Name: 조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 배우세요 조건부 재프로그래밍을 이용해 소아 환자 유래 식도 상피 세포를 확장하는 방법입니다. 이 기술은 유전자 변형 없이 조직 공학 및 식도 질병 연구에 활용할 수 있는 환자 특이적 세포원을 제공합니다.

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이 작업을 지원해 준 Connecticut Children's Medical Center Strategic Research Funding에 감사드립니다.

동의가 소아 환자의 부모 / 보호자로부터 및 기관 검토위원회 (IRB # 13-094)에 따라 얻은 후 식도 생검을 얻었다. 1. 살균 악기 및 젤라틴 솔루션 <ol><li> 오토 클레이브 겸자 면도날 및 오염을 방지하기 위해 조직을 처리하기 전에 위. </li><li> 0.1 % 젤라틴 용액을 200 mL로, 젤라틴 0.2 g에 증류수 200 ㎖를 조합. 압력솥 멋진 사용하기 전에. </li></ol> 2. 코팅 조직 배양 플레이트 <ol><li> 종래 셀 분리하는데 약 2 시간이, 조직 배양 접시 (100mm)를 커버하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다 충분한 0.1 % 젤라틴을 추가한다. 참고 :이 접시도 미리 만들어 사용하기 전에 배양기에서 유지 될 수있다. </li></ol> 3. 해리에 대한 효소 솔루션을 만들기 <ol><li> 약 세포 분리에 앞서 30 분, 밖으로 무게유리 병에 밀리그램 농도 당 단위를 기준으로 균형에 디스 파제의 10 대. 37 ° C의 물을 욕조에 10 ㎖ 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 및 장소 15 ML 원뿔 튜브에 분말을 배치합니다. </li></ol> 4. 만들기 세포 배양 매체 <ol><li> F12의 35 ㎖ (햄의 중간), DMEM의 11.5 ㎖, L 글루타민 0.5 mL를 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신 0.5 ㎖, 2.5 ㎖의 : 멸균 원뿔 튜브에 다음 성분을 혼합, 조건부 재 프로그래밍 매체의 50 mL로한다 소 태아 혈청 (FBS), 인간 인슐린 250 μg의 인간 표피 성장 인자 (EGF)의 (500)의 NG. </li><li> , 3T3 매체의 500 mL로 FBS의 50 ㎖, 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신의 5 mL의 DMEM 500 mL를 L 글루타민 5 mL를 혼합합니다. </li><li> 각질 세포의 무 혈청 배지 500 mL로, EGF와 (미디어 제공) 소 뇌하수체 추출물 (BPE) 보조 식품을 해동. 기본 매체의 500 ㎖ 병에 보충제를 추가하고 10의 5 mL를 넣고0X 페니실린 / 스트렙토 마이신 </li></ol> 피더 소스로 5. 배양 및 조사 3T3 세포 <ol><li> DMEM, 10 % FBS, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2 mM L- 글루타민을 포함하고, 3T3 매체를 준비한다. </li><li> 문화 적어도 삼일 환자 샘플의 도착 전 조직 처리 T-75 플라스크에서 3T3 세포. <ol><li> 5 ㎖ 플라스크 당 0.25 % 트립신 - EDTA의 및 사용 3T3 세포가 5 분 동안 또는 가장 셀 때까지 37 ° C에서 부화 환자 샘플의 도착를 Trypsinize 직전이 떠있다 </li></ol></li><li> 반응을 정지 3T3 매체의 5 ML을 추가합니다. 세포 현탁액을 기음과 15 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 300 X g에서 5 분 스핀. </li><li> 매체를 기음과 세포 계수를위한 트리 판 블루의 정의 된 볼륨 세포를 재현 탁. 죽은 세포를 제외 트리 판 블루 10 μL와 세포의 10 μL를 결합합니다. 세포 계수를위한 혈구에이 솔루션의 부하 10 μL. 참고 :이 프로토하십시오COL, 조사 3T3 세포 접종 밀도는 100mm 플레이트 당 600,000 세포와 동일한 cm 2 당 10,900 세포이다. </li><li> 한 50㎖ 원추형 튜브에 3T3 배지 25 mL에 환자 샘플 재현 탁 당 100mm 플레이트 접시 3000 래드로 조사하는데 필요한 세포의 수를 나누어지는. </li><li> 다음 조사, 아래로 100mm 플레이트 당 5 ㎖에서 조건부 재 프로그래밍 배지에서 5 300 XG에 분,에 resuspend에 대한 스핀 세포. </li><li> 환자 세포의 도금 프로토콜의 뒷부분에서 발생 때까지 옆으로 튜브를 설정 (단계 7.6 참조). </li></ol> 6. 소아 식도 생검을 보존하고 운반, 취득 <ol><li> 15 ML 원뿔 튜브에 100 μg의 / ML의 primocin 완료 각질 세포의 무 혈청 배지 5 mL를 추가하고 얼음에 의료 시설로 가져온다. 