Name: 세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 세포 내 염색 및 유동 세포 계측법을 사용하여 쥐 대동맥, 신장, 림프절에서 T 림프구 하위 집합을 식별하고 정량화하는 방법을. 이 기술은 고혈압 모델에서 심혈관 질환의 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 FL에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (16POST29950007), 건강 (NIH T32 HL069765) BLD, MA 살레에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (14POST20420025) 중 국립 연구소에서 훈련 보조금 및 NIH에 의해 지원되었다 K08 상 MSM에 (HL121671). MSM은 길르앗 과학, Inc.의 연구 보조금에 의해 지원됩니다

밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인했다. 마우스는 보관 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 마음에 든다고된다 (국립 아카데미를 누릅니다. 개정 2010). 쥐의 대동맥 배수 림프절, 신장 및 대동맥 1. 분리 <ol><li> CO 2 흡입하여 쥐를 안락사. 70 % 에탄올로 가슴 스프레이 조심스럽게 피부와 마음을 노출 가위로 가슴 벽을 엽니 다. </li><li> 혈관을 관류하기 우심방에 작은 절개를 수행하고 꾸준히 21 23 G 바늘을 사용하여 좌심실의 정점에 차가운 PBS (약 1 ㎖ / 초)의 적어도 10 ㎖를 주입. 모든 기관이 희게 될 때까지 관류. 핵심은 첫째 blanches. 간의 창백하면 관류 잘 수행되었음을 나타냅니다. </li><li> 작은 집게와 미세 가위를 사용하여, 부드럽게, 절단 및 창자를 꺼내위장, 비장, 췌장과 간 더 나은 대동맥을 시각화합니다. 참고 :이 단계는 오염을 유도 할 수 위장관 손상으로 매우 정확하게 수행해야합니다. </li><li> 잘라 가위 각각의 폐를 제거합니다. 무 바늘 주사기를 사용하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 흉강을 씻어. 멸균 거즈를 사용하여 여분의 혈액과 액체를 제거합니다. </li><li> 미세 해부 집게를 사용하여 복부 대동맥 림프절을 제거합니다. 캡슐을 파열하지 않도록합니다. 해부 포셉 각 림프절의 표면에 남아있는 지방을 제거합니다. 미세 가위로 두 개의 신장을 잘라. </li><li> 잘, 곡선 가위로 전체 대동맥 (흉부 및 복부 대동맥)을 해부하다. 마음의 수준에서 시작하고 조심스럽게 식도 및 대동맥에 부착 된 주변 혈관 주위 지방을 유지해야하고 장골 분기의 수준에 이르기까지 척추의 해부. 참고 : 대동맥의 추가 절개는 레모하기주변 구조 현미경 하에서 수행 될 수했습니다. 특히, 동맥 분기 (경동맥, 쇄골 하 동맥, 복강, 장간막, 신장 동맥)과 림프절을 제거합니다. 이 많은 염증 세포가 고혈압의 설정에있는 사이트이기 때문에 각 대동맥 주위 혈관 주위 지방의 일관된 층을 유지 마십시오. 차가운 PBS를 포함하는 별도의 튜브에서 각 조직을 놓습니다. </li></ol> 각 조직에서 단일 세포 현탁액의 2 세대 <ol><li> 신장 주 : 신장 기계적 해리 플러스 소화 효소를 결합하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 될 수있다. <ol><li> (5 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충) 1640 배지 (2 ㎎ / ㎖) 콜라게나 D를 첨가의 DNase I (100 μg의 / ㎖) RPMI에 의해 신장 분해 용액을 제조 하였다. 신장 샘플 당 10 ml의를 준비합니다. </li><li> 신장 다이제스트 10㎖를 함유하는 분리 튜브에 두 신장 전송 집게를 사용하여이온 용액. </li><li> 제조자의 지시에 따른 반자동 dissociator 장치를 이용하여 기계적 분리를 수행한다. </li><li> 기계적 해리 후에 장치로부터 튜브를 분리하여 효소 소화를 수행한다. 연속 회전에서 37 ºC에서 20 분 동안 샘플을 품어. 즉시 5 % FBS로 보충 차가운 RPMI 1640 배지를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다. </li><li> 40 μm의 여과기를 통해 여과 한 후 50 ML 원뿔 튜브에 피펫으로 솔루션을 전송합니다. 1 ML의 주사기의 플런저로 눌러 떨어져 나머지 조직을 애타게. 세포 (500 XG, 8 분, 4 ºC)를 펠렛. </li><li> 36 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 15 ML 원뿔 관에 정지를 전송합니다. 조심스럽게 중단없이 3 ml의 36 % 세포 현탁액을 72 % 아래 밀도 구배 원심 분리 배지 3 ㎖을 추가한다. 원심 분리기 (브레이크없이 1,000 XG, 20 분, 4 ° C). &lt;/ 리&gt; <li> 면역 세포는 인터페이스에 위치한다. 세포 파편을 포함하는 최상위 황색 층을 제거하고 차가운 PBS를 사용하여 15 ml의 볼륨을 불러옵니다. 고장 잘 구배를 흔들어. 셀 (300 XG, 8 분, 39 ° C)를 스핀 5 % FBS와 RPMI 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산. </li></ol></li><li> 대동맥 <ol><li> 콜라게나 제 A (1 ㎎ / ㎖), 콜라게나 제 B (1 mg / ㎖)을 첨가하여 대동맥 소화 용액을 조제하고,의 DNase I (100 μg의 / ㎖) RPMI로 (5 % FBS로 보충) 1640. </li><li> 미세 핀셋을 이용하여 대동맥 소화 용액 1 ㎖를 함유하는 2 ml의 튜브로 대동맥을 전송. 1 ml의 소화 용액 미세 가위로 아주 작은 조각으로 전체 대동맥을 말하다. 