Name: 일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 배우세요 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs를 소규모로 전파하여 면역 세포 화학 특성화를 수행하는 방법을. 이 기술은 시간과 비용을 절감하면서 다능성 항원 검출에 적합한 기질에서 줄기세포를 효율적으로 배양할 수 있게 합니다.

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자금 출처: 애리조나 대학교, 짐 히멜릭 재단, 애리조나 복합 질병 생물학 센터.

hiPSCs는 4mm 피부 펀치 생검에서 분리 센다이 바이러스 매개 재 프로그래밍 (11)를 통해 집에서 재 프로그래밍 인간 피부 섬유 아세포에서 유래되었다. 애리조나 임상 시험 심사위원회의 대학은 대상 모집 및 생검 수집을위한 모든 절차를 승인했다. IPSC 문화에 대한 세포 외 매트릭스 코팅 표면의 1. 준비 <ol><li> 어느 날 이전 iMEFs에 성장 hiPSC 문화의 합류로, 세포 외 기질 (마트 리겔) 코팅 된 플레이트를 준비합니다. </li><li> 천천히 해동는 세포 외 기질의 나누어지는 2 시간 동안 4 ° C에서 얼음 (종속 많이는 사양서에 지시 사항을 따르십시오). </li><li> 바이오 안전성 후드에서 차가운 피펫 팁을 사용하여 (DMEM / F12 / HEPES)이 많은 특정 희석 요인에 따라 감기 둘 베코의 변형 이글 중간 / 영양 혼합물 F-12 세포 외 기질의 1 분취 량을 추가 (-20 ° C에서 보관) . </li><li> 분배 ~ 600(81) 각각의 새로운 세포 배양을 잘 당 세포 외 기질의 L은 12 웰 플레이트가 필요로 처리 하였다. </li><li> 실온에서 수 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. 여기서, 3 시간의 배양 시간을 사용합니다. 참고 : 접시는 즉시 사용 또는 최대 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 전파에 대한 세포 외 매트릭스에 IMEF 피더 세포에 성장 hiPSCs 2. 전송 <ol><li> 계대하는 날에, 4 ° C에서 매트릭스 도장 판을 제거하고, 플레이트는 조직 배양 후드에서 1 시간 동안 실온에 적응하도록 허용한다. </li><li> iMEFs에 성장 hiPSC 문화의 6 웰 플레이트의 1도에서 매체를 대기음 500 μL 콜라게나 해리 시약으로 대체 (1 밀리그램 / 기초 배지에서 ㎖). </li><li> IPSC 식민지의 가장자리가 약간 들어 올려 나타날 때까지 30 분 - 10 ~ 37 ° C에서 품어. 참고 : 배양 시간이 줄 의존과 다를 수 있습니다. 현미경 분리를 모니터링합니다. </li><li> 차efully 해리 시약을 기음과 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, pH를 7.4)으로 가볍게 두 번 씻는다. </li><li> 잘 10 NG / ㎖의 Rho 관련 단백질 키나제 억제제 (Y-27632 ROCK 저해제) 실온 mTeSR1 전체 매체의 1 ML을 추가합니다. 참고 :이 초기 통과하는 동안 IMEF 에어컨 매체와 mTeSR1의 50:50 혼합물을 사용하여 제안하고,이 미디어 전환시 hiPSCs의 생존에 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 수동으로 점수 1 선택, 후드 내부에 부분적으로 배치 된 작은 위상차 현미경을 사용하여 - 2 hiPSC 식민지를 (~ 700 - 직경 1000 μm의) 주사기와 바늘 (25 G, 1.5에서)를 사용. P200 피펫 팁을 가진 매체로 식민지의 득점 조각을 밀어 넣습니다. </li><li> 대기음은 코팅을 방해하지 않도록주의, 새로운 판에서 매트릭스를 처리합니다. </li><li> 이전 잘 잘 코팅 된 새로운 행렬로 득점 iPSCs를 포함한에서 세포 현탁액의 양도 1 mL를. </li><li> 놀이터37 ° C의 배양기에서 플레이트 CE, 5 % CO 2. 