Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

이 비디오의 전반적인 목표는 psoralen 가교 결합 결찰 및 선택된 하이브리드 또는 SPLASH의 염기서열 분석 방법을 설명하는 것입니다. 이는 쌍별 in vivo RNA-RNA 상호 작용이 게놈 전체 방식으로 매핑됩니다. 이 기술은 in vivo에서 RNA 상호 작용을 매핑하기 위한 간단하고 처리량이 많은 방법입니다. 이 방법은 RNA의 단일 가닥을 따라 또는 RNA의 서로 다른 가닥 사이의 다른 영역이 서로 어떻게 상호 작용하는지와 같은 RNA 유전체학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 효모와 인간 세포에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 세포의 박테리아 및 멤브레인을 포함한 다른 현대 유기체에 대한 연구에도 적용할 수 있습니다. 우리는 분자 상호 작용을 매핑하는 방법을 고안하고 싶었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 다음 절차에는 몇 가지 중지 지점이 포함되어 있습니다.

이 경우 실험이 잠시 또는 무기한으로 일시 중지될 수 있습니다. 자세한 내용은 첨부된 본문에서 확인할 수 있습니다. 5ml의 PBS로 HeLa 세포를 두 번 세척하여 이 절차를 시작합니다.

접시를 1분 동안 세로로 놓아 여분의 PBS를 완전히 배출합니다. 다음으로, 200마이크로몰의 비오틴화된 프소랄렌과 0.01%디지토닌을 함유한 PBS 1ml를 첨가하여 세포 투과성을 증가시킵니다. 용액을 세포 표면에 고르게 첨가하도록 주의하십시오.

섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 접시의 뚜껑을 제거하고 UV 전구에서 3cm 떨어진 UV Crosslinker 내부의 얼음 위에 놓습니다. 365나노미터 UV를 20분 동안 조사합니다.

20분 후, Crosslinker에서 접시를 제거한 다음 동봉된 문서의 지침에 따라 HeLa 세포에서 단편을 분리하고 RNA를 침전시킵니다. 변성된 ladder와 RNA 샘플을 8.6cm 정사각형 6%TBE-요소 겔에 로드합니다. 40분 동안 180볼트에서 전기영동으로 크기를 분별합니다.

1:10, 000 희석된 핵산 겔 염색을 포함하는 10ml의 TBE 완충액으로 겔을 어두운 곳에서 5분 동안 염색합니다. 겔이 염색되는 동안 24게이지 바늘을 사용하여 바닥에 있는 깨끗한 0.6ml 마이크로분리 튜브에 구멍을 뚫습니다. 2밀리리터 마이크로분리관에 넣습니다.

transilluminator를 사용하여 염색 후 겔의 띠를 시각화하고 90 - 110개의 뉴클레오티드에 해당하는 겔 슬라이스를 절단합니다. 겔 슬라이스를 2밀리리터 마이크로분리 튜브의 구멍이 뚫린 0.6ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 크기 선택을 통해 키메라 단편의 최소 길이를 설정하고 나중에 접합 산물과 비결찰 산물을 구별할

젤 조각을 12, 2 분 동안 실내 온도에 000 시간 g에 젤 조각을 갈가리 찢고 2 밀리리터 microfuge 관에서 모으기 위하여 젤 조각을 원심 분리하십시오. 탈수 후 빈 0.6ml 마이크로퓨지 튜브를 버립니다. 파쇄된 젤 슬라이스에 700마이크로리터의 용리 완충액을 추가합니다.

섭씨 4도에서 밤새 일정한 회전으로 배양하여 샘플이 완충액으로 확산될 수 있도록 합니다. 겔 슬라이스와 용출 완충액을 원심분리기 튜브 필터로 옮기고 20분 동안 20, 000회 g으로 원심분리합니다. 스핀 후 젤 조각은 필터의 상단 구획에 갇히게 되며 폐기될 수 있습니다.

동반 문헌에 기술된 대로 RNA를 침전시키고 정량화합니다. RNA를 급속 동결하고 사용할 때까지 섭씨 영하 80도의 액체 질소에 보관하십시오. RNA 교차결합 영역을 풍부하게 하려면 먼저 RNase 억제제를 포함하는 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가하여 마이크로fuge 튜브에서 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드를 세척합니다.