얼음에 보관하십시오. 연속 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 샘플을 품어. </li><li> 조직 배양 접시에 용액을 옮기고 enzyma 정지5 % FBS와 차가운 RPMI의 5 배 부피를 첨가하여 TIC 소화. </li><li> 40 μm의 여과기를 통해 여과 한 후 50 ML 원뿔 튜브에 피펫으로 솔루션을 전송합니다. 1 mL의 주사기 플런저로 눌러 단일 세포 현탁액으로 이격 나머지 조직 애타게. 여과기를 세척하고 세포 (300 XG, 8 분, 4 ºC)를 펠렛. </li><li> 5 % FBS RPMI에 10 ㎖를 첨가하여 침전물을 세척 하였다. 셀 (300 XG, 8 분, 39 ° C)를 스핀 5 % FBS와 RPMI 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산. </li></ol></li><li> 대동맥 림프절 <ol><li> 조직 배양 접시 (60mm X 15mm)에 40 μm의 여과기를 놓습니다. 스트레이너의 림프절을 놓고 1 ML의 주사기의 플런저로 눌러 단일 세포 현탁액에 떨어져 그들을 애타게. 5 % FBS와 RPMI 2 ㎖와 스트레이너를 플래시합니다. 접시에 세포를 수집합니다. </li><li> 이전15 ㎖의 팔콘 튜브에 세포 펠렛 세포 (300 XG, 8 분, 4 ° C). 5 % FBS와 RPMI 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인 탐지 3. 예 생체 자극 <ol><li> 5 % FBS, 비 필수 아미노산는 0.1mm, 50 μM의 β 머 캅토 에탄올 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 RPMI : 세포 배양액을 준비한다. </li><li> 원심 분리기 신장, 대동맥 림프절에서 얻은 각각의 세포 현탁액 (300 XG, 8 분, 4 ° C). 용액에 1 × 106 세포의 농도로 세포 배양 배지와 각 펠렛을 재현 탁. </li><li> 세포 배양의 각 1 ml를 위해 (포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA), 칼슘 이온 운반체에 이오 노마 이신을 함유하고, 골지체 억제제 Brefeldin A) 세포 활성화 칵테일 2 μl를 첨가하여 세포를 자극한다. 참고 : 최종 농도PMA의 81 nm의, PMA와 Brefeldin A. 치료 이오 노마 이신의 1.33 μM, 5 ㎍ / ㎖의 이오 노마 이신은 사이토 카인을 생산하는 세포를 활성화 : 각 구성 요소들입니다. 사이토킨 검출 할 수있는 세포에 포획해야 단백질이 분비된다. Brefeldin A는 소포체와 골지체 장치에서 정상적으로 분비되는 단백질의 축적을 야기한다. 따라서, 여기에 설명 된 기술은 유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인의 생산 림프구의 검출 가능성을 향상시킨다. </li><li> 12 잘 2 백만 세포 (대동맥 또는 신장) 또는 24 웰 (림프절) 낮은 부착 판에 판 1. 3 시간 동안 37 ° C 가습 CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. 주 : 도금 된 세포의 수는 대조군 마우스로부터의 림프절에서 낮아질 수있다. 또한, 자극 시간은 경험적 연구 각 세포 집단 및 사이토킨에 대해 결정되어야한다. 대동맥, 신장, 림프절로부터 분리 된 T 세포의 경우는 3 내지 4 시간 동안 자극하는 것을 권장합니다. 더 긴 자극 w병 사이토 카인 분비를 증가시키고, CD3, CD4 및 CD8과 같은 여러 가지 T 세포 표면 마커의 추가의 하향 조절을 유도하지 않습니다. (심지어 3 ~ 4 시간 자극이 마커의 일부 하향 조절을 유도 않습니다.) </li></ol> 4. 표면 얼룩 <ol><li> 폴리스티렌 FACS 튜브와 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C)에 세포를 전송합니다. (FACS 완충액으로 두번 (칼슘 및 마그네슘 +없는 PBS 4 % FBS 및 2mM의 EDTA를 함유) 세포를 세척하고, 원하는 항체 패널의 개수 및 필요한 제어 튜브의 수에 따라 서로 다른 FACS 튜브에 동등 세포 현탁액을 나누어 아래 참조). </li><li> 각 패널에 대한 보상을 수행하려면 각 조직 유형 및 항체 패널 흠 제어 튜브와 하나의 스테인드 튜브를 준비합니다. 또한, 모든 그러나 하나의 항체를 첨가하여 각각의 항체 패널 용 형광 마이너스 온 (FMO) 제어 튜브를 준비한다. </li><li> FACS 2 ml의 각 튜브의 볼륨을 조절완충기. 원심 분리기는 세포 현탁액 (300 XG, 8 분, 4 ° C), 얼음에 10 분 동안 만 셀 당 항 CD16 / CD32 항체 0.5 μg의와 세포를 배양하여 상층 액과 블록 된 Fc 수용체를 제거합니다. 참고 : CD16는 선호도가 낮은 IgG의 Fc 수용체 III FCR (III)이며, CD32는 FcRγ 쇄 II입니다. CD16 / CD32는 과립구, 비만 세포, 단핵구 / 대 식세포, 자연 살해 세포, B 세포, 수지상 세포 및 일부 활성화 성숙한 T 세포 상에 발현된다. </li><li> 생존 염색을 수행 1X PBS의 1,000 μL에 1X PBS, 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C) 및에 resuspend로 세포를 씻으십시오. 셀 - impermeant 아민 반응성 염료 (생존 얼룩) 1 μl를 추가합니다. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 15 분 동안 품어. </li><li> 배양하는 동안, FACS 버퍼의 적절한 볼륨 (표면 염색) 항체의 칵테일을 준비합니다. FACS 버퍼의 1-2 ㎖로 두 번 세포를 씻으, 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C) 100 ㎕를 각 펠렛을 재현 탁항체 혼합물. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분 동안 품어. 주 : 각 항체 유동 세포 계측법,이 도즈 적정 곡선을 수행함으로써 필요한 항체의 최적 량을 결정하는데 유용하다. </li><li> 세포 (300 XG, 8 분, 4 ° C)를 FACS 버퍼 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 펠렛. </li></ol> 5. 고정, Permeabilization 및 세포 내 염색 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 적절한 버퍼를 포함하는 고정 및 permeabilization 키트와 함께 세포 염색을 수행합니다. 수정 및 적절한 버퍼에이를 재현 탁하여 세포 Permeabilize 하시려면. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 40 분 동안 샘플을 품어. </li><li> 1 배의 permeabilization 1 ㎖를 추가하고 고정 투과성이 세포에 직접 버퍼 씻는다. 원심 분리기 (500 XG, 8 분, 4 ° C)과 뜨는을 제거합니다. 1X 세척 버퍼의 2 ㎖로 펠렛을 재현 탁. </li><li> antib의 혼합물을 준비1X 세척 버퍼 (튜브 당 보통 100 μL)의 적절한 볼륨 (세포 내 염색만을위한) odies. 주의 : 전술 한 바와 같이, 최적의 항체 농도는 패널의 각 항체에 대해 결정해야한다. 예를 들어, IL-17A 또는 IL-17F에 대한 항체, 우리 1:30의 희석 배수를 사용하지만, IFNγ와 T-내기에 대한 항체, 우리는 하나의 희석 배수 사용 : 100. </li><li> 원심 분리기 세포 (500 XG, 8 분, 4 ° C) 및 항체 혼합물 100 ㎕ 각 펠렛을 재현 탁. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 40 분 동안 품어. </li><li> 세포 (500 XG, 8 분, 4 ° C)를 1 배 세척 버퍼 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 펠렛. 1X 세척 완충액 300 μL에 펠렛을 재현 탁하고 적절한 필터를 유세포 분석. </li><li> 조직 샘플 당 세포의 총 수 정량을 위해 카운트 비드를 사용한다. 인수 이전에, 각각의 튜브에 구슬을 계산의 권장 볼륨 / 번호를 추가 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 보상, 게이팅, 정규화, 및 팁 <ol><li> 보상 및 게이팅 <ol><li> 보상을위한 실행 흠 단일 스테인드 제어 튜브 스펙트럼 중복에 대한 조정합니다. 주 : 보상 비드보다는 세포 보상 제어의 사용은 샘플에 대한 관심 또는 세포 집단의 항원 그 보상 어렵다 세포를 사용하여 낮은 수준으로 존재하는 경우에 필요하다. 탠덤 염료를 사용하는 경우 또한 노트의, 탠덤 염료가 많이-많은-과 매일 함께 다양하기 때문에 각 실험에 대한 보상을 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 새로운 여러 가지 빛깔의 실험을 시작할 때 형광을 뺀 패널의 모든 형광 하나의 컨트롤 (FMOs)를 실행합니다. 참고 : FMO 컨트롤 하나를 제외한 패널의 모든 항체를 포함하는 샘플입니다. 이러한 컨트롤에 제대로 adjus 생략 된 항체에 대한 부정적인 신호 대 양의 정확한 차별을 허용게이트에서 t. 이러한 제어는 발현이 표적 집단의 분리가 불량 할 때 또는 (예를 들면, 대상이 사이토 카인 또는 전사 인자이다) 낮을 때 특히 중요하다. 그들은 항원 특이성이없는 항체 이소 타입 및 형광 복합체에 대한 적절한 보상을 제공하기 때문에 FMO 컨트롤 항상 필요하지 않지만, 어떤 경우에는, 아이소 타입 컨트롤 곳에서 바람직 할 수있다. </li><li> 기본 게이트를 설정 : 백혈구 인구를 검출하기 위해 앞으로 분산 형 지역 (FSC-A) 및 사이드 분산 형 지역 (SSC-A) 전압을 조정합니다. </li><li> 죽은 세포를 제외합니다. 참고 : 생존의 얼룩은 표면과 세포의 내부 모두에 존재하는 무료 아민과 반응. 세포를 살아 달리 (손상된 멤브레인) 사균 단백질 표지의 양을 증가 염료 세포질에 입력 할 수있다. 따라서, 죽은 세포는 쉽게 차별을 허용하는 살아있는 세포보다 밝은 것입니다. 라이브에 게이트세포. 주 : 대동맥 및 신장에서 세포 현탁액의 생존 인해 추가 소화 단계 림프절로부터 세포 현탁액의 생존율보다 낮을 수있다. </li><li> 플롯 앞으로 분산 형 지역 (FSC-A) [y 축] 및 전달 살포 높이 (FSC-H) x 축]. 단봉이 점 플롯에 대각선으로 나타납니다. 이 대각선에 게이트 이중선을 제외합니다. 이어서 SSC-A [Y 축] 및 CD45 [X 축] 플롯. </li><li> 백혈구 CD45 + 집단은 쉽게 식별 될 수있다. 이 인구에 문입니다. 후속 집단은이 집단으로부터 식별 될 수있다. </li></ol></li><li> 세포 수의 정규화 <ol><li> 계산 구슬 낮은 FSC 높은 SSC 발생 특성을 가지고있다. 50,000 비드 단일 세포 현탁액 300 ㎕를 첨가하는 경우에 다음과 같이 튜브는 당, 예를 들어, 어느 하나의 절대 수의 계산을위한 방정식은 세포 유형을 제공 : 세포의 수 페이지어 관 = (흐름 cytometer에 의해 계산 구슬 50,000 / 수) 계산 세포의 X 번호. 이 계산을 이용하여, 튜브 당 특정 세포 유형의 절대 값이 결정될 수있다. 각 장기로부터 발생 얼마나 많은 튜브 기준 장기 당 세포의 수를 산출 할 수있다. 참고 : 프로토콜 동안 4 ° C에서 모든 세포 및 시약 보관하십시오. 이 세포를 손상시킬 수 있기 때문에 활발한 텍싱을 피하십시오. 세포 펠렛 최소한의 힘을 사용합니다. 이 세포 사멸을 침전 수 있으므로 FACS 튜브에 거품을 피한다. 펠릿 언제든지 건조하게하지 마십시오. </li></ol></li></ol>

