 베르그 향상했다. 외부 점성 저항이 회전 (15, 16)에 내부 점성 저항에 비해 낮았다 너무 작았 닿는 골드 나노 비드 (~ 60 ㎚)의 그들의 방법을 사용 추적. 이 대장균에서 달성 가능한 최대 속도 (~ 300 Hz에서)의 측정을했다. V.의 alginolyticus에서 유사한 비드 분석은 중간 점성 부하 (~ 700 Hz에서) (17)의 회전 속도를 측정 할 수 있었다. (제로로드에서 가까운 매점에) 점성 부하의 전체 가능한 범위에서 모터 반응의 측정을 가능하게함으로써, 비드 분석은 t을 이해하는 중요한 생물 리 학적 도구를 제공orque 생성 프로세스 (18, 19). 최근에, 우리는 각각의 모터 6 정밀 기계적인 자극을 적용 할 수있게 광 핀셋을 포함하도록 위안 - 버그 분석을 수정했습니다. 그들은 점성 부하의 변화에 ​​응답하여 개조 -이 기술을 이용하여, 모터 회전 힘 발전기 동적 mechanosensors이다 것으로 나타났다. 이 메커니즘 불분명 남아 있지만 이러한 하중 감지가 진을 치고 박테리아로 세포 분화를 유발하는 것이 가능하다. 직접적인 증거는 부족하지만 다른 종의 편모 모터는,도 20 mechanosensitive 것으로도 보인다. 여기, 우리는 편모 필라멘트 (15)에 닿는 라텍스 구슬의 회전을 추적하기위한 광전자 기반 (PMT) 접근 방식에 대해 설명합니다. 이 실시간으로 긴 경질 위에 단일 비드를 추적 비교적 간단하기 때문에 초고속 카메라 추적 비교에서, 광전자 - 설치 유리한TIONS. 때문에 환경 자극 (21)에 편모 모터 단지에 리모델링 긴 시간을 공부 할 때 특히 유용합니다. 구체적으로는 E. coli에 대한 우리 상세히 프로토콜이지만, 그들은 용이하게 다른 종 편모 모터 공부하도록 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>폴리-L-라이신 용액(0.1%)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US 폴리비드 마이크로스피어</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1 mL 루어 슬립 팁 주사기</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub 어댑터 23-게이지</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>광전자 증배관 튜브</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>스펙트럼 응답 범위는 300에서 920 nm, 피크 파장은 630 nm,&nbsp; 0.78 ns 응답 시간&nbsp; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 x 1 mm 정밀 슬릿</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>광전자 증배관에 서로 직각으로 장착된 2개의 슬릿</td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>대체 브랜드를 사용할 수 있습니다. 디지털 오실로스코프, TBS 1000B 시리즈, 2 아날로그, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&nbsp; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>8극 LP/HP 필터</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>대체 브랜드를 사용할 수 있습니다. 0.1Hz에서 200kHz 사이의 주파수 범위를 사용하는 것이 좋습니다. &nbsp; &nbsp; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Optiphot 현미경</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>모든 직립 또는 반전 위상 현미경을 사용할 수 있습니다. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Cube Beamsplitter</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

박테리아 운동성과 화학주성에서 편모 모터의 역할은 잘 알려져 있습니다. 최근의 발견에 따르면 편모 모터는 다양한 환경 자극에 반응하여 리모델링할 수 있으며 표면 집락 및 감염의 유발 요인 중 하나입니다. 모터가 세포 적응을 리모델링하고 촉진하는 정확한 메커니즘은 주요 모터 속성에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에 제시된 광전자 증배관 기반 비드 추적 기술을 사용하면 모터 속도 및 스위치 역학의 적응을 포함하여 모터 기능의 정확한 생물물리학적 특성을 분석할 수 있습니다. 이 접근 방식은 실시간 추적의 이점과 장기간에 걸쳐 모터 동작을 프로브할 수 있는 기능을 제공합니다. 논의된 프로토콜은 다양한 박테리아 종의 편모 모터를 연구하기 위해 쉽게 확장될 수 있습니다.

