Name: 인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 학습하세요 iCRISPR 플랫폼을 활용한 hPSC 게놈 편집 및 췌장 세포로의 유도 분화 방법을 통해 인간 췌장 발달과 당뇨병의 유전적 기전을 연구하는 기술입니다.

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이 작품은 NIH / NIDDK (R01DK096239) 및 뉴욕 주 줄기 세포 과학 (NYSTEM C029156)에 의해 부분적으로 투자되었다. ZZ는 슬로안 케터링 연구소의 줄기 세포 생물학 센터에서 NYSTEM 박사 친교에 의해 지원되었다.

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저자는 공개 아무것도 없어.

생성 돌연변이 라인을위한 시간 고려 사항 게놈 편집 CRISPR / 카스 시스템을 기반으로 최근의 접근 방식이 성공적으로 타겟팅 주도하고 있지만,보다 효과적인 보편적 인 플랫폼은 유전자 기능 분석 대규모 바람직 할 것이다. iCRISPR 플랫폼은 관심 5, 9의 유전자에 돌연변이를 소개하는 신속하고 효율적인 방법을 제공합니다. 우선, PCR 기반 gRNA 합성법은 시간 소모적 클로닝 단계없이 하루에 배열 형식 gRNAs 수백의 생산을 허용한다. 둘째, iCas9 hPSCs에서 독시사이클린 - 유도 Cas9 식으로 gRNA 형질 관련된 공정 작업의 최소량을 필요로하며, 따라서, 여러 gRNA 타겟팅 실험을 동시에 수행 될 수있다. 우리의 시스템의 분석을 달성 셋째, 높은 타겟팅으로 인해 효율성 ~ 24 - 형질 전환 gRNA 당 48 콜로니 suff해야한다효율이 목표 궤적에 따라 달라질 수 있지만 icient는 단일 유전자에 대해 여러 monoallelic 및 biallelic 돌연변이 라인을 설정합니다. 훈련 된 개인 기계적 단번에 384 콜로니 (4 × 96 웰 플레이트)을 선택하는 해부 현미경 ~ 4 시간이 소요되는 것이 가능하기 때문에, 숙련 된 개인은 내 12 유전자에 영향을 미치는 돌연변이 라인을 생성하는 것으로 할 수있다 12 개월. 단시간 hPSC 돌연변이 유선형 생성 발달 과정 (9)을 조절, 서로 상호 작용하는 전사 인자 및 / 또는 신호 경로 성분의 배열을 체계적으로 분석 할 수있다. 또한, 효율적인 다중 유전자 타겟팅은 유전 적 상호 작용을 기본 복잡한 인간의 특성을 조사에 문을 엽니 다. 정확한 유전 수정의 생성 쉽게 접근 할 수 체세포 유형에서 환자 맞춤형 iPSCs의 유도<html> 의 질병 관련 세포 유형으로 분화 질병 관련 돌연변이의 기능 검증을위한 좋은 기회를 제공합니다. 그러나, 개인 간의 유전 적 배경에서 상당한 변화로, 환자의 iPSCs 사이의 건강한 기증자로부터 직접 비교 한 배경 효과에서 질병 표현형을 구별 할 수 없습니다 수 있습니다. 따라서, 위로 야생형 서열 질환 돌연변이를 정정하여 동질 제어 iPSCs를 생성하거나 타인 25, 26에 의해 제안 된 바와 같이, 야생형 hPSC 배경으로 환자의 특정 돌연변이를 도입하는 것이 필요하다. 기능 상실 (NULL) 돌연변이에 더하여, 하나는 더욱 정확하게 hypermorphic hypomorphic, neomorphic 또는 우성 음성 환자 포함 hPSCs에서 내인성 궤적으로 환자 별 서열 변화의 도입을 통해 질병 메커니즘을 해부 수도 돌연변이. 이 NHEJ 매개 DNA 수선보다 훨씬 덜 효율적 때문이다. 수리 템플릿의 존재 DSB 수리를 위해 HDR 고용 정확한 유전자 변형 ntent &quot;&gt; 환자 특이 돌연변이 약물 선택 카세트와 상 동성 암을 포함하는 도너 플라스미드 가장 널리 사용되는 Cre 호텔-에 loxP 및 FLP-FRT 시스템 남겨진 동안 이전 수리 서식이 사용되고있다. 약물 선택 및 환자 특이적인 변이의 확인 후, 제 2 단계는 일반적. 약물 선택 카세트를 제거하는 데 필요한 내인성 유전자좌 잔류 시퀀스는 피기 백 트랜스포존의 사용은 약물의 선택, 카세트 (27)의 완벽한 제거를 위해 사용할 수있다.보다 최근에, 짧은 ssDNA를 템플릿이 또한 설계 DNA 엔도 뉴 클레아 28 효율적인 HDR을 지원하기 위해 도시되어있다. 도너 플라스미드에 비해 , ssDNA를 직접 합성하고, 따라서 많은 시간이 소요되는 복제 단계를 회피 할 수있다. 여기서, 보유 될도시 욕실, 그 공동 형질 상동 - 감독 수리를 유도하는 gRNA 및 ssDNA를 템플릿을 iCRISPR 높은 효율로 특정 염기 변형을 도입하는 데 사용할 수 있습니다로. 이것은뿐만 아니라 인간 질환 돌연변이를 모델링하고 잠재적으로 치료 학적 개입이 질환 - 관련된 돌연변이를 보정하기위한 단백질의 기능적 도메인 내 필수적인 뉴클레오티드의 역할을 절개하지 중요하다. 때문에 각 당뇨병과 같은 복잡하고 multigenic 질병 모델링, 여러 시퀀스 변형과 관련된 감수성 유전자좌의 많은 수의 유전에 대한 도전이었다. iCRISPR 플랫폼은 대립 시리즈의 급속한 발전 또는 multiplexable 유전자 타겟팅 관대 같이, 개별적으로 또는 동종의 배경과 함께, 다수의 질병 - 관련 궤적의 조사를 용이하게 할 수있다. 