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본원에 기술된 프로토콜은 쥐 신장, 대동맥 및 림프절 내에 존재하는 T 세포 서브세트를 적절하게 식별하도록 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 B 림프구 및 선천성 면역 세포와 같은 다른 면역 세포 하위 집합을 검사하도록 쉽게 적응할 수 있으며 다른 조직 유형을 포함하도록 수정될 수 있습니다. 소화 단계는 중요하며 각 조직에 대해 수정 및 최적화되어야 합니다9. 장기간의 소화 단계나 부적절한 효소의 사용은 항원 발현의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로, 불완전한 소화는 결과에 영향을 미쳐 양성 세포의 수를 줄일 수 있습니다. 또한, 세포 독성을 최소화하면서 최적의 자극을 허용하기 위해 각 세포 유형/사이토카인에 대해 생 체 외 자극 시간을 신중하게 조정해야 합니다. 
유세포 분석과 결합된 세포내 염색은 혈액 및 조직의 세포 수준에서 면역 과정을 분석하는 가장 강력한 방법 중 하나이지만 이 기술에는 한계가 있습니다. 이러한 한계에는 심혈...

최근의 증거는 적응성 면역계, 특히 T 림프구가 여러 1,2,3,4,5 심혈관 질환의 발달에서 중요한 역할을한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 안지오텐신 II 고혈압의 모델에서는, 용기 및 마우스의 신장에서 T 세포의 축적이 6을 설명 하였다. 혈관 축적은 외막과 혈관 주위 지방에 주로있다. 신장에서, T 세포는 골수 및 신장 피질 모두에서 축적된다. 관련되는 서브 세트에 따라 이러한 T 세포는 혈관 및 신장 기능에 영향을 병리 현상을 초래할 수있는 다른 사이토킨을 야기 (맥 매스터 등. (6)에 의해 검토). CD4 + T 헬퍼 림프구 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 그 기능 및 서명 사이토에 기초하여 T 헬퍼 1 (받은 Th1), TH2, TH9, Th17, Th22, T 조절 (TREG) 세포 및 T 모낭 헬퍼 (TFH) 세포kines 7. 마찬가지로, CD8 + 세포 독성 T 세포는 T에서, TC2, TC9 Tc17 또는 8로 분류 될 수있다. 합니다 (CD4 또는 CD8 T 세포 마커를 발현하지 않는, 즉 세포) 더블 부정적인 T 세포도 있습니다. 이들 세포의 서브 세트는 다른 감마 델타 T 세포 수용체 (대신 고전 알파 및 베타 수용체)를 갖고, 따라서 감마 델타 T 세포라고 칭한다. 표면 마커, 사이토 카인 및 전사 인자의 유동 세포 계측법에 의한 다 변수 분석은 이들 세포를 식별하기 위해 가장 좋은 방법을 구성한다. 이 방법은 광범위 면역학 분야에서 사용되지만, 그것은 덜 단단한 장기 및 심혈 관계 질환의 설정에 대하여 설명한다. 역사적으로, 조직에 임파구의 식별은 면역 또는 RT-PCR에 방법에 한정되었다. 면역 조직 화학 및 면역 형광은 INT의 항원의 조직 분포를 결정하는 강력한 방법이 있지만erest, 그들은 표현형과 관련된 부분 집합을 식별하는 데 불충분하다. RT-PCR 분석은 항원, 사이토 카인 또는 전사 인자의 mRNA의 발현을 검출하는 데 유용하면서 또한, 그것은 동시에 각각의 세포의 레벨에 여러 단백질의 검출을 허용하지 않는다. 사이토 카인 및 전사 인자를 검출하는 세포 염색 결합 특히 유동 세포의 출현은, 고형 장기 면역 세포 서브 세트의 단일 세포 수준에서의 식별 및 정량화 할 수있는 강력한 방법으로 연구자를 제공한다. 우리는 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절 내에 존재하는 주요 T 세포 하위 집합 유동 세포 계측법에 의해 식별하는 세포 내 염색 분석을 최적화했다. 높은 다시 A의 조직 소화, 생체 활성화, permeabilization, 표면 및 세포 내 염색 결과 : 각 단계의 최적화심혈관 및 신장 질환 모델에 적용 할 수있는 제조 가능한 분석.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 분해 효소 D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 A</td><td>ROCHE</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 B</td><td>ROCHE</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>1x 적혈구 용해 완충액</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 매체 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>밀도 구배 원심분리용</td></tr><tr><td>GentleMACS&trade; C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS 해리기 장치</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>프로그램 사용</td></tr><tr><td>SPLEEN_04 세포 활성화 칵테일 (Brefeldin A와 함께)</td> <td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16 / 32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>희석 1 : 100</td></tr><tr><td>LIVE / DEAD fixable 바이올렛 사체 염색 키트</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>전사 인자 버퍼 세트</td><td>BD Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 count</td><td>eBeads eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (클론 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (클론 17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (클론 TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (클론 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>517004</tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (클론 GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (클론 53-67)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (클론 4B10)</td><td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN&gamma; FITC (클론 XMG1.2)</td><td>BD 생명과학</td><td>557724</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