주 : 매체의이 튜브는 최대 2 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> TI의에서 약 8 식도 조직 검사를 구합니다나에게 다음과 같이 내시경의 분리 : <ol><li> 젖은 얼음에 100 μg의 / ML의 primocin 및 장소 완전한 각질 세포의 무 혈청 배지를 포함하는 15 ML 원뿔 여섯 조직 검사를 놓습니다. </li><li> 젖은 얼음에 완충 포르말린과 장소의 5 mL에 하나의 조직 검사를 놓습니다. </li><li> 최적의 절단 온도 화합물 cryomold 작은 생검 한 조직 검사를 놓습니다. <ol><li> 즉시 액체 질소에 배치 이소 펜탄의 비커에 넣고,이 금형을 놓습니다. 일단 냉동, 견본 가방에 cryomold을 배치하고, 스티로폼 용기에 드라이 아이스에 저장합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 밀봉 가방 안에 다음 젖은 얼음을 포함하는 배송 상자에 중간 또는 포르말린에서 조직 검사를 포함하는 튜브를 놓습니다. 인감 및 생물 학적 레이블 상자에 레이블과 실험실로 운반 할 것. 참고 : 드라이 아이스가 들어 컨테이너 및 냉동 조직 검사는 밀봉 생물 학적 레이블과 레이블이 붙어 있습니다. </li></ol> 7. 처리다운 스트림 문화 분석을위한 환자 조직 <ol><li> 실험실에 도착하면, 하류 단면 또는 RNA 추출을 위해 C의 냉동고 ° -80에 드라이 아이스에 냉동 생검을 전송합니다. 포르말린의 샘플을 놓습니다. 4 ° C 냉장고에 보관 하룻밤 해결 할 수 있습니다. </li><li> 300 XG에 남아있는 조직 검사를 스핀 다운, 그리고 매체를 대기음. 원추형 튜브 시일 디스 파제 용액 10 mL를 첨가하고 15 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 배양 할 수 있습니다. </li><li> 배양 후, 300 × g으로의 조직 검사를 스핀 다운. 0.05 % 트립신 EDTA 5ml에 재현 탁하고 배지를 흡인 생검. </li><li> 100mm의 멸균 판에 조직 검사를 포함하는 트립신 EDTA의 5 mL를 전송하고 2 멸균 면도날 가능한 벌금을 사용하여 조직 검사를 말하다. </li><li> 새로운 15 ML 원뿔에 다진 조직 검사를 포함하는 트립신 EDTA의 5 mL를 전송합니다. 0.05 % 트립신 - EDTA의 추가 5 mL로 두 번 접시를 씻어 원추형에 추가튜브. 37 ° C의 물을 욕조에 10 분 동안 튜브를 품어. </li><li> 배양 후, 5 분 300 XG (1.4 RPM)에서 조직 검사를 스핀 다운 및 매체를 대기음. 원추형 튜브뿐만 아니라 조사 피더 세포를 포함하는 조건부 프로그래밍 매체의 5 ㎖ 조건부 프로그래밍 배지 5 ㎖를 추가한다 (단계 5.7 참조). </li><li> 조직 배양 접시에서 젤라틴을 흡입 한 후 세포 현탁액과 판의 10 ㎖에 ROCK 저해제 (1 μL / mL로)를 추가합니다. 37 ° C에서 품어. </li></ol> 8. 배양 및 확장 셀 <ol><li> 문화의 약 5 일 후, 다진-생검 조각을 포함하는 초기 매체를 대기음 5 mL의 멸균 PBS와 함께 접시에 2-3 번 헹군다. 10 μM에서 ROCK 저해제를 포함하는 판에 새로운 매체를 추가합니다. </li><li> 70 % 포화 상태에 도달하면, 세포를 확장. 접시에 0.05 % 트립신 - EDTA의 5 ㎖를 추가하고 37 ° C 배양기에서 일을 제거 이하 2.5 분을 품어전자 피더 세포. 그 배양 한 후, 트립신 EDTA를 기음과 PBS 5 mL로 접시를 씻어. </li><li> PBS를 대기음하고 판에 0.25 % 트립신 - EDTA 5 mL를 추가하고 5 ~ 10 분 동안이나 세포가 접시에서 느슨한 때까지 배양한다. 반응을 중지하고 50 ML 원뿔 관에 유체를 모두 전송하고 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운 판에 매체의 동일한 금액을 추가합니다. </li><li> 조건부 프로그래밍 매체의 정의 부피 재현 탁 세포는 트리 판 블루 10 μL로 현탁액 10 μL를 혼합한다. 총 세포 수를 결정하는 혈구의 개수. </li><li> 세포를 확장 120 만 15 mL의 총 부피에 3T3 세포를 조사와 함께 150mm 판에 1 백만 인간의 식도 세포를 추가합니다. 10μM에서 신선한 ROCK 억제제를 추가하고 젤라틴 코팅 150mm 접시에 세포 현탁액을 추가합니다. </li></ol> 9. 동결 및 저장 인간의 식도 상피 세포 <ol><li> 매체를 동결하려면 10 % 추가조건부 프로그래밍 매체 DMSO. trypsinizing 및 계산 한 후, 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 고정하고 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운 세포 나누어지는. </li><li> 매체를 기음과 cryovial 당 2 mL의 부피에 매체를 동결 추가합니다. 세포 현탁액을 균질되면, 미리 라벨링 cyrovials 10 6 세포 분취. 장기 액체 질소 저장에 튜브를 이동하기 전에 최소 24 시간 동안 -80 ° C에서 냉동 컨테이너의 장소. </li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