효율성 오프 대상 효과를 타겟팅 우리는이<html> T7E1 및 RFLP 분석 결과 및 시퀀싱에 의해 식별 돌연변이 라인의 수 사이의 상관 관계를 발견 하였다. 이 클론 라인의 설립과 평행이 분석을 수행의 중요성을 강조한다. 대부분 단일 유전자 타겟팅 실험에서 유전자 좌위에 따라 달라질 수 달성 타겟팅 효율이 20 동안 - 클론의 60 %가 두 대립 유전자가 돌연변이가 발견되었다 (프레임 이동 돌연변이를 포함하고 프레임 내의) 9. 다중 유전자 타겟팅이 수행 된 경우, 5 ~ 10 %의 효율 트리플 biallelic 돌연변이 클론 5를 얻었다. 10 % - 5 여러 유전자 ssDNA를 매개 HDR은 노크 1에서부터 클론 동형 획득 효율과 정확한 유전 적 변형을 수득 하였다. 같은 gRNA 대상 시퀀스를 공유하지 않는 잠재적 인 오프 대상 사이트에 hPSCs에 CRISPR / 카스 어떤 돌연변이를 작업 아직 검출한다아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 5, 9, 12. 최근의 연구에서 수행 전체 게놈 시퀀싱은 CRISPR / 카스 (29)를 사용하여 생성 된 클론 hPSC 라인에 상당한 오프 대상 돌연변이를 식별하는 데 실패했습니다. 그러나 오프 - 타겟 효과 부위에서 돌연변이에 의해 도입 된 표현형을 교란의 잠재적 효과를 최소화하기 위해, 동일한 유전자 내에서 상이한 서열을 타겟팅 적어도 두 개의 독립적 gRNAs 독립된 돌연변이 라인을 생성하기 위해 제안된다. 다열 관찰 유사한 표현형은 주로 표현형 오프 - 타겟 효과에서 유래한다는 가능성을 배제 할 수있는 다른 gRNAs을 이용하여 생성. 공급 장치에 의존하는 독립적 인 문화 타겟팅 대 hPSC 문화에 대한 전통적인 방법은 동물의 자극을 포함 혈청 또는 혈청 교체를 포함하는 배지에서 피더 세포에 자신의 유지 보수 및 확장을 포함예컨대 소 혈청 알부민 ucts을. 피더 세포, 혈청, 혈청 교체 및 모든 알부민은 복잡하고 정의되지 않은 성분을 함유하고 상당한 배치 변동성을 보여줍니다. 피더 - 무료 및 화학적 조건에 적응하는 것은 크게, 더 중요한 것은, 분화 실험의 일관성을 증가 hPSC의 유지 보수를 위해 노력을 줄일 수 있습니다. 현재, 완전히 정의 배양 조건 (30)에 배양 hPSCs에 게놈 편집 절차를 설명 거의 연구가있다. 우리는 gRNA 형질 전환 및 클론 증착 장치에 의존하는 배양 조건에 비해 공급이없는 조건에서 수행했을 때 효율성을 대상으로 높은 CRISPR을 발견했다. 우리는이 식민지 형성을위한 형질 전환 및 단일 세포 파종 후 증가 된 세포 생존에 기인한다고 믿는다. 또, 피더 세포는 이전시켜 형질 전환 효율을 저하 형질 전환 시약을 격리시키는 것으로 나타났다. 결합감독 차별화와 게놈 편집 이전 분화 프로토콜 인슐린 양성 세포의 작은 분획을 수득 한 대다수의 polyhormonal 있었다 태아 내분비 세포 (23)를 닮았다. 최근의 진보는 더 성숙 글루코스 응답 베타 형 셀 16, 17, 19, 20로 hPSCs의 분화를 허용하고있다. 우리는 일상적으로 HUES8 hPSCs (9)를 사용하여 75 % 이상 최종 내배엽 세포, 40 % PDX1 + NKX6.1 + 췌장 전구 세포, 그리고 20 %의 NKX6.1 + CPEP + 포도당 응답 베타 - 유사 세포를 얻을 수 있습니다. iCRISPR 게놈 편집 시스템과 결합이보다 견고한 분화 프로토콜 췌장 분화 췌장 전구 세포와 내분비 단계에 중요하다 전사 인자의 분석을 용이하게하고있다. 이 것그것은 가능한 미래 연구에서 당뇨병 9 기초 메커니즘으로 기능 검증 및 조사 후보 질환 유전자의 다수를 조사. 미래 응용 프로그램 또는 방향 등을 통해 기자 대립 유전자의 생성과 같은보다 복잡한 유전자 변형의 발생을 용이하게 할 수있다 우리의 iCRISPR 시스템 긴 기증자의 DNA 템플릿 인코딩 단백질 태그 또는 형광 기자 (12)를 사용하여 표적 유전자를 HDR은 중재. 우리 인해 시스템 효율을 달성 타겟팅 높은 CRISPR에 그렇게 도시 한이 프로세스는 또한 약물의 선택 (12) 없이도 hPSCs 수행 될 수있다. 또한, 표적 유전자는 다중화 우리는 직장 (31)의 첫번째 예를 판단 우리의 최근의 연구에서와 같이, 기본 복합 인간 질병 유전자의 상호 작용을 조사 할 수있다. ICRISPR 또한 프로모터 및 인핸서와 같은 조절 영역, 결실을 생성하여 하나의 RNA 비 암호화 유전자 또는 유전자 규제 제어를 이해하는데 사용될 수있다. 효율적 iCRISPR를 사용 규제 돌연변이를 생성하기 gRNAs을 포함하는 DNA 결합 단백질의 결합 부위를 방해하도록 설계되지만 기저 전사 기계 또는 조직 - 특이 적 전사 인자로 제한되지 않을 수있다. ssDNA를 템플릿 매개 HDR은 특정 단백질 - 결합 부위를 돌연변이를 위해 사용될 수있다. 마지막으로, 체외 분화 프로토콜과 결합 될 때 더 최적화 능성 표현형 또는 질환 표현형의 높은 처리량에 대한 유전자 분석 hPSCs에서 iCRISPR 플랫폼의 사용을 가능하게 할 것으로 예상 할. 이 iCRISPR 중재 연구는 후보의 질병 관련 유전자 및 기능 관련 연구의보다 신속한 식별을 위해 허용 할 수있다.

