Name: 대상 현장에서 돌연변이 유발 히스톤의 유전자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 히스톤 유전자의 특정 돌연변이를 내인성 염색체 위치에서 생성하는 방법을. 이 기법은 크로마틴 관련 과정에서 특정 히스톤 잔기의 역할을 연구하는 데 도움이 됩니다.

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이 원고를 준비하는 동안 도움이 된 의견을 제시해 준 Reine Protacio에게 감사드립니다. 기금 지원에 대해 National Science Foundation(보조금 번호 1243680 및 1613754)과 Hendrix College Odyssey Program에 감사를 표합니다.

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

반수체 S. cerevisiae의 세포에서 4 개의 핵심 히스톤 단백질의 각각에 대한 코드가 구체적으로 돌연변이 유발을위한 두 개의 유전자 중 하나를 타겟팅하려는 연구자에 대한 도전을 나타낼 수있는 두 개의 비 대립 유전자 사이의 서열 상 동성의 높은 수준. 이전에 종종 의존 상기 Delitto PERFETTO, 부위 - 특이 적 유전자 (SSG) 돌연변이 유발, 클로닝없이 PCR 기반 대립 유전자 교환 방법 5, 6, 7,뿐만 아니라 최근 효모 CRISPR 기반 기술 (15)을 포함하여, 효모 돌연변이 유발 방법을 설명 원하는 유전자 재조합 사이트 또는 수리 기계 모집 표적 유전자의 ORF 내의 서열에 적어도 부분적으로 결국 최종 돌연변이 대립 유전자를 생성한다. 한편, 우리는 여기서 ...

