Name: 고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 배우세요 차동 원심 분리를 이용한 골격근 미토콘드리아 분리 및 고해상도 호흡 측정법입니다. 이 방법은 미토콘드리아 기능 장애 관련 신경계 질환과 노화 관련 질환 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation, Grant 32003B_127619)의 지원을 받았습니다.

사두근 근육 조직 검사는 미토콘드리아가 차등 원심 분리에 의해 분리되는에서 마취 돼지에서 가져온 것입니다. 돼지는 또 다른 실험 이후에 사용됩니다. 이 연구는 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소에 따라와 광저우 베른, 스위스의 동물 관리위원회의 승인을 수행한다. 1. 골격근의 균질화와 미토콘드리아 격리 <ol><li> 소비세 마취 돼지 5-10g의 대퇴사 두근 근육 표본. 본 분석에서는 돼지의 골격 근육을 사용합니다. 이 프로토콜은 다른 종으로부터 미토콘드리아 분리하는데 사용될 수있다 (예를 들면, 래트, 마우스, 사람 등.). 참고 :이 단계는 수술에 대한 전문 지식과 의료 전문가에 의해 수행된다. <ol><li> 근육 내 케타민 (20 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (2 밀리그램 / kg)으로 진정 돼지 마취 인트라로 유도되기 이전정맥 미다 졸람 (0.5 ㎎ / ㎏, 플러스 아트로핀 0.02 ㎎ / ㎏). 수술 중 연속 정맥 주사 프로포폴의 주입 (시간 당 4 ~ 8 ㎎ / ㎏)과 펜타닐 (시간 당 30 μg의 / kg)으로 마취를 유지한다. </li></ol></li><li> 즉시 빙냉 미토콘드리아 분리 완충액 20 ㎖ (표 1)을 함유하는 비이커에 조직 샘플을 담가. 참고 : 버퍼가 균질화 동안 사용 및 회 원심은 차가운 얼음하고 세포질과 호환 이온과 삼투 강도 생리 관련 pH가 있어야합니다. </li><li> 분석 칭량 균형 비이커에서 조직 샘플을 단다. 차단 완충액 20 ㎖를 함유하는 비이커 균형 용기. </li><li> 얼음 양동이에 비커를 놓습니다. 참고 : 얼음 양동이 온도에서 균질화 과정의 다음 단계를 모두 수행하고 얼음 양동이에있는 모든 버퍼를 유지합니다. </li><li> 비커에서 골격 근육을 말하다 미세 sciss를 사용하여 3-4 분 동안 1-2mm 작은 조각으로 (얼음 계속)ORS. </li><li> 얼음 차가운 분리 버퍼 (20 ㎖ 각 세척 단계)로 두 번 비커에 다진 조직을 씻어. </li><li> 5 mg의 프로테아제 / g 조직을 포함하는 조직 무게 (g) 당 분리 버퍼 볼륨 (10)의 조직을 중단. </li><li> 자석 교반기 빙욕에서 비커를 놓고 10 분 동안 교반한다. </li><li> 0.2 % (중량 / 부피) 탈지 된 소 혈청 알부민 (BSA)이 보충 된 조직 무게 (g) 당 분리 버퍼 볼륨으로 추가 10 비커 현탁액을 희석. </li><li> 0.2 % BSA로 보충 된 분리 버퍼의 모든 경사 분리하고 0.2 % BSA (20 ㎖ 각각 세정 공정)으로 보충 된 차가운 얼음 분리 완충액으로 두번 비커 조직을 헹군다. </li><li> 탈지 BSA와 0.2 %로 보충 조직 무게 (g) 당 분리 버퍼 10 부피에 재현 탁 조직. </li><li> 느슨한 - 피팅 유봉 (10 획)와 (얼음에 보관) 반자동 유리 균질와 조직을 균질화. 참고 : Homogeniz동일한 방식으로 항상 조직 (스트로크의 동일한 횟수, 예를 들면, 10 스트로크) 전자. 스트로크의 높은 숫자는 손상 미토콘드리아를 풀다 수 있습니다. 바람직하게는, 자동화 된 균질기를 이용하여 조직을 균질화. 수동으로 (그리고 주관적으로) 유리 균질의 균질 조직 샘플은 고립 된 미토콘드리아의 서로 다른 특성을 생성 할 수있다. </li><li> 원심 분리기 10,000 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 균질 조직. 