여러 빠른, 전후에 판 바위, 그리고 좌우로 움직임이 고르게 세포를 확산한다. 24 시간 동안 접시를 방해하지 마십시오. </li><li> mTeSR1 완전 배지 (Y-27632 ROCK 억제제를 첨가 단계 2.5의 초기 도금 후 필요하지 않습니다)와 매일 전체 미디어 변경을 수행합니다. </li></ol> 매트릭스 코팅 된 플레이트에 hiPSCs 3. 작은 규모과 Passaging 주 : 일반적으로, 코팅 된 플레이트를 매트릭스 할 hiPSCs 초기 전송 한 후, 세포를 모두 iMEFs가 제거 된 세포는 조건없이 공급기하도록 보장하기 위하여 유사한 방식으로 한 번 계대한다. <ol><li> 섹션 1에서 설명한 바와 같이 이전 IPSC의 포화 상태에 어느 날 갓 매트릭스 판을 코팅 준비합니다. </li><li> 통로의 날에, 39 ° C의 항온에서 매트릭스 도장 판을 제거하고, 판 조직 막힌 1 시간 동안 실온에 적응하도록 허용진짜야 후드. </li><li> (원래 매트릭스 공급 장치에서 전환) hiPSCs의 6 웰 플레이트의 1도에서 매체를 대기음 500 μL 세포 분리 버퍼로 교체합니다. 주 : 여기에서 사용되는 상업용 세포 해리 완충액 (재료 표 참조)에 비해 콜라게나 mTeSR1 매체와 함께 사용하기에보다 적합하다. </li><li> IPSC 콜로니의 가장자리가 약간 들어 올려 나타날 때까지 7 분 - 3 시간 동안 실온에서 인큐베이션. 앞서 언급 한 바와 같이, 인큐베이션 타임 라인 종속 변수이다. 따라서, 최적의 시간을 결정하기 위해 현미경으로 세포 분해를 감시한다. </li><li> 조심스럽게 분리 버퍼를 대기음하고 PBS로 부드럽게하는 과정을 2 회 반복한다. </li><li> 잘 10 NG / mL의 Y-27632 ROCK 저해제 실온 mTeSR1 전체 매체의 500 μL를 추가합니다. </li><li> 대신, 단계 260에서와 같이 득점 콜로니하는 P200 팁을 사용하여 미디어에 콜로니의 수를 밀어 부드럽게 세포 현탁액을 2 회 AG를 씹다크기 200 μm의 - 우물의 한 구석에 ~ (50)의 덩어리로 hiPSC 식민지를 깰 ainst. 각 1 개의 새 우물에 전송하는 2 식민지 - 예를 들어, 12 웰 플레이트를 들어, 1을 선택합니다. 물론 12 웰 플레이트의 하나의 새로운 우물에 기존의 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 여러 빠른 전후에 판 암, 및 좌우 운동은 균일하게 세포를 확산하고, 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 24 시간 동안 접시 나머지하자. </li><li> mTeSR1 완전한 매체와 매일 전체 미디어 변경을 수행합니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 초기 도금 후 Y-27632의 ROCK 억제제를 추가 할 필요가 없다. 참고 : 단계 3.7에서 사용되지 않는 IPSC 식민지가이 시점에서 쉽게 냉동 보관 할 수있다. </li></ol> 면역 세포 화학에 대한 hiPSCs의 시드 대한 상공 회의소 슬라이드 및 Coverslips는 4. 준비 참고 : 다음 프로토콜은 4 웰 플라스틱 챔버 슬라이드와 appropriat와 12mm 커버 글라스를 사용한다멀티 웰 미디어의 전자 볼륨은 비용 효과적인 면역 세포를 지원한다. 더 잘 커버 슬립 크기의 사용이 요구되는 경우, 매체 볼륨이 증가 될 수있다. <ol><li> 어느 날 hiPSC 합류하기 전에 충분히 매트릭스 솔루션 부 (1)에서 설명한 바와 같이 갓 세포 외 기질로 코팅 챔버 슬라이드를 준비 추가 (~ 300 - 4 잘 챔버 슬라이드의 잘 당 500 μL)의 우려없이 잘 완전히 코트 각 증발. 