네 개의 핵심 히스톤 단백질 H2A, H2B, H3 및 H4는 진핵 세포 염색체의 압축, 조직 및 기능에 중심 역할을한다. 이러한 히스톤 각각 두 세트의 궁극적 뉴 클레오 (1)의 형성의 결과로, 히스톤 옥타 자체 주변 DNA의 ~ 147 염기쌍의 감쌈 지시 분자의 스풀을 형성한다. 뉴 클레오 솜은 염색체 전체 유전자 전사의 조절과 euchromatin의 형성 및 이질 같은 염색체 기반 프로세스의 다양한 활성 참가자이며, 같은 과거 수십 년에 걸쳐 집중적 연구의 초점이되어왔다. 이러한 메커니즘은 히스톤 잔류의 번역 후 변형, ATP 의존적 인 뉴 클레오 리모델링 및 ATP 독립적 인 뉴 클레오 재구성을 포함 - 메커니즘의 수는있는 뉴 클레오는 특정 프로세스의 실행을 용이하게 할 수있는 방법으로 조작 할 수있는 기술되어있다조립 / 해체 (2, 3). 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 진핵 생물에서 히스톤 함수의 이해에 특히 강력한 모델 생물이다. 이것은 주로 도메인 eukarya 걸쳐 히스톤 단백질의 진화 적 보전의 높은 유전 생화학 실험 다양 효모의 가공성에 기인 할 수있다 (4)에 접근한다. 효모 역방향 유전자 접근법 널리 염색질 생물학의 다양한 양상의 특정 히스톤 돌연변이의 효과를 연구하기 위해 사용되었다. 실험은 이러한 유형의 비정상적인 세포 (인해 세포에서 플라스미드의 수를 가변으로) 히스톤 단백질의 수준을 초래할 수 자율 플라스미드로부터 발현 같은 돌연변이 히스톤은 그 나라의 게놈 유전자좌로부터 발현 된 세포를 사용하는 것이 바람직하다 크로 엔의 수반 변경최종적으로 결과의 해석을 혼동 할 수 많은 환경. 여기서는 게놈 남은 외래 DNA 서열없이, 원하는 돌연변이 (들)의 발생에 클로닝 단계 및 결과를 필요로하지 않고 그 나라의 게놈 위치에서 히스톤 유전자 표적화 돌연변이 유발을 허용하는 PCR 계 기술을 설명한다. 이 기술은 효모에서 효율적인 상동 재조합 시스템을 활용하고 다른 그룹에 의해 개발 된 다른 유사한 기술과 공통점이 몇 가지 기능이있다 - 가장 특히 Delitto PERFETTO, 사이트 별 게놈 (SSG) 돌연변이 유발 및 복제없이 PCR 기반의 대립 유전자를 대체 방법 5, 6, 7. 그러나,이 설명 된 기술은 특히 히스톤 유전자의 돌연변이 유발에 적합하게 한 측면을 갖는다. 반수체 효모 세포에서, 네 개의 코어 히스톤의 각각은 두 개의 비 a로 인코딩llelic 높은 상 동성 유전자는 예를 들어, 히스톤 H3가 HHT1 HHT2 및 유전자에 의해 암호화되고,이 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF를는) 시퀀스의 90 % 이상 동일하다. 상 동성이 높은 수준은 구체적으로 돌연변이 유발을위한 두 개의 히스톤를 코딩하는 유전자 중 하나를 목표로 설계된 실험을 복잡하게 할 수 있습니다. 상기 방법들은 상동 재조합을 유도하는 표적 유전자의 ORF 내의 적어도 몇몇 시퀀스의 사용을 필요로하는 반면, 우리는 여기서 설명하는 기술에 대한 (더 적은 서열 상 동성을 공유하는) 히스톤 유전자의 ORF를 플 랭킹 서열을 이용한다 재결합 단계, 따라서 원하는 궤적에 돌연변이를 성공적으로 표적의 가능성을 증가시킨다. 또한, 재조합 드라이브 상동 지역이 더 효율적 대상 상동 재조합에 기여하고, 매우 광범위 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA 사다리 (DNA 표준)</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 믹스(각 10mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 용액(0.5M, pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(200프루프)</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨염 이수화물(EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트 이수화물</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)</td><td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS DNA 중합효소(고충실도 DNA 중합효소)&nbsp; 및 5x 버퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>연어 정액 DNA 용액</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 7-9 (Tris base, 분말 형태)</td><td>Sigma</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 삼수화물</td><td>Sigma</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supra Sieve GPG Agarose (저온 아가로스)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taq 중합효소 및 10x 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>이쑤시개</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>A-D(+)-효</td><td>모 매체용</td>포도당 <td>Fisher Scientific</td><td>AC170080025</td></tr><tr><td>한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>효모 매체</td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-2</td><td>YPD 매체</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>YPD 매체</td></tr><tr><td>4-아미노벤조산</td><td>Sigma</td><td>A9878-100G</td>는 <td>완전한 최소 드롭아웃 매체를 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한</td> <td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A8626-100G</td>&nbsp;</tr><tr><td>완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한</td> <td>글리신 하이드로클로라이드</td><td>Sigma</td><td>G2879-100G</td>;</tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Sigma</td><td>A7627-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-아르기닌 모노하이드로클로라이드</td><td>시그마</td><td>A5131-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asparagine monohydrate</td><td>Sigma</td><td>A8381-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-아스파르트산 나트륨 소금 일수화물</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-글루타민산 하이드로클로라이드</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G3126-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Histidine monohydrochloride monohydrate</td><td>Sigma</td><td>H8125-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-이소류신</td><td>시그마</td><td>I2752-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Lysine monohydrochloride</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다.</td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>시그마</td><td>M9625-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Sigma</td><td>P2126-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-트립토판</td><td>시그마</td><td>T0254-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T3754-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 제품입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한&nbsp;</td></tr><tr><td>암모늄 황산염</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>은 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한</td> <td>효모 질소 기반</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-07-3</td>;</tr><tr><td>5-플루오로로틱산 (5-FOA)</td><td>AmericanBio</td><td>AB04067-00005</td><td>for&nbsp; 5-FOA 매체</td></tr></tbody></table>