주 : 모든 원심 분리 단계는 고정 된 각도 로터와 원심 분리기에서 수행된다. </li><li> 혈청 학적 피펫을 사용하여 상청액을 폐기하고 BSA-보충 빙냉 분리 매질 펠릿 (10 ㎖ / g 조직)에 재현 탁. </li><li> 원심 분리기 350 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 정지. </li><li> 혈청 학적 피펫을 이용하여 상층 액을 예약 및 펠릿 (세포 파편)을 폐기합니다. </li><li> (17 스레드 / cm 2) 세포 debr을 제거하는 거즈 두 레이어를 통해 (얼음에 보관) 비커에 뜨는 필터이다. </li><li> 원심 분리기 7,000 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 필터링 된 서스펜션. </li><li> 뜨는을 취소하고 7,000 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 0.2 % (중량 / 부피) BSA와 원심 분리기 정지 보충 분리 버퍼 (5 ㎖ / g 조직)의 원유 미토콘드리아 펠렛을 재현 탁. </li><li> 뜨는을 취소하고 세척 버퍼 (표 1)에서 원유 미토콘드리아 펠렛을 재현 탁. 원심 분리기 7,000 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 다시 정지. </li><li> g 뜨는을 취소하고 세척 버퍼의 원유 미토콘드리아 펠렛을 재현 탁하고 X 7,000에서 10 분 동안 4 ° C에서 다시 정지를 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 세척 완충액 1.0 mL에 조 미토콘드리아 펠렛을 재현 탁. </li><li> 미토콘드리아 현탁액의 단백질 농도를 결정하고 얼음에 집중 미토콘드리아 현탁액을 유지합니다. 주 : 단백질 농도는 표준 방법을 사용하여 측정 할 수있다. </li><li> 직전분석을 위해 호흡율, 0.4 ㎎ / ㎖ 미토콘드리아 단백질의 최종 농도 호흡 버퍼 내의 미토콘드리아 현탁액을 재현 탁. </li></ol> 2. 고해상도 호흡율 <ol><li> 고해상도 oxygraph 챔버로 호흡 완충액 (표 1) (16)의 피펫 2.1 mL의 연속 안정된 산소 플럭스 신호까지 1 시간 동안 37 ° C에서 챔버 (700 RPM)에 존재하는 자기 교반 막대를 사용하여 상기 버퍼 교반 폴라로 그래프 산소 센서를 얻을 수있다. 주 : 각 oxygraph 챔버 내의 폴라로그래피 산소 전극, 산소 농도를 측정하고, 각 챔버 내에 산소 소비량 (유량)을 구한다. 산소 농도 및 산소 소모 속도 (광속)은 데이터 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터에 온라인으로 실시간으로 표시된다. 또, 정확하고 신뢰할 수있는 결과를 보장하기 위해서, 쓸모 산소 배경 보정되어야제조업체의 지시에 따라 수행 하였다. 주 : 호흡 버퍼 정확히 2.1 ㎖를 마개를 닫은 후 2.0 ㎖의 최종 챔버 체적 교정 용 챔버로 추가된다. </li><li> 제조자의 프로토콜에 따라 17 폴라 산소 센서의 공기 보정을 수행한다. 주 : 공기 교정 중에, 기체 상으로 존재하는, 미디어 산소 농도가 15 ~ 20 분 정도의 평형 것이다. 온도, 기압, 미디어와 산소 농도에 따라 용해도 것이 계산 될 수있다. </li><li> 공기 교정 후, oxygraph 실에서 호흡 매체를 기음과 oxygraph의 챔버에 단계 1.24에서 고립 된 미토콘드리아 현탁액 (0.4 ㎎ / ㎖ 미토콘드리아 단백질)의 2.1 mL를 넣어. 참고 : 호흡 버퍼의 볼륨이 설정 악기와 제조 업체에 따라 달라집니다. 고해상도 호흡율 들어 호흡 BU의 2.1 mL의ffer은 스토퍼를 닫은 후 2.0 ㎖의 최종 챔버 체적 교정 용 챔버로 추가된다. </li><li> 스토퍼를 삽입하여 oxygraph 실을 닫습니다. </li><li> 안정적인 산소 유량 신호가 도달 할 때까지 지속적으로 3 ~ 5 분 동안베이스 라인에서 37 ° C에서 챔버 (700 RPM)에 존재하는 자기 교반 막대 및 기록 세포 호흡을 사용하여 미토콘드리아 정지를 저어. 주 : 산소 농도 및 산소 플럭스 신호는 데이터 수집 및 분석 용 소프트웨어 (17)를 사용하는 컴퓨터에 온라인으로 실시간으로 표시된다. </li><li> 그 후, 다음과 같은 표준 프로토콜을 사용하여 스토퍼 티탄 주입 포트를 통해 미토콘드리아 호흡 기질 및 억제제를 주입. </li></ol> 3. 복잡한 I-따라 호흡 <ol><li> 단계 2.1-2.5에 기재된 절차에 따라 단리 된 미토콘드리아 현탁액 (0.4 ㎎ / ㎖)을 함유하는 oxygraph 챔버 준비안정된 신호를 기다리십시오. </li><li> (0.4 ㎎ / ㎖) 챔버 스토퍼 티탄 주입구 고립 미토콘드리아 현탁액을 함유 oxygraph 챔버에 0.8 M 말산 12.5 μL (5 mM의 최종 농도) 및 2 M 글루타메이트 10 μL (10 mM의 최종 농도)을 주입 안정된 산소 플럭스 신호가 달성 될 때까지 3-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다. 