Name: MitoCeption는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아 전송 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 MitoCeption 프로토콜을 사용하여 인간 중간엽 줄기세포에서 아교모세포종 줄기세포로 미토콘드리아를 전달하는 방법을. 이 기술은 암 대사 연구에서 미토콘드리아 기능을 독립적으로 평가하는 데 활용됩니다.

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우리는 도움이 토론에 대한 실험실의 구성원뿐만 아니라 안드레아 Parmeggiani (L2C 및 DIMNP, 몽펠리에), 벤와 샬럿 (IES, 몽펠리에를) 감사합니다, 크리스토프 Duperray를 제공하기위한 FACS 분석은 몽펠리에 RIO 영상 설비 (MRI)에 대한 도움말 FACS와 공 초점 현미경에 적합한 환경을 제공합니다. BNM은 LABEX Numev (규칙은 ANR-10 LabX에-20)에서 대학원 친교에 의해 지원되었다. AB 바르샤바과 유럽 연합 (EU)의 대학에서 학사 교제에 의해 지원되었다 (N POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV는 과학 연구를위한 국립 센터 (CNRS)에서 직원 과학자입니다.

1 일 중간 엽 줄기 세포의 1 라벨링 (MSC) 미토콘드리아 (선택 사항) <ol><li> 1 일에 문화에 4 × 10 5 엽 줄기 세포를 갖도록 이틀 미토콘드리아 준비하기 전에, 10 ml의 αMEM / FBS 10 %에서 100 밀리미터 배양 접시에서 인간 중간 엽 줄기 세포를 시드. </li><li> PBS (4 ml)로 중간 엽 줄기 세포를 씻어 4 ml의 αMEM / FBS 1 %를 추가 (37 ° C로 데워진). </li><li> 37 ° C 배양기에서 30 분 동안 세포를 미토콘드리아 중요한 염료의 필요한 양을 추가하고 품어. </li><li> , 미토콘드리아 염료 용액을 제거 데워진 4 ㎖ (37 ° C) αMEM / FBS 1 %로 두 번 세포를 씻어 내고 다시 4 ml의 αMEM / FBS 10 %를 추가합니다. 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 2 시간 후, 다른 시간 30 분 후 배지 (αMEM 10 ㎖ / FBS 10 %)을 변경하고. </li></ol> 1 일 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC) 2. 라벨 (선택 사항, 토론 섹션 참조) <table border="1" fo:keep-together.within 페이지 = &quot;1&quot;FO : 유지 -에 - next.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td> 세포 배양 배지 </td><td> 구성 </td></tr><tr><td rowspan="5"> GSC 기초 배지 </td><td> DMEM / F-12로 보충 </td></tr><tr><td> 인슐린 20 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> N2 보충 1 배 </td></tr><tr><td> 포도당 3g의 /의 L </td></tr><tr><td> L 글루타민 2 mM의 </td></tr><tr><td rowspan="9"> GSC 증식 매체 </td><td> 기초 매체에 추가 </td></tr><tr><td> B27 보충제의 1 배 </td></tr><tr><td> EGF (10) NG / ㎖ </td></tr><tr><td> bFGF를 10 NG / ㎖ </td></tr><tr><td> Fungine 10 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> Fungizone 0.25 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> 헤파린 2 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> 시프로플록사신 2 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> 겐타 마이신 2 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td rowspan="4"> MSC 증식 매체 </td><td> &amp; #945; MEM은 보충 </td></tr><tr><td> L 글루타민 2 mM의 </td></tr><tr><td> 10 % FBS </td></tr><tr><td> bFGF를 2 NG / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 문화 미디어. <ol><li> 폴리 HEMA 코팅 된 세포 배양 플라스크에 neurosphere를 성장 중 GSC를 (GB4 세포주 (32) (10 × 106 세포) (단계 3.12-3.1 참조) 해리. </li><li> 105 세포로 48- 웰 플레이트에 시드 GSC를 / 웰 GSC 증식 배지 (500 μL)를 (표 1 참조). </li><li> 20 ° C에서 5 분 동안 270 XG에 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 세포 중요한 염료의 필요한 양을 추가하고 37 ° C에서 30 분 동안 품어. </li><li> 48 웰 플레이트의 웰 당 GSC 기초 배지 500 ㎕의 (표 1)를 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 20 ℃에서 270 × g으로 원심 분리 판. 