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

우리는 발아 효모 세포의 히스톤 유전자에서 표적 돌연변이를 생성하기 위한 PCR 및 상동 재조합 기반 시스템을 설명합니다. 그 결과로 생성된 돌연변이 대립유전자는 내인성 유전체 부위에 존재하며 절차 후 게놈에 외인성 DNA 염기서열이 남지 않습니다. 반수체 효모 세포에서 4개의 핵심 히스톤 단백질 각각은 고도의 상동 개방 판독 프레임(ORF)을 가진 2개의 비대립형질 유전자에 의해 암호화되기 때문에 특정 히스톤 단백질을 암호화하는 두 유전자 중 하나를 특이적으로 표적으로 하는 돌연변이 유발은 문제가 될 수 있습니다. 여기에서 설명하는 전략은 상동 재조합 단계를 위해 표적 유전자의 ORF 내부가 아닌 외부에서 염기서열을 활용함으로써 이 문제를 우회합니다. 이 시스템의 또 다른 특징은 상동 재조합 단계를 주도하는 DNA의 영역이 매우 광범위해질 수 있으므로 성공적인 통합 이벤트의 가능성을 높일 수 있다는 것입니다. 이러한 특징으로 인해 이 전략은 히스톤 유전자 돌연변이 유발에 특히 적합하지만 효모 게놈에 있는 다른 유전자의 돌연변이 유발에도 적용할 수 있습니다.

우리는 시츄 돌연변이 전략 표적의 대표 예로서 글루탐산 (돌연변이 H3-R53E)에 아르기닌에서 위치 53에서의 치환을 보유하는 히스톤 H3 돌연변이 단백질을 표현한 hht2 대립 형질의 발생을 설명한다. 우리 HHT2 전체 ORF가 URA3 유전자 (프로토콜의 단계 1 참고)로 대체 된 균주를 생성. 이 균주 yAAD156 또한 세포가 히스티딘 영양 요 구성 될시키는 his3Δ200 대립 유전자를 항구. 프로토콜의 단계 2에 나타난 절차에 따라, 우리는 다음 HHT2 두 부분 오버랩하는 단편을 생성. 다음의 프라이머가 제 단편을 사용 하였다 : 정방향 프라이머 (OAD20) : 5 &#39;GCGTTCATTATCGCCCAATGTG ...

Saccharomyces cerevisiae의 내인성 위치에서 히스톤 유전자의 돌연변이를 생성하는 전략이 제시됩니다.

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

본 절차의 전체적인 목표는 출아 효모 세포의 내인성 염색체 위치에서 히스톤 유전자에 특정 돌연변이를 생성하는 것입니다. 이 방법은 DNA 전사와 같은 크로마틴을 기질로 사용하는 다양한 과정에서 특정 히스톤 잔기가 기여하는 바를 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효모에서 각 히스톤 단백질이 상동성이 매우 높은 두 개의 비대립 유전자에 의해 인코딩됨에도 불구하고, 특정 히스톤 유전자를 표적으로 하여 돌연변이 유발을 수행할 수 있다는 점입니다.표적 히스톤 유전자가 녹아웃되고 URA3로 대체된 효모 균주를 생성한 후, 유전자의 전반부를 위해 다음 반응을 설정하여 표적 히스톤 유전자의 부분적으로 중첩되는 두 단편에 대한 PCR 생성물을 만듭니다. 유전자의 후반부의 경우, 서로 다른 프라이머를 사용하여 유사한 PCR 반응을 설정합니다. 반응물을 써모사이클러에 넣고 다음과 같이 프로그램을 설정합니다.TBE 버퍼 내의 0.9% 저융점 아가로스 겔에서 PCR 반응액 20~50 µL를 전기영동합니다. 그 다음, 깨끗한 면도날을 사용하여 겔에서 PCR 산물을 절단하고, 각 조각을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 아가로스 조각은 사용 전까지 20 °C에서 보관합니다.전장 PCR 산물을 생성하기 위한 PCR 반응용 템플릿 DNA를 준비하려면, 가열 블록에서 아가로스 섹션을 65 °C로 5분 동안 녹입니다. 이때 1~2분마다 튜브를 볼텍싱하여 잘 녹도록 돕습니다. 각 샘플에서 일정량의 녹은 아가로스를 하나의 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 볼텍싱하여 혼합합니다.이를 fusion PCR의 템플릿으로 사용하며, 사용 전까지 20 °C에서 보관하십시오. 대량의 전체 크기 PCR 산물을 증폭하려면, 각각 다음의 시약을 포함하는 6개의 PCR 반응을 설정하십시오. 튜브를 thermocycler에 넣고 다음 설정으로 반응을 진행하십시오.침전법을 통해 PCR 산물을 농축한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 백본 플라스미드와 공동 형질전환(cotransformation)하는 데 사용하십시오. PCR 산물 통합의 결과로 URA3 유전자가 소실되었는지 확인하기 위해, 플레이트 뚜껑을 열고 콜로니가 포함된 플레이트를 멸균된 벨벳에 눌러 플레이트 1에서 20까지의 세포를 복제 플레이팅(replica plate)하십시오. 벨벳에 묻은 세포를 5-FOA 플레이트로 옮기기 위해 플레이트를 벨벳 위에 누르십시오.플레이트를 30°C에서 2일 동안 배양