환자로부터 생검 식도 상피 세포를 분리하고 확장하기 위해 가장 중요한 단계가있다 : 1) 적절히 최소 세포사와 생검 조직 해리; 2) 보장 ROCK 억제제마다 변화 매체에서 세포 배양 배지에 첨가되고; 3) 권장보다 더 피더 세포를 사용하지 마십시오 4) 깨끗한 무균 문화를 유지; 5) 합류에 도달하기 직전 통로 세포. 조건부 인해 프로그래밍 얻어 생검 표본에서 환자 - 관련 차이로는 성장 동역학, 표현형 여러 통로로 확장하는 능력의 차이를 예상하는 것이 합리적이다. 일반적으로, 4 식도 생검 세포 격리 각 환자로부터 얻을 수있다. 일단 해리, 우리는이 평균 통로 (3)에 의해 만 10 세포로 확장 일 0에서 약 300,000-600,000 세포를 그물. 상피 세포 라인에 대한 설명 조약돌 형태를 유사하게 나타납니다 형성 식민지의 형태 &lt;SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 25 (그림 2). 문화에 세포의 샘플은 유동 ...

식도 조직 공학 및 호산 구성 식도염 (삼킴)는 지난 10 년간 많은 실험실에서 연구의 초점이되고있다. 이러한 식도 폐쇄증과 같은 선천성 결함, 1 먹을 수 없다는 선도 식도의 불완전 개발 결과 약 1 4,000에서 출산에 볼 수 있습니다. 호산구 식도염의 발생률과 유병률은 1993 년 질병 엔티티의 식별이 호산구 식도염의 빈도는 10 인 - 연간 / 100,000 0.7에서 변화와 유병률은 43 / 10 만 2 0.2에서 원거리 이후로 증가하고있다. 롱갭 식도 폐쇄증의 치료에 대한 새로운 매력적인 접근법 수술은 환자 자신의 세포를 이용하여 이식을위한 조직 구조를 생성하는 것으로 이루어진다. 합성 비계와 함께이 세포들은 면역 억제를 필요로하지 않는자가 구조를 생성합니다. 일부 그룹은 이미 우리를 조사하기 시작했다7 - 식도 조직 공학 (3)뿐만 아니라 고유의 식도 상피 세포의 사용과 같은 줄기 세포의 예는 점막 4를 다시 채울. 소아 환자의 식도에 존재하는 질병은 종종 진단이나 간섭없이 공부하기 어렵다. 또한, 사용 동물 모델 또는 시험 관내에서 정확한 질병의 발병 또는 환자 별 차이 (8)을 포함하지 않는 호산구 식도염 등 소아 질환 세포주 모델을 불멸. 따라서, 위해 체외에서 환자의 질병 과정을 연구 할 수있는 기능은 특정 질병 유발 항원을 식별하는 기본 메커니즘을 평가하고 새로운 일 및 환자 치료에 도움이되는 정보와 임상의를 제공 할 것이다 약물 치료를 조사합니다. tissu에서 사용하기 위해 제안 된 많은 환자는자가 또는 특정 세포 유형이 있었다전자 공학 및 인간 질병의 발병 기전을 연구. 그러나, 이들 세포 유형의 일부 큰 지지체 시드 또는 시험 관내 연구에서 높은 처리량을 수행 할 특정 표현형의 충분한 세포를 생성하는 그들의 능력에 제한된다. 다 능성 또는 다 능성 줄기 세포의 사용은 많은 연구의 논의의 주제왔다 그러나, 이들 세포를 사용 제한 및 단점도 9를 설명 하였다. 인간 배아 줄기 세포의 사용은 매우 많은 논쟁 윤리적 문제를 제시한다. 가장 중요한 것은, 이러한 세포는 그들의 능성 상태 사전 거실 호스트 (10)로 전달을 구별하지 않는 경우, 종양과 유사한 기형 종을 형성한다. 또, 배아 줄기 세포의 사용은 환자의 특정되지 않을 것 및 동종 면역 반응 억제 (10)의 필요성을 유도 할 수있다. 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 그 수있는 만능 세포이다환자 자신의 세포로부터 유도 될 수있다. 피부 세포 등의 체세포, 통합 및 비 통합하는 다양한 기술을 사용하여 다 능성 상태로 유도 할 수있다. 이 세포는 조직 공학 또는 질병 연구를위한 환자 맞춤형 세포 소스 역할을합니다. 