뜨는을 대기음. </li><li> 반복 2.6-2.5 단계를 반복합니다. </li><li> GSC 기초 배지 500 μl를 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 5 분 동안 20 ℃에서 270 × g으로 원심 분리 판. 뜨는을 대기음. </li><li> 48 웰 플레이트의 웰 당 GSC 증식 배지 500 μl를 추가하고 37 ° C 배양기에서 배양한다. 주 : GSC를 금액이 표시 (10 × 106 세포)를 상이한 선량 - 반응 실험 FACS 제어를 수행 할 수 있습니다. 실험 조건은보다 정확하게 정의되면이 금액의 크기가 축소 될 수있다. </li></ol> 2 일 아교 모세포종 줄기 세포의 3 시드 <ol><li> 한 50㎖ 튜브에서 20 ° C에서 5 분, 270 × g으로 원심 분리하여 GSC의 neurosphere를 (10 × 106 세포)를 수집한다. </li><li> 20 ° C에서 5 분 동안 270 XG에서 5 HBSS ml의, 원심 분리로 세포를 씻으십시오. </li><li> 뜨는을 대기음. </li><li> 부드럽게 100 μL 트립신 EDTA (0.25 %) (에서 GSC 펠렛을 재현 탁 10 × 10 당 <s)&gt; 6 셀까지 </li><li> 3 분 37 ° C에서 품어. </li><li> 10 μL 염화칼슘 2 (20 mM)을 2 μL의 DNase I (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 P200 피펫와 피펫 팅 아래 (30-50x)에 의해 neurosphere를을 떼어 놓다. 거품을 피하십시오. 모든 GSC를이 분해되는 현미경으로 확인합니다. </li><li> 10 μL 트립신 억제제 (5 %) 및 10 ml의 HBSS를 추가합니다. </li><li> 20 ° C에서 7 분 270 XG에 원심 분리기 GSC를. </li><li> 뜨는을 취소하고 10 ml의 GSC 기초 배지 (표 1)를 추가합니다. </li><li> 토마스 계산 챔버와 GSC를 계산 한 다음 20 ℃에서 7 분 동안 270 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> GSC를 106 / ㎖의 세포 농도에 도달 GSC 증식 배지 (표 1)의 적절한 부피를 추가한다. </li><li> 시드 105 GSC를 96- 웰 플레이트의 웰 당 (세포 현탁액 100 ㎕). </li><li> 봇에 GSC를 얻을 20 ° C에서 7 분 270 XG에 접시를 원심 분리기우물의 톰. </li><li> 제 5 절까지 37 ° C에서 96 웰 플레이트를 품어. </li></ol> 2 일 4. MSC 미토콘드리아 격리 <ol><li> 4 °의 C에 마이크로 튜브 원심 분리기의 온도를 조정합니다. </li><li> 두 튜브를 1.5 ml의 &quot;A&quot;및 (모두 EDTA 프리 프로테아제 억제제 함유하는 200 ㎕의 반응물 (A)와 400 μL 시약 C) 미토콘드리아 추출 용 시약을 함유하는 &quot;C&quot;를 준비한다. 2 다른 튜브, &quot;MSC&quot;와 &quot;미토&quot;를 표시를 준비합니다. 얼음에있는 모든 튜브를 유지합니다. 또한 미토콘드리아 연속 희석 용 튜브를 준비합니다. </li><li> 데워진 10 ㎖ (37 ° C) PBS로 세척 중간 엽 줄기 세포. </li><li> 2 ml를 10 초 동안 트립신 (없음 EDTA) 1 ㎖의 트립신 (없음 EDTA)를 추가 씻을 중간 엽 줄기 세포. 37 ° C에서 5 ~ 10 분 동안 세포를 품어. </li><li> 10 ㎖ αMEM / FBS 10 %, 50 ㎖의 튜브에 전송을 추가하여 중간 엽 줄기 세포를 복구. </li><li> 20 ° C에서 5 분 270 XG에 원심 분리기 세포. </li><li> 뜨는을 취소하고 추가세포 펠렛을 10 mL의 αMEM / FBS 10 %. </li><li> Malassez 계산 챔버와 중간 엽 줄기 세포를 계산합니다. </li><li> 중간 엽 줄기 세포를 원심 분리기 (4-5 × 105) 20 ° C에서 5 분 동안 270에서 XG. </li><li> , 상층 액을 버리고 세포 펠렛에 1m 얼음처럼 차가운 αMEM / FBS에게 10 %를 추가하고 &quot;MSC&quot;라벨이 지정된 튜브 (단계 4.2에서 준비)에 세포를 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 900 XG에서 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 튜브. </li><li> 튜브의 모든 잔여 매체를 제거합니다. </li><li> 미토콘드리아 절연 시약 A (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이없는 단백질 분해 효소 억제제를 포함)의 200 μl를 추가합니다. 5 초 동안 중간 속도로 소용돌이 정확히 2 분 동안 얼음에 튜브를 둡니다. </li><li> 10 초 동안 최대 속도로 미토콘드리아의 분리 시약 B. 