Name: 능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포 + 췌장 전구 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 인간 다능성 줄기세포를 4단계 분화 프로토콜을 통해 NKX6-1 양성 췌장 전구세포로 효율적으로 분화시키는 방법을. 이 기술은 당뇨병 치료 및 질병 모델링 연구에 활용됩니다.

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이 원고는 토론토 일반과 서양 재단과 밴팅 &amp; 베스트 당뇨병 센터 - 대학 건강 네트워크 대학원 수상에서 자금에 의해 지원되었다.

솔루션 및 미디어 1. 준비 주 : 무균 환경에서 세포 배양에 대한 모든 미디어를 준비합니다. 미디어 만든 즉시 사용할 수 있습니다. 시약 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다. <ol><li> 차별화 미디어 <ol><li> 1 % 글루타민, 2 μM CHIR 99021, (100) NG / ㎖ 티빈 A, 104 M MTG와 RPMI 매체 : 일 0 차별화 미디어를 준비합니다. </li><li> 1 % 글루타민, 100 NG / ㎖ 티빈 A, 104 M MTG, 5 NG / ㎖의 bFGF, 50 μg의 / ㎖ 아스 코르 산으로 RPMI 매체 : 하루 1-2 차별화 미디어를 준비합니다. </li><li> 1 % 글루타민, 1 % B27, 104 M MTG, 0.75 μM Dorsomorphin, 50 NG / ㎖ FGF10로 RPMI 매체 : 하루 3-5 차별화 미디어를 준비합니다. </li><li> 하루 6 ~ 7 차별화 미디어를 준비 : DMEM을 1 % 글루타민, 1 % B27, 50 μg의 / ㎖ 아스 코르 산, 50 NG / ㎖ FGF10, 0.25 μM의 SANT-1, 2 μM 레티노 산, 50 NG / ㎖ 소량으로. 참고 : 레티노산성 마지막 배지에 첨가되어야하며, 용지가 산화 분해 (15)을 방지하기 위해 빛으로부터 보호되어야한다. </li><li> 일 8-12 차별화 미디어를 준비 : DMEM을 1 % 글루타민, 1 % B27, 50 μg의 / ㎖ 아스 코르 산, 50 NG / ㎖ 소량, 100 NG / ㎖ hEGF, 10 mM의 니코틴 아미드와 함께. </li></ol></li><li> PBS에서 10 % FBS, 마이너스 칼슘과 마그네슘 : FACS 버퍼를 준비합니다. </li></ol> 2. HESC 차별화 참고 : HESC는 해동 계대과의 bFGF (16) 보충 KOSR 기반 미디어의 존재에 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포에 확장됩니다. 세포가 80-95%의 포화 상태에 도달했을 때 hESCs는 차별화를위한 준비가되어 있습니다. 이 때 식민지 정의 테두리와 &#39;domelike&#39;구조 (그림 1A)와 커야합니다. 모든 세포 배양 평면 바닥 0.1 % 젤라틴으로 코팅 된 조직 배양 처리 된 플레이트에서 수행된다. 일반적으로, 세포 (6)에서 재배되거나각각 2 ml의 또는 1 ㎖의의 매체 볼륨의 12 웰 플레이트. <ol><li> 0 일에서 일 0 차별화 미디어로 KOSR 기반 미디어를 대체하여 차별화를 시작합니다. </li><li> 일 1과 2에서 부드럽게 흡입하기 전에 단일 층에서 죽은 세포를 제거하기 위해 판을 흔들어. 주 1 ~ 2 차별화 미디어로 교체하십시오. </li><li> 3 일에, 유동 세포 계측법을위한 수확 세포. 세포가 90 % 이상 CXCR4 + / CD117 + 표현하면 2.4 단계로 진행합니다. </li><li> 일 3, 5, 부드럽게 이전에 흡입에 단일 층에서 죽은 세포를 제거하기 위해 판을 흔들어. 하루 3-5 차별화 미디어로 교체하십시오. </li><li> 일 6, 7 일, 하루 6 ~ 7 차별화 미디어로 교체합니다. </li><li> 일 8, 10 및 12에서 하루 8-12 차별화 미디어로 교체합니다. </li><li> 날 13 일, 흐름에 대한 수확 세포는 세포 계측법 PDX1과 NKX6-1 식을 결정합니다. </li></ol> 유동 세포 계측법 분석 3. 수확 세포 <ol><li> 와 세포를 떼어 놓다제조 업체의 프로토콜과 3 분 동안 37 ° C에서 부화에 따라 1 배 상업 트립신 솔루션입니다. </li><li> 30 μL의 DNase의의 I. 1,000 μL FACS 버퍼에 단일 세포를 상용 트립신 용액을 제거하고 재현 탁 </li><li> 미세 원심 분리 관에 35 ㎛의 나일론 메쉬 셀 스트레이너 및 전달을 이용하여 필터 셀. </li><li> 5 분 455 XG에 원심 분리기 세포. 