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유전학

효모의 유전자 연구는 세포의 DNA 대사에 인간 유전자의 분자 및 세포 기능을 조사하기 위해 고용 수 있습니다. 방법은 인간의 유전 특성에 대해...

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

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HO - Endonuclease의 형성의 Quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 Translocations을 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

출처: Bennett, S. A., et al., 효모 신경퇴행성 단백질병증 모델에서 히스톤 번역 후 변형 특성화. J. Vis. 특급 (2019). 이 비디오는 신경퇴행성 단백질을 과발현하는 효모 세포의 히스톤 변형을 평가하는 절차를 보여줍니다. 이 단계에는 세포 용해, 원심분리, 전기영동, 멤브레인 전달 및 변형된 히스톤의 항체 기반 검출이 포함됩니다.

Neurodegenerative Protein Overexpression을 이용한 효모 세포의 히스톤 변형 검출(Detecting Histone Modifications in Yeast Cells with Neurodegenerative Protein Overexpression)

유전자 인코딩 히스톤 - miniSOG는 푸른 빛 의존적으로 게놈 전체의 유전 변이를 유도한다. 이 돌연변이 유발 방법은 빠르고 간단 독성 화학 물질의 자유, 앞으로 유전자 검사 및 유전자 통합에 적합합니다.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

여기, 우리는 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에서 수정 된 히스톤의 염색 질 immunoprecipitation에 대 한 프로토콜을 설명합니다. Immunoprecipitated DNA가 풍부 하 고 지역화의 게놈을 통해 히스톤 포스트 번역 상 수정 양이 많은 PCR 이후에 사용 됩니다.

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

Ribonucleotides는 가장 풍부한 비정규 뉴클레오티드 핵 핵 DNA 복제 중 게놈으로 통합 중 이다. 제대로 제거, DNA 손상과 mutagenesis ribonucleotides 발생할 수 있습니다. 여기, 우리가 DNA와 그 변이 원 성 영향으로 ribonucleotide 설립의 풍부를 평가 하는 데 사용 되는 두 가지 실험 방법을 제시.

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

여기에 제시된 효모 Saccharomyces 세레비시아에 종족을 건설하고 악용하는 네 가지 프로토콜은 인간 P53 의 일시 활성화 잠재력, 다양한 암 관련 돌연변이의 영향, 공동 발현 된 상호 작용 단백질, 및 특정 작은 분자의 효과.

인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

선물이 분열에 간단한 억압 화면 프로토콜 효 모. 이 방법은 효율적, 돌연 무료이 고 단일 게놈 소재 시에 자주 발생 하는 돌연변이 대 한 선택적입니다.  프로토콜은 진압 완화 돌연변이 또는 약물에 의해 발생 하는 액체 문화에서 성장 결함 격리 적합 합니다.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 히스톤 유전자의 특정 돌연변이를 내인성 염색체 위치에서 생성하는 방법을. 이 기법은 크로마틴 관련 과정에서 특정 히스톤 잔기의 역할을 연구하는 데 도움이 됩니다.

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