소용돌이의 2.5 μl를 추가 한 다음 얼음에 튜브를 둡니다. 5 분마다 30 초를 반복합니다. </li><li> 미토콘드리아 절연 시약 C합니다 (EDTA없는 단백질 분해 효소 억제제를 포함)의 200 μl를 추가합니다. RO (튜브를 기울 믹스ughly 30 회)하지 소용돌이 않습니다. 4 ℃에서 10 분 동안 700 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 은 &quot;미토&quot;튜브 (단계 4.2에서 준비)에 뜨는합니다 (MSC의 미토콘드리아를 포함)를 전송합니다. </li><li> 3000 XG, 4 ° C에서 15 분, 원심 분리기는 미토콘드리아 펠렛을 얻을 수 있습니다. 상층 액을 버린다. 펠렛은 고립 된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다. </li><li> 미토콘드리아 펠렛을 얻기 위해, 12,000 XG, 4 ° C에서 5 분에서 다음 시약 C. 200 μL, 원심 분리기와 미토콘드리아 펠렛을 씻어. </li></ol> GSC를 격리 된 MSC 미토콘드리아 5. 전송 (MitoCeption) <ol><li> 중간 엽 줄기 세포 (4 × 10 5)에서 분리 된 미토콘드리아 펠릿에 미리 냉각 (0 ° C) GSC 증식 배지 200 μl를 추가합니다. </li><li> 지속적으로 GSC를에 미토콘드리아 현탁액의 20 μl를 추가 (GSC 증식 배지에서) 미토콘드리아 준비를 희석. </li><li> 96-w의 우물에 절연 미토콘드리아의 양을 추가원하는 농도 (0.1-10 μg의)에서 (단계 3.15에서)를 GSC를을 포함 엘 플레이트. 한 번 이상 전체 표면을 덮고, 가까운 우물의 바닥에 천천히 미토콘드리아를 추가합니다. </li><li> MSC 미토콘드리아 중요한 색소의 누출을 제어, GSC 증식 배지 전용 (GSC를)를 (중대한 염료 누출 감지 부 6.2 참조)를 함유하는 96- 웰 플레이트의 웰에 미토콘드리아 제제 (0.1 μg의 10)의 동일한 양을 추가한다. </li><li> 원심 4 ℃에서 15 분 동안 1,500 XG에서 MSC 미토콘드리아 (스텝 5.3)과 상기 제어 플레이트 (스텝 5.4)과 미토콘드리아받는 GSC를 함유 96- 웰 플레이트. </li><li> 즉시 원심 분리 후 37 ℃ 세포 배양기에서 배양 플레이트를 놓습니다. 주 : 미토콘드리아 전송 프로토콜이 SYST에 따라 조정될 수 회 원심 다수의 적절한 원심 력에서 배양 된 세포의 미토콘드리아 현탁액의 원심 분리에 의존미토콘드리아 기증자 /받는 사람 세포의 그들. </li></ol> 3 일 FACS와 공 촛점 이미징에 의해 미토콘드리아 전송 6. 분석 <ol><li> FACS 분석 GSC 샘플의 제조 주 : MSC 미토콘드리아 미리 중요한 색소 (제 1)로 표지 된 경우, 효율은 24 시간 미토콘드리아 전송 후에, FACS로 모니터링 할 수있다. <ol><li> 원심 분리기 20 ° C에서 5 분 270 XG에서 MitoCepted GSC를 가진 96 웰 플레이트. </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 각 웰에 100 ㎕의 트립신 (없음 EDTA)를 추가합니다. 3 분 37 ° C에서 품어. 피펫은 위아래로 24 시간 기간에 형성된 neurosphere를을 해리. </li><li> GSC 기초 배지 100 μl를 추가합니다. </li><li> 20 ° C에서 5 분 동안 270 XG에 접시를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 재현 탁 GSC를 300 ㎕의 GSC에 FACS에 기초 배지 및 전송 튜브를 채택. </li><li> 외과를 수행alysis. </li></ol></li><li> 격리 된 미토콘드리아에서 미토콘드리아 중요한 염료 누출에 대한 제어 (FACS) 주 :이 단계의 목적은 오히려 진정한 MSC 미토콘드리아 전송을 반영하지만 것이다 백그라운드 FACS 신호 MitoCeption (단계 5.3)에 사용되는 표지 된 MSC 미토콘드리아에서 중요한 염료의 단순한 리크를 결정하는 것이다. <ol><li> 3.15에 단계 3.1에 설명 된대로 GSC 세포를 시드. </li><li> 1 시간 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 원심 20 ° C에서 5 분 동안 1,500 XG에 (단계 5.4에서 5.6)만을 미토콘드리아를 함유하는 96- 웰 플레이트. </li><li> GSC 96 웰 플레이트 (단계 6.2.2)에서 문화 매체를 기음과 미토콘드리아 만 (단계 6.2.3에서 상층 액)와 함께 배양 배지로 교체합니다. </li><li> 2 시간 동안 37 ° C에서 GSC를 함유 96- 웰 플레이트를 인큐베이션. </li><li> FACS 분석 6.1.7하기위한 단계 6.1.1에서와 같이 진행합니다. </li></ol></li><li> GSC의 SAMP의 제조공 촛점 이미징을위한 레 주 : GSC를 MSC에 미토콘드리아의 전송 형광 이미징에 의해 분석 할 경우, 중간 엽 줄기 세포와 GSC를 모두 미토콘드리아 (단계 1)과 셀 (단계 2) 중요한 염료 각각 미리 표시하여야 할 필요가있다. <ol><li> 단계 6.1.5에 6.1.1에서와 같이 GSC를 준비. </li><li> 재현 탁 GSC를 35mm 배양 접시 (유리 하단)에서 2 %를 FBS와 씨앗을 포함하는 2 ml의 GSC 증식 매체입니다. </li><li> 24 시간 후 전송 된 형광 MSC의 미토콘드리아와 GSC를에 공 촛점 이미징을 수행합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

