조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍

이 절차의 전반적인 목표는 식도 질환을 연구하기 위해 내시경 생검에서 환자 유래 식도 상피 세포를 확장하거나 다운스트림 모델링 또는 식도 조직 교체를 위한 3D 식도 골격을 만드는 것입니다. 이 방법은 식도 질환에서 식도 상피 세포의 역할을 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 모델링 또는 이식을 위한 3D 골격을 보는 데 사용할 수 있습니다.

이 기술의 장점은 유전적 또는 영구적인 변형 없이 매우 작은 조직 조각에서 환자 특이적 상피 세포를 생성할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 호산구성 식도염의 발병 기전을 이해하고 식도 폐쇄증 및 호산구성 식도염에 대한 치료법을 개발하는 데까지 확장됩니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 순도를 유지하기 위해 인간 식도 상피 세포를 수확하기 전에 영양 세포를 완전히 제거하는 능력에 어려움을 겪을 것입니다.

이 기술을 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Christopher Foster가 될 것입니다. 환자 샘플을 얻기 최소 3일 전에 조직 처리된 T75 플라스크의 3T3 배양 배지에 3T3 세포를 플레이트화합니다. 실험 당일, 샘플을 채취하기 직전에 플라스크당 0.25%트립신-EDTA 5밀리리터가 함유된 3T3 셀을 섭씨 37도에서 약 5분 동안 분리합니다.

대부분의 세포가 떠 있을 때 5ml의 3T3 배지를 첨가하여 반응을 중지하고 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮겨 원심분리합니다. 계수를 위해 펠릿을 중간에 다시 매달아 놓습니다. 그런 다음 파종을 위해 적절한 수의 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 25ml의 새로운 3T3 배지를 세포에 추가하여 3000rads에서 조사합니다. 그런 다음 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 100mm 플레이트당 5밀리리터의 조건부 프로그래밍 배지에 다시 현탁시킵니다. 내시경 검사 시 약 6개의 식도 생검을 받은 후, 젖은 얼음에 프리모신을 보충한 완전한 무혈청 각질 세포 배지가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 6개의 생검을 실시합니다.

완충된 포르말린 5ml에 하나의 바이옵시를 젖은 얼음 위에 올려놓고, 매립 배지가 들어 있는 작은 바이오몰드(cryomold)에 바이옵시 크리오몰드(cryomold)에 바이옵시를 한 번 넣습니다. 즉시 액체 질소 용기 안의 얼음 또는 펜탄 비커에 금형을 담그십시오. 조직이 얼면 cryomold를 폴리스티렌 폼 용기에 드라이 아이스 위의 표본 백에 넣습니다.

그런 다음 생검 튜브를 젖은 얼음이 들어있는 생물학적 위험 라벨이 있는 배송 상자 안의 밀봉 가능한 백 안에 넣고 실험실로 운송하기 위해 두 용기에 생물학적 위험 스티커를 밀봉하고 라벨을 붙입니다. 실험실에 들어가면 즉시 다운스트림 절편 또는 RNA 추출을 위해 냉동 생검을 섭씨 영하 80도의 저장소로 옮깁니다. 포르말린에 함유된 검체를 섭씨 4도의 냉장고에 넣어 하룻밤 동안 고정하고 나머지 생검 결과를 원심분리기에 넣습니다.

각 튜브의 매체를 10ml의 디스페이즈 용액으로 교체하고 수조에서 섭씨 37도에서 15분 동안 배양할 수 있도록 튜브를 밀봉합니다. 배양이 끝나면 생검을 다시 중단하고 0.25%Trypsin-EDTA를 5ml에 재현탁합니다. 생검을 단일 100ml 멸균 플레이트로 옮기고 두 개의 멸균 면도기를 사용하여 조직을 가능한 한 미세하게 다집니다.

모든 조직을 절단한 후 조직 조각을 새 15ml 튜브로 옮기고 0.05% 트립신-EDTA 5ml로 플레이트를 두 번 헹굽니다. 세척액을 튜브에 모으고 샘플을 섭씨 37도의 수조로 되돌립니다. 10분 후, 분해된 샘플 조각과 공급 세포를 원심분리하고 펠릿을 각각 5ml의 조건부 재프로그래밍 배지에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 피더 샘플과 식도 생검 샘플을 하나의 튜브에 결합하고 젤라틴으로 코팅된 조직 배양 접시에서 공동 배양을 위해 세포에 rho kinase 또는 ROCK 억제제를 추가합니다. 약 5일 후, 흡인에 의해 배지 및 다진 생검 조각을 제거하고 5ml의 멸균 PBS로 접시를 2-3회 헹굽니다. 마지막 세척 후 ROCK 억제제가 보충된 신선한 배지 10ml를 플레이트에 추가하고 세포가 70% 밀도에 도달할 때까지 공동 배양을 인큐베이터로 되돌립니다.

