세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

이 프로토콜의 전반적인 목표는 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 단세포 현탁액을 얻어 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델에서 면역 세포를 정량화하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 두 개의 림프구 하위 집합이 고혈압의 발병을 촉진하는 것과 같은 심혈관 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단세포 수준에서 고형 장기의 면역 세포 하위 집합을 식별하고 정량화할 수 있다는 것입니다.

절차를 시작하기 전에 마우스 가슴을 70% 에탄올로 소독하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 피부와 흉벽을 조심스럽게 열어 심장을 드러냅니다. 혈관 구조를 관류하려면 우심방을 작게 절개하고 초당 약 1ml의 속도로 좌심실 정점에 최소 10ml의 차가운 PBS를 꾸준히 주입합니다.

모든 장기가 희어지면 복부 대동맥 배출 림프절을 제거하기 위해 미세 절개 겸자를 사용하고 캡슐이 파열되지 않도록 주의합니다. 해부 현미경으로 가느다란 가위로 두 개의 신장을 제거합니다. 그런 다음 가늘게 구부러진 가위를 사용하여 심장에서 시작하여 장골 분기점에서 끝나는 흉부 및 복부 대동맥 전체를 절개하고 주변 혈관 주위 지방이 대동맥에 부착되지 않도록 주의합니다.

다음으로, 10ml의 신장 소화 용액이 들어 있는 해리 튜브로 신장을 옮기고 반자동 해리기를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 신장 조직을 기계적으로 분해합니다. 해리가 끝나면 연속 회전으로 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다. 20분 후 5% FBS가 보충된 저온 RPMI 1640 배지로 효소 분해를 즉시 중단하고 생성된 조직 슬러리를 40미크론 여과기를 통해 50ml 원추형 튜브로 여과합니다.

1밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 남은 조직을 분리하십시오. 그런 다음 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. 펠릿을 36% 밀도 구배 배지 3ml에 재현탁시키고 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

세포 아래에 3ml의 72% 밀도 구배 배지를 부드럽게 층을 이루고 층을 방해하지 않도록 주의하고 원심분리로 세포를 분리합니다. 면역 세포는 계면에 위치합니다. 세포 파편이 포함된 맨 위의 황색 층을 제거한 다음 차가운 PBS를 사용하여 부피를 최대 15ml까지 가져옵니다.

잘 흔들어 구배를 분해한 다음 원심분리로 세포를 세척합니다. 대동맥 면역 세포를 분리하기 위해 대동맥을 얼음 위에 갓 준비한 대동맥 소화액 1ml가 들어 있는 2밀리리터 튜브로 옮기고 가는 가위를 사용하여 대동맥 전체를 미세한 조각으로 다집니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 계속 회전하면서 조각을 배양합니다.

분해가 끝나면 분해 용액 부피의 5배에서 5% FBS가 보충된 차가운 RPMI를 추가하고 생성된 조직 슬러리를 40미크론 스트레이너를 통해 여과합니다. 그런 다음 원심분리로 단일 세포 현탁액을 수집하고 FBS를 사용하여 펠릿을 새로운 RPMI에 재현탁합니다. 대동맥 배출 림프절에서 단일 세포 현탁액을 생성하려면 림프절을 60 x 15mm 조직 배양 접시의 40미크론 여과기로 옮기고 1ml 주사기 플런저를 사용하여 조직을 분해합니다.

그런 다음 2ml의 RPMI와 FBS로 스트레이너를 세척하고 방출된 세포를 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포를 자극하려면 먼저 세포 배양 배지에서 각 세포 현탁액을 10의 1배로 10배로 1밀리리터당 6번째 세포 농도로 조정합니다. 그런 다음 배지 1밀리리터당 각 세포 그룹에 2마이크로리터의 세포 활성화 칵테일을 추가합니다.