주 : 다음 단계에서의 모든 주사가 ​​주사기를 사용하여 스토퍼 티탄 주입 포트를 통해 수행된다. </li><li> 다음 감소하고 (3-5 분) 안정화 챔버 스토퍼 티탄 주입구를 통해 oxygraph 챔버 내로 0.05 M ADP (0.25 mM)을 10 μL를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 미토콘드리아 호흡을 기록한다. 참고 : ADP의 첨가 후 호흡의 고원 ADP 농도가 높고 포화을 나타냅니다. 호흡 중에 사용 미토콘드리아의 양에 따라 ADP 농도 적정해야안정된 상태 3 산소 소비 (최대 호흡)합니다. 미토콘드리아 현탁액 ADP를 첨가 (주 3 호흡)을 증가 산소 소비량의 증가와 산소 플럭스 신호를 유도 할 것이다. ADP에 소비 된 후, 산소 유량 신호 (상태 4 호흡)을 감소한다. </li></ol> 4. 복합 II 의존 호흡 <ol><li> 단계 2.1-2.5에서 설명하고 안정적인 신호를 기다리 절차에 따라 격리 된 미토콘드리아 현탁액 (0.4 ㎎ / ㎖)가 포함 된 oxygraph 챔버를 준비합니다. </li><li> 주사기를 사용하여 챔버 스토퍼 티탄 주입구를 통해 oxygraph 챔버에 0.2 밀리미터 로테 논 (0.2 μM) &#39;주의&#39;2 μL를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 달성 될 때까지 3-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다. 주 : 로테 위험한 독약과 인체에 큰 영향을 미칠 수있다. </li><li> oxygraph의 채널에 1 M 숙시 네이트 (10 mM)을 20 μL를 주입황색 안정된 산소 플럭스 신호까지 3-5 분 동안 기록 미토콘드리아 호흡이 달성된다. </li><li> 다음 감소하고 (3-5 분) 안정화 안정화 챔버 스토퍼 티탄 주입구를 통해 oxygraph 챔버 내로 0.05 M ADP (0.25 mM)을 10 μL를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡을 기록한다. 주 : 미토콘드리아 현탁액 ADP의 첨가 (주 3 호흡)을 증가 산소 소비량의 증가와 산소 플럭스 신호를 유도 할 것이다. ADP에 소비 된 후, 산소 유량 신호 (상태 4 호흡)을 감소한다. </li></ol> 5. 복잡한 IV-따라 호흡 <ol><li> 단계 프로토콜 2.5-2.1 안정된 신호를 기다리에 기재된 절차에 따라, 격리 된 미토콘드리아 현탁액을 함유하는 oxygraph 챔버 (0.4 ㎎ / ㎖)를 제조 하였다. </li><li> 그런 다음 0.8 mM의 아스 코르 빈산의 2.5 μL (1 mm)를 주입. 그 직후 0.2 2.5 μL를 주입TMPD M (0.25 mM)을 산소 플럭스 신호가 증가 될 때까지 oxygraph 챔버 기록 세포 호흡에 0.05 M ADP (0.25 mM)을 10 μL 및 (3-5 분) 안정화시킨다. </li><li> 마지막 oxygraph 챔버로 1 M 소듐 아자 이드 (5 mM)을 &#39;주의&#39;10 μL를 투입하고, 산소 유량의 신호가 감소 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다. 주 : 아 지드 화 나트륨 위험한 독약과 인체에 큰 영향을 미칠 수있다. </li></ol> 6. 시토크롬 C 테스트 <ol><li> 단계 프로토콜 2.5-2.1 안정된 신호를 기다리에 기재된 절차에 따라, 격리 된 미토콘드리아 현탁액을 함유하는 oxygraph 챔버 (0.4 ㎎ / ㎖)를 제조 하였다. </li><li> (0.4 ㎎ / ㎖) 챔버 스토퍼 티탄 주입구 절연 미토콘드리아 현탁액을 함유 oxygraph 챔버에 0.8 M 말산 12.5 μL (5 mM의 최종 농도) 및 2 M 글루타메이트 10 μL (10 mM의 최종 농도)을 주입안정된 산소 플럭스 신호가 달성 될 때까지 3-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다. </li><li> 다음 감소하고 (3-5 분) 안정화 산소 플럭스 신호가 증가 될 때까지 상기 챔버 스토퍼 기록 미토콘드리아 호흡 티탄 주입구를 통해 oxygraph 챔버로 0.5 M ADP (2.5 mM)을 10 μL를 주입한다. </li><li> 마지막으로, 챔버로 oxygraph 4 mM의 시토크롬 C (10 μM)의 5 μL를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 분 동안 세포 호흡을 기록한다. </li></ol>

