고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

본 절차의 전반적인 목표는 차등 원심분리를 통해 골격근 미토콘드리아를 분리하고, 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I, II 및 IV의 호흡률을 측정하는 것입니다. 이 방법은 다양한 신경계 질환, 패혈증 및 연령 관련 질환과 같이 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 질병 및 증후군 등 미토콘드리아 생체 에너지학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분리된 미토콘드리아 표본에 미토콘드리아 기능 분석을 방해할 수 있는 대부분의 세포학적 요인이 포함되어 있지 않다는 점입니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Sandra Nansoz가 진행하겠습니다.

이 절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 골격근 샘플이 담긴 비커를 준비하십시오. 비커를 아이스 버킷 위에 놓습니다. 정밀 가위를 사용하여 근육을 1~2mm 크기로 잘게 다집니다.

다음으로, 잘게 다진 조직을 20 mL의 차가운 분리 완충액으로 2회 헹굽니다. 세척된 조직을 조직 1g당 10 mL의 분리 완충액에 현탁시킨 후, 5 mg의 protease-G를 첨가합니다. 그런 다음 비커를 마그네틱 교반기가 있는 얼음 수조에 넣고 10분 동안 교반합니다.

그 후, 조직 1g당 0.2% 탈지 BSA가 첨가된 분리 버퍼 10mL를 추가하여 현탁액을 희석합니다. 다음으로, 비커에서 분리 버퍼를 모두 따라냅니다. 0.2% BSA가 첨가된 얼음처럼 차가운 분리 버퍼 20mL를 사용하여 조직을 두 번 세척합니다.

그 다음, 조직 1g당 10밀리리터의 BSA가 첨가된 분리 완충액에 조직을 재현탁합니다. 헐겁게 장착된 페스틀이 있는 반자동 유리 균질기를 사용하여 조직을 균질화합니다. 이어서, 균질물을 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.

세롤로지컬 피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다. 조직 1g당 10mL의 얼음처럼 차가운 BSA 보충 분리 배지를 넣어 펠렛을 재현탁합니다. 현탁액을 4°C에서 350 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.

그 후, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 상층액을 따로 보관하고 펠렛은 폐기합니다. 거즈 두 겹을 통해 상층액을 얼음 위에 둔 비커에 여과합니다. 여과된 현탁액을 원심분리관으로 옮기고 4°C에서 10분 동안 7,000 ×g로 원심분리합니다.

그 다음 상층액을 버립니다. 조직 1g당 5mL의 BSA가 첨가된 분리 완충액으로 조미토콘드리아 펠렛을 재현탁합니다. 이 현탁액을 4°C에서 7,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 상층액을 버리고 펠렛을 20 milliliters의 세척 완충액에 재현탁합니다. 4 °C에서 7,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 이 재현탁 및 원심분리 과정을 한 번 더 반복합니다.

그 후, 상층액을 버리고 펠렛을 1 mL의 세척 완충액에 다시 현탁합니다. 표준 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음, 호흡 측정 분석을 수행할 준비가 될 때까지 농축된 미토콘드리아 현탁액을 얼음 위에 보관합니다.

먼저, 미토콘드리아 농축액을 호흡 완충액(respiration buffer)에 재현탁하여 미토콘드리아 단백질의 최종 농도가 0.4 mg/mL가 되도록 합니다. 다음으로, 공기 보정된 옥시그래프 챔버(oxygraph chamber)에서 호흡 배지를 흡입하여 제거합니다. 분리된 미토콘드리아 현탁액 2.1 mL를 첨가합니다.

마개로 옥시그래프 챔버를 밀폐합니다. 그런 다음, 37 °C에서 미토콘드리아 현탁액을 700 RPM으로 지속적으로 교반합니다. 안정적인 산소 유속 신호가 얻어질 때까지 3~5분 동안 기저 상태의 세포 호흡을 기록합니다.

복합체 I 의존적 호흡을 시작하려면, 분리된 미토콘드리아 현탁액으로 준비된 옥시그래프 챔버의 스토퍼 티타늄 주입구를 통해 0.8 molar malate 12.5 microliters를 주입하십시오. 그런 다음, 2 molar glutamate 10 microliters를 주입하십시오. 안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 3분에서 5분 동안 세포 호흡을 기록하십시오.