이들 세포에 원하지 않는 유전 물질의 통합은 여러 설명하고 서열하더라도 완전히 제거 iPSCs들이 11 유도되었던 세포 유형 향해 후생 유전 학적 &quot;메모리&quot;보존 나타날 우려이다. 이식 11 일 전에 분화되지 않는 경우 상기 세포는 생체 내에서 기형 종을 형성한다. 많은 분화 프로토콜 그러나, 분화의 끝에서 생성 된 세포 유형이 균일 및 O 아니라는 것을주의하는 것이 중요 상피 계통 (12, 13), (14)에 집중 조사되었다할수 있답니다 관심의 세포 유형의 일부를 소유한다. 이것은 낮은 수율 및 목적하는 세포 유형을 정제 할 필요성을 초래한다. iPSCs 잠재적 환자 별 셀 소스이지만, 처리는 조직 공학 또는 질병 조사 중 하나에 대한 관심의 세포 유형은 매우 비효율적이다 얻었다. 폐 15 유 16 17 소장, 결장 (18), 방광 (19) 및 식도 (20) : 인간 상피 세포가 성공적 포함한 인체에 질병 및 비 병변 조직 모두 다양한 분리되었다. 이는 일차 인간 세포 표현형 (21), (22)이 유지되는 통로 유한 수있는 것이 중요하다. 불행하게도,이 즉, 질병 조사 또는 설계 발판을 시드에 필요한 세포의 수주입 달성되지 않을 수 있습니다. 따라서, 새로운 기술은 여전히 ​​상피 표현형을 유지하면서 환자의 세포를 확대 할 필요가있다. 피더 세포와 ROCK 저해제를 이용하여 정상 및 암 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍은 리우 등에 의해 2012 년에 설명했다. 2 3. 이 기술은 조사 된 피더 세포, 암 억제제 및 조건부 프로그래밍 매체를 이용하여 전립선 및 유방암의 생검에서 얻은 암성 상피 세포를 확장하는 데에 이용 하였다. 목표는 약물 검사 등의 체외 분석을위한 충분한 세포를 생성하는 것이 었습니다. 이 기술은 높은 증식하는 줄기 또는 선조 같은 상태를 &quot;리 프로그래밍&quot;이 무기한 세포 상피 세포를 확대 할 수있다. 이들 세포가 아닌 종양이며 기형 종 (23), (24)을 형성하는 능력을 갖고 있지 않는 것이 입증되었다. 또한, 아니염색체 이상 또는 유전자 조작이 기술 23, 24을 사용 문화에 이러한 세포를 계대 후 참석했다. 가장 중요한 것은, 이들 세포는 주목 원시 세포 유형으로 분화 할 수있다. 따라서,이 기술은 불멸화 없이도 질환 조사 또는 조직 공학을위한 환자 별 상피 세포의 큰 저장 용기를 제공한다. 질병 과정을 연구하기 위해 특정 기관의 상피 조직을 얻기 때문에, 환자의 위험을 가능 종종 한정되지 항상. 식도 질환 또는 결함을 앓고있는 환자의 경우, 내시경 생검 검색이 해리 조건이 환자의 식도 점막 고유 부정 셀 소스를 제공하기 위해 재 프로그램 될 수있는 상피 조직을 얻기위한 최소 침습적 방법이다. 이것은 다음 체외 연구 허용상피 세포의 잠재적 치료제에 대한 질병 프로세스와 화면을 평가합니다. 크게 이러한 접근법으로부터 이익을 얻을 수 한 질병 과정 식도 (8)의 알레르기 질환과 같은 설명했지만 호산구 식도염이다. 알레르기 시험뿐만 아니라 치료 방법은 환자 자신의 상피 세포를 사용하여 시험 관내에서 평가 될 수 있고,이 데이터는 개별 치료 계획을 수립하기 위해 치료 의사에 전달 될 수있다. 소아 환자에서 내시경 생검을 얻기과 함께 조건부 프로그래밍의 기술은 모든 환자에서 무기한 정상 식도 상피 세포를 확장 할 수있는 기능을 제공합니다. 이 셀 소스 따라서 결함, 질병이나 외상에 대한 환자 맞춤형 수술 옵션을 제공하는 천연 또는 합성 비계와 함께 협력 할 수있다. 무기한 세포 수를 갖는 것은 완전히 시드 가지고 식도 구조 엔지니어링 도움이 될 것이다위해 식도 상피 세포와 루멘하면 나머지 세포 유형의 재생을 촉진하는 데 도움.