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본 연구에서 우리는 고품질의 손상 및 고해상도 호흡율 기능성 연구에 사용할 수있는 차등 원심 분리에 의해 단단히 결합 골격근 미토콘드리아를 분리하는 프로토콜을 기술한다. 손상과 밀접하게 결합 미토콘드리아를 분리하기 위해, 본 프로토콜 내에서 고려되어야 할 몇 가지 한계점이있다. 골격 조직을 채취 후, 즉시 빙냉 미토콘드리아 차단 완충액에 침지한다. 모든 원심 분리 단계는 4 ° C에서 수행해야하며, 미토콘드리아 현탁액을 분리하는 동안 얼음에 항상 보관해야합니다. 분리 절차는 가능한 한 빨리 수행해야합니다. 균질는 청소 세제없이 원심 분리기 튜브에 원심 분리되어야한다. 프로 시저의 끝에서, 미토콘드리아 현탁액 농축 유지되어야하고 호흡율 직전에 희석 될 수있다. 호흡율 데이터는 초 당 pmol의 PE로 표현되기 때문에미토콘드리아 단백질 밀리그램의 R은 정확하게 분리 후의 미토콘드리아 단백질 농도를 측정하는 좋은 방법을 사용하는 것이 중요하다. <p class="jove_c...

미토콘드리아 생물 에너지 학 및 호흡기 용량은 투과성이 세포 또는 섬유에서뿐만 아니라 고립 된 미토콘드리아에뿐만 아니라 공부하실 수 있습니다. 본 연구에서는 고해상도 호흡율 측정을위한 차등 원심 분리를 이용하여 그대로 골격근 미토콘드리아를 분리하는 프로토콜을 기술한다. 호흡율 위해 미토콘드리아 손상을 분리하기 위해, 조직을 균일화하고 미토콘드리아는 종래의 차등 원심 분리 방법에 의해 분리된다. 차동 원심 분리 방법은 순차적 회 원심에 처음 Pallade에 의해 도입 된 조직 균질 및 동료 거의 70 년 전 1의 (증가 속도의 직렬)을 기반으로합니다. 조직은 처음 가위를 사용하여 다진과 헐렁한 유봉과 유리 균질에서 기계적으로 균질화한다. 그 후 균질 저속 깨지지 조직을 포함하는 생성 된 펠릿 세포 원심 분리파편과 핵은 폐기된다. 그 후, 상등액을 고속으로 여러 번 원심 분리하여 농축 된 미토콘드리아 분획을 수집한다. 차등 원심 분리 방법의 장점은 미토콘드리아가있는 분리하기 : ⅰ) 상기 방법은 빠르며 미토콘드리아 (호흡 실험 최대한 빠른 같이 수행되어야한다) 1-1.5 시간 내에 분리 할 수있다; ⅱ)이 저렴하다; 및 ⅲ) 그것은 매우 효율적입니다 및 차등 원심 분리하여 얻은 미토콘드리아는 호흡율 분석을위한 충분한 순수하다. 차동 원심 분리 방법의 단점은 미토콘드리아는 분리하기가 ⅰ) 미토콘드리아가 손상 및 균질화 동안 비 결합 얻을 수 있습니다; ⅱ) 다른 세포 구성 요소와 미토콘드리아 (의 오염은 더 세정 추가 원심 분리 단계와 미토콘드리아 펠렛)에 의해 해결 될 수있다; ⅲ) 차동 회 원심 단계 동안 예를 들어, 다른 개체군 미토콘드리아를, 선택의 가능성, MIT낮은 밀도와 ochondria 7을 제외 할 수 있습니다; 및 ⅳ) 미토콘드리아 세포 주변 누락 단지 이론적 최대 호흡을 측정 할 수있다. 호흡율 분석법 미토콘드리아를 분리하는 또 다른 방법은 밀도 구배 원심이있다. 에 따라 다른 세포 성분으로부터 분리 될 미토콘드리아 원인이 기술에서, 조직 추출물 자당 또는 (원심 분리 튜브의 하단보다 높은 밀도)를 퍼콜 구배 용액 위에 적층되고, 소정의 속도로 원심 분리하여 그 밀도. 이 방법은 종종 시냅 토좀 (synaptosome)에서 매우 낮은 오염 미토콘드리아 뇌를 분리하기 위해 사용된다. 그러나, 밀도 구배 원심 분리에 의해 단리 래트의 간 미토콘드리아는 매우 다른 세포 소기관 (3)로 오염된다. 이러한 방법의 한계 중 하나는 원심 분리 튜브 내의 수크로오스 구배 본 너무 파열 수도 있다는나 미토콘드리아 (삼투압 충격). 조직의 유형에 따라, 차동 원심 분리하여 손상 미토콘드리아의 분리를 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 요소가있다. 첫 번째 필요성은 부드러운 방식으로 조직을 균질화하는 것입니다. 이러한 신장, 뇌, 간 등의 부드러운 조직을 균질화 동안 적용 부드러운 기계적 힘을 필요로한다. 이것은 훨씬 더 강한 기계적인 힘을 필요로 심장과 골격 근육 열심히 조직과 대조. 다진 조직은 일반적으로 이전에 조직을 부드럽게 균질화에 단백질 분해 효소로 처리됩니다. 균질화 및 원심 분리 동안 사용 된 모든 버퍼는 차가운 얼음하고 세포질 4, 5와 호환 이온과 삼투 강도 생리 관련 pH가 있어야합니다. 