INSERM (연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE),있는 CJ와 ML.V. 제휴의 MitoCeption 기술 (EP14306154.7)에 특허 출원을 제기했다.

연구의 증가는 세포가 미토콘드리아를 교환 할 수 있고 이러한 미토콘드리아 표적 세포 대사와 기능에 심각한 영향을 보여준다. 따라서, 양적으로 생물학적 효과의 정확한 연구 있도록이 표적 세포에 공여 세포에서 미토콘드리아를 전송하는 툴을 습득하는 것이 필수적이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 원래 점착성 암 세포주 MDA-MB-231 33 인간 중간 엽 줄기 세포로부터 분리 된 미토콘드리아를 전송할 아웃 처리 하였다. 여기에 도시 된 바와 같이,이 체외 neurosphere를 암으로 성장 줄기 세포에 대해 적응 될 수있다. 미토콘드리아 전송 MSC 미토콘드리아가 GSC의 neurosphere를 첨가 할 때 발생할 수 없지만, 본 프로토콜에 기재된 바와 같이, 그것은, 하나의 셀에 GSC를보다 효율적이었다. 이 프로토콜은 또한, 행의 필요성, T 세포와 같은 다른 비 - 부착 세포에 외삽 될 수있다MitoCeption 단계를...

미토콘드리아는 영양소 흡수뿐만 아니라 에너지 대사 산물 생산의 중심적인 역할을 진핵 세포에서 발견되는 세포 내 소기관이다. 이 세포 소기관은 원형 미토콘드리아 DNA 전자 수송 체인 단지,의 tRNA 및 rRNAs 1의 단백질을 인코딩 16.6 KB 긴 (미토콘드리아 DNA)를 포함합니다. 이러한 소기관의 기능은 세포 항상성 여러 병리는 미토콘드리아 장애 1, 2, 3과 연관되어 매우 중요하다. 미토콘드리아 상태는 예를 들어 치료를 4, 5, 6, 7 전이 저항에 대한 영향이 후자의 경우에, 염증, 감염증, 암에 연결되어있다. 미토콘드리아는의 놀라운 능력을 표시<html> &quot;기증자&quot;과 &quot;대상&quot;세포 사이에 전송하기. 최근에, 15 개의 실험실 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14에 의해 도시 된 바와 같이,이 같은 조직 복구 및 화학 요법 제에 대한 저항성과 같은 다른 기능적인 변형뿐만 아니라 표적 세포의 에너지 대사의 변화를 초래 16. 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)이 세포의 기능적 특성의 변형 선도, 심근 세포, 내피 세포, 폐의 폐포 상피 세포, 신 세뇨관 세포와 암 세포를 포함하여 표적 세포의 매우 다양한 미토콘드리아를 전송하는 이러한 능력을 표시 8,&gt; 9, 10, 12, 17, 18. 미토콘드리아 교환 이제 다른 세포 유형의 수가 서로 통신 및 생물학적 특성을 수정할 수있는 광범위하게 사용되는 메커니즘으로 나타난다. 이 미토콘드리아 교환은 19 복잡한 넥신 43 함유 간극 연접 8 또는 M-초 / TNFaip2 및 exocyst를 포함하는, 터널링 나노 튜브 (TNT) 형성을 통해 발생할 수 있습니다. 대안 적으로, 미토콘드리아 전송은 도메인 함유 단백질 일 매개 마이크로 소포 (ARMMs) 20 아레스에 의해 매개되는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 전송의 효능는 GTPase ρ-1의 발현 속도 MIRO1 21 iPSC- 간의 미토콘드리아 전사 효능의 차이를 설명하기위한 핵심 요소에 링크 된중간 엽 줄기 세포와 성인 BM-중간 엽 줄기 세포 22. 세포 간 미토콘드리아 교환에 관한이 데이터 부에도 불구하고, 상대적으로 적은이 미토콘드리아 전송의 대사 및 생물학적 결과에 대해 공지되어있다. 따라서,이 완전히 충분히 전달의 생물학적 효과를 평가하기위한 적절한 툴을 설정 보증. 수년에 걸쳐, 여러 기술적 접근법 수용체 세포 공여자로부터 미토콘드리아를 전송하는 것이 제안되어있다. 이것은 27 transmitochondrial cybrids (26)를 생성하는 난자 23, 24, 25, 세포 융합으로 미토콘드리아의 직접 분사를 포함 그리고, 최근, 광열를 사용하여 격리 된 미토콘드리아의 전송은 28 nanoblades. 우리는 이전과 다른 절연 mitochond의 능력을 입증시험 관내 및 생체 내 모두에서 관찰 RIA는 살아있는 세포에 의해 내부화 될 메커니즘을 통해 29, 30, 31, macropinocytosis (32)을 포함 할 것을 제안. 우리는 더 정량적 (점착성)로 예시 된 바와 같이, 표적 세포 MDA-MB-231 유방암 세포주 (31) (MSC들)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 MitoCeption라는 방법을 개발 하였다. 이 프로토콜은 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아의 전송 (GSC를) 여기 적응했다. 교 모세포종은 빠르게 주로 종양 (33) 내에 존재하는 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 치료에 내성 뇌의 적극적인 악성 종양이다. 이 GSC를 시험관에서 neurosphere를로 성장하고 이종 이식 모델에서 종양을 생성합니다. 아교 모세포종 내 암 세포를방사선 내성 성상 네트워크 (34)에 생성 된 확장 된 모세관을 통해 상호 연결되는 미토콘드리아 (또한 칼슘 세포 핵)을 통해 이전 할 수 성상 뇌종양 세포에 대해 최근에 도시 된 바와 같이, 용량은 세포 간 연결을한다. 아교 모세포종은 MSC들 (35), (36)를 포함하여 종양 미세 환경 내에서 여러 셀을 채용 할 수있다. 우리는 중간 엽 줄기 세포를 공 배양에 GSC를 가진 세포 - 세포 연결을하고 GSC 기능적 특성을 수정할 것으로 예상된다 그들의 미토콘드리아 (도시되지 않은 데이터)를 전송할 수 있음을 보여 주었다. 본 프로토콜은 MitoCeption 기법 기능적 생물학적 결과를 결정하기위한 목적으로 인간에게 GSC를 인간 중간 엽 줄기 세포에서 미토콘드리아 절연 미리 전송하는 방법을 설명한다. 능성 높은 종양 GB4 GSC 라인 37는이 연구에 사용 하였다.