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>돼지 껍질의 젤라틴</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>6769006</tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>완전한 각질 세포 무혈청 매체</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 솔루션</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ml</td><td></td></tr><tr><td>인간 표피 성장 인자 (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 (Y-27632)</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 중간&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>100mm 접시</td><td>덴빌 Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>150mm 접시</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원뿔</td>형 <td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; C1062-9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811</td><td></td></tr><tr><td>9" 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

조직 공학 및 질병 조사에 사용하기 위해 배양에서 환자 특이적 세포를 식별하고 확장하는 것은 매우 어려울 수 있습니다. 관심 세포 유형을 도출하기 위해 다양한 유형의 줄기 세포를 활용하는 것은 종종 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 매우 비효율적입니다. 또한 이 세포 소스를 사용하기 전에 원치 않는 세포 유형을 제거해야 하며, 이를 위해서는 프로세스의 또 다른 단계가 필요합니다. 식도 구조의 내강을 설계하거나 식도 질환 치료를 위한 치료 방법을 스크리닝하기에 충분한 식도 상피 세포를 얻기 위해서는 유전자 발현이나 표현형을 변경하지 않고 천연 식도 상피 세포를 확장해야 합니다. 식도 상피 조직의 조건부 재프로그래밍은 환자 특이적 식도 상피 세포를 확장하기 위한 유망한 접근 방식을 제공합니다. 또한, 이러한 세포는 분류하거나 정제할 필요가 없으며 조건부 재프로그래밍 배양에서 제거한 후 성숙한 상피 상태로 돌아갑니다. 이 기술은 많은 암 스크리닝 연구에서 설명되었으며 여러 계대에 걸쳐 이러한 세포를 무기한 확장할 수 있습니다. 식도 선별 검사를 수행할 수 있는 능력은 환자의 증상을 유발하는 유발 메커니즘을 식별하여 호산구성 식도염과 같은 소아 식도 질환의 치료에 혁명을 일으키는 데 도움이 될 것입니다. 선천적 결함, 질병 또는 식도 부상으로 고통받는 환자의 경우, 이 세포 공급원은 영향을 받은 부위를 복구하거나 대체하기 위해 이식용 합성 구조물을 파종하는 수단으로 사용될 수 있습니다.

환자로부터 생검 식도 상피 세포를 단리의 주요 단계의 요약은도 1에 요약 하였다. 상피 세포의 콜로니는 약 4-5일에 형성되고 섬유 아세포의 피더 세포 (그림 2A)에 의해 포위됩니다. 이러한 식민지가 확장됨에 따라 그들은 더 큰 식민지 (그림 2B)를 형성하기 위해 다른 식민지로 병합합니다. 문화가 70 % 합류하게되면, 그들은 (그림 2C)를 확장 할 필요가있다. 섬유 아세포 전에 상피 세포를 제거하기 판에서 제거되는 것을 보장하기 위해, 0.05 % 트립신 EDTA는 피더를 제거하기 위해 최대 2.5 분 동안 사용됩니다. 피더의 부재는 2D 그림과 유사하게 나타납니다. 자기편 상피 세포를 0.25 % 트립신 - EDTA와 트립신 새로운 조사 피더 세포 (그림 2E)에</...