T 림프구가 여러 심혈관 질환의 발병에 중요한 역할을 한다는 것은 이제 잘 알려져 있습니다1,2,3,4,5. 예를 들어, 우리 그룹의 연구에 따르면 고혈압은 실험적 고혈압이 발생하는 동안 혈관과 신장에 T 세포가 과도하게 축적되는 것과 관련이 있습니다6. 일단 이러한 조직에 들어가면 T 세포는 혈관 및 신장 기능에 영향을 미치는 여러 사이토카인을 생성하여 혈관 수축과 나트륨 및 수분 저류를 유발합니다1,2. T 세포가 어떻게 심혈관 및 신장 질환을 유발하는지 완전히 이해하려면 이러한 조직에 존재하는 특정 T 세포 하위 집합을 식별하고 정량화할 수 있는 것이 중요합니다. T cell subset은 표면 마커, 이들이 분비하는 사이토카인, 이들이 발현하는 전사 인자의 조합으로 정의됩니다. T 세포 집단의 복잡성으로 인해 유세포 분석 및 세포 내 염색은 조직에 존재하는 림프구의 표현형을 해부하는 데 매우 유용한 기술입니다. 여기에서는 안지오텐신 II 유도 고혈압 모델에서 쥐 신장, 대동맥 및 대동맥 배출 림프절에서 분리된 T 세포의 표면 및 세포 내 마커(사이토카인 및 전사 인자)를 식별하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 다음 단계가 자세히 설명되어 있습니다: 조직의 분리, 단세포 현탁액의 생성, 생체 외 자극, 고정, 투과화 및 염색. 또한 적절한 제어 및 적절한 게이팅 전략을 선택하는 것을 포함한 유세포 분석의 몇 가지 기본 원칙에 대해 논의합니다.