또한, 500 μL 각 24 웰 플레이트의 웰 코트에 세포 외 기질을 1 청소 및 소독 커버 슬립을 배치하고 coverslip에이 솔루션의 상단에 떠 있지 않은지 확인 후. </li><li> 통로의 날, 4 ° C에서 코팅 된 챔버 슬라이드 / 커버 슬립을 제거하고 조직 배양 후드에서 1 시간 동안 실온에 적응을 허용한다. </li><li> hiPSCs의 12 웰 플레이트의 한 우물에서 매체를 대기음 500 μL 해리 버퍼로 교체합니다. </li><li> 객실 템피에 품어~ 3 rature - 7 분은 IPSC 식민지의 가장자리가 약간 들어 올려 나타날 때까지. </li><li> 조심스럽게 분리 버퍼를 기음과 우물에 10 NG / mL의 Y-27632 ROCK 저해제 실온 mTeSR1 완전 배지 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 수동으로 4 웰 챔버 슬라이드 또는 1 새 coverslip에의 한 식민지 / 새로운 잘 선택, 조직 문화 후드 내부에 배치 작은 위상차 현미경을 사용하여 도금 될 (~ 1000 - 직경 1,500 μm의)를 추진하여 P200 피펫 팁을 사용하여 그것은 오프 매체에 플레이트 표면. </li><li> 코팅을 방해하지 않도록주의, 새로운 챔버 슬라이드 / 커버 슬립에서 행렬을 대기음. </li><li> 크기 200 μm의 - 부드럽게 ~ 50의 덩어리로 세포 현탁액에게 hiPSC 식민지를 깰 우물의 한 구석에 대하여 2 번 씹다. 잘 4 잘 챔버 슬라이드 / 커버 슬립의 새 우물에 이전에서 세포 현탁액 250 μL를 전송합니다. </li><li> 잘 mTeSR1의 계속 500 μL까지 새로운 각의 볼륨을 가져와10 NG / mL의 Y-27632 ROCK 억제제를 aining. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2의 인큐베이터에서 챔버 슬라이드 / 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 24 시간 후, mTeSR1 완전한 매체와 매일 전체 미디어 변경을 수행합니다. 앞서 언급 한 바와 같이 다시, Y-27632 ROCK 억제제의 첨가는 초기 도금 후 불필요하다. </li></ol> 면역 세포 화학에 대한 iPSCs 5. 준비 <ol><li> 합류 후, 미리 예열주의 4 % 파라 포름 알데히드를 우물에서 미디어를 제거하고 추가하여 고정을 통해 hiPSC 식민지를 유지 (~ 300 μL / 웰의 4 웰 챔버 슬라이드 / 커버 슬립). 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> 적절하게 기관 생물 및 화학 안전 지침에 따라 파라 포름 알데히드를 폐기하십시오. </li><li> PBS와 벤치 탑 진탕 기에서 5 분마다 세포를 3 회 반복한다. 참고 : 챔버 슬라이드에 세포 / 커버 슬립이 단계에서 무한정 4 ° C에서 충분한 PBS로 저장할 수 있습니다.대안 적으로, 그들은 즉시 ICC를 위해 사용될 수있다. </li></ol> 만능 마커와 hiPSCs 6. 면역 염색 참고 : 표준 만능의 항체 발현 사이의 hiPSCs. 예를 들어, 여기 세포 더블 스테인드 다음과 같이 항체가 하나의 1면과 순차적으로 1 세포 내 항원을 대상으로 다음과 같습니다과 안티 무대 특정 배아 항원-4 (SSEA4) 단백질 4 (옥트을 방지 옥타 결합 4) 및 안티 트라-1-60 반 SRY 관련 HMG 상자 유전자 2 (SOX2)와 () 항체 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. <ol><li> 우물에서 PBS를 기음과 트리톤 X-100없이 500 μL / 잘 차단 솔루션에 추가 할 수 있습니다. 