광전자 증 배관 설치는 그림 1A에 표시됩니다. 이는 관심의 PMT가 비드에 의해 산란의 파장 범위에서 높은 감도를 갖는 것이 중요하다. 여기에서 사용되는 PMT가 가시 근적외선 범위에서 동작하고, 할로겐 광원에 의해 조명 비즈 산란광을 검출 할 수 있었다. 최적의 조명 조건 및 공급 전압을 하나의 설정마다 다를 것이다. 이 작업에 사용되는 설정하는 PMT 이득 ~ 들어 4월 10일에서 5월 10일까지 충분히 입증했다. 각각의 광전자는 광전자 앞에 위치하는 3 × 1mm 슬릿 제외 덮었다. 슬릿 광은 광전자 증 배관을 입력 할 수있는 세포 샘플의 영역을 제한하고,이 슬릿은 서로 직교한다. 회전 비드 올바른 위치 (도 1b)에 위치하는 경우, 광전자 증 증가 들어오는 빛의 양이 비드 온다그것의 원형 경로로보기 및 감소에 떨어져보기에서 그것을합니다. 정현...

최근의 연구 결과에 따르면 박테리아 편모 모터는 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 반응하여 리모델링을 합니다. 여기에서 논의된 비드 분석은 환경 스트레스 요인에 대한 세포 적응에서 리모델링의 역할을 설명하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 살아있는 박테리아 세포 내 개별 편모 모터에 부착된 프로브 비드의 회전을 측정하는 것입니다. 본 설명에서 다룰 기술은 모터 반응을 실시간으로 추적할 수 있고, 허용 가능한 데이터와 허용 불가능한 데이터를 실시간으로 구별할 수 있다는 장점이 있습니다. 이러한 접근 방식은 기계생물학 분야의 핵심 질문에 답하고 분자 모터 행동의 기반이 되는 물리학을 밝히는 데 도움을 줍니다.우리는 주로 E.coli의 편모 모터를 연구하기 위해 이러한 기술을 사용하지만, 이 프로토콜은 다른 편모 박테리아 종의 모터를 연구하는 데에도 쉽게 적용될 수 있습니다. sticky fliC 대립유전자를 보유한 대상 균주를 TB 배지에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 신선한 TB 10밀리리터를 1:100 희석 비율로 접종하십시오. 600nm에서의 광학 밀도가 0.5가 될 때까지 진탕 배양기에서 33°C로 배양하십시오.1500 ×g에서 5~7분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음, 필터 멸균된 10 mL의 운동성 완충액(motility buffer)에 펠렛을 강력하게 재분산시킵니다. 원심분리와 재현탁 과정을 두 번 더 반복합니다.최종 펠렛을 1 mL의 MB에 다시 분산시킵니다. 폴리에틸렌 튜브로 연결된 21에서 23 gauge 어댑터가 장착된 두 개의 시린지 사이로 현탁액을 약 75회 왕복시켜 전단(shear)합니다. 전단에 소요되는 총 시간은 30에서 45초로 제한합니다. 전단된 세포를 원심분리한 후, 펠렛을 100에서 500 µL의 MB에 다시 분산시킵니다. 커버 슬립과 현미경 슬라이드 사이에 두 개의 양면 테이프를 샌드위치 구조로 배치하여 이미징 챔버를 준비합니다.챔버에 0.01% poly-L-lysine 용액을 넣고 5분 후, 표면을 MB로 부드럽게 헹굽니다. 챔버에 40 microliters의 세포 현탁액을 넣고 유리 표면에 부착될 때까지 충분한 시간을 둡니다. 챔버의 한쪽에 100 microliters의 MB를 추가하는 동시에 반대편에서 여과지로 용액을 흡수시켜 부착되지 않은 세포를 흘려보냅니다. 다음으로, 챔버에 10 내지 15 microliters의 라텍스 비즈를 넣습니다.충분한 대비(contrast)를 얻을 수 있는 다양한 크기의 비드를 실험에 사용하십시오. 비드가 가라앉아 세포에 부착될 수 있도록 충분한 시간을 둡니다. 부착되지 않은 비드를 제거하기 위해 100 µL의 MB로 비드를 부드럽게 헹굽니다.시료를 현미경 스테이지 위에 놓고 모터에 부착된 비드를 찾기 위해 표면을 스캔하십시오. 어두운 배경에서 밝은 비드를 명확하게 구별할 수 있을 만큼 충분한 대비가 유지되는 한, 60X 대물렌즈를 사용하여 명시야 이미징을 수행하십시오. 비드가 선택되면 스테이지를 가로 방향으로 이동시켜 비드를 미리 정해진 모서리에 배치하십시오.비드의 회전 방향을 정확하게 파악하기 위해 비드들을 동일한 모서리에 배치하십시오. 앨리어싱(aliasing)과 관련된 오차를 방지하기 위해 샘플링 주파수를 모터의 회전 주파수보다 2배 이상 높게 유지하십시오. 본 연구에서는 50 hertz로 회전하는 모터를 관찰하기 위해 10배 더 높은 샘플링 주파수를 사용하였습니다.테더링 후 비드의 흔들림 편심이 비드 반경의 1~2배보다 크게 나타나면, 세포에 더 많은 횟수의 전단력을 가하는 것이 권장됩니다. 여기에는 적절하게 테더링된 비드와 테더링되지 않은 비드의 시각적 비교가 제시되어 있습니다. 500 Hz로 샘플링된 두 광증배관의 출력값이 측정의 짧은 기간 동안 표시되어 있습니다.중심화 및 스케일링을 거친 PMT의 필터링된 출력값은 여기에 표시된 것과 같이 회전하는 비드의 원형 궤적을 재구성하는 데 사용되었습니다. 이상적인 비드 궤적은 거의 원형에 가깝지만, 타원형 궤적도 허용됩니다. 단일 모터에 대해 비드 궤적으로부터 계산된 각속도는 3초의 윈도우 범위에 걸쳐 나타납니다.모터의 반시계 방향과 시계 방향 회전 사이의 반복적인 전환은 양수 값과 음수 값의 전환으로 나타납니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 본 영상에서 제시한 광증배관 기반 기술을 사용하여 단일 편모 모터에 결합된 비드의 위치를 높은 정확도로 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 박테리아 편모 모터는 수백 헤르츠의 속도로 회전할 수 있기 때문에 독특한 일련의 과제들을 제시합니다.분자 모터에 결합된 프로브 비드의 고정밀 추적을 통해 키네신(kinesin), 미오신(myosin) 및 F1-ATPase를 포함한 여러 유형의 모터 특성 분석이 가능해졌습니다. 비드 결합 기술을 편모 모터로 확장함으로써 연구자들은 전례 없는 정확도로 모터 역학을 연구할 수 있게 되었습니다. 이 방법의 시각적 시연은 개별 모터에 적절하게 결합된 비드를 찾는 것과 같은 어려움을 극복하고 이 기술을 활용하고자 하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.본 연구에서 시연한 방법들을 통해 다양한 박테리아 종에서 이러한 나노머신의 적응성에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있을 것으로 기대됩니다.

