MitoCeption는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아 전송

이 절차의 전반적인 목표는 중간엽 줄기세포와 같은 기증자 세포에서 이전에 분리된 미토콘드리아를 교모세포종 줄기세포와 같은 표적 세포로 전달하는 것입니다. 이 절차는 터널링 나노튜브 또는 미세소포와 같은 과정에 의해 세포 간에 자발적으로 전달되는 미토콘드리아의 대사 및 생물학적 효과와 같은 대사 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미토콘드리아의 효과를 사이토카인 또는 대사 산물과 같은 미시 환경에 존재하는 다른 요인 및 터널링 나노튜브에서 이동할 수 있는 다른 화합물과 독립적으로 평가할 수 있다는 것입니다.

이미징 목적을 위해 MSC 미토콘드리아와 GSC는 MitoCeption에 의한 미토콘드리아 전달 전에 필수 염료로 표지할 수 있습니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 GSC를 필수 염료로 사전 라벨링한 후 섭씨 20도에서 5분 동안 270배 g의 원심분리로 50ml 튜브에 GSC 신경구를 수집합니다. HBSS 5ml를 사용하여 세포를 세척하고 튜브를 다시 돌립니다.

상등액을 흡입하고 100 마이크로 리터의 0.25 % 트립신 -EDTA로 GSC 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 3분 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, DNase I 1밀리리터당 10밀리그램으로 2마이크로리터에 20밀리몰 염화칼슘 10마이크로리터를 튜브에 추가합니다.

P200 피펫을 사용하여 기포 형성을 피하면서 위아래로 30-50회 부드럽게 피펫팅하여 신경구를 해리합니다. HBSS 10ml에 5%트립신 억제제 10마이크로리터를 세포에 첨가하고 GSC를 7분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액과 10ml의 GSC 기초 배지를 샘플에 버립니다.

이제 Thoma 계수 챔버를 사용하여 다시 회전하기 전에 세포를 계수합니다. 적절한 부피의 GSC 증식 배지를 추가하여 10의 세포 농도에서 밀리리터당 6번째 GSC에 도달합니다. 그런 다음 96 웰 플레이트의 웰당 10에서 5번째 GSC를 시드합니다.

GSC가 우물 바닥에 가라앉도록 플레이트를 원심분리합니다. 현미경으로 세포를 확인하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.

MSC 미토콘드리아 분리를 수행하려면 먼저 마이크로 원심분리기 온도를 섭씨 4도로 조정합니다. 미토콘드리아 추출을 위한 시약이 들어 있는 A와 C로 표시된 두 개의 1.5ml 튜브를 준비합니다. MSC 및 MiTo로 표시된 두 개의 추가 튜브를 준비합니다.

튜브를 얼음 위에 두십시오. 또한 미토콘드리아 제제와 함께 설정될 미토콘드리아 연속 희석을 위한 튜브를 준비합니다. MSC를 세척하기 위해 섭씨 37도로 예열된 PBS 10밀리리터를 사용하십시오.

그런 다음 EDTA가 없는 트립신 2ml로 10초 동안 세포를 세척하고 1ml의 트립신을 추가로 첨가한 후 섭씨 37도에서 5분에서 10분 동안 세포를 배양합니다. EDTA의 사용은 프로토콜에 따라, 특히 MSC 트립신화 및 미토콘드리아 제제에 사용되는 프로테아제 억제제에 대해 피해야 합니다. Alpha MEM 10%FBS 10ml를 첨가하여 MSC를 회수하고 현탁액을 50ml 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 세포를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 세포 펠릿에 Alpha MEM 10%FBS 10ml를 첨가합니다. 그런 다음 Malassez 계수 챔버를 사용하여 MSC를 계수한 후 4-5배, 10배, 5번째 세포까지 회전합니다.

상층액을 버리고 세포 펠릿에 얼음처럼 차가운 Alpha MEM 10%FBS 1ml를 첨가한 다음 얼음 위에 계속 보관하면서 세포를 이전에 준비된 MSC 표지 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 MSC 튜브를 섭씨 4도에서 900배 g으로 5분 동안 원심분리하고 튜브에서 모든 잔류 매체를 제거합니다. 다음으로, EDTA-free 프로테아제 억제제가 포함된 미토콘드리아 분리 시약 A 200마이크로리터를 MSC에 추가하고 5초 동안 중간 속도로 와류를 일으킵니다.

그런 다음 튜브를 얼음 위에 정확히 2분 동안 그대로 두십시오. 2.5마이크로리터의 미토콘드리아 분리 시약 B를 넣고 튜브를 다시 얼음 위에 놓기 전에 10초 동안 최대 속도로 세포를 소용돌이칩니다. 5분 동안 30초마다 소용돌이를 반복합니다.