절연 미토콘드리아 생체 에너지 연구의 장점 중 하나는 세포 원형질막 permeabi가있을 필요가 없다는 것이다미토콘드리아 외막 무결성을 손상 수있는 등 디기 토닌 또는 사포닌 4, 6 등의 세제와 함께하게 안정적. 단리 된 미토콘드리아의 또 다른 장점은 산소 소비 미토콘드리아 기능의 분석을 방해 할 수있는 다른 세포 내 인자의 부재이다. 단리 된 미토콘드리아를 사용하는 단점은 원심 분리 단계 동안 특정 미토콘드리아 인구의 가능한 선택 균질화시 미토콘드리아 손상 고립 미토콘드리아 7, 8의 양호한 수율을 얻기 위해서 생물학적 시료의 높은 양에 대한 요구이다. 분리 과정을 거친 후, 미토콘드리아 복합체의 호흡 속도 I-, 및 IV II- 의존성 (주 2, 3, 4)는 고해상도 호흡율을 사용하여 결정된다. 복잡한 I-구동 호흡, 글루타메이트에 대한및 말산은 아데노신이 인산염 (ADP) 다음에 추가됩니다. 복잡한 II 중심의 호흡을 위해, 숙시 네이트는 ADP 다음에 추가됩니다. 복잡한 IV 구동 호흡, 아스 코르 베이트 및 tetramethylphenylendiamine (TMPD) 미국 ADP 9, 10, 11, 12을 첨가한다. 상태 2 형 기질의 존재 하에서 산소 소비를 지칭한다. 상태 3은 기판 및 ADP의 존재하에 산소 소비를 지칭한다. 주 4 ADP 고갈 후 산소 소비를 의미한다. 호흡 조절 비율 (RCR)은 산소 소모 ATP 생산의 결합의 지표이고, 상태 3, 상태 4 (13), (15) 사이의 비율로서 계산된다. 요약하면, 우리는 차동 원심 분리에 의해 기능적 손상 골격근 미토콘드리아를 분리하고 이러한 고립 mitochon를 사용하는 프로토콜을 기술높은 해상도 호흡율과 같은 기능과 생체 에너지 연구 dria.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>화학</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>화학, 에탄올</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>화학</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>화학</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>화학 물질</td></tr><tr>에 용해<td>글루타메이트</td><td>시그마,</td> <td>G 1626</td><td>화학</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>화학</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>화학</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>화학</td></tr><tr><td>K-락토바이오네이</td>트 <td>시그마</td><td>L 2398</td><td>화학</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>화학</td></tr><tr><td>모르폴리노프로판 설폰산 (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td>화학</td></tr><tr><td>O2k-코어: 옥시그래프-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>고해상도 호흡 측정 기구</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소, 박테리아</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>시그마</td><td>S2002</td><td>화학</td></tr><tr><td>로테논</td><td>시그마</td><td>R 8875</td><td>화학, 에탄올에 용해</td></tr><tr><td>숙시네이</td>트 <td>Sigma S</td><td>2378</td><td>화학</td></tr><tr><td>Schuett homogen-plus 반자동 균질화기&nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>조직 균질화 장치</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>화학</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>화학 물질</td></tr></tbody></table>