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs는) 할 수있는 기능이 모두 자기 갱신과 세 개의 배아 생식 계통의 모든 파생 상품에 상승을 제공합니다. 이들은 인간 개발 환경에서 세포 과정 요점을 되풀이하기위한 고유 한 플랫폼으로서 작용하여 세포 대체 요법, 질병 모델링 귀중한 자원을 제공한다. 또한 스케일 러블 고 처리량 분석에 대한 실험 세포의 공급원이다. 효율적인 유전자 조작 도구의 부족 및 배양 접시에 배아 복잡한 발육 단계 recapitulating 어렵다는 : 그러나, 진보로 인해 두 가지 문제를 한정하고있다. 유전 적 변형은 정상 개발 및 질병의 유전자 기능을 연구하는 필수적인 도구입니다. 상동 재조합을 통해 접근을 대상으로 고전적인 유전자를 입증하면서 그러나, 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 유전자 기능을 해부하는 강력한 도구 하나,이 방법이 될 수 있습니다hPSCs 2, 3에 적용 할 때 매우 비효율적이었다. 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs) 및 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / CRISPR은 관련을 포함하여 실험실 사용에 자연 프로그램, 사이트 별 클레아의 최근 활발한 가입 (CAS) 시스템 (4)은 유전체 공학 hPSCs 포함한 유기체 및 세포주의 넓은 범위에서 훨씬 쉽게 작업이 될 것을 의미한다. 이러한 유전자 편집 도구 등 Cas9 효소로서 키메라 클레아 어느 비 - 상동 활성화 정확한 위치에서 이중 가닥 나누기 (DSBs)을 유발하는 내인성 DNA 수리 장치를 트리거하여 유전 적 변형의 전체 범위를 허용 할 수 있다는 사실을 활용 (NHEJ)에 가입 종료하거나 상동 - 감독 수리 (HDR). 두기구는 eith을 유도하여 유전자 조작을 위해 이용 될 수있다어 임의 삽입과 삭제 돌연변이 (삽입과 삭제, NHEJ을 통해)은 인간의 질병 모델링을위한 환자 돌연변이 요점을 되풀이하거나 유전자 치료를위한 질병을 유발하는 돌연변이를 해결하기 위해, 유전자 대립 유전자, 또는 (HDR 통해) 정확한 염기 치환을 무효화 프레임 이동 돌연변이를 만드는 방법 . DNA 대상 인식을 지정 DNA 절단 및 가변 CRISPR의 RNA (crRNA) 및 트랜스 활성화 (tracrRNA) 양면 인쇄에 필요한 일정 RNA 유도 Cas9 효소 : CRISPR / 카스 매개 게놈 엔지니어링은 두 가지 구성 요소가 필요합니다. crRNA / tracrRNA 듀플렉스보다 효율적 5, 6, 7 일 밝혀졌다 단일 키메라 가이드 RNA (gRNA)로 대체 될 수있다. CRISPR / Cas9 시스템은 대부분의 유기체 실험 세포주 Cas9 및 gRNA 크게 변동의 전달 및 발현에 적응해야되었지만 상기 아치하도록 최적화 될hPSCs 8 등 많은 시스템에서 이브 효율적인 게놈 편집. 효율적인 게놈 편집 플랫폼, iCRISPR는 hPSCs 5 년에 설립되었습니다. 이 시스템에서, TALEN 중재 접근 방식은 (TRE를 역 테트라 사이클린 제어 transactivator (M2rtTA)과 테트라 사이클린 응답 요소와 다른와 트랜스, 하나의 대립 유전자의 &quot;유전자 안전한 항구의 궤적&quot;AAVS1의 두 대립 유전자를 대상으로 사용되어왔다 )이 hPSCs에서 Cas9 (iCas9의 표현)를 구동. 설립 클론 라인 (iCas9 hPSCs)에서 Cas9은 매우 독시사이클린 처리로 표현된다. 한편, 인해 작은 크기 (100 NT), 하나 또는 여러 개의 gRNAs 쉽게 높은 효율로 iCas9 hPSCs에 전달 될 수 있으며, HDR-매개뿐만 아니라, 효율적인 NHEJ 매개 유전자 중단을 가능하게, 사이트 별 분열에 대한 Cas9을 안내 할 수 있습니다 짧은 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 기증자 템플릿의 존재 정확한 염기 수정. iCRISPR 시스템이 될 수 있습니다성공적 9 중요한 발달 유전자 5 biallelic (동형 접합성 또는 이형 화합물) 또는 이형 기능 상실 돌연변이 질병 모방 hPSC 라인의 패널을 생성하는 데 사용된다. 그룹의 개수에 hPSCs CRISPR / CAS를 이용한 효율적인 유전자 편집보고되었지만, 성공은 기술적으로 숙련 실험실 소수의 제한 남아있다. iCRISPR 플랫폼은 상이한 기술 수준의 연구자 루틴 유전자 편집 효율적인하면서도 간단한 해결책을 제공하며, 이는 이미 기 등 9, 10, 11, 12에 의해 출판 다수의 연구에 사용되었다. 이 방법은 또한 상기 dCas9-KRAB (13)의 식에 기초하여 유도 침묵으로 확장되었다. 게놈 편집 테크노의 진행과 함께말의 뜻, 상당한 개선도 hPSC 유지 관리 및 감독 차별화를 달성했다. hPSCs을위한 배양 조건은 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포 (IMEF) 공급에 의존하는 정의 된 세포 외 기질 구성 요소에 대한 공급이없는 상태로, 복잡한 미디어 제제에서이 화학적으로하는 매체 조건 (14)로부터 진화했다. 이러한 개선은 IMEF 준비와 녹아웃 혈청 교체 부품의 배치 별 차이로 인해 hPSCs의 변동성을 감소하고, 따라서 hPSC 차별화에 대한 더 많은 재생 가능한 환경을 제공하고있다. 한편, 높은 처리량 약물 스크리닝에서 인간 배아 발달에 적용 경로뿐 아니라 발견 시그널링 향상된 기술이 향상 분화 프로토콜 15, 16, 17, 18을 이끌어왔다. 이러한 프로토콜은 더 밀접하게 비브에서 모방오 발달 단계는 밀접하게 자신의 생체 대응 요점을 되풀이 세포 유형을 생성합니다. 췌장 혈통에 hPSC 차별화를 들어, 초기 프로토콜은 비교적 잘하지만 결국 미성숙 한 태아의 표현형의했다 포도당 자극에 제대로 반응 polyhormonal β 세포를 발생 초기에 췌장 개발을 모방. 최근의 진보 16, 17, 19, 20 등의 형성 및 monohormonal β 세포의 더 성숙 후술 사건을 조사 할 수있게된다 글루코스 응답 췌장 β 형 세포의 생성을 허용하고있다. 여기서는 상세히 글루코스 응답 pancr 향해 hPSC 기반 체외 분화 플랫폼으로 iCRISPR 시스템을 조합함으로써 췌장 발달의 연구 게놈 변성 라인의인가eatic β와 같은 세포. 개선 된 hPSC 차별화 프로토콜과 강력한 게놈 편집 도구의 결합은 질병의 인과 관계 검증에 대한 증가하는 수요를 충족하는 데 필요한 속도와 규모를 제공 할뿐만 아니라 정상적인 개발 및 질병 (9)을 기본 전사 컨트롤에 더 기계적인 조사에 대한 정교한 유전자 조작을 할 수 있습니다뿐만 아니라, .