<table><tbody><tr><td>조직용 미토콘드리아 분리 키트&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>10579663</tr><tr><td>N-2 보충제 (100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제 W/O VIT A (50x)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11500446</tr><tr><td>HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+</td><td>&nbsp; 시그마</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>폴리 헴&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>aMEM w/o 글루타민</td><td>Ozyme</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 글루타민 없음</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11540566</tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>25030-024&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>포도당&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>인슐린&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>나는 1882년&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인간&nbsp; bFGF&nbsp;</td><td>R& D 시스템</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>인간 EGF&nbsp;</td><td>페프로텍&nbsp;</td><td>AF-100-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERCK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제</td><td>시그마&nbsp;</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>10104159001</tr><tr><td>트립신 0.25% / EDTA 1&nbsp; mM</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>트립신</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 EDTA 프리</td><td>시그마</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>시프로플록사신&nbsp;</td><td>시그마</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>펑진&nbsp;</td><td>인비보젠</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Euromedex</td><td>EU0410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Green FM</td><td>분자 프로브</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>분자 프로브</td><td>&nbsp; M7512</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker 딥 레드 FM</td><td>분자 프로브</td><td>&nbsp; M22426&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>분자 프로브</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Blue CMF2HC</td><td>분자 프로브</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish 멸균 배양 접시</td><td>세계 정밀 기기</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>2,523,749</td><td></td></tr><tr><td>FACS 장치</td><td>Gallios&nbsp;</td><td>&nbsp; 3L 10C</td><td></td></tr><tr><td>LC 패스트 스타트 DNA 마스터 플러스&nbsp;</td><td>로슈</td><td>3515885001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitoception는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 msc 미토콘드리아 전송

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

미토콘드리아는 세포 대사, 에너지 생산 및 세포 사멸의 제어를위한 중심적인 역할을한다. 부적절한 미토콘드리아 기능은 신경 학적 병변에서 암에 이르기까지 매우 다양한 질병에 대한 책임이 발견되었다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 최근 용량을 표시하도록 도시 된 상기 현재 관심을 향상 미토콘드리아받는 세포 대사 및 기능적 결과와 공 배양 조건에서 암 세포에 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 특히 세포 유형 사이에서 전송 될 이러한 세포 소기관의 생물학적 특성에 대한. 표적 세포에서 전사 MSC 미토콘드리아의 효과를 평가하는 것은 예컨대 세포 - 세포 상호 작용의 생물학적 결과를 이해하기 위해 가장 중요하다. 여기에 설명 MitoCeption 프로토콜 MSC 미토콘드리아를 이용하여 표적 세포를 도너 세포로부터 미리 격리 미토콘드리아의 전송을 허용모델 시스템으로서 교 모세포종 및 줄기 세포 (GSC). 이 프로토콜은 이전에 MDA-MB-231 유방암 세포를 접착하는 중간 엽 줄기 세포에서 미토콘드리아 격리를 전송하는 데 사용되었다. 이것은 미토콘드리아 전송 프로토콜은 체외로 neurosphere를 성장시키는 특정 특이성을 제시 GSC를 여기하도록 구성된다. 격리 된 미토콘드리아의 전달은 미토콘드리아에게 중요한 염료를 사용하여 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 공 초점 이미징 다음에 할 수 있습니다. 별개의 일배 체형 (SNP가)와 미토콘드리아 공여체 및 목표 세포의 사용은 또한 표적 세포에서의 원형 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아)의 농도에 기초하여 상기 전송 된 미토콘드리아의 검출을 허용한다. 프로토콜이 이러한 기준을 검증 한 후에, 전사 된 미토콘드리아 형질 세포를 상기와 같은 세포 대사, 소성, 증식 및 치료에 대한 응답으로서 생물학적 특성에 외인성 미토콘드리아의 효과를 결정하기 위해 분석 될 수있다.