조건부 재 프로그래밍을 이용하여 인간의 소아 식도 상피 세포의 확장 결함이나 부상을 치료 및 치료 심사 분석을위한 저수지 역할을하는자가 이식을 위해 식도 구조 엔지니어링에 이용 될 수있는 셀의 환자 별 인구와 수사관을 제공합니다.

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

본 절차의 전반적인 목적은 내시경 생검을 통해 얻은 환자 유래 식도 상피 세포를 확장하여 식도 질환을 연구하거나, 하위 모델링 또는 식도 조직 대체에 사용할 3D 식도 스캐폴드를 제작하는 것입니다. 이 방법은 식도 질환에서 식도 상피 세포의 역할을 더 잘 이해하는 데 활용될 수 있습니다. 또한, 모델링 또는 이식을 위한 3D 스캐폴드를 제작하는 데에도 사용할 수 있습니다.이 기술의 장점은 유전적 또는 영구적인 변형 없이 아주 작은 조직 조각으로부터 환자 맞춤형 상피 세포를 생성할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 영향은 호산구성 식도염의 병인 이해뿐만 아니라, 식도 폐쇄증 및 호산구성 식도염의 치료법 개발로까지 확장됩니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자들은 순도를 유지하기 위해 인간 식도 상피 세포를 수확하기 전 피더 세포(feeder cells)를 완전히 제거하는 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.이 기술의 시연은 저희 실험실의 테크니션인 Christopher Foster가 진행하겠습니다. 환자 샘플을 채취하기 최소 3일 전에, 조직 처리된 T75 플라스크에 3T3 배양 배지를 사용하여 3T3 세포를 플레이팅합니다. 실험 당일, 샘플을 채취하기 직전에 플라스크당 5 milliliters의 0.25% Trypsin-EDTA를 사용하여 37 °C에서 약 5분 동안 3T3 세포를 탈착시킵니다.대부분의 세포가 부유했을 때, 반응을 중단시키기 위해 3T3 배지 5 milliliters를 첨가하고, 세포 현탁액을 원심분리를 위해 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포 수 측정을 위해 펠릿을 배지에 다시 현탁합니다. 그 후, 분주에 필요한 적절한 수의 세포를 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다.다음으로, 3000 rads에서 조사하기 위해 세포에 신선한 3T3 배지 25 milliliters를 첨가합니다. 그런 다음, 원심분리를 통해 세포를 수집하고, 100 millimeter 플레이트당 5 milliliters의 조건부 프로그래밍 배지로 펠릿을 재현탁합니다. 내시경 검사 시 약 6개의 식도 생검 조직을 얻은 후, Primocin이 보충된 완전 무혈청 각질형성세포 배지가 담긴 15 milliliter 원추형 튜브에 6개의 생검 조직을 넣고 젖은 얼음 위에 둡니다.생검 조직 하나를 얼음 위에 둔 5 mL의 완충 포르말린에 넣고, 다른 생검 조직 하나는 매몰제가 들어 있는 소형 생검 냉동 몰드(cryomold)에 넣습니다. 즉시 액체 질소 용기 내의 얼음 또는 펜탄이 담긴 비커에 몰드를 담급니다. 조직이 동결되면, 폴리스티렌 폼 용기 내의 드라이아이스 위에 있는 검체 봉투에 냉동 몰드를 넣습니다.그 다음, 생검 조직이 든 튜브를 습식 얼음이 들어 있고 바이오해저드 라벨이 부착된 운송 박스 내의 밀봉 가능한 백에 넣고, 실험실로 운송하기 위해 두 용기 모두를 바이오해저드 스티커로 밀봉 및 라벨링합니다. 실험실에 도착하는 즉시, 냉동 생검 조직을 이후의 섹셔닝 또는 RNA 추출을 위해 -80°C 보관소로 옮깁니다. 샘플을 4°C 냉장고 내의 Formalin에 넣어 하룻밤 동안 고정시키고, 나머지 생검 조직은 원심분리기에 넣습니다.각 튜브의 배지를 10 milliliters의 dispase 용액으로 교체하고, 튜브를 밀봉하여 37 degree Celsius의 항온수조에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 생검 조직을 다시 원심 분리하고, 5 milliliters의 0.25%Trypsin-EDTA에 샘플을 재현탁합니다. 생검 조직을 100 milliliter 멸균 플레이트 하나에 옮긴 후, 멸균된 면도날 두 개를 사용하여 조직을 최대한 잘게 다집니다.모든 조직의 절단이 완료되면, 조직 조각들을 새로운 15 milliliter 튜브로 옮기고 플레이트를 0.05% Trypsin-EDTA 5 milliliter로 두 번 헹굽니다. 세척액을 튜브에 모두 모은 후, 샘플을 37 degree Celsius 항온수조에 넣습니다. 10분 후, 소화된 샘플 조각들과 피더 세포(feeder cells)를 원심분리하고, 각각의 펠렛(pellet)을 5 milliliter의 조건부 리프로그래밍 배지(conditional reprogramming medium)에 재현탁합니다.