어느 라이브 또는 고정 염색 세포를 준비합니다. </li></ol> 유동 세포 계측법 4. 염색 <ol><li> 3 일에 라이브 염색에 대비 흐름 <ol><li> 1000 μL FACS 버퍼에 재현 탁 세포. 전송 200 μL (모두 흠 염색 샘플) 96- 웰 플레이트의 웰에 두 개 (약 1-3 × 105 세포). </li><li> 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> APC 및 CD117 : 차 복합 항체, CXCR4으로 얼룩 PE는 3 (M의 aterials 표 참조)실온에서 0 분 빛으로부터 보호. </li><li> 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 100 μL FACS 버퍼에 재현 탁 샘플. </li><li> 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 1 ml의 마이크로 테스트 튜브 또는 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브 300-500 μL FACS 완충액에서 총 부피 각각의 샘플 및 전송을 재현 탁. </li><li> (17) 흐름 cytometer에서 실행 샘플. 샘플을 즉시 실행할 수없는 경우, 4 ℃에서 보관 빛으로부터 보호. </li></ol></li><li> 하루 (13)에 고정 염색에 대비 흐름 <ol><li> 4 ℃에서 24 시간 동안 상업 고정 / permeabilization 솔루션에서 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 5 분 동안 455 XG에서 샘플을 원심 분리기. 400 μL 파마 / 세척 용액을 Resuspend. </li><li> (TW)에 샘플 (약 0.5 × 10 6 세포)의 200 μl를 전송(IgG의 제어 및 PDX1 / NKX6-1 염색 용) 96 웰 플레이트의 O를하는 것은 우물. 2 분 동안 931 XG에 원심 분리기. </li><li> 안티 PDX1 및 안티 NKX6-1 차 또는 이소 제어 항체를 포함하는 100 ㎕의 파마 / 세척 용액의 세포 펠렛을 재현 탁 (재료 표 참조). 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다. 100 μL 파마 / 세척 용액을 Resuspend 샘플. </li><li> 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 동안 이차 항체를 포함하는 100 μL 파마 / 워시 샘플을 재현 탁. </li><li> 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 100 μL 파마 / 세척 용액에 재현 탁 샘플. </li><li> 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 대표단계 4.2.9 및 4.2.10을 먹는다. </li><li> 1 ml의 마이크로 테스트 튜브 또는 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브 300-500 μL FACS 완충액에서 총 부피 각각의 샘플 및 전송을 재현 탁. </li><li> (17) 흐름 cytometer에서 실행 샘플. 샘플을 즉시 실행할 수없는 경우, 4 ℃에서 보관 빛으로부터 보호. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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성공적으로 시험 관내에서 hPSCs에서 NKX6-1 + 췌장 전구 세포를 생성하는 췌장 개발 과정에서 중요한 발달 단계를 관리하는 특정 신호 전달 경로의 정확한 규정을 포함 hPSCs의 높은 품질의 문화와 감독 분화의 사용에 의존한다. 이전에 다음과 같은 고려가 이루어져야 NKX6-1 효율적인 생성을 위해, 3이 나타내는 바와 같이 프로토콜 hPSC 라인의 다양한 걸쳐 NKX6-1의 강력한 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있지만. 모든 세포 배양 및 미디어 제제 오염을 방지하기 위해 살균 환경에서 수행되는 것이 중요하다. hESC의 식민지가 적절한 포화 상태에 도달 전에 분화 일 0을 시작으로 분화하기 시작하지 않은 것이 중요합니다. 최종 내배엽과 절차 개발의 비효율적 인 유도 될 수 있습니다 최적이 아닌 hESCs는와 차별화 시작알 단계. 최종 내배엽의 효율적인 도입을 위해 유동 세포 계측법에 의해 3 일째에 세포를 분석하는 중요한 이유이다. 이중...