<table><tbody><tr><td>화학적으로 정의된 배지(E8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Essential 8 basal medium 및 Essential 8 보충제 포함</td></tr><tr><td>, Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 Y-27632</td>, <td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>해리 시약(TrypLE Select enzyme)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>1x, 동물 유래 성분 무함유, 재조합 효소</td></tr><tr><td>G418 Sulfate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td>Geneticin 선택적 항생제</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>Puromycin 선택적 항생제</td></tr><tr><td>DNA 중합효소 (Herculase II Fusion)</td><td>Agilent Technologies</td><td>600679</td><td>PCR kit</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transcription 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear 전사 클린업 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린 하이클레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>환원 혈청 매체</td></tr><tr><td>리포펙타민 RNAiMAX 트랜스펙션 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>13778150</tr><tr><td>DNeasy 혈액 & 조직 키트</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>게놈 DNA 추출 키트</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>BLAR 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>발표된 제형으로 맞춤 제작(Rezania et al., 2014)</td></tr><tr><td>L-글루타민 보충제(GlutaMAX)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE 생물학 연구소</td><td>7500855</td><td>지방산 무함유</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>GSK-3 억제제</td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4544</td><td>비타민 C</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>고슴도치 억제제</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>레티노산</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>BMP 억제제</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Wnt 길항제&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>EMD Millipore</td><td>565740-1MG</td><td>PKC 활성제</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-445</td><td>ALK5 억제제 II</td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>헤파린,</td><td>시그마-알드리치</td>, <td>H3149</td><td></td></tr>, <tr><td>GSiXX</td>, <td>EMD, 밀리포어</td><td>, 565789</td><td>감마 분비효소 억제제 XX, NOTCH 신호 억제제</td></tr>, <tr><td>N-Cys(N-아세틸 시스테인),</td> <td>시그마-알드리치</td>, <td>A9165</td><td></td></tr>, <tr><td>트롤록스</td><td>EMD, 밀리포어</td><td>, 648471</td><td>비타민 E, 아날로그</td></tr><tr><td>R428</td>, <td>Selleck Chemicals</td><td>, S2841</td>, <td>AXL, 수용체, 티로신 키나아제 억제제</td></tr><tr><td>24mm Transwell with insert</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0.4 cm Electroporation Cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>Long oligonucleotide</td><td>Eton Bioscience 또는 IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXA2 항체</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CXCR4-APC 항체</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170A</td><td>1:25</td></tr><tr><td>PDX1 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX6.1 항체</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX2.2 항체</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NEUROD1 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>인슐린 항체</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>C-펩타이드 항체</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>글루카곤 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1,000</td></tr></tbody></table>

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hpscs의 감독 차별화

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

자기 갱신 또는 인간 다 능성 줄기 세포를 분화 (hPSCs)에 질의 유전자 기능은 인간 발달을 이해하고 접시에 질병 메커니즘을 해부으로 가치있는 플랫폼을 제공합니다. 이 잠재적 인 응용 프로그램을 활용하는 것은 밀접하게 자신의 생체 대응 요점을 되풀이 질환 관련 세포 유형을 생산하기 위해 질병 관련 유전자 hPSC 돌연변이뿐만 아니라 체외 hPSC 차별화 프로토콜을 생성하는 효율적인 게놈 편집 도구가 필요합니다. iCRISPR라는 hPSCs위한 효율적인 유전자 편집 플랫폼은 AAVS1 궤적에 Cas9 발현 카세트의 TALEN 매개 타겟팅을 통해 개발되고있다. 여기서, 화학적으로 정의 된 배지 및 공급없는 상태에서 배양 된 세포를 사용하여 유도 Cas9 hPSC 라인의 생성을위한 프로토콜을 설명한다. N을 통해 하나의 유전자 녹아웃 또는 hPSCs의 정확한 유전 적 변화에 대한 iCRISPR 시스템 사용에 대한 자세한 절차,온 - 동종 (NHEJ)에 가입 종료 또는 동성 지시 수리 (HDR) 템플릿을 사용하여 정확한 염기 변화를 통해 각각 포함되어 있습니다. 이러한 기술적 인 절차는 설계, 생산의 설명 및 CRISPR 가이드 RNA를 (gRNAs)의 형질을 포함한다; T7E1 또는 RFLP 분석에 의한 CRISPR 돌연변이 속도의 측정; 설립과 클론 돌연변이 라인의 검증 및. 마지막으로, 생체 췌장 배아 발달에 모방에 의한 포도당 응답 췌장 β와 같은 세포로 hPSC 차별화 우리 연대기 절차. 감독 hPSC 차별화와 iCRISPR 기술을 결합하면 췌장 개발과 당뇨병 질병 메커니즘에 대한 우리의 이해를 촉진하는 유전자 기능의 체계적인 검사를 할 수 있습니다.