세포를 확장하려면 섭씨 37도에서 2분 30초 동안 0.05%Trypsin-EDTA 5밀리리터로 공급기를 제거합니다. 5ml의 새 PBS로 플레이트를 헹구어 떠다니는 공급 세포를 제거하고, 5ml의 0.25% 트립신-EDTA를 추가하여 생검 샘플 세포가 플레이트 바닥에서 느슨해질 때까지 5-10분 동안 배양합니다. 그런 다음 10ml의 새로운 배지로 반응을 중지하고 원심분리를 위해 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

계수를 위해 펠릿을 새로운 조건부 재프로그래밍 배지에 다시 현탁시키고, 이제 새로운 원추형 튜브로 여섯 번째 인간 식도 세포에 10 배를 설명합니다. 식도 세포에 여섯 번째로 조사된 3T3 세포에 1.2 곱하기 10을 추가하고, 새로운 조건부 재프로그래밍 배지로 튜브의 총 부피를 15밀리리터로 가져옵니다. 그런 다음 세포에 새로운 ROCK 억제제를 첨가하고 젤라틴으로 코팅된 150mm 접시에 공동 배양을 플레이트합니다.

영하 80도의 보관을 위해 식도 세포를 동결하려면 방금 설명한 것처럼 공급기를 제거하고 식도 세포를 분리하십시오. 다음으로, 원심분리를 위해 세포를 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 펠릿을 동결 매체 농도 2밀리리터당 6번째 세포까지 1배 10으로 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 2밀리리터의 세포를 사전 라벨링된 각 극저온에 옮기고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 최소 24시간 동안 보관한 후 장기 액체 질소 저장소로 이동합니다.

상피 세포 군집은 약 4-5일 내에 형성되며 섬유아세포 공급 세포로 둘러싸여 있습니다. 이 식민지가 확장됨에 따라 다른 식민지와 병합되어 더 큰 식민지를 형성하게 됩니다. 문화가 70% 집중되면 확장해야 합니다.

공급세포가 제거된 후, 부착 상피세포는 트립슨화되어 방사선 조사된 새로운 공급세포에 재도금될 수 있습니다. qRT-PCR을 통한 이러한 세포의 표현형 특성6on은 초기 바이오스파이 샘플과 비교하여 계대 1 말단의 전구 세포 마커인 P63의 상향 조절을 나타내며, 이는 세포가 더 전구 줄기와 유사한 상태로 재프로그래밍되었음을 나타냅니다. 이러한 세포가 정상 조직 배양 플레이트로 전달되면 P63 발현이 감소하고 밀착 접합 단백질 1(TJP1) 및 E-cadherin 발현이 증가하여 전구 세포에서 보다 분화된 상피 세포로의 표현형 이동을 보여줍니다.

1번 계대 후 세포의 유세포 분석을 통해 90% 이상의 세포가 EpCAM에 대해 양성임을 알 수 있습니다. 면역형광 염색은 세포가 상피 마커, 전구 마커, 증식 마커 및 상피 밀착 접합 단백질 발현을 유지함을 보여줍니다. 질병에 걸리지 않은 환자의 식도 세포가 배가되는 시간은 약 36-40시간으로 계산되었지만, 병에 걸린 세포의 배가 시간은 더 느릴 가능성이 있습니다.

이 기술을 완전히 익히면 약 1시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 멸균 기술을 사용하여 오염을 방지하고 세포 생존력을 유지하기 위해 신속하게 작업해야 합니다. 이 절차에 따라 어떤 항원이 식도 염증 또는 발병을 유발하는지 평가하기 위해 트랜스웰 배양과 같은 다른 분석을 수행할 수 있습니다.

개발 후, 이 분석법은 연구자들이 호산구성 식도염을 유발하는 유발 항원과 이러한 환자를 치료하기 위한 새로운 치료 옵션을 식별할 수 있는 길을 열 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 식도 질환을 연구하거나 3D 모델을 생성하는 데 사용하기 위해 내시경 생검에서 식도 상피 세포를 분리하고 확장하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 날카로운 기구와 생물학적 조직으로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

날카로운 기구는 반드시 적절하게 폐기하고 우수한 생물 안전성 관행을 사용하십시오.