실온에서 1 시간 동안 배양. </li><li> 트리톤 X-100 않고 차단 용액으로 희석하여 표면 항체, SSEA4 또는 트라-1-60 중 하나로서, 미리 결정된 농도를 준비 (200 여기서, 1을 사용). <ol><li> 챔버 슬라이드를 들어, 4 잘 챔버 슬라이드의 300 μL / 잘 준비위의 솔루션 및 안티 SSEA4 또는 트라-1-60 일차 항체의 1.5 μL를 차단의 298.5 μL를 혼합하여. </li><li> 된 커버를 들어, 솔루션 및 안티 SSEA4 또는 트라-1-60 일차 항체의 1 μL 차단의 199 μL를 혼합하여 40 μL / 커버 슬립을 준비합니다. </li></ol></li><li> 챔버 슬라이드에서 차단 솔루션을 기음하고 적절한 우물에 차 항체를 분배. 된 커버를 들어, 단단히 페트리 접시 안에 파라 필름의 조각을 놓고 방울로 위에 차 항체의 40 μL를 분배. 구부러진 주사기 바늘과 집게를 사용하여 조심스럽게 아니라 문화의 밖으로 커버 슬립을 들어 올려 파라 필름에 대한 항체의 드롭에 아래로 셀 측면을 배치합니다. 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 챔버 슬라이드에서 항체를 제거하고 PBS에 추가하여 10 분마다, - 다음날 아침, 세포 3 번, 5 씻는다. 된 커버를 들어, 파라 필름 오프 각을 들어 올려 24 웰 플레이트, 세포면이 위로의 잘에 다시 배치합니다. 조심스럽게 P를 추가BS. </li><li> 1 적절한 보조 항체를 준비 : (500)를 차단 솔루션에. <ol><li> 챔버 슬라이드를 들어, 준비 300 μL / 웰 4 잘 챔버 슬라이드의 항 - 마우스 IgM의 알렉사 플 루어 염소의 항 - 마우스 IgG3 알렉사 플 루어 488 (SSEA4) 또는 1 μL 염소의 μL를 차단 솔루션의 499 μL를 혼합 1로 488 (트라-1-60)입니다. </li><li> 커버 슬립을 위해 솔루션을 차단의 499 μL를 혼합하여 40 μL / 커버 슬립을 준비하고 염소의 1 μL 항 - 마우스 IgG3 알렉사 플 루어 488 염소의 μL 항 - 마우스 IgM의 알렉사 플 루어 488 (SSEA4) 또는 1 (대한 트라-1-60 ). </li></ol></li><li> 챔버 슬라이드에서 PBS를 대기음하고 적절한 우물에 차 항체를 분배. 커버 슬립 들어, 스텝 6.2 다음, 실온에서 2 시간 동안 파라 필름 상에 배치 된 항체 용액 위에 커버 슬립을 반전. 참고 : 사용하는 형광 이차 항체를 태그하면, 세포가 빛으로부터 보호해야합니다. 어두운 ENV에 챔버 슬라이드와 커버 슬립을 배치배양 및 세척시 ironment. </li><li> 챔버 슬라이드에서 항체를 제거하고 PBS에 추가하여 10 분마다 - 5 세포를 3 회 반복한다. 된 커버를 들어, 파라 필름에서 조심스럽게 하나 하나를 들어 올려 24 웰 플레이트, 세포면이 위로의 잘 다시 배치합니다. 부드럽게 세척하는 동안 PBS를 추가합니다. </li><li> 제 항원 프로빙에 앞서, 세포 옥트 4이 경우 SOX2 실온에서 1 시간 동안 permeabilization 시약 (트리톤 X-100)로 이루어진 차단 용액으로 다시 배양한다. </li><li> 옥트 4 SOX2위한 발현 사이하려면 일차 및 이차 항체를 가하는 단계 6.1-6.6에서 설명 된 방법을 따른다. 1 (200) 및 이차 항체를 염소 항 - 토끼 IgG를 렉 형석 594 :이 프로토콜의 목적을 위해, 하나의 농도 옥트 4 SOX2를 사용하여 500. </li><li> 6&#39;-diamidino-2 &#39;PBS로 각각 10 분 및 4 Counterstain과 - 상기의 일차 및 이차 항체 치료 후 5 세포를 3 회 세척-phenylindole 핵 시각화가 요구되는 경우 표준 프로토콜에 따라 디 히드로 클로라이드 (DAPI). </li></ol> 보기 7. 준비 <ol><li> 챔버 슬라이드를 들어, 조심스럽게 제조업체의 지침에 따라, 슬라이드에서 상부 챔버를 제거합니다. 그런 다음, 증류수로 세척하고, 현미경을 사용하려면 매체와 커브 글라스를 장착 추가합니다. </li><li> 커버 슬립 들어, 중간 유리 현미경 슬라이드에 위치 장착 하락에 커버 슬립을 반전. </li><li> 표준 또는 공 초점 형광 현미경 이미지. </li></ol>