당뇨병의 유병률은 증가하고 캐나다 당뇨병 협회에 따르면, 제 1 형 당뇨병 (T1D) 1을 가진이 개인의 5 ~ 10 %로, 캐나다에서 만 11 이상의 개인이 당뇨병 또는 당뇨병 진단 전의 것으로 추정된다. T1D는 랑게르한스섬 내에 위치 인슐린 생성 β 세포의 파괴에 의해 야기 된자가 면역 질환이다. 현재 T1D 함께 사는 사람들은 인슐린이의 외인성 소스를 필요로한다. 인슐린 치료에서의 진보에도 불구하고, T1D 환자는 혈당 수치를 조절하는데 어려움이 있고 하이포 고혈당 모두 고생 계속합니다. 치료의 유망한 형태는 T1D에서 정상 혈당이 생체 내 및 시험 관내 3 모두 β 세포의 인슐린 생산의 무제한 공급을 생성하는데 사용될 수있는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)의 사용이다 복원 <s클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 4, 5, 6, 7까지. hESCs는 차별화하는 β-같이하는 세포는 가능한 제 2 형 당뇨병에 대한 새로운 치료 표적의 식별을 허용, 시험 관내에서 당뇨병을 연구하고 T1D 환자에 이식 세포를 제공하기 위해 만들 수 있습니다. 체외에서 hESCs는에서 인슐린 생산 세포를 생성에서 가장 성공적인 시도는 췌장 개발 4, 5시에 발생하는 배아 이벤트를 요점을 되풀이하는 것입니다. 이것은 정확하게 현상 췌장의 주요 단계를 모델링 별개의 신호 경로의 조작을 포함한다. 췌장 개발은 CXCR4 및 CD117 (C-KIT) 8, 9의 발현을 특징으로 최종 내배엽의 유도로 시작합니다. definit의 정확한 조절필자 내배엽 조직은 다음 전방 - - 후방 및 복부 - 등의 패턴 거쳐 창자 관의 형성이 필요합니다. 지느러미와 복부 췌장 싹이 췌장 개발 (10)에 필요한 췌장과 십이지장 호 메오 박스 유전자 (Pdx1)를 표현하는 후방 foregut의 영역에서 등장. 지느러미와 복부 싹 퓨즈는 광범위한 상피 리모델링 및 확장 (11)를 거쳐 췌장을 형성한다. 내분비 및 외분비 혈통에 의지가 표현하는 다 능성 전구 세포 (MPC와)의 생성을 동반, 다른 사람의 사이에서, 전사는 Pdx1, Nkx6.1 및 Ptf1a 12, 13 요인. 내분비 및 유관 세포가 될 것이다 MPC와는 Ptf1a 식을 줄이면서 Nkx6-1을 표현하는 것을 계속한다. 이에 대하여, 외분비 혈통 세포는 expressio 잃게됩니다Nkx6-1의 n 및 Ptf1a 식 (12)을 유지한다. 전사 인자 Nkx6-1 특히 세포와 β 내분비 전구 세포의 분화 과정, 췌장 발달에 중요한 역할을한다. 이전 췌장 개발 14 중 β 세포 장애가 형성 Nkx6-1 결과, 결실 한 바와 같이. 따라서, 생체 외 및 생체 내 인슐린 생성 β 세포를 발생시키는 Nkx6-1의 효율적인 도입을 필요로한다. 우리는 최근에 효율적으로 hPSCs에서 PDX1 + / NKX6-1 + 췌장 전구 세포를 생성 할 수있는 프로토콜을 개발했다. 이 hPSC 파생 췌장 전구 세포는 면역 결핍 마우스 3에 이식에 따라 성숙 β 세포를 생성합니다. 1) 최종 내배엽 유도 : 분화 프로토콜 4로 분할 될 수 특징 스테이지2) 후방 foregut 패터닝, 3) 췌장 사양 및 4) NKX6-1 유도. 여기서 우리는 분화 방향의 각 단계에 대한 상세한 설명을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Media 및 cytokines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& 재질 보기 D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 완충액</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash 완충액, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>토크리스</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>도르소모르핀</td><td>시그마</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R & 돼지</td> 껍질에서 추출한 D <td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>25030</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 매체 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), 페놀 레드</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antibodies for flow cytometry (working dilutions)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp; 생명과학</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티-마우스 IgG (H+L), Alexa Fluor 647 접합체 (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티-염소 IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp;</td><td>잭슨 면역 연구소 Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>이소타입 제어 마우스 IgG&nbsp;</td><td>잭슨 면역 연구소 Inc.&nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>동형 제어 염소 IgG</td><td>R & 디&nbsp; &nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2,000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& 디</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