biophysical-characterization-of-flagellar-motor-functions

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

소포 또는 세포 소기관과 같은 화물의 세포 내 수송은 편광된 미세소관을 추적하는 분자 운동 단백질에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 뉴런 내부로 이동하는 개별 화물 입자의 수송 방향성과 관련 운동 단백질의 상대적 양 및 유형의 상관관계를 설명합니다.

사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 &quot;화물 매핑&quot;분석

이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

여기에 제시된 미오신 5a를 발현하고 정화하는 절차이며, 체외 형광 현미경 기반 의 앙상블 과 단일 분자를 모두 사용하여 이러한 방법이 비근육 근신 2b의 특성화를 위해 어떻게 수정될 수 있는지에 대한 논의가 뒤따릅니다.

체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 Myosin 특이적 적응

여기에 제시된 것은 공정 myosin-5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 포괄적인 프로토콜이며, 이는 다른 등급의 공정 모터 연구로 쉽게 확장될 수 있습니다. 프로토콜은 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.

초고속 포스 클램프 분광법을 사용한 공정 미오신의 기계적 효소 특성 해부

여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.

박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

이 프로토콜은 MultiBac Baculovirus 시스템을 사용하여 인간 myosin-7a holoenzyme을 재조합 생산하고 맞춤형 in vitro 필라멘트 글라이딩 분석을 사용하여 운동성을 연구하는 절차를 자세히 설명합니다.

인간 Myosin-7a의 MultiBac 시스템 기반 정제 및 생물물리학적 특성 분석

배우세요 E. coli 편모 모터의 실시간 회전 측정 기법을 통해 기계생물학적 특성을 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 환경 신호에 대한 모터 리모델링 반응을 정밀하게 추적할 수 있습니다.

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

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