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

미토콘드리아는 세포 에너지 대사에 관여하며 산소를 사용하여 아데노신 삼인산(ATP) 형태의 에너지를 생성합니다. 저속 및 고속의 차등 원심분리는 일반적으로 조직과 배양된 세포에서 미토콘드리아를 분리하는 데 사용됩니다. 차등 원심분리로 얻은 미토콘드리아 조잡한 분획은 호흡 측정 측정에 사용됩니다. 차등 원심분리 기법은 소기관의 크기와 침전 속도에 따른 소기관의 분리를 기반으로 합니다. 미토콘드리아의 분리는 조직 채취 직후에 수행됩니다. 조직은 얼음처럼 차가운 균질화 매체에 담그고, 가위를 사용하여 다지고, 헐렁한 유봉이 있는 유리 균질화기에서 균질화됩니다. 차등 원심분리 기법은 효율적이고 빠르며 저렴하며 차등 원심분리로 얻은 미토콘드리아는 호흡 측정 분석에 충분히 순수합니다. 차등 원심분리를 기반으로 하는 분리된 미토콘드리아의 한계와 단점 중 일부는 균질화 및 분리 과정에서 미토콘드리아가 손상될 수 있다는 점과 미토콘드리아 분리를 위해 많은 양의 조직 생검 또는 배양된 세포가 필요하다는 것입니다.

복잡한 I-따라 호흡 격리 미토콘드리아 복합체 I 의존적 호흡 레이트 (주 2, 3, 4)는 고해상도 호흡율 (도 1, 대표도)를 사용하여 결정된다. 미토콘드리아 복합체 I 기판 글루타메이트 말산은 ADP를 첨가하여 추가된다. 상태 2는 단독으로, 기판의 존재 하에서 산소 소비를 지칭한다. 상태 (3)은 기판 및 ADP의 존재하에 산소 소비를 지칭한다. 주 4 ADP 고갈 후 산소 소비를 의미한다. RCR은 ATP 생산에 대한 산소 소비량의 결합의 지표이며,도 1에 도시 된 바와 같이, ADP, 미토콘드리아 호흡 속도가 증가 즉시 (주 3 호흡)의 첨가시, 상태 3 및 상태 4의 비율로서 계산되며, 다음 수준의 매우 s의 (주 4 호흡)을 감소상태 (2)의 것과 imil...

여기서, 마취된 돼지에서 대퇴사두근 표본을 채취하고 미토콘드리아를 차등 원심분리로 분리합니다. 그런 다음 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I, II 및 IV의 호흡수를 고해상도 호흡 측정을 사용하여 결정합니다.