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</ol>

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여기에 제시된 프로토콜 체계 특히 면역 세포를 통해 효과적인 능성 분석을 지원하기위한 축소 된 배양 기술의 형태로 시간을 절약하고 비용 효율적인 방법을 제공한다. 다음과 같이 설명 된 방법의 주요 장점이다. 전통적 이상의 3~4 통로 12, 13을 표시 대량 분리 기술의 사용 후에 잔존 iMEFs을 제거하기 위해 전형적인 단층 형태를위한 배양 조건 부담을 피더 세포층으로부터 iPSCs를 전환 할 필요가있다. 대조적으로, 여기에서 제시된 방법은 IPSC 콜로니의 수동 따기 통해 무 혈청 조건 iPSCs 비교적 빠른 전송을 가능하게 단축 타임 라인을 포함한다. iPSCs 작은 챔버 슬라이드 나 면역 세포에 대한 도움이 된 커버에 제한된 양으로 성장하고 있습니다. 사실, volu웰 당 필요한 배지 내 단지 0.5 mL로하고이 프로토콜을 사용할 때 하나의 커버 슬...

유도 된 다 능성 줄기 세포로 인간 성인 체세포 재 프로그래밍 (iPSCs)는 병 (1, 2)를 연구하기 위해 환자의 특정 셀의 잠재적으로 무제한의 전원을 얻을 수있는 방법을 제공한다. 시험 관내에서 질병 표현형을 Recapitulating 것은 그럴듯한 질환과 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 조사 할 수 있도록하고, 신약 개발을 강화하고 약 3 개인 것입니다. 또한, 인간 iPSCs (hiPSCs)는 죽은 세포 또는 장애를 바꾼 여러 질환 (4)의 컨텍스트 (5)에 기능을 회복하기위한 고유 자원으로 이용 될 수있는 특정 유형의 세포를 유도 할 가능성을 제공한다. 위의 응용 프로그램에서 iPSCs를 사용하는 중요한 전제 조건은 다 능성 및 미분화 상태가 문화의 확장 동안 유지되는 것을 보장한다. 일반적으로, techniq세포 및 특수 장비를 대량으로 필요로 이러한 유세포, 웨스턴 블롯, 중합 효소 연쇄 반응 분석 및 기능 등의 단말은, IPSC의 능성 6, 7, 8, 9, 10의 상세한 분석을 위해 사용된다. 그러나, iPSCs &#39;미분화 상태의 일상적인 평가를 효과적으로 이렇게 감소 된 시간과 자원을 포함하는, 특히 면역 세포 (ICC) 이러한 세포의 제한된 전파를 통해 달성 될 수 있습니다. 최근 발전은 뮤린 섬유 아세포의 피더 레이어 혈청 함유 배지를 필요 종래 배양 시스템에 비해 상당히 개선 된 정의를 무 혈청 조건 iPSCs의 성장을 허용한다. 그러나, 현재의 문학 공급 장치에서 iPSCs를 전환하는 방법에 대해 설명 명확한 단계적 프로토콜을 포함하지 않는공급 장치가없는 시스템에 층. 이러한 맥락에서, 본 프로토콜은 체계적으로 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포 성장 hiPSCs는 (IMEF) 세포층 (1) 일 무 혈청 배지에서 전파하도록 적응, (2) 소규모 배양 특별히 강력한 지원하는 방법을 자세히 면역 세포 화학 분석. 전반적으로,이 방법은 면역 세포를 이용하여 정기적으로 자신의 분화능을 확인하기위한 무 혈청 조건에서 인간 iPSCs 전파하기위한 신속하고 비용 효과적인 방법을 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12/HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 혈청 교체</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>생명 기술</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>생명 기술</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-염기성</td><td>세포 과학</td><td>CRF001B</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK 억제제</td><td>R& D</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV형</td><td>생명 기술</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스</td><td>코닝</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 기초 매체</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5x 보충제</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>07174</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M PO4 Buffer</td><td>In-House</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 프릴</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td></td> 16210072 <td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) 마우스 mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) 마우스 mAb</td><td>세포 신호 세포 신호 세포 신호 세포 신호</td><td>2840 3579 4755 4746</td><td>또는 카탈로그 #9656</td></tr><tr><td>Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21151</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>멀티웰 세포 배양 플레이트</td><td>에서 6가지 다능성 1차 항체 조합을 키트로 함께 구입할 수 있습니다.피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>0720080/0720081</td><td>6, 12, 24, 48, 96 웰 크기로 사용 가능한</td></tr><tr><td>챔버 슬라이드</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 565 21</td><td>유리 또는 퍼마녹스 플라스틱에서 사용 가능 1, 2, 4, 8, 16 웰 크기</td></tr><tr><td>커버글라스 성장을 위한 Fisher</td><td>Scientific&nbsp;</td><td>12 545 82</td><td>12, 15, 18, 22 및 25mm 크기로 제공</td></tr></tbody></table>