그 다음, 주입구를 통해 10 µL의 0.05 M ADP를 챔버에 주입합니다. 산소 플럭스 신호가 증가했다가 감소하여 안정될 때까지 세포 호흡을 기록합니다. 복합체 II 의존적 호흡을 위해서는, 분리된 미토콘드리아 현탁액으로 준비된 oxygraph 챔버에 2 µL의 0.2 mM rotenone을 주입합니다.

안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 세포 호흡을 기록합니다. 그 다음, 1 M succinate 20 µL를 주입합니다. 안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 세포 호흡을 기록합니다.

그 후, 주입구를 통해 0.05 M ADP 10 µL를 챔버에 주입합니다. 산소 플럭스 신호가 증가했다가 감소하여 안정될 때까지 세포 호흡을 기록합니다. complex IV 의존적 호흡을 위해서는, 분리된 미토콘드리아 현탁액으로 준비된 oxygraph 챔버에 0.8 mM ascorbate 2.5 µL를 주입합니다.

다음으로, 즉시 2.5 µL의 0.2 M TMPD와 10 µL의 0.05 M ADP를 주입합니다. 안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 세포 호흡을 기록합니다. 그런 다음, 10 µL의 1 M sodium azide를 주입합니다.

산소 플럭스 신호가 감소하다가 안정될 때까지 세포 호흡을 기록합니다. 본 연구에서는 골격근으로부터 온전한 미토콘드리아를 분리합니다. 이후 고해상도 호흡측정법을 통해 Complex I 의존적 호흡률을 측정합니다.

보시는 바와 같이, ADP를 첨가하자마자 미토콘드리아 호흡률이 즉각적으로 증가합니다. ADP가 고갈된 후 호흡률은 ADP 첨가 전과 유사한 수준으로 감소합니다. 이는 호흡 조절 지수(respiratory control ratio, RCR)로 알려진 상태 3과 상태 4의 비율이 높으며, 분리 과정 동안 미토콘드리아의 무결성이 잘 유지되었음을 나타냅니다.

그 다음, rotenone으로 complex I 호흡을 억제하고 complex II 기질인 succinate를 주입하여 complex II 의존적 호흡률을 관찰합니다. 이어서 ADP를 첨가하면 호흡률이 즉각적으로 증가합니다. ADP가 고갈되면 호흡률이 ADP 첨가 전과 유사한 수준으로 감소하는데, 이는 RCR이 높음을 나타내며, 결과적으로 분리 과정 동안 미토콘드리아의 무결성이 잘 유지되었음을 의미합니다.

ascorbate, TMPD 및 ADP를 첨가하여 복합체 IV 의존적 호흡률을 관찰합니다. 그 후 소듐 아자이드를 첨가하여 복합체 IV를 억제합니다. 소듐 아자이드 첨가 전후의 산소 소비량 차이를 실제 복합체 IV 호흡으로 해석합니다. 상태 3에서 관찰되는 높은 복합체 IV 의존적 호흡률은 분리 과정 동안 미토콘드리아의 무결성이 잘 유지되었음을 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 1시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 균질화 전에 미리 산소 센서의 보정을 수행하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 세포 내 ADP 함량, 미토콘드리아 막 전위, ATP 합성효소 효소 활성 및 기질 수준 측정과 같은 다른 방법들을 수행하여, 호흡률의 변화가 미토콘드리아 기질의 부족, 막 전위 또는 ATP 합성효소 효소 활성의 감소로 인한 것인지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 차등 원심 분리를 통해 골격근에서 미토콘드리아를 분리하는 방법과 고해상도 호흡 측정법을 사용하여 미토콘드리아 복합체 I, II 및 IV의 호흡률을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 개발 이후 미토콘드리아 에너지 대사 분야의 연구자들이 유전성 미토콘드리아 질환, 근육병증, 분리된 미토콘드리아의 허혈-재관류 손상과 같은 분야에서 미토콘드리아 에너지 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. Antimycin A, Rotenone, Sodium azide 및 FCCP를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

또한, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑과 실험복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.