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

본 절차의 전반적인 목표는 차등 원심분리를 통해 골격근 미토콘드리아를 분리하고, 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I, II 및 IV의 호흡률을 측정하는 것입니다. 이 방법은 다양한 신경계 질환, 패혈증 및 연령 관련 질환과 같이 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 질병 및 증후군 등 미토콘드리아 생체 에너지학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분리된 미토콘드리아 표본에 미토콘드리아 기능 분석을 방해할 수 있는 대부분의 세포학적 요인이 포함되어 있지 않다는 점입니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Sandra Nansoz가 진행하겠습니다.이 절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 골격근 샘플이 담긴 비커를 준비하십시오. 비커를 아이스 버킷 위에 놓습니다. 정밀 가위를 사용하여 근육을 1~2mm 크기로 잘게 다집니다.다음으로, 잘게 다진 조직을 20 mL의 차가운 분리 완충액으로 2회 헹굽니다. 세척된 조직을 조직 1g당 10 mL의 분리 완충액에 현탁시킨 후, 5 mg의 protease-G를 첨가합니다. 그런 다음 비커를 마그네틱 교반기가 있는 얼음 수조에 넣고 10분 동안 교반합니다.그 후, 조직 1g당 0.2% 탈지 BSA가 첨가된 분리 버퍼 10mL를 추가하여 현탁액을 희석합니다. 다음으로, 비커에서 분리 버퍼를 모두 따라냅니다. 0.2% BSA가 첨가된 얼음처럼 차가운 분리 버퍼 20mL를 사용하여 조직을 두 번 세척합니다.그 다음, 조직 1g당 10밀리리터의 BSA가 첨가된 분리 완충액에 조직을 재현탁합니다. 헐겁게 장착된 페스틀이 있는 반자동 유리 균질기를 사용하여 조직을 균질화합니다. 이어서, 균질물을 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.세롤로지컬 피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다. 조직 1g당 10mL의 얼음처럼 차가운 BSA 보충 분리 배지를 넣어 펠렛을 재현탁합니다. 현탁액을 4°C에서 350 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.그 후, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 상층액을 따로 보관하고 펠렛은 폐기합니다. 거즈 두 겹을 통해 상층액을 얼음 위에 둔 비커에 여과합니다. 여과된 현탁액을 원심분리관으로 옮기고 4°C에서 10분 동안 7,000 ×g로 원심분리합니다.그 다음 상층액을 버립니다. 조직 1g당 5mL의 BSA가 첨가된 분리 완충액으로 조미토콘드리아 펠렛을 재현탁합니다. 이 현탁액을 4°C에서 7,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.다음으로, 상층액을 버리고 펠렛을 20 milliliters의 세척 완충액에 재현탁합니다. 4 °C에서 7,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 이 재현탁 및 원심분리 과정을 한 번 더 반복합니다.그 후, 상층액을 버리고 펠렛을 1 mL의 세척 완충액에 다시 현탁합니다. 표준 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음, 호흡 측정 분석을 수행할 준비가 될 때까지 농축된 미토콘드리아 현탁액을 얼음 위에 보관합니다.먼저, 미토콘드리아 농축액을 호흡 완충액(respiration buffer)에 재현탁하여 미토콘드리아 단백질의 최종 농도가 0.4 mg/mL가 되도록 합니다. 다음으로, 공기 보정된 옥시그래프 챔버(oxygraph chamber)에서 호흡 배지를 흡입하여 제거합니다. 분리된 미토콘드리아 현탁액 2.1 mL를 첨가합니다.마개로 옥시그래프 챔버를 밀폐합니다. 그런 다음, 37 °C에서 미토콘드리아 현탁액을 700 RPM으로 지속적으로 교반합니다. 안정적인 산소 유속 신호가 얻어질 때까지 3~5분 동안 기저 상태의 세포 호흡을 기록합니다.복합체 I 의존적 호흡을 시작하려면, 분리된 미토콘드리아 현탁액으로 준비된 옥시그래프 챔버의 스토퍼 티타늄 주입구를 통해 0.8 molar malate 12.5 microliters를 주입하십시오. 그런 다음, 2 molar glutamate 10 microliters를 주입하십시오. 안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 3분에서 5분 동안 세포 호흡을 기록하십시오.그 다음, 주입구를 통해 10 µL의 0.05 M ADP를 챔버에 주입합니다. 산소 플럭스 신호가 증가했다가 감소하여 안정될 때까지 세포 호흡을 기록합니다. 복합체 II 의존적 호흡을 위해서는, 분리된 미토콘드리아 현탁액으로 준비된 oxygraph 챔버에 2 µL의 0.2 mM rotenone을 주입합니다.안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 세포 호흡을 기록합니다. 그 다음, 1 M succinate 20 µL를 주입합니다. 안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 세포 호흡을 기록합니다.그 후, 주입구를 통해 0.05 M ADP 10 µL를 챔버에 주입합니다. 산소 플럭스 신호가 증가했다가 감소하여 안정될 때까지 세포 호흡을 기록합니다. complex IV 의존적 호흡을 위해서는, 분리된 미토콘드리아 현탁액으로 준비된 oxygraph 챔버에 0.8 mM ascorbate 2.5 µL를 주입합니다.다음으로, 즉시 2.5 µL의 0.2 M TMPD와 10 µL의 0.05 M ADP를 주입합니다. 안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 세포 호흡을 기록합니다. 그런 다음, 10 µL의 1 M sodium azide를 주입합니다.산소 플럭스 신호가 감소하다가 안정될 때까지 세포 호흡을 기록합니다. 본 연구에서는 골격근으로부터 온전한 미토콘드리아를 분리합니다. 이후 고해상도 호흡측정법을 통해 Complex I 의존적 호흡률을 측정합니다.보시는 바와 같이, ADP를 첨가하자마자 미토콘드리아 호흡률이 즉각적으로 증가합니다. ADP가 고갈된 후 호흡률은 ADP 첨가 전과 유사한 수준으로 감소합니다. 이는 호흡 조절 지수(respiratory control ratio, RCR)로 알려진 상태 3과 상태 4의 비율이 높으며, 분리 과정 동안 미토콘드리아의 무결성이 잘 유지되었음을 나타냅니다.그 다음, rotenone으로 complex I 호흡을 억제하고 complex II 기질인 succinate를 주입하여 complex II 의존적 호흡률을 관찰합니다. 이어서 ADP를 첨가하면 호흡률이 즉각적으로 증가합니다. ADP가 고갈되면 호흡률이 ADP 첨가 전과 유사한 수준으로 감소하는데, 이는 RCR이 높음을 나타내며, 결과적으로 분리 과정 동안 미토콘드리아의 무결성이 잘 유지되었음을 의미합니다.ascorbate, TMPD 및 ADP를 첨가하여 복합체 IV 의존적 호흡률을 관찰합니다. 그 후 소듐 아자이드를 첨가하여 복합체 IV를 억제합니다. 소듐 아자이드 첨가 전후의 산소 소비량 차이를 실제 복합체 IV 호흡으로 해석합니다. 상태 3에서 관찰되는 높은 복합체 IV 의존적 호흡률은 분리 과정 동안 미토콘드리아의 무결성이 잘 유지되었음을 나타냅니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 1시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 균질화 전에 미리 산소 센서의 보정을 수행하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 세포 내 ADP 함량, 미토콘드리아 막 전위, ATP 합성효소 효소 활성 및 기질 수준 측정과 같은 다른 방법들을 수행하여, 호흡률의 변화가 미토콘드리아 기질의 부족, 막 전위 또는 ATP 합성효소 효소 활성의 감소로 인한 것인지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 차등 원심 분리를 통해 골격근에서 미토콘드리아를 분리하는 방법과 고해상도 호흡 측정법을 사용하여 미토콘드리아 복합체 I, II 및 IV의 호흡률을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 개발 이후 미토콘드리아 에너지 대사 분야의 연구자들이 유전성 미토콘드리아 질환, 근육병증, 분리된 미토콘드리아의 허혈-재관류 손상과 같은 분야에서 미토콘드리아 에너지 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. Antimycin A, Rotenone, Sodium azide 및 FCCP를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.또한, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑과 실험복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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연구