다음으로, 웰당 10배에서 6번째 대동맥 또는 신장 세포를 12웰 플레이트로 옮기고, 웰당 10에서 6번째 림프절 세포를 1-2배 2배로 24웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 37도의 가습 이산화탄소 인큐베이터에 3시간 동안 놓습니다. 그런 다음 세포를 적절한 해당 폴리스티렌 FACS 튜브로 옮기고 원심분리로 세포를 펠릿화합니다.

동일한 원심분리기 조건에서 새로운 FACS 버퍼로 세포를 두 번 세척한 후 FC 블록으로 결합 및 비특이적 표면 결합을 차단하고 PBS에서 세포를 세척합니다. 펠릿을 1ml의 신선한 PBS에 재현탁시키고 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 15분 동안 1마이크로리터의 세포 불침투성 아민 반응성 생존도 염색으로 세포를 염색합니다. 배양이 끝나면 1-2밀리리터의 FACS 완충액으로 세포를 2회 더 세척하고 펠릿을 100마이크로리터의 적절한 세포 표면 염색 항체 칵테일에 재현탁합니다.

섭씨 4도에서 30분 동안 빛으로부터 보호한 후 2밀리리터의 새 FACS 완충액으로 세포를 두 번 더 세척하고 제조업체의 지침에 따라 고정 및 투과화 키트로 세포를 고정하고 투과화합니다. 다음으로, 관심 세포 내 항체 칵테일로 세포를 라벨링하고 FACS 완충액에서 세포를 다시 세척합니다. 자극된 세포 내 사이토카인 생산에 대한 유세포 분석을 위해 먼저 염색되지 않은 control tube와 single stained control tube를 실행하여 스펙트럼 중첩을 조정한 다음 패널의 각 형광단에 대해 fluorescence-minus-one 대조군을 실행합니다.

기본 형광 분석 매개변수가 설정되면 forward-by-side scatter area plot을 사용하여 백혈구 집단 검출을 위한 기본 게이트를 설정한 다음, gating을 사용하여 생존력 염색 발현 부족에 따라 죽은 세포를 제외합니다. 전방 산점도 높이와 게이트에 대해 전방 산점도 영역을 플로팅하여 이중선을 제외합니다. 그런 다음 백혈구는 CD45 발현으로 식별할 수 있습니다.

쥐의 신장 또는 대동맥과 함께 T 세포를 생산하는 IL-17A 또는 IL-17F의 존재를 확인하기 위해 각 사이토카인의 형광 마이너스 1 대조군 분석을 위해 방금 설명한 것처럼 단일 세포 현탁액을 준비할 수 있습니다. 예상한 바와 같이, 형광 마이너스 원 대조군에서 IL-17A 또는 IL-17F에 대해 양성인 세포는 거의 없기 때문에 양성 신호와 음성 신호를 정확하게 구별하여 실험 샘플에서 IL-17A 또는 IL-17F 양성 세포를 식별하기 위해 게이트를 적절하게 조정할 수 있습니다. 비히클 또는 안지오텐신 II를 주입한 야생형 마우스의 신장과 대동맥에서 분리된 T세포의 대표적인 세포 내 염색은 두 조직 내에서 IL-17A 또는 IL-17F를 발현하는 T세포의 하위 집합이 존재함을 나타냅니다.

또한, 대동맥 배출 림프절에서 T 세포의 세포 내 염색은 CD8 양성 T 세포가 안지오텐신 II 자극 후 인터페론 감마 및 T-벳을 발현한다는 것을 보여줍니다. 일단 숙달되면 이 기술은 처리되는 조직의 수에 따라 6시간에서 9시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 세포 사멸을 최소화하기 위해 빠르고 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 쥐의 신장, 대동맥 및 림프절에서 단세포 현탁액을 생성하고 이러한 장기에서 면역 세포 하위 집합을 특성화하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 통해 심혈관 및 신장 생리학은 고혈압 및 기타 전염증성 질환에 기여할 수 있는 면역 세포 집단의 변화를 탐색할 수 있습니다.