일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 ipscs의 소규모 전파

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)는 환자 특이성과 특징적인 줄기세포성으로 인해 질병 모델링 및 세포 치료에 활용하는 데 큰 관심이 있습니다. 그러나 iPSC의 기능에 필수적인 다능성은 이러한 세포를 이러한 응용 분야에 사용하기 전에 확인해야 합니다. 다능성을 확립하기 위해서는 다양한 세포 및 기능적 분석을 통한 iPSC의 엄격한 특성 분석이 필요하지만, 면역세포화학 기술을 통해 다능성 유지에 대한 일상적인 평가를 보다 간단하고 효과적으로 달성할 수 있습니다. 여기에서는 특히 면역세포화학을 사용하여 만능 상태의 검증을 용이하게 하기 위해 축소된 방식으로 hiPSC를 배양하기 위한 체계적인 프로토콜을 제시합니다. 보다 구체적으로 말하자면, 이 방법론은 무혈청 조건에서 iPSC를 성장시키고 면역세포화학에 이상적인 작은 챔버 슬라이드 또는 유리 커버슬립에 도금하는 효율적이고 비용 효율적인 방법을 포함합니다.

이 프로토콜은 특별히 능성 유지를 확인하기위한 비용 효율적인 면역 세포를 활성화하는 제한된 방식 피더 확보 조건 세포층으로부터 전송하고,이어서 전달되는 방법 인간 iPSCs의 단계적인 설명을 제공한다. 도 1은이 프로토콜의 개략도를 도시한다. 도 2a는 6 웰 플레이트에 iMEFs에 성장 hiPSC 식민지를 보여줍니다. 이러한 식민지 정의 테두리와 조밀 한 단계 밝은 센터와 전형적인 형태를 나타낸다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 12- 웰 플레이트에서 iPSCs의 전송이 끝날 공급기없는 조건, 콜로니 형태는 덜 뚜렷한 가장자리 다소 혼란 나타난다. 또한, 일부 iMEFs이 단계에서 문화에 남아있을 수 있습니다. 도 2c는 공급 장치가없는 시스템의 추가 통과 한 후, IPSC 식민지가 CY에 높은 핵을 가진 고전적인 단층 형태를 표시하는 것을 보여...

유도만능줄기세포(iPSC)의 유지를 확인하기 위한 정기적인 특성화는 이러한 세포가 다른 응용 분야에 사용되기 전에 중요한 단계입니다. 여기에서는 면역세포화학을 통해 쉽고 일상적인 특성 분석을 가능하게 하도록 특별히 설계된 인간 iPSC의 소규모 증식 방법에 대해 설명합니다.