능성의 효율적인 분화 nkx6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

다 능성 줄기 세포는 자기를 갱신하고의 연구 및 미래 당뇨병 치료에 사용될 수있는 췌장 선조 세포의 생성을위한 매력적인 소스 만드는 다중 계통으로 분화하는 능력을 가지고있다. 이 문서에서는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)에서 췌장 전구 세포를 생성하도록 설계된 4 단계의 분화 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC) 라인의 수에 적용 할 수있다. 췌장 전구 세포를 생성하기 위해 취해진 방식은 정확하게 췌장 개발의 주요 단계를 모델링 hESCs는 구별한다. 이것은 티빈 A, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF에) 및 CHIR990210의 존재 하에서 세포를 배양함으로써 달성되는 최종 내배엽의 유도와 함께 시작된다. 섬유 아세포 성장 인자 10 (FGF10) 및 Dorsomorphin와 또한 차별화 및 패터닝 후방 foregut를 닮은 세포를 생성합니다. 레틴의 추가OIC 산, 소량는 SANT-1과 FGF10은 췌장 내배엽의 특성 세포로 후방 foregut 세포를 구별합니다. 마지막으로, 표피 성장 인자 (EGF)의 조합은, 니코틴 및 소량은 PDX1 + / NKX6-1 + 세포의 효율적인 생성을 이끈다. 유동 세포 계측법 췌장 개발의 주요 단계에서 특이 마커의 발현을 확인하기 위해 수행된다. 스테이지 (4)의 끝에 PDX1 + / + 췌장 선조 NKX6-1은 면역 결핍 마우스에 이식시 성숙한 β 세포를 발생시킬 수 있으며 상기 체외 인슐린 생성 세포를 생성하기 위해 구별된다. 따라서, PDX1의 효율적인 생성 + / NKX6-1 + 췌장 전구 세포,이 프로토콜에서 입증 된 바와 같이,이 시험 관내에서 인간의 췌장 개발을 연구하기위한 플랫폼을 제공하기 때문에 매우 중요하고 분화 잠재력 세포의 공급원을 제공한다 EV 수 β 세포entually 당뇨병 치료에 이용 될 수있다.

도 1a에 개략적으로 도시 된 바와 같이, 췌장 전구 세포의 효율적 생성, 분화 프로토콜 중 특정 신호 분자의 정확한 첨가하여 미분화 된 세포의 적절한 성장 및 유지에 의존한다. 0 일에서 미분화 세포 80-95% 합류를해야하며, 식민지 정의 가장자리 (그림 1A)를 가져야한다. 세포 사멸이 단계에서 매우 일반적이기 때문에 1 단계 동안, 미디어 가능성이 흐린 표시됩니다. 1 단계 말까지, 세포 비율 90 % 이상 (그림 1B)에서 최종 내배엽 마커, CXCR4 및 CD117를 공동으로 표현한다. 셀이 4 단에 걸쳐 분화 프로토콜로서, 가늘고 긴 타원 형상의 외관 형태 학적 변화는 (단계 1에서 관측 2)보다 작고 둥근 세포 (스테이지 3에서 볼 등 4) ( <st룽&g...