이제 EDTA-free 프로테아제 억제제가 포함된 미토콘드리아 분리 시약 C 200마이크로리터를 튜브에 추가하고 튜브를 약 30회 기울여 내용물을 혼합합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 700회 g으로 10분 동안 원심분리합니다. MSC 미토콘드리아를 함유한 상등액을 미리 준비된 MiTo 튜브로 옮깁니다.

3, 000 시간 g에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리하십시오. 상등액을 버린 후 200마이크로리터의 시약 C를 사용하여 미토콘드리아 펠릿을 헹굽니다. 다음 12, 4 섭씨 온도에 g에 현탁액을 5 분 동안 회전시켜 세포 기관을 펠릿으로 만듭니다.

분리된 MSC 미토콘드리아를 GSC로 전달하려면 미토콘드리아 펠릿에 200마이크로리터의 사전 냉각된 GSC 증식 배지를 추가합니다. GSC 증식 배지에서 미토콘드리아 제제를 희석하여 GSC에 20마이크로리터의 미토콘드리아 현탁액을 일관되게 추가할 수 있도록 합니다. 다음으로, 미토콘드리아를 우물 바닥 가까이에 천천히 추가합니다.

MSC 미토콘드리아 바이탈 염료 누출을 제어하려면 GSC 증식 배지만 포함된 96웰 플레이트의 웰에 동일한 양의 미토콘드리아 제제를 첨가합니다. 1, 500 회 g에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 플레이트를 원심 분리하십시오. 그런 다음 즉시 배양물을 섭씨 37도에 놓습니다.

다음 날, 중요한 염료 누출에 대한 대조군을 분석하기 위해 앞서 설명한 대로 GSC 세포를 시딩하고 플레이트를 원심분리한 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양물을 배양합니다. 미토콘드리아만 포함하는 96웰 플레이트를 원심분리합니다. 그런 다음 GSC 96 웰 플레이트에서 배지를 흡입하고 미토콘드리아 상층액으로 교체합니다.

GSC를 미토콘드리아 상등액으로 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 미토콘드리아 전달, FACS 분석 및 컨포칼 이미징 분석을 수행합니다. GSC는 줄기세포 특성을 보존하기 위해 신경구로 성장한 암 줄기세포입니다.

미토콘드리아 전달 직전에 높은 미토콘드리아 전달 효율을 허용하기 위해 단일 세포로 파종되고 다음 날 여기에서 볼 수 있듯이 세포가 다시 신경구를 형성하는 것이 관찰됩니다. 이 그림에서는 형광 표지된 MSC 미토콘드리아가 Gb4 GSC 내부에 국한되어 있는 것을 볼 수 있습니다. MSC 미토콘드리아는 GSC 미토콘드리아와 유사하게 GSC 전체에 나타납니다.

MSC 미토콘드리아의 전달은 GSC 컨포칼 이미지에서 3D 재구성에서 대부분의 GSC에서 관찰될 수 있으며, 이는 전달된 MSC 미토콘드리아의 세포 간 국소화를 확인합니다. 청색 세포 및 적색 미토콘드리아 바이탈 염료로 GSC를 사전 라벨링하면 내인성 GSC 미토콘드리아에 비해 녹색으로 보이는 전이된 MSC 미토콘드리아의 국소화를 시각화할 수 있었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 형광 MSC 미토콘드리아의 양이 증가한 MitoCeption은 FACS 신호를 증가시키고 대조 신호보다 몇 배나 더 높았습니다.

여기에 제시된 미토콘드리아 전달 프로토콜은 단일 세포 GSC에서 수행되었으며 용량 의존적 반응과 상대적 평균 형광 강도를 보여주었습니다. 마지막으로, MSC 미토콘드리아 전달이 GSC 신경구에서도 달성되었지만, 이러한 조건에서 GSC로의 전달의 효능은 단세포로 처음 파종된 GSC로 전달된 미토콘드리아에 비해 낮았습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 항상 미토콘드리아 제제를 얼음 위에 두는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 절차에 따라 표적 세포로의 MSC 미토콘드리아 전달을 시각화하고 정량화하기 위해 미토콘드리아 DNA에 대한 FACS, 컨포칼 현미경, QPCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 전달된 미토콘드리아의 생물학적 효과를 결정하기 위해 기능 연구를 수행할 수도 있습니다.

이러한 연구는 일반적으로 미토콘드리아 전달을 시각화하는 데 사용되는 것보다 더 적은 양의 미토콘드리아로 수행된다는 점을 명심하십시오. 이 기술을 통해 정상적인 생리학적 또는 병리학적 조건에서 세포 간에 자발적으로 전달되는 미토콘드리아의 결과와 생물학적 효과를 탐구할 수 있으므로 새로운 치료 요법 개발에 기여할 것입니다.