간엽 줄기 세포 (MSC) 및 MitoCeption하여 타겟 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC) 그들의 전송에서 미토콘드리아의 분리를 개설 절차의 단계는도 1에 도시된다. GSC를 자신의 줄기 세포 특성을 유지하기 neurosphere를로 성장 암 줄기 세포이다. 이 프로토콜의 경우, GSC를 미토콘드리아가 높은 전송 효율을 허용 미토콘드리아 (단계 3)의 전송 전에 단일 세포로 두 시간을 시딩 (FACS 데이터도 3b 참조). 제 5 조 (3 일) 후,이 세포를 neurosphere를을 (그림 1) 형성으로 다시 관찰된다. GB4 GSC를의 이미징, 형광 표지 된 MSC의 미토콘드리아와 MitoCeption 후 72 시간은, 공 초점 이미지에서 얻은 직교 뷰에 의해 입...

여기에, 프로토콜 (MitoCeption)는 GSC 대사와 기능에 대한 생물학적 효과를 연구 목적으로, 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 위해 제공됩니다. 유사한 프로토콜이 다른 세포 유형 간 미토콘드리아를 전송하도록 구성 될 수있다.

MitoCeption는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아 전송

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

이 절차의 전반적인 목표는 중간엽 줄기세포와 같은 공여 세포에서 이전에 분리된 미토콘드리아를 교모세포종 줄기세포와 같은 표적 세포로 전달하는 것입니다. 이 절차는 터널링 나노튜브나 미세 소낭과 같은 과정을 통해 세포 간에 자발적으로 전달되는 미토콘드리아의 대사 및 생물학적 영향과 같이 대사 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사이토카인이나 대사산물과 같이 미세 환경에 존재하는 다른 요인뿐만 아니라 터널링 나노튜브를 통해 이동할 수 있는 다른 화합물들과 독립적으로 미토콘드리아의 효과를 평가할 수 있다는 점입니다.이미징 목적으로, MitoCeption을 통한 미토콘드리아 전이 전에 MSC 미토콘드리아와 GSC를 생체 염색약으로 표지할 수 있습니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 따라 GSC를 생체 염색약으로 사전 표지한 후, 20 °C에서 270 ×g로 5분간 원심분리하여 GSC 뉴로스피어를 50 mL 튜브에 수집합니다. 5 mL의 HBSS를 사용하여 세포를 세척하고 튜브를 다시 원심분리합니다.상층액을 흡입 제거하고 100 µL의 0.25% Trypsin-EDTA를 사용하여 GSC 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 다음으로, 20 mM 염화칼슘 10 µL와 10 mg/mL DNase I 2 µL를 튜브에 첨가합니다.P200 피펫을 사용하여 기포가 생기지 않도록 주의하며 30~50회 부드럽게 파이펫팅하여 뉴로스피어를 분리합니다. 10 mL의 HBSS에 희석된 5% Trypsin inhibitor 10 µL를 세포에 첨가하고 GSC를 7분 동안 원심분리합니다. 그 후 상층액을 제거하고 샘플에 GSC Basal Medium 10 mL를 첨가합니다.이제 Thoma counting chamber를 사용하여 다시 원심 분리하기 전에 세포 수를 측정합니다. 밀리리터당 10⁶개의 GSC 농도가 되도록 적절한 부피의 GSC 증식 배지를 추가합니다. 그런 다음 96 well plate의 well당 10⁵개의 GSC를 분주합니다.GSC가 웰 바닥에 가라앉도록 플레이트를 원심분리합니다. 현미경으로 세포를 확인합니다. 그 후 플레이트를 37 °C에서 배양합니다.MSC 미토콘드리아 분리를 수행하려면, 먼저 마이크로원심분리기의 온도를 4 °C로 설정하십시오. 미토콘드리아 추출용 시약이 들어 있는 A와 C로 표시된 1.5 mL 튜브 두 개를 준비합니다. 추가로 MSC와 MiTo로 표시된 튜브 두 개를 더 준비하십시오.튜브를 얼음에 보관하십시오. 또한 미토콘드리아 조제물과 함께 준비할 미토콘드리아 단계별 희석용 튜브를 준비하십시오. 37°C로 예열한 10 milliliters의 PBS를 사용하여 MSC를 세척하십시오.그 다음 EDTA-free Trypsin 2 mL로 세포를 10초 동안 세척하고, Trypsin 1 mL를 추가로 넣은 후 37 °C에서 5~10분 동안 세포를 배양합니다. 프로토콜에 따라 EDTA의 사용은 피해야 하며, 특히 MSC Trypsinization과 미토콘드리아 조제에 사용되는 프로테아제 억제제 사용 시 주의해야 합니다. Alpha MEM 10% FBS 10 mL를 첨가하여 MSC를 회수하고, 해당 현탁액을 50 mL 튜브로 옮깁니다.그 다음 세포를 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛에 10 milliliters의 Alpha MEM 10%FBS를 첨가합니다. 그런 다음 Malassez 카운팅 챔버를 사용하여 MSCs의 수를 측정하고, 4~5 × 10⁵개의 세포를 원심 분리하여 모읍니다.상층액을 버리고, 세포 펠릿에 얼음처럼 차가운 Alpha MEM 10%FBS 1mL를 첨가한 후, 계속 얼음에 보관하며 미리 준비된 MSC 표시 튜브로 세포를 옮깁니다. 그런 다음 MSC 튜브를 4°C에서 900×g로 5분 동안 원심 분리하고 튜브에서 모든 잔류 배지를 제거합니다. 