이 프로토콜은 허용에게 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절에서 분리 된 T 세포 표면과 세포 마커의 식별을 설명했다. 대표 결과는 다음과 같다. 도 1은 고혈압을 유도하는 안지오텐신 II로 넘치는 WT 마우스의 대동맥으로부터 제조 한 세포 현탁액 중의 T 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여준다. 유사한 전략은 신장, 림프절에 사용됩니다. 순방향 분산 영역 (FSC-A) 및 측면 스 캐터 지역 (SSC-A)의 전압은 백혈구 집단 (G1)를 검출하고, 이물질을 제외하도록 조정 하였다. 라이브 세포 (G2)는 태평양 파란색과 결합 된 생존 마커 음. 라이브 세포를 만에 게이트에 전달 살포 높이 (FSC-H) 및 전달 살포 지역 (FSC-A)에 문이 있었다단일 인구 (G3). 백혈구는...

이 문서에서는 식별하고 세포 내 염색에 의해 쥐의 신장, 대동맥 림프절 내에 존재하는 기능 T 림프구의 하위 집합을 정량화 및 유동 세포 계측법하는 자세한 방법을 제공합니다. 안지오텐신 II 유발 된 고혈압의 모델은 설명 단계별, 절차 및 유동 세포 계측법의 기본 원리 및 세포 내 염색하기 위해 선택되었다.