15ml 원뿔형 원심분리 튜브에 2ml의 새로 준비된 혼성화 완충액, 1ml의 보충 용해 완충액, 1.5μg의 크기 분획 RNA 및 100μl의 재현탁 비드를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이치십시오. 섭씨 37도에서 30분 동안 종단 간 교대로 배양합니다.

배양 후에는 예열된 세척 버퍼로 비드를 5회 세척합니다. 다섯 번째 세척이 끝나면 비드가 들어있는 마이크로 분리 튜브를 자석 스탠드에 1 분 동안 놓고 세척 버퍼를 제거합니다. 세척된 비드에 1ml의 차가운 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액을 추가합니다.

비드를 섭씨 4도에서 종단 간 회전으로 5분 동안 배양합니다. 비드가 들어 있는 마이크로분리관을 마그네틱 스트립에 놓습니다. 1분 후 버퍼를 부드럽게 제거합니다.

이 단계를 반복하여 총 2회 세척하고 마지막 세척 후 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 동봉된 문서의 지침에 따라 5개의 프라임 말단과 3개의 프라임 말단을 ligation compatible로 변환하고 근접 ligation을 수행합니다. 세척 후 100마이크로리터의 RNA PK 버퍼를 비드에 추가하고 위아래로 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다.

열 블록에서 섭씨 95도에서 10분 동안 샘플을 가열합니다. 다음으로, 샘플을 얼음에 1분 동안 식힙니다. 500마이크로리터의 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름을 샘플에 추가합니다.

10초 동안 격렬하게 소용돌이치면서 섞습니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 키트를 사용하여 RNA를 침전, 세척 및 복구하고 작은 RNA도 유지되도록 합니다.

100마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 RNA를 용리합니다. 용출된 샘플 100마이크로리터를 니스의 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 두고 UV는 254나노미터에서 5분 동안 조사합니다.

역 가교 결합된 샘플을 깨끗한 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 아세트산나트륨 10마이크로리터, 글리코겐 1마이크로리터, 100% 에탄올 300마이크로리터를 추가합니다. RNA를 섭씨 영하 20도에서 최소 1시간 동안 침전시킵니다.

RNA를 재기하기 위하여는, 침전된 RNA를 20, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 000 시간 g에 원심 분리하십시오. 스핀 후 상등액을 제거하고 70% 차가운 에탄올 1ml를 첨가하여 RNA 펠릿을 세척합니다. 세척한 펠릿을 20, 000 시간 g에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 원심 분리기

세척 완충액을 제거하고 4.25마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 RNA를 재현탁합니다. RNA를 0.2 millil PCR 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 동봉된 문서의 지침에 따라 cDNA를 역전사, 순환 및 증폭합니다.

이 회로도는 SPLASH 워크플로우를 나타냅니다. 0.01% 디지토닌 및 UV 교차결합이 있는 상태에서 비오틴화된 psoralen을 첨가하면 세포에서 총 RNA를 추출하고 교차결합이 효율적인지 확인하기 위해 도트 블롯을 수행합니다. 그런 다음 비오틴화된 20개의 염기 올리고를 양성 대조군으로 사용하여 세포에 첨가할 비오틴화된 소랄렌의 양을 적정하여 150개 염기 중 약 1개가 교차결합되도록 합니다.

그런 다음 심층 염기서열분석에 필요한 최소 사이클 수를 결정하기 위해 증가하는 PCR 사이클 수를 사용하여 소규모 PCR 증폭을 수행합니다. 효율적인 라이브러리 준비 프로세스에서, cDNA 염기서열분석 라이브러리는 1.5마이크로그램의 선택된 RNA 입력에서 15주기 미만의 PCR 증폭으로 증폭될 수 있습니다. 그런 다음 라이브러리는 높은 전체 염기서열분석 기계에서 두 개의 150 염기쌍 판독을 사용하여 시퀀싱됩니다.

그런 다음 시퀀싱 읽기는 계산 파이프라인에 따라 처리됩니다. 최종 결과는 전사체에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용을 모두 포함하는 필터링된 키메라 상호 작용 목록입니다. 이 절차를 시도하는 동안 새로운 유기체에 SPLASH를 사용할 때 비오틴화 소랄렌 혼입을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후 이 기술은 RNA 생물학 분야의 연구자들이 다양한 유기체에서 RNA 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포에서 전 세계적으로 쌍별 RNA 상호 작용을 캡처하는 염기서열분석 라이브러리를 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.