다음으로, EDTA-free protease inhibitors가 포함된 미토콘드리아 분리 시약 A 200µL를 MSC에 첨가하고 중간 속도로 5초 동안 볼텍싱합니다.그런 다음 튜브를 얼음 위에 정확히 2분 동안 둡니다. mitochondria isolation reagent B 2.5 µL를 첨가하고, 튜브를 다시 얼음 위에 놓기 전에 최대 속도로 10초 동안 세포를 볼텍싱합니다. 5분 동안 30초마다 볼텍싱을 반복합니다.이제 EDTA-free protease inhibitors가 포함된 미토콘드리아 분리 시약 C 200 µL를 튜브에 넣고, 튜브를 약 30회 기울여 내용물을 섞어줍니다. 4 °C에서 700 ×g로 10분 동안 튜브를 원심분리합니다. MSC 미토콘드리아가 포함된 상층액을 미리 준비한 MiTo 튜브로 옮깁니다.시료를 4°C에서 3,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 200 µL의 시약 C를 사용하여 미토콘드리아 펠렛을 세척합니다. 그런 다음 현탁액을 4°C에서 12,000 ×g로 5분 동안 원심분리하여 소기관을 펠렛화합니다.분리된 MSC 미토콘드리아를 GSC로 전이시키기 위해, 미리 냉각시킨 GSC 증식 배지 200 µL를 미토콘드리아 펠렛에 추가합니다. 미토콘드리아 현탁액 20 µL를 GSC에 일정하게 추가할 수 있도록 GSC 증식 배지로 미토콘드리아 조제물을 희석합니다. 그다음, 미토콘드리아를 웰 바닥 근처에 천천히 추가합니다.MSC 미토콘드리아 활성 염료 누출을 제어하기 위해, GSC 증식 배지만이 포함된 96 웰 플레이트의 웰에 동일한 양의 미토콘드리아 준비물을 첨가합니다. 플레이트를 4°C에서 1,500 ×g로 15분 동안 원심 분리합니다. 그 후 즉시 배양물을 37°C에 둡니다.다음 날, 대조군 웰의 생존 염료 누출을 분석하기 위해 앞서 설명한 대로 GSC 세포를 파종하고, 플레이트를 원심 분리한 후 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 미토콘드리아만 포함된 96-웰 플레이트를 원심 분리합니다. 그런 다음 GSC 96-웰 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거하고 미토콘드리아 상층액으로 교체합니다.GSC를 미토콘드리아 상층액과 함께 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 미토콘드리아 전이 분석, FACS 분석 및 공초점 이미징을 수행합니다. GSC는 줄기세포 특성을 유지하기 위해 뉴로스피어 형태로 배양된 암줄기세포입니다.미토콘드리아 전이 직전에, 높은 미토콘드리아 전이 효율을 위해 세포를 단일 세포로 분주하며, 다음 날 여기에서 보는 바와 같이 세포들이 다시 뉴로스피어(neurospheres)를 형성하는 것이 관찰됩니다. 이 그림에서 형광 표지된 MSC 미토콘드리아가 Gb4 GSCs 내부에 국소화되어 있는 것을 볼 수 있습니다. MSC 미토콘드리아는 GSC 미토콘드리아와 유사하게 GSCs 전반에 걸쳐 나타납니다.GSC 공초점 이미지의 3D 재구성을 통해 대부분의 GSC에서 MSC 미토콘드리아의 전이가 관찰되었으며, 이는 전이된 MSC 미토콘드리아의 세포 간 국소화를 확인시켜 줍니다. GSC를 청색 세포 생존 염색약과 적색 미토콘드리아 생존 염색약으로 사전 염색함으로써, 내인성 GSC 미토콘드리아에 대비하여 녹색으로 나타나는 전이된 MSC 미토콘드리아의 국소화를 시각화할 수 있었습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 형광 MSC 미토콘드리아의 양을 늘려 MitoCeption을 수행한 결과 FACS 신호가 증가했으며, 이는 대조군 신호보다 수 차례의 자릿수(orders of magnitude)가 더 높게 나타났습니다.단일 세포 GSC에서 수행된 본 미토콘드리아 전송 프로토콜은 용량 의존적 반응과 상대적 평균 형광 강도를 나타냈습니다. 마지막으로, MSC 미토콘드리아 전송이 GSC 뉴로스피어에서도 달성되었으나, 이러한 조건에서 GSC로의 전송 효율은 단일 세포로 먼저 파종된 GSC로의 미토콘드리아 전송에 비해 낮았습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안, 미토콘드리아 제제물을 항상 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 절차 이후, FACS, 공초점 현미경 관찰, 미토콘드리아 DNA의 QPCR과 같은 다른 방법들을 통해 표적 세포로의 MSC 미토콘드리아 전이를 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 또한 전이된 미토콘드리아의 생물학적 효과를 결정하기 위해 기능 연구를 수행할 수도 있습니다.이러한 연구들은 일반적으로 미토콘드리아 전이를 시각화하는 데 사용된 양보다 적은 양의 미토콘드리아로 수행된다는 점에 유의하십시오. 이 기술을 통해 정상적인 생리적 조건 또는 병리적 조건에서 세포 간에 자발적으로 전이되는 미토콘드리아의 결과와 생물학적 영향을 탐구할 수 있으며, 결과적으로 새로운 치료법 개발에 기여할 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 절연, 강화하고, 이소성 소닉 헤지 호그 경로 활동과 돌연변이 생쥐에서 파생된 medulloblastoma 종양의 줄기 세포의 유지 보수를 설명합니다.