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생물학

이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서...

골격근에서 Mitochondrial 절연

포유 동물 조직 생검에서 미토콘드리아의 신속한 분리를위한 방법을 설명한다. 쥐 간 또는 골격근 제제 상용 조직 dissociator 균질화하고, 미토콘드리아는 나일론 메쉬 필터를 통한 여과에 의해 미분을 분리 하였다. 대안적인 방법을 사용하여 100 분간 - 미토콘드리아 분리 시간은 60 비교 &lt;30 분이다.

조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

광근의 lateralis의 조직 검사, 정제 미토콘드리아의 준비, 호흡계 프로파일 링하는 방법이 설명되어 있습니다. 작은 부피의 근육 사용은 임상 연구 애플리케이션이 기술에 적합하다.

경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

미토콘드리아는 골격 근육에서 높은 수준의 페노티픽 가소성을 나타내는 주요 대사 세포기관입니다. 사이토솔에서 단백질의 수입은 세포기관 생물 발생을 위한 중요한 통로입니다, 망상의 확장 및 미토콘드리아 기능의 유지에 필수적입니다.  따라서, 단백질 수입은 세포 건강의 기압계 역할을 한다.

골격 근육 미토콘드리아의 단백질 수입 능력 측정

여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

말은 뛰어난 유산소 운동 능력을 가지고 있어 말 골격근을 말 운동 생리학 연구와 포유류 미토콘드리아 생리학 연구 모두에 중요한 조직으로 만듭니다. 이 기사에서는 말 골격근의 미토콘드리아 기능을 종합적으로 평가하는 기술을 설명합니다.

말 골격근의 고분해능 불소 호흡 측정

미토콘드리아에 대한 생체 에너지 및 대사체 연구는 많은 질병에서 미토콘드리아의 다면적인 역할을 밝혀냈지만, 이러한 세포 소기관에 대한 분리 방법은 다양합니다. 여기에 자세히 설명된 방법은 여러 조직 소스에서 고품질 미토콘드리아를 정제할 수 있습니다. 품질은 호흡 조절 비율 및 고해상도 호흡 측정법으로 평가된 기타 지표에 의해 결정됩니다.

설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리 

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

직접 칼슘 불꽃을 측정하는 방법이 여기에 설명, 칼슘 2 +의 기본 단위는 그대로 골격 근육 섬유의 근질 세망에서 놓습니다. 이 방법은 고립 된 근육 섬유의 ryanodine 수용체에서 칼슘 2 + 릴리스의 삼투 스트레스 매개 트리거를 사용합니다. 역학과 내 Ca 2 + 신호 전달의 항상성 용량은 건강과 질환에서 근육 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다.

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

배우세요 차동 원심 분리를 이용한 골격근 미토콘드리아 분리 및 고해상도 호흡 측정법입니다. 이 방법은 미토콘드리아 기능 장애 관련 신경계 질환과 노화 관련 질환 연구에 활용됩니다.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

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