여기에서는 시험 관내 NKX6-1 + 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 다능성 줄기세포를 췌장 발달의 4가지 주요 단계를 통해 분화시킴으로써 NKX6.1을 발현하는 췌장 전구세포를 체외에서 효율적으로 생성하는 것입니다. 인간 다능성 줄기세포를 췌장 발달의 4가지 주요 단계를 거쳐 분화시킴으로써, 본 프로토콜은 인간 췌장 발달을 체외에서 연구할 수 있는 모델을 제공합니다. 기존 프로토콜과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 다양한 인간 다능성 줄기세포주를 사용하여 높은 비율의 NKX6.1 양성 췌장 전구세포를 생성할 수 있다는 점입니다.췌장 전구세포가 인슐린을 생성하는 베타 유사 세포를 생성할 가능성이 있다는 점을 고려할 때, 이 기술은 당뇨병 치료, 약물 발견 및 질병 모델링을 위한 세포를 개발할 기회를 제공할 것입니다. 0일 차에 KnockOut 혈청 대체 배지를 0일 차 분화 배지로 교체하여 분화를 시작하십시오. 이후 1일 차와 2일 차에는 배지를 흡입하기 전에 플레이트를 부드럽게 흔들어 단일층에서 죽은 세포를 제거하십시오.그 후, 이를 1~2일 차 분화 배지로 교체하십시오. 3일 차에 유세포 분석을 위해 세포를 수확합니다. 세포의 CXCR4 및 CD117 발현율이 90% 이상이면 효율성에 도달한 것입니다.그 후, 흡입 전 단층 배양물에서 죽은 세포를 제거하기 위해 플레이트를 부드럽게 흔들어 주고, 이를 3~5일차 분화 배지로 교체합니다. 유세포 분석을 통해 3일차까지 확정 내배엽(definitive endoderm)이 효율적으로 유도되었는지 확인하는 것이 중요합니다. CXCR4와 CD117을 모두 발현하는 세포의 비율이 90%보다 낮으면, 췌장 전구세포로의 분화가 저해될 가능성이 큽니다.6일째와 7일째에는 배지를 6~7일차 분화 배지로 교체합니다. 8일, 10일 및 12일째에는 배지를 8~12일차 분화 배지로 교체합니다. 이후 13일째에 PDX1 및 NKX6.1 발현을 측정하기 위해 유세포 분석용 세포를 수확합니다.유세포 분석을 위해 세포를 수확하려면, 제조사의 프로토콜에 따라 상용 Trypsin 용액으로 세포를 분리하고 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 3분 후, Trypsin 용액을 제거하고 30 µL의 DNA One이 포함된 1,000 µL의 fax buffer에 단일 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 35 µm 나일론 메시 세포 여과기를 사용하여 세포를 여과하고 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.생세포 또는 고정 세포 염색을 준비하기 전, 세포를 455 ×g에서 5분 동안 원심 분리하십시오. 이제 세포를 1,000 µL의 fax buffer에 다시 현탁하십시오. 비염색 및 염색 시료 모두를 위해 200 µL를 96-well plate의 두 웰에 각각 옮기십시오.그 후, 플레이트를 931 ×g에서 2분간 원심분리하고, 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거합니다. 최종 부피 100 µL의 1차 접합 항체로 세포를 염색하며, 실온에서 30분 동안 빛이 차단된 상태로 유지합니다. 이어서, 플레이트를 931 ×g에서 2분간 원심분리한 후, 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거합니다. 그 다음, 샘플을 100 µL의 fax buffer에 재부유시킵니다.그 다음 플레이트를 931 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거합니다. 이어서 샘플을 300~500 µL의 fax buffer에 재현탁하고, 이를 1 mL 마이크로 테스트 튜브 또는 5 mL 라운드 바텀 튜브로 옮긴 후 유세포 분석기로 샘플을 분석합니다.샘플을 즉시 분석할 수 없는 경우, 4°C에서 빛이 차단된 상태로 보관하십시오. 본 절차에서는 세포 펠릿을 상용 고정 및 투과화 용액에 재현탁하여 4°C에서 24시간 동안 처리합니다. 24시간 후, 샘플을 455 ×g에서 5분 동안 원심분리한 다음, 400 µL의 상용 펌워시(perm wash) 용액에 재현탁하십시오.다음으로, 96-웰 플레이트의 두 웰에 IgG 대조군 및 PDX1, NKX6.1 염색을 위해 샘플 200 µL씩 옮기고, 플레이트를 931 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 그 다음, anti-PDX1 및 anti-NKX61 1차 항체 또는 동형 대조군 항체가 포함된 100 µL의 상용 perm wash 용액에 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. 이를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 플레이트를 931 ×g에서 2분 동안 원심분리하고, 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거한 후 100 µL의 상용 perm wash solution으로 샘플을 재현탁합니다. 그다음, 플레이트를 931 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거합니다.