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 생쥐의 대동맥, 신장 및 림프절에서 단일 세포 현탁액을 얻어 안지오텐신 II 유도 고혈압 모델 내 면역 세포를 정량화하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 어떤 두 가지 림프구 하위 집합이 고혈압 발생을 촉진하는지와 같은 심혈관 질환 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고형 장기 내의 면역 세포 하위 집합을 단일 세포 수준에서 식별하고 정량화할 수 있다는 점입니다.절차를 시작하기 전, 70% ethanol로 마우스의 흉부를 소독합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 피부와 흉벽을 조심스럽게 절개하여 심장을 노출시킵니다. 혈관을 관류시키기 위해 우심방에 작은 절개창을 내고, 좌심실 심첨부에 차가운 PBS를 초당 약 1 mL의 속도로 최소 10 mL 이상 일정하게 주입합니다.모든 장기가 탈색되면, 미세 해부용 핀셋을 사용하여 캡슐이 파열되지 않도록 주의하며 복부 대동맥 배출 림프절을 제거합니다. 해부 현미경 하에서 미세 가위로 양쪽 신장을 제거합니다. 그런 다음 미세 곡선 가위를 사용하여 심장에서 시작하여 장골 분지점에서 끝나는 흉부 및 복부 대동맥 전체를 절제하며, 이때 주변의 혈관 주위 지방이 대동맥에 부착된 상태를 유지하도록 주의합니다.다음으로, 신장을 10 milliliters의 신장 소화액이 들어 있는 해리 튜브로 옮기고, 제조사의 지침에 따라 반자동 해리기를 사용하여 신장 조직을 기계적으로 분쇄합니다. 해리가 끝나면 샘플을 37 degrees Celsius에서 지속적으로 회전시키며 배양합니다. 20분 후, 5%FBS가 보충된 차가운 RPMI 1640 배지로 효소 소화를 즉시 중단시키고, 결과물인 조직 슬러리를 40-micron 스트레이너로 걸러 50-milliliter 원심 분리 튜브에 담습니다.1mL 주사기의 플런저를 사용하여 남은 조직을 잘게 분리합니다. 그 다음 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다. 펠렛을 36% 밀도 구배 배지 3mL에 재부유시킨 후 세포를 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다.층이 섞이지 않도록 주의하며 72% 밀도 구배 매질 3 mL를 세포 아래에 조심스럽게 층을 쌓고, 원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 면역 세포는 계면에 위치하게 됩니다. 세포 파편이 포함된 가장 위의 노란색 층을 제거한 후, 차가운 PBS를 사용하여 부피를 15 mL로 맞춥니다.흔들어 섞어 농도 구배를 없앤 후, 원심분리로 세포를 세척합니다. 대동맥 면역 세포를 분리하려면, 얼음 위에서 새로 조제한 대동맥 소화액 1 mL가 들어 있는 2 mL 튜브로 대동맥을 옮기고 미세 가위를 사용하여 대동맥 전체를 잘게 다집니다. 그 다음, 파쇄된 조각들을 37 °C에서 30분 동안 지속적으로 회전시키며 배양합니다.소화 과정이 끝나면, 소화액 부피의 5배에 해당하는 5% FBS가 보충된 차가운 RPMI를 첨가하고, 생성된 조직 슬러리를 40-micron 스트레이너로 여과합니다. 그 다음 원심분리를 통해 단일 세포 현탁액을 수집하고, 펠렛을 FBS가 포함된 신선한 RPMI에 재현탁합니다. 대동맥 배수 림프절에서 단일 세포 현탁액을 생성하려면, 60-by-15 millimeter 조직 배양 접시 내의 40-micron 스트레이너로 림프절을 옮긴 후 1-milliliter 시린지 플런저를 사용하여 조직을 분쇄합니다.그 다음, 2 mL의 FBS가 포함된 RPMI로 스트레이너를 세척하고, 분리된 세포를 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 세포를 자극하기 위해, 먼저 각 세포 현탁액을 세포 배양 배지에서 1×10⁶ cells/mL 농도가 되도록 조정합니다. 그런 다음, 배지 1 mL당 2 µL의 세포 활성화 칵테일을 각 세포 그룹에 첨가합니다.다음으로, 12-well 플레이트의 웰당 1~2 × 10⁶개의 대동맥 또는 신장 세포를 분주하고, 24-well 플레이트의 웰당 1~2 × 10⁶개의 림프절 세포를 분주합니다. 플레이트를 37 °C 습윤 이산화탄소 배양기에 넣고 3시간 동안 배양합니다. 그 후, 세포를 적절한 폴리스티렌 FACS 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포 펠렛을 형성합니다.동일한 원심분리 조건에서 신선한 FACS buffer로 세포를 2회 세척한 후, FC block을 사용하여 비특이적 표면 결합을 차단하고 PBS로 세포를 세척하십시오. 펠릿을 1 mL의 신선한 PBS에 재부유시키고, 세포 투과성 없는 아민 반응성 생존 염색약을 1 µL 첨가하여 4 °C에서 빛을 차단한 상태로 15분간 염색하십시오. 배양이 끝나면 FACS buffer 1~2 mL로 세포를 2회 더 세척하고, 펠릿을 100 µL의 적절한 세포 표면 염색 항체 칵테일에 재부유시키십시오.4°C에서 빛을 차단한 상태로 30분 동안 반응시킨 후, 2mL의 신선한 FACS buffer로 세포를 두 번 더 세척하고, 제조사의 지침에 따라 고정 및 투과화 키트를 사용하여 세포를 고정 및 투과화합니다. 다음으로, 원하는 세포 내 항체 칵테일로 세포를 염색하고 FACS buffer로 다시 세척합니다. 자극된 세포 내 사이토카인 생성의 유세포 분석을 위해, 먼저 염색되지 않은 대조군과 단일 염색 대조군 튜브를 실행하여 스펙트럼 중첩을 보정하고, 이어서 패널의 각 형광체에 대한 fluorescence-minus-one 대조군을 실행합니다.기본 형광 분석 파라미터 설정이 완료되면, 전방 산란광(forward scatter) 및 측방 산란광(side scatter) 면적 도표를 사용하여 백혈구 집단 검출을 위한 1차 게이트를 설정하고, 이어서 생존 염색 발현 여부에 따라 사멸 세포를 제외하는 게이팅을 수행합니다. 전방 산란광 면적을 전방 산란광 높이에 대해 도식화하고 게이팅하여 더블렛(doublets)을 제외합니다. 그 다음 CD45 발현을 통해 백혈구를 식별할 수 있습니다.마우스 신장 또는 대동맥에서 IL-17A 또는 IL-17F를 생성하는 T-세포의 존재를 확인하기 위해, 각 사이토카인의 fluorescence-minus-one 대조군 분석에서 보여준 것과 동일하게 단일 세포 현탁액을 준비할 수 있습니다. 예상대로, fluorescence-minus-one 대조군에서는 IL-17A 또는 IL-17F 양성 세포가 매우 적게 나타나며, 이를 통해 양성 신호와 음성 신호를 정확하게 구별함으로써 실험 샘플 내 IL-17A 또는 IL-17F 양성 세포 식별을 위한 게이트를 적절하게 조정할 수 있습니다. vehicle 또는 angiotensin II를 주입한 야생형 마우스의 신장 및 대동맥에서 분리한 T-세포의 대표적인 세포 내 염색 결과는 두 조직 모두에서 IL-17A 또는 IL-17F를 발현하는 T-세포 하위 집단이 존재함을 보여줍니다.또한, 대동맥 배출 림프절에서 유래한 T세포의 세포 내 염색 결과, angiotensin II 자극 후 CD8 양성 T세포가 interferon gamma와 T-bet을 발현함을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 처리하는 조직의 수에 따라 6~9시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 세포 사멸을 최소화하기 위해 신속하고 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 마우스의 신장, 대동맥 및 림프절로부터 단일 세포 현탁액을 생성하는 방법과 이러한 장기 내 면역 세포 하위 집단을 특성화하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 통해 심혈관 및 신장 생리학 연구자는 고혈압 및 기타 염증성 질환의 원인이 될 수 있는 면역 세포 집단의 변화를 탐구할 수 있습니다.