절연, 강화하고, Medulloblastoma의 줄기 세포의 유지 보수

이 비디오에서는 원심분리를 통해 형광 표지된 미토콘드리아를 교모세포종 줄기세포(GSC)로 전달할 수 있는 방법을 보여줍니다. 공여자 미토콘드리아의 성공적인 흡수 및 기능적 통합은 컨포칼 현미경을 사용하여 형광을 검출함으로써 확인됩니다.

원심분리 보조 미토콘드리아 교모세포종 줄기세포로의 이식

종양을 추구 치료 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 침략 세포종에 대 한 치료로 서 약속을 보여줍니다. 최적의 이식 건설 기계에 종양 절제술 구멍으로 MSCs의 납품을 포함 한다. 여기, MSC 세포종의 치료를 공부 하기 전 임상 기술을 포함 하 여 제공 됩니다: 이미지 기반 종양 절제술; 주입 장비의 MSC 시드; 그리고 수술 후 치료 추적입니다.

세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

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인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

이 프로토콜은 종양 형성 과정에서 미토콘드리아의 역할을 연구하기 위한 도구로서 현탁액 성장 암세포에서 사이브리드를 생성하는 기술을 설명합니다.

암 세포주를 이용한 트랜스미토콘드리아 Cybrid 생성

여기에서는 미토콘드리아 추적, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 망막 색소 상피 세포(ARPE19)의 직접 공동 배양 절차, MSC와 ARPE19 세포 간의 TNT를 통한 미토콘드리아 교환을 특성화하기 위해 터널링 나노튜브(TNT) 형성 및 미토콘드리아 전달을 관찰하고 통계적으로 분석하는 방법을 포함한 프로토콜을 제시합니다.

중간엽 줄기 세포와 망막 색소 상피 사이의 터널링 나노튜브를 통한 미토콘드리아 전달 in vitro

뇌 오가노이드는 미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드(MELAS) 연구를 위한 귀중한 모델 역할을 하며 근본적인 병태생리학에 대한 통찰력을 제공하고 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공합니다. 질병 유발 유전자의 다양한 수준의 이형질을 가진 세포주에서 유래한 오가노이드는 상당한 표현형 차이를 나타냅니다.

뇌 오가노이드를 사용한 미토콘드리아 질환 모델링: 미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드에 초점

인간의 배아 줄기 (ES) 세포의 전파

가능한 세포의 정확한 수를 지식은 많은 조직 문화 조작이 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 hemacytometer를 사용하여 세포를 계량하는 방법에 대해 설명합니다. 그것이 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명하지만, 그것은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.

인간 신경 줄기 세포를 계산

배우세요 MitoCeption 프로토콜을 사용하여 인간 중간엽 줄기세포에서 아교모세포종 줄기세포로 미토콘드리아를 전달하는 방법을. 이 기술은 암 대사 연구에서 미토콘드리아 기능을 독립적으로 평가하는 데 활용됩니다.

MitoCeption는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아 전송

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