그 다음, 2차 항체가 포함된 perm wash solution 100 µL에 시료를 재현탁하고 실온에서 1시간 동안 빛이 차단된 상태로 유지합니다. 1시간 후, 플레이트를 931 ×g에서 2분 동안 원심분리한 다음, 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거합니다. 이어서, 시료를 상용 perm wash solution 100 µL에 재현탁하고, 플레이트를 931 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후, 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거합니다. 그 다음, 시료를 상용 perm wash solution 100 µL에 다시 재현탁하고, 플레이트를 931 ×g에서 2분 동안 다시 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.다음으로, 샘플을 300에서 500 µL의 fax 버퍼에 다시 현탁하고, 유세포 분석을 위해 각각의 1 mL 시험관 또는 5 mL 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다. 여기 보시는 것은 인간 배아 줄기세포로부터 췌장 전구세포를 유도하는 과정의 모식도로, 분화 일수, 발달 단계, 기본 배지와 각 단계에서 첨가된 사이토카인을 나타냅니다. 그리고 여기 췌장 분화의 주요 단계별 위상차 현미경 이미지들이 있습니다.H1 세포는 묘사된 4단계 분화 프로토콜에 따라 분화되었습니다. 0일차의 미분화 인간 배아줄기세포, 1단계의 definitive endoderm, 2단계의 posterior foregut, 3단계의 pancreatic endoderm, 그리고 4단계의 NKX6.1 양성 endoderm pancreatic progenitor가 이에 해당합니다. 이 그림은 CXCR4 PE 및 CD117 APC 항체 염색에 대한 3일차의 대표적 유세포 분석 도표를 보여줍니다.여기 염색되지 않은 시료가 있고, 여기 염색된 시료가 있습니다. 그리고 이 그림은 NKX61과 PDX1을 발현하는 4단계 유래 췌장 전구 세포의 13일 차 대표 유세포 분석 도표를 보여줍니다. 이것은 IgG 대조군이며, 이것은 염색된 시료입니다.숙련된 후에는 이 기술을 13일 만에 완료할 수 있습니다. 다만, 이는 사용하는 세포주에 따라 달라질 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 배치 간 가변성으로 인해 모든 시약을 테스트하는 것이 중요합니다.해당 절차를 마친 후, NKX6.1 양성 췌장 전구세포는 이미 발표된 다른 프로토콜을 사용하여 인슐린을 생성하는 베타 유사 세포로 추가 분화시킬 수 있습니다. 이는 인비트로(in vitro)에서 베타 세포의 성숙과 발달을 연구할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 이 영상을 시청함으로써, 세포를 발달의 4가지 주요 단계를 거치게 하여 인간 다능성 줄기세포를 췌장 전구세포로 효율적으로 분화시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 비형질전환 및 형질전환 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 신경전구세포의 생성을 보여줍니다. hPSC는 신경세포 분화 배지를 사용하여 신경전구세포로 분화됩니다. 분화는 작은 분자를 사용하여 비형질전환 세포에서 유도되는 반면, 형질전환 hPSC는 뉴런 분화 특이적 전사 인자를 위해 프로모터를 유도하는 항생제를 첨가하여 분화됩니다.

Non-Transgenic 및 Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells (비유전자 변형 및 형질전환 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화)

여기서는 하류 어플리케이션 및 상기 분화의 개선을위한 결정적인 내배엽으로 분화 노력하고 인간 배아 줄기 세포의 정제를위한 방법을 설명한다.

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

여기, 우리 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 로 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 차별화 하는 상세한 프로토콜을 제시 (PDX1+) 췌 장 계보의 세대에 대 한 셀의 비 식민지 유형 단층 성장에 따라 단일 세포를 해리 했다. 이 메서드는 생산 하는 동종 hPSC 파생 된 세포, 유전자 조작 및 심사에 적합 합니다.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.

피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

배우세요 인간 다능성 줄기세포를 4단계 분화 프로토콜을 통해 NKX6-1 양성 췌장 전구세포로 효율적으로 분화시키는 방법을. 이 기술은 당뇨병 치료 및 질병 모델링 연구에 활용됩니다.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포

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