그다음, 피더 세포와 식도 생검 샘플을 하나의 튜브에 합치고, 젤라틴 코팅된 조직 배양 접시에서 공동 배양하기 위해 세포에 rho kinase 또는 ROCK 억제제를 첨가합니다. 약 5일 후, 흡입법으로 배지와 잘게 썬 생검 조각을 제거하고, 5 mL의 멸균 PBS로 접시를 2~3회 세척합니다. 마지막 세척 후, ROCK 억제제가 보충된 신선한 배지 10 mL를 플레이트에 넣고, 세포의 합류도가 70%에 도달할 때까지 공동 배양물을 인큐베이터에 다시 넣습니다.세포를 확장하려면, 37 °C에서 0.05% Trypsin-EDTA 5 mL를 사용하여 2분 30초 이내로 피더 세포를 제거합니다. 플레이트를 신선한 PBS 5 mL로 헹구어 부유하는 피더 세포를 제거한 후, 0.25% Trypsin-EDTA 5 mL를 첨가하고 생검 샘플 세포가 플레이트 바닥에서 떨어져 나올 때까지 5~10분 동안 배양합니다. 그 다음, 신선한 배지 10 mL를 넣어 반응을 중단시키고, 세포를 50 mL 원심분리관으로 옮겨 원심분리합니다.펠릿을 신선한 조건부 재프로그래밍 배지에 다시 현탁하여 세포 수를 측정하고, 1x10⁶개의 인간 식도 세포를 새로운 원뿔형 튜브에 분취합니다. 식도 세포에 1.2x10⁶개의 조사된 3T3 세포를 추가하고, 신선한 조건부 재프로그래밍 배지를 사용하여 튜브 내의 총 부피를 15 milliliters로 맞춥니다. 그 다음, 세포에 신선한 ROCK 억제제를 첨가하고, 이 공동 배양물을 젤라틴 코팅된 150 millimeter 디시에 분주합니다.식도 세포를 -80°C에서 보관하기 위해 동결시키려면, 방금 시연한 대로 피더 세포를 제거하고 식도 세포를 분리하십시오. 다음으로, 세포를 새로운 50 mL 원심분리 튜브(conical tube)로 옮겨 원심분리하고, 펠렛을 동결 배지 2 mL당 1 × 10⁶ cells 농도로 재부유시키십시오. 그런 다음, 미리 라벨을 붙인 크라이오바이알(cryovial) 각각에 세포 2 mL씩을 옮기고, 장기 액체 질소 보관소로 옮기기 전 최소 24시간 동안 -80°C에서 보관하십시오.상피세포 콜로니는 약 4~5일 후에 형성되며, 섬유아세포 피더 세포(fibroblast feeder cells)로 둘러싸이게 됩니다. 이러한 콜로니가 확장됨에 따라 다른 콜로니와 병합되어 더 큰 콜로니를 형성합니다. 배양 세포의 밀도가 70%confluent에 도달하면 확장 배양이 필요합니다.피더 세포를 제거한 후, 부착성 상피 세포를 트립신 처리하여 새로운 조사된 피더 세포 위에 다시 도말할 수 있습니다. qRT-PCR을 통한 이 세포들의 표현형 분석 결과, 초기 생검 샘플과 비교하여 계대 배양 1회차 종료 시점에 전구 세포 마커인 P63의 발현이 상향 조절되었음을 보여주며, 이는 세포가 더욱 전구 줄기세포와 유사한 상태로 재프로그래밍되었음을 나타냅니다. 이 세포들을 일반 조직 배양 플레이트로 옮기면 P63 발현은 감소하고, 밀착 연접 단백질 1(TJP1) 및 E-cadherin의 발현이 증가하는데, 이는 표현형이 전구 세포에서 더욱 분화된 상피 세포로 전환되었음을 입증합니다.1대 계대 배양 후 세포의 유세포 분석 결과, 90% 이상의 세포가 EpCAM 양성임을 나타냅니다. 면역형광 염색을 통해 세포들이 상피 마커, 전구 세포 마커, 증식 마커 및 상피 밀착 연접 단백질 발현을 유지하고 있음을 확인하였습니다. 비질환 환자의 식도 세포 배가 시간은 약 36에서 40시간으로 계산되었으나, 질환 세포의 배가 시간은 이보다 더 느릴 가능성이 높습니다.이 기술을 숙달하면 약 1시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 오염을 방지하기 위해 무균 기술을 사용하고, 세포 생존력을 유지하기 위해 신속하게 작업하십시오. 이 절차 이후에는 식도 염증이나 병인 기전을 유발하는 항원이 무엇인지 평가하기 위해 트랜스웰 배양과 같은 다른 분석을 수행할 수 있습니다.이 분석법이 개발되면, 연구자들은 호산구성 식도염을 유발하는 항원을 식별하고 환자를 치료하기 위한 새로운 치료 옵션을 찾는 길을 열게 될 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 식도 질환 연구나 3D 모델 생성을 위해 내시경 생검 조직에서 식도 상피 세포를 분리하고 확장하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 날카로운 기구와 생물학적 조직을 다루는 것은 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.날카로운 도구는 적절하게 폐기하고, 우수한 생물안전 수칙을 준수하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 수술 조직과 생검에서 수집한 결장 소굴에서 인간 장류를 확립하고 결장 소굴에서 콜로노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 방법론적 기사에서는 인간 장 및 콜로노이드의 성공적인 성장과 유지에 필수적인 배양 방식을 제시합니다.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