<html> hPSC 화학적 정의 및 피더없는 문화 적응 및 유지 관리 IMEF 모이 배양 hPSCs 신속 피더가없는 배양 조건 VTN - 코팅 된 플레이트로 구성 될 수있다. 통상 피더 IMEF 배양과 같은 분할 비 적응 기간 동안 사용될 수있다. 도 1a는 KSR 기반 매체와 공급이없는 매체에서 VTN 코팅 표면에 IMEF 피더에 hPSCs의 전형적인 형태학을 보여줍니다. 도 1b는 전형적인 형태 변화 및 적응 (4 일)의 제 1 통로 중 hPSC 콜로니의 성장을 나타낸다. 세포는 더 계대 또는 미래의 실험에 고정 될 수 있습니다. 분화 실험을 시작하기 전에 적응 문화의 3 통로 - 2를 수행합니다. 우리는 적응 단계에서 핵형 이상을 관찰하지 않은 있지만, 핵형 또한, 적응 후 좋습니다. &quot;fo를하기 : 유지-together.within 페이지를 =&quot;1 &quot;&gt;를 통해 iCas9 hPSC 라인의 세대 TALEN 매개 AAVS1 타겟팅 이전에 나타낸 바와 같이,이 hPSCs AAVS1 TALEN 플라스미드 및 플라스미드 M2rtTA Cas9 및 (5)의 한 쌍의 전기 천공 하였다. 도 2A 및 B는 디자인 iCas9 hPSC 클론 라인을 생성하는 전체 과정을 상세 타겟팅 도너 벡터를 나타낸다. (- 그림 2C, 십이일 전기 후 10) 항생제 선택 후, 적절한 크기와 일반 hPSC 형태를 표시하는 단일 세포 유래 클론 뽑 준비가되어 있었다. 남부 (그림 2D) 5 블로 팅에 의해 확인으로 보통 ~ 클론의 50 %가 제대로 임의의 통합없이 대상이된다. 랜덤 통합 독시사이클린 치료 부재시 Cas9 누설의 발현을 야기 할 수있다. 효율적인 유전 MiCRISPR 플랫폼을 사용 hPSCs에서 odification 설립 iCas9 hPSCs에서 Cas9는 독시사이클린 처리로 표현하고 DSBs을 생성하는 형질 gRNAs에 의해 목표 궤적 안내. 수리 템플릿이없는 경우, NHEJ 통해 DNA 수리 종종 유전자 붕괴 또는 넉 아웃 될 삽입과 삭제를 발생시킨다. 수리 템플릿 (예 ssDNA를 공여체)의 존재하에 HDR 그러한 야생형 hPSC 배경에서 환자 - 특정 돌연변이 생성 또는 론 환자의 질병 관련 유전자 변이를 보정하는 등의 정확한 유전 적 변형을 위해 이용할 수있다 파생 된 iPSCs (그림 3A). 그것은 iCRISPR 시스템을 이용한 클론 돌연변이 라인을 생성하는 1개월 ~ 걸린다. iCas9 유도 및 gRNA 형질 후에 T7EI 및 / 또는 RFLP 분석법 Cas9 절단 효율을 평가하는데 사용하고, 형질 감염된 세포는 나중에 ~ 저밀도 (10-cm 접시에 단셀 500 시딩 - 2 000세포 / 10 cm 요리). 10-12일 후 단일 세포 유래 클론 확장 및 상기 특성 (즉, 유전자형 및 웨스턴 블롯) (도 3B)에 대한 96 웰 플레이트의 웰에 넣었다. iCRISPR 매개 유전자 녹아웃 용이성 때문에, 어떤 선택 처리가 포함되지 않으며, 일반적 20-50% biallelic 돌연변이 쉽게 (도 3C) (5)를 얻을 수있다. 효율적이고 정확한 유전자 변형 들어 gRNAs은 (게놈 서열 작지만 특정 변경에 대한) 특정 순서 변경을 나르는 ssDNA를 공여체와 공동 - 형질 감염된다. 종종, 수정 대립 유전자에 다시 절단을 방지하기 위해,에 또는 PAM 순서 (그림 3D)에 근접 자동 돌연변이를 포함하는 것이 좋습니다. 이 시스템으로, ~ 두 대립 유전자의 추가 변경없이 원하는 HDR-매개 게놈 수정을 들고 클론의 10 % (도 3E) 달성된다. 급속 및 p-iCRISPR 플랫폼을 사용하여 hPSC 게놈의 recise 수정은 우리가 신속하고 효율적으로 인간 발달 및 질병 연구를위한 모델 역할 hPSC 라인을 만들 수 있습니다. 포도당 응답 β와 같은 세포를 향해 hPSCs의 효율적인 분화 hPSC 췌장 분화 최근 진행 밀접 췌장 배아 개발 요점을 되풀이 프로토콜의 개발을 허용했다. 미분화 hPSCs는 먼저 PDX1 + 초기 췌장 전구 세포 (PP1) 및 PDX1 + NKX6.1 + 나중에 췌장 전구 세포 (PP2)로, 최종 내배엽으로, 그리고 마지막으로, 20 포도당 응답 β와 같은 세포 16, 17, 19로 분화 , 23, 24. 이 protocOLS 더 한층 확실 PDX1 NKX6.1 + + 췌장 전구 세포와 글루코오스 반응 β 형 셀 (9)를 생성하기 위해 최적화되었다. 도 4a는 분화의 각 단계에서 사용되는 상세한 화학 첨가제를 보여줍니다. 일반적으로 2 일 초기 셀 도금 후 ~ 80 % 전면 생장을 HUES8 hPSCs (도 4b)의 분화를 시작하기에 적합하다. 여러 파종 밀도를 테스트하는 것은 매우 각 특정 세포주에 대한 최적 조건을 발견하도록 권장한다. 통상적으로 75 % 이상 FOXA2 +를 PP2 단계에서 DE 단계 40 % PDX1 NKX6.1 + + + 세포에서 세포를 얻을 수있다 SOX17 (도 4C). S5 단계에서, 셀 집합체 주위 분위기 형상의 존재는 NKX6.1 + CPEP + 글루코스 응답 β 유사 세포 (도 4D에있어서 분화에 중요한 세포의 우수한 생존율에 대한 지표이다 ). 이 프로토콜은 인간의 췌장 d를 공부하는 데 유용합니다<html> 접시에 evelopment과 질병. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig1.jpg" /> 그림 1. hPSC가 화학적으로 정의하고 공급이없는 유지 관리 및 IMEF 공급기에서 문화 적응. (A) hPSCs의 대표 이미지는, 4 일에 VTN IMEF 공급 장치 나에 분할 할 준비가 배양. (B)는 IMEF 공급 장치에서 공급이없는 문화에 대한 적응의 제 1 통로 동안 hPSCs의 전형적인 형태. IMEF 피더에서 배양 4 일 hPSCs는 ROCK 저해제와 화학적 매체에 VTN 코팅 된 플레이트에 분할 도금했다. 분할 비율은 IMEF 공급 조건에서 배양을위한 통상의 분할 비율과 동일하다. 매체는 ROCK 저해제없이 매일 변경되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> 1 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지 = FO &quot;ve_content <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig2.jpg" /> iCas9 hPSC 라인의 그림 2 세대. (A) iCas9 hPSC 라인의 생성을위한 전략을 타겟팅. 순수하지 않아-Cas9 공여체 및 네오 M2rtTA 공여체 AAVS1 TALENs 한 쌍의 인간 AAVS1 궤적로 타겟팅 하였다. 전기, 항생제 선택 콜로니 피킹 및 확장 및 세포주 특성 포함한 전체 타겟팅 프로세스의 (B) 회로도. 전기가 12 일 - (C) 대표 단일 세포 클론 준비가 약 10에서 포착 할 수 있습니다. (D)이 기증자 플라스미드의 추가 통합하지 않고 올바르게 대상으로 클론을 식별하기위한 남부 오 예. 