intracellular-staining-flow-cytometry-to-identify-lymphocyte-subsets

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 논문은 aortas의 면역 성분을 조사하기 위해 흐름 cytometry 기반 방법을 제공합니다. 신문은 또한 별도로 주변 adventitia 및 혈관 벽을 검사 수 있습니다 추​​가 기법을 보여줍니다. 이 방법은 대동맥 leukocytes의 phenotypical 분석을 수행하고 죽상 경화증 연구에 대한 몇 가지 면역 assays을 적용하는 가능성을 엽니다.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

조직화학적 및 면역조직화학적 분석과 결합된 대동맥동 및 상행 대동맥의 정밀 절단을 사용하여 마우스 모델에서 죽상경화성 병변을 정량화하고 특성화하는 절차를 설명합니다.

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

혈관 세포 기능은 세포 내 메신저의 활성에 따라 달라집니다.  여기에 설명된 것은 고립된 대동맥의 개별 내피 및 평활근 세포에서 생리학적 및 약리학적 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 및 산화질소 수준을 측정할 수 있는 생체 외 이광자 이미징 방법입니다.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

이 원고 설명 기자 유전자 변형 마우스의 사용 및 다른 관리 경로 angiotensin II 유발 고혈압 면역 세포의 활성화를 평가 하기 위해 혈관의 intravital 비디오 현미경을 사용 하 여 형광 염료의 그들의 롤 및 endothelium에 고착 하는 능력.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

이 프로토콜의 목표 설명된 마커를 사용 하 여 간 내 림프 내 피 세포 인구를 식별 하는 것입니다. 우리는 콜라 IV 및 DNase 및 조직, 림프 내 피 세포의 명료한 인구를 식별 하기 위해 cytometry와 결합의 부드러운 닦지를 이용 한다.

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

우리 세포 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변 포함 하 여 동물 해 부, 조직 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥의 분석의 체계적인 방법을 구성 하는 표준화 된 프로토콜을 제안 atheroprone에서 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스.

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.

골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8+ T 세포를 수용하고 비 점막 TRM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

여기에서는 쥐 대동맥을 3차원(3D)으로 이미지화하기 위해 최적화된 조직 제거 프로토콜을 제시합니다. 우리는 면역 염색, 광학 제거 및 이미징에 대한 최첨단 절차를 설명하며, 죽상 경화성 플라크가 있는 말초 신경계의 해부학적 근접성과 죽상 경화증의 외막을 정의하기 위해 설명합니다.

죽상동맥경화증에서 대동맥 조직의 3차원 이미징

배우세요 세포 내 염색 및 유동 세포 계측법을 사용하여 쥐 대동맥, 신장, 림프절에서 T 림프구 하위 집합을 식별하고 정량화하는 방법을. 이 기술은 고혈압 모델에서 심혈관 질환의 면역 반응 연구에 활용됩니다.

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

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