이 원고는 생산, 특성화 및 일반 차 인간의 식도 섬유 아세포와 드 cellularized 돼지 비계 내에서 시드 편평 상피 세포로부터 제조 된 조직 설계 3D 식도 구조의 사용 가능성에 대해 설명합니다. 결과 정상적인 인간 식도 유사한 성숙한 상피 성층의 형성을 입증한다.

3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

이 간행물은 어린이의 코 상피 점막을 성공적으로 샘플링 및 배양하고 이러한 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다.

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식도 재건은 도전적인 절차이며, 식도 점막과 근육의 재생을 가능하게하고 인공 이식으로 이식 할 수있는 조직 공학 식도의 개발이 필요합니다. 여기에서는 스캐폴드 제조, 생물 반응기 재배 및 다양한 수술 기법을 포함한 인공 식도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

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이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

현재 프로토콜은 1차 조직(피부, 폐포, 기도 및 장)의 전층 장기 온칩 배양의 성공적인 확립 및 성숙을 위한 Open-Top Organ-Chip의 기능과 필수 배양 양식을 설명하여 시험관 내에서 인간 상피/중간엽 및 혈관 틈새 인터페이스의 다양한 기능적 측면을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.

Reconspartuting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성)

오가노이드-섬유아세포 공동배양은 생체 내 줄기세포 틈새를 연구하기 위한 모델을 제공한다. 여기서, 식도 오가노이드-섬유아세포 공동배양을 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 또한 전체 마운트 이미징을 사용하여 섬유아세포-오가노이드 상호작용을 시각화합니다.

Functional Characterization and Visualization of Espacageal Fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화)

여기에서는 인간 식도 오가노이드 배양 및 공기-액체 계면 배양을 위한 프로토콜을 제공합니다. 식도 오가노이드의 공기-액체 계면 배양은 식도 상피 장벽에 대한 사이토카인의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

호산구성 식도염의 상피 장벽을 조사하기 위한 3차원 세포 배양 모델 

본 프로토콜은 종양 진행의 여러 단계를 나타내는 식도 오가노이드 모델의 확립 및 조직학적 분석을 설명합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 정상 조직에서 암 조직으로 전환하는 동안 세포 형태, 공간 조직 및 분자 마커 발현 패턴의 변화를 연구할 수 있습니다.

정상 조직에서 암 조직으로의 진행을 모델링하는 식도 오가노이드의 확립 및 조직학적 분석

배우세요 조건부 재프로그래밍을 이용해 소아 환자 유래 식도 상피 세포를 확장하는 방법입니다. 이 기술은 유전자 변형 없이 조직 공학 및 식도 질병 연구에 활용할 수 있는 환자 특이적 세포원을 제공합니다.

조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍

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