올바른 클론은 빨간색으로 표시됩니다. (A)와 (D)는 허가, 참조 5에서 적응되었다.ig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig3.jpg" /> iCRISPR 시스템을 사용 hPSCs 그림 3. 효율적인 유전자 변형. 유전자 녹아웃 돌연변이 또는 iCRISPR 시스템을 이용하여 정밀한 유전자 변형의 발생에 대한 (A) 회로도. (B) 타겟팅 절차 및 클론 라인 설립. hPSCs 9 NHEJ을 통해 (C) 유전자 녹아웃 효율. 특정 염기 변형을 나르는 ssDNA를의 (D) 디자인. P, 빨간색 : 환자 맞춤형 돌연변이; 녹색 X : 침묵 돌연변이. (E)를 매개 HDR 정확한 염기 변형 효율. GATA6 궤적에서 (특정 염기 C&gt; T 돌연변이로 인한)는 정확한 R456C 돌연변이는 iCRISPR 시스템을 사용하여 도입 하였다.(자세한 내용은 5 참조 참조). (C)와 (E)는 권한을 각각 참조 9 참조 5에서 적응되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig4.jpg" /> 포도당 응답 췌장 β와 같은 세포로 그림 4. 감독 hPSC 차별화. 분화의 각 단계에서 보충 된 화학 물질 상세한 분화 프로토콜 (A) 회로도. 차별화하는 동안 활성화 또는 억제하는 신호 전달 경로는 각각 녹색 또는 빨간색으로 강조 표시됩니다. CHIR : GSK3 억제제; GDF8 : 성장 분화 인자 8 미오 스타틴하는 TGF 베타 단백질 가족; HH : 고슴도치; DE : 확실한 내배엽; PP1 :PDX1 + 초기 췌장 전구; PP2 : PDX1 + NKX6.1 + 나중에 췌장 전구. (B) 일반 컨 플루 - hPSCs 48 (70 ~ 80 %) 시간 준비가되면 차별화 개시를위한 파종 후. (C) 최종 내배엽에서 성공적으로 차별화를 보여주는 대표적인 면역 염색 이미지 (DE) 단계 (FOXA2 및 SOX17 공동 염색), 췌장 전구 단계 (PP2 : PDX1 및 NKX6.1 공동 염색), 포도당 응답 β- 세포 단계 (NKX6.1와 C 펩타이드 공동 염색) 등을들 수있다. 일반적으로, 상기 β 형 세포 단계에서 10 % 이상 NKX6.1 + CPEP + 세포를 달성 적어도 75 % FOXA2 + SOX17 + DE 세포 및 40 % PDX1 + NKX6.1 + PP2 셀은 해당 단계에서 요구한다. (D) 공기 - 액체 계면 배양 인서트 여과막의 S5 단계에서 세포 집합체의 전형적인 형태. 살아남은 세포 (어둠) 집합체의 중심으로 마이그레이션 및 에지 분위기 형 구조를 떠났다. (A </str옹&gt;)와 (D)는 권한 참조 9에서 적응되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 플라스미드 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-L </td><td> 5 μg의 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-R </td><td> 5 μg의 </td></tr><tr><td> AAVS1 - 순수하지 않아-iCas9 </td><td> 40 μg의 </td></tr><tr><td> AAVS1 - 네오 M2rtTA </td><td> 40 μg의 </td></tr></tbody></table> 1 번 테이블 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 뇌관 </td><td> 순서 </td></tr><tr><td>T7F </td><td> TAATACGACTCACTATAGGG </td></tr><tr><td> TracrR </td><td> AAAAGCACCGACTCGGTGCC </td></tr></tbody></table> 표 2 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 35.5 μL </td></tr><tr><td> 배 PCR 반응 완충액 </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> 의 dNTP 믹스 (25 mM)을 </td><td> 0.5 μL </td></tr><tr><td> T7F (10 μM) </td><td> 1.25 μL </td></tr><tr><td> TracrR (10 μM) </td><td> 1.25 μL </td></tr><tr><td> T7-gRNA IVT 템플릿 (250 ㎚) </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> DNA 중합 효소 </td><td> 0.5 μL </td></tr><tr><td> 전체 PCR 반응 믹스 </td><td> 50 μL </td></tr></tboDY&gt; </table> 표 3 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> PCR 사이클링 조건 </td></tr><tr><td> 사이클 수 </td><td> 변성하다 </td><td> 어닐링 </td><td> 넓히다 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 94 ºC 2 분 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-31 </td><td> 94 ºC, 20 초 </td><td> 60 ºC, 20 초 </td><td> 72 ºC, 1 분 </td></tr><tr><td> (32) </td><td></td><td></td><td> 72 ºC 2 분 </td></tr></tbody></table> 표 4 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td><strong&gt; 금액 </td></tr><tr><td> T7 ATP </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> T7의 CTP </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> T7 GTP </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> T7의 UTP </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> T7 10 배 버퍼 </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> T7 효소 믹스 </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> PCR 증폭 템플릿 </td><td> 8 μL </td></tr><tr><td> 총 체외 gRNA 전사 믹스 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> 하룻밤에 6 시간 동안 37 ºC에서 품어 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 5 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 금액 (μL) </td></tr><tr><td> 정제되지 않은 PCR 제품 </td><td> 8 </td></tR&gt; <tr><td> 버퍼 2 배 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 증류수 (DH 2 O) </td><td> (10) </td></tr></tbody></table> 표 6 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> DNA 변성과 하이브리드 자전거 조건 </td></tr><tr><td> 온도 </td><td> 지속 </td><td> 열 순환기 조건 </td></tr><tr><td> 95 ° C </td><td> 10 분 </td><td></td></tr><tr><td> 85 ° C </td><td> 1 분 </td><td> 2 ° C / s로 85 ° C에 램프 </td></tr><tr><td> 75 ° C </td><td> 1 분 </td><td> 0.3 ° C / s로 75 ° C에 램프 </td></tr><tr><td> 65 ° C </td><td> 1 분 </td><td> 0.3 ° C / s로 65 ° C에 램프 </td></tr><tr><td> 55 ° C &lt;/ TD&gt; <td> 1 분 </td><td> 0.3 ° C / s로 55 ° C에 램프 </td></tr><tr><td> 45 ° C </td><td> 1 분 </td><td> 0.3 ° C / s로 45 ° C에 램프 </td></tr><tr><td> 35 ° C </td><td> 1 분 </td><td> 0.3 ° C / s로 35 ° C에 램프 </td></tr><tr><td> 25 ° C </td><td> 1 분 </td><td> 0.3 ° C / s로 25 ° C에 램프 </td></tr><tr><td> 4 ° C </td><td> 보류 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 7 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 일 </td><td> 미디어 </td><td> 보충 </td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"> S1 </td><td> D0 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 NG / mL로 </td><td> CHIR-99021 3 μM </td></tr><tr><td> (D1) </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 NG / mL로 </td><td> CHIR-99021 0.3 μM </td></tr><tr><td> (D2) </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 NG / mL로 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> S1 미디어 : MCDB 131 + 1 배 L 글루타민 보충 + 0.5 % BSA + 1.5 g / L의 NaHCO3 + 10 mM의 포도당 </td></tr></tbody></table> 표 8 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 일 </td><td> 미디어 </td><td colspan="8"> 보충 </td></tr><tr><td> S2 </td><td> D3-D4 </td><td> S1 </td><td> LAA 0.25 mM의 </td><td> FGF7 50 NG / mL로 </td><td> IWP-2 2.5 μM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><tD&gt; S3 </td><td> D5-D6 </td><td> S3 </td><td> LAA 0.25 mM의 </td><td> FGF7 50 NG / mL로 </td><td> SANT-1 0.25 μM </td><td> RA 1 μM </td><td> LDN 100 nm의 </td><td> TPB 200 nm의 </td><td> ITS-X 1 : 200 </td><td></td></tr><tr><td> S4 </td><td> D7-D9 </td><td> S3 </td><td> LAA 0.25 mM의 </td><td> FGF7 2 NG / mL로 </td><td> SANT-1 0.25 μM </td><td> RA 0.1 μM </td><td> LDN 200 nm의 </td><td> TPB 100 nm의 </td><td> ITS-X 1 : 200 </td><td> IWP-2 2.5 μM </td></tr><tr><td colspan="11"> S3 미디어 : MCDB 131 + 1 배 L 글루타민 보충 + 2 % BSA + 2.5 g / L의 NaHCO3 + 10 mM의 포도당 </td></tr></tbody></table> 표 9 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.withiN-페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td> 단계 </td><td> 일 </td><td> 미디어 </td><td colspan="8"> 보충 </td></tr><tr><td> S5 </td><td> D10-D12 </td><td> S5 </td><td> T3 1 μM </td><td> ALK5i II 10 μM </td><td> SANT-1 0.25 μM </td><td> RA는 0.05 μM </td><td> LDN 100 nm의 </td><td> ITS-X 1 : 200 </td><td> 의 ZnSO4 10 μM </td><td> 헤파린 10 μg의 / mL의 </td></tr><tr><td> S6 </td><td> d13- D19 </td><td> S5 </td><td> T3 1 μM </td><td> ALK5i II 10 μM </td><td> GSiXX 100 nm의 </td><td></td><td> LDN 100 nm의 </td><td> ITS-X 1 : 200 </td><td> 의 ZnSO4 10 μM </td><td> 헤파린 10 μg의 / mL의 </td></tr><tr><td> S7 </td><td> d20- D33 </td><td> S5 </td><td> T3 1 μM </td><td> ALK5i II 10 μM </td><td> N-시스테인를 1mM </td><td> 트롤 록스 10 μM </td><td> R428 2 μM </TD&gt; <td> ITS-X 1 : 200 </td><td> 의 ZnSO4 10 μM </td><td> 헤파린 10 μg의 / mL의 </td></tr><tr><td colspan="11"> S5 미디어 : BLAR + 1 배 L 글루타민 보충 + 2 % BSA + 1.5 g / L의 NaHCO3 + 20 mM의 포도당 </td></tr></tbody></table> 표 10