일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

본 배양법의 전반적인 목표는 인간 유도만능줄기세포(human iPSCs)를 소규모로 증식시켜 면역세포화학법을 통한 일상적인 특성 분석을 가능하게 하는 것입니다. 본 연구실의 이 프로토콜은 인간 유도만능줄기세포를 하부 태아층에서 특정 만능성 항체를 이용한 항원 검출에 더 적합한 기질로 전이시키는 스케일 다운(scale down) 기술을 제시합니다. 이 기술의 주요 장점은 면역세포화학법에 이상적인 소형 챔버 슬라이드나 커버슬립에서 만능성 세포를 배양할 수 있는 시간 및 비용 효율적인 수단을 제공한다는 점입니다.계대 배양 당일, 4°C에 보관했던 매트릭스 코팅 플레이트를 꺼내 조직 배양 후드 내에서 1시간 동안 실온에 적응시킵니다. 다음으로, iMEF 상에서 배양 중인 인간 iPSC가 담긴 6-웰 플레이트의 한 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고, 500 µL의 콜라게나제 해리 시약으로 교체합니다. 이어서 세포를 37°C에서 10~30분 동안 배양하며, 현미경 관찰 시 iPSC 콜로니의 가장자리가 약간 들뜬 것처럼 보일 때까지 기다립니다. 그 후 해리 시약을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 PBS로 세포를 2회 부드럽게 세척합니다.각 iPSC 라인마다 해리 프로필이 다를 수 있으므로, 해리 시약과 함께 필요한 최적의 배양 시간을 결정하기 위해 현미경으로 콜로니의 탈착 상태를 모니터링하는 것이 중요합니다. 10 ng/mL의 ROCK inhibitor가 포함된 상온의 mTeSR 완전 배지 1 mL를 웰에 첨가합니다. 후드 내부에 일부 배치된 소형 위상차 현미경을 사용하여, 1~2개의 인간 iPSC 콜로니를 수동으로 표시하고 채취합니다.P200 파이펫 팁을 사용하여 분할된 콜로니 조각들을 배지로 밀어 넣습니다. 그 후, 코팅이 손상되지 않도록 주의하며 세포를 분주할 새 웰의 매트릭스를 흡입하여 제거합니다. 분할된 iPSCs가 포함된 기존 웰에서 세포 현탁액 1 mL를 취해 매트릭스가 코팅된 새 웰로 옮깁니다.플레이트를 인큐베이터에 넣고, 전후좌우로 빠르게 여러 번 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다. 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 인간 iPSC를 iMEF에서 세포외 기질로 전이시킨 후, 이전의 계대 배양 단계와 유사한 방식으로 12웰 플레이트에 계대 배양합니다.이 계대 배양 과정은 배양액에서 남아 있는 iMEF를 제거하고 세포가 피더 프리(feeder-free) 조건에 적응하도록 합니다. P200 팁을 사용하여 원하는

small-scale-propagation-human-ipscs-serum-free-conditions-for-routine

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

세포 - 표면 마커에 대한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 중지 immunocytochemical 얼룩 (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4)가 관측 및 부량에 대한 세포 monolayer을 생성하기 위해 스스로 만든 cytospin 장치의 사용을 기반으로 달성했다.

자수 성 가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 Pluripotent 줄기 세포의 Immunocytochemical 분석

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다.

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

프로토콜은 차별화에 생체 재료의 강성 효과 확산의 조사와 펩타이드, 없이 투입 했다 다양 한 뻣 뻣 함과 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 hydrogels를 준비 하 여 줄기 세포입니다. hydrogels 강성 가교에 의해 통제 되었다.

폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화

선물이 여기 각 somite 파생 (myotome, sclerotome, dermatome, 및 syndetome)에 인간 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대 한 프로토콜 정의 화학적 조건에서 미래의 질병 모델링에 응용 프로그램에는 고 정형 외과에서 세포 기반 요법입니다.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기에서는 인간 유도 만능 줄기 세포를 기능적 전뇌 특이적 성상세포로 분화시키는 것을 용이하게 하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 취약 X 증후군(Fragile X Syndrome)과 같은 신경 발달 장애의 발병기전에서 신경교세포의 역할에 대한 조사와 다른 뇌 질환의 모델링을 수행할 수 있습니다.

Fragile X Messenger Ribonucleoprotein이 결핍된 인간 유도 만능 줄기세포 유래 성상세포의 생성 및 특성화

배우세요 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs를 소규모로 전파하여 면역 세포 화학 특성화를 수행하는 방법을. 이 기술은 시간과 비용을 절감하면서 다능성 항원 검출에 적합한 기질에서 줄기세포를 효율적으로 배양할 수 있게 합니다.

일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파

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