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

본 프로토콜은 인간 다능성 줄기세포(hPSCs)에서 신속한 게놈 편집을 위한 iCRISPR 플랫폼을 구축하는 방법과, 게놈 편집된 세포주를 hPSC 유래 췌장 분화 과정에 통합하여 인간 췌장 발달 및 질병을 연구하는 방법을 보여줍니다. 이러한 방법들은 정상적인 췌장 발달의 유전적 조절 및 당뇨병의 분자적 기초와 같이 인간 췌장 발달 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 hPSCs에서 관심 유전자를 효율적으로 수정할 수 있으며, 이렇게 수정된 세포주를 사용하여 체외(in vitro)에서 인간 췌장 발달 및 질병 연구에 활용할 수 있다는 점입니다.절단된 인간 비트로넥틴(vitronectin)이 코팅된 디쉬에서 화학적으로 정의된 무피더(feeder-free) 조건으로 hPSCs를 배양합니다. 전기천공 전날, 배지를 교체할 때 10 µM ROCK 억제제를 첨가합니다. 전기천공 당일에는 비트로넥틴이 코팅된 10 cm 디쉬를 미리 준비합니다.그 다음, 세포에서 배양액을 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 한 번 세척한 후, 37°C에서 약 3분 동안 1X 해리 시약을 처리합니다. 이어서 세포가 떨어지기 전에 해리 시약을 흡입하여 제거하고 10.5 mL의 완전 배지를 추가합니다. 원심분리 튜브로 옮기기 전, 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 형성합니다.자동 세포 계수기를 사용하여 세포 현탁액 500 µL의 세포 수를 측정합니다. 그 후 hPSCs를 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리하여 펠릿화합니다. 세포를 차가운 PBS에 12.5 × 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁하고, 800 µL씩 분주합니다.각 800 µL hPSC 현탁액에 플라스미드를 첨가하고 잘 섞습니다. 혼합물을 0.4 cm 전기천공 큐벳으로 옮기고 약 5분 동안 얼음에 보관합니다. 전기천공 시스템을 사용하여 250 V 및 500 µF 조건에서 세포를 전기천공합니다.게놈 편집을 위해서는 건강하고 증식 중인 hPSC를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 전기천공 후, 세포를 5 mL의 미리 데워둔 완전 배지가 들어있는 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 세포를 펠렛화합니다. 10 µM ROCK 억제제가 포함된 10 mL의 완전 배지에 세포를 재현탁하고, 각 전기천공 시료당 1×10⁶, 2.5×10⁶, 5×10⁶개의 세포를 비트로넥틴 코팅 디시에 분주하여, 적어도 하나의 플레이트에서 피킹에 충분한 단일 세포 콜로니가 형성되도록 합니다.세포를 37 °C에서 배양합니다. 2일 차에 500 µg/mL G418 sulfate가 포함된 배지를 첨가하여 네오마이신 선택을 시작합니다. 6일 차에 1 µg/mL puromycin dihydrochloride가 포함된 배지를 첨가하여 퓨로마이신 선택을 시작합니다.10일에서 12일 차가 되면 hPSC 단일 세포 콜로니의 직경이 1~2mm에 도달합니다. 이때 입체 현미경 하에서 12~24개의 콜로니를 선택하십시오. 200µL 피펫 팁을 사용하여 hPSC 콜로니를 작은 조각으로 기계적으로 분해한 후, 세포를 비트로넥틴이 코팅된 24-웰 플레이트에 직접 옮기십시오.가이드 RNA transfection 24시간 전에 iCas9 hPSC를 2 µg/mL의 doxycycline으로 처리합니다. transfection 당일에 vitronectin이 코팅된 24-well plate를 준비하고, 이전과 같이 1X dissociation reagent를 사용하여 iCas9 세포를 단일 세포로 분리합니다. 다음으로, 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리하여 펠렛을 형성하고, 2 µg/mL doxycycline과 10 µM ROCK inhibitor가 첨가된 완전 배지에서 0.5 × 10⁶ cells/mL 농도로 세포를 재부유시킵니다.재현탁된 세포 500 microliters를 24-well 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 각 가이드 RNA에 대해 다음과 같이 형질전환 혼합물을 만듭니다. 혼합물 A: 환원 혈청 배지 50 microliters와 가이드 RNA 1 microliter를 혼합합니다.혼합물 B를 준비합니다. 감량 혈청 배지 50 µL에 트랜스펙션 시약 3 µL를 추가합니다. 혼합물 A와 B를 결합하여 100 µL의 혼합물을 만들고 상온에서 5분 동안 배양합니다. 24-웰 플레이트의 중복 웰에 있는 세포에 혼합물 50 µL를 첨가하고 잘 섞어줍니다.4일 후, 게놈 DNA를 추출하고 가이드 RNA 표적 서열의 양측 플랭킹 영역을 PCR로 증폭한 뒤, T7E1 소화를 통해 편집 효율을 추정합니다. 세포를 파종한 지 2일 후 세포 밀도가 80%에 도달하면 hPSC 라인의 분화를 시작합니다. 분화 0일차 배지를 첨가하고, 이후 여기 제시된 조성법에 따라 매일 배지를 교체합니다.10일째에, 세포 일부를 면역형광 염색하여 후기 췌장 전구세포 PP2 마커인 PDX1 및 NKX6.1을 확인합니다. 그 다음, PP2 세포를 10 micromolar ROCK 억제제로 4시간 동안 처리하여 공기-액체 계면 배양을 진행합니다. 배양 시간이 지나면 이전과 동일한 방법으로 세포를 분리합니다.분화의 공기-액체 계면(air-liquid interface) 단계에서 세포 파종 시 세포 생존율을 극대화하기 위해 해리 시약 처리 시간을 최소화하십시오. 세포가 완전히 떨어져 나가기 전에 해리 시약을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 플레이트에 boo-lah 배지 10 milliliters를 첨가하고, 부드럽게 파이펫팅하여 PP2 세포를 단일 세포로 분산시킵니다.단일 세포 현탁액을 수집합니다. 세포 수를 측정하고 세포를 펠렛화합니다. 세포 펠렛을 S5 분화 배지에 다시 현탁한 후, 트랜스웰 인서트 필터의 각 지점당 5~10 µL의 세포를 분주합니다.각 트랜스웰 인서트 바닥에 S5 배지를 추가하고, 면역형광 염색으로 췌장 내분비 마커가 검출될 때까지 배지를 교체하며 배양합니다. 이 그림은 hPSC에서 iCRISPR 매개 비상동 말단 연결을 보여줍니다. 선택 과정이 포함되지 않아 유전자 넉아웃 효율이 매우 높으며, 20%에서 50%의 양쪽 대립유전자 돌연변이를 쉽게 유도할 수 있습니다.효율적이고 정밀한 유전자 변형을 위해, 가이드 RNA를 특정 서열 변형(빨간색으로 표시)이 포함된 단일 가닥 DNA 공여체와 함께 공동 전이시킵니다. 변형된 대립유전자의 재절단을 방지하기 위해, 일반적으로 PAM 서열에 무음 돌연변이(초록색으로 표시)를 포함시키는 것이 권장됩니다. 이 시스템을 통해, 두 대립유전자 모두에 추가적인 변형 없이 원하는 상동성 유도 복구 매개 게놈 변형을 가진 클론을 약 10% 정도 확보할 수 있습니다.숙달되면 새로운 iCas9 hPSC 라인을 구축하는 데 두 달 미만이 소요됩니다. 그 후, 다양한 hPSC 돌연변이 콜로니 라인을 1~2개월 이내에 생성할 수 있습니다. hPSC 유전적 돌연변이 라인을 생성한 후, 돌연변이 세포 라인을 췌장 베타 유사 세포로 체외 단계별 분화시킴으로써 이러한 돌연변이에 의해 영향을 받는 특정 발달 단계를 연구할 수 있으며, 이는 기저 질환 기전에 대한 더 나은 이해를 가능하게 할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

현재의 연구는 인간 배아 줄기 세포를 췌장 분화를 유도으로 이동 차별화 접근 방식에 대해 설명합니다. 큰 의미 중 인슐린을 표현하는 세포로 췌장 progenitors을 얻은​​ 인간 배아 줄기 세포를 찾는 것이 내피 세포 공동 배양 mediates의 성숙입니다.

인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

여기에서는 시험 관내 NKX6-1 + 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

여기, 우리 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 로 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 차별화 하는 상세한 프로토콜을 제시 (PDX1+) 췌 장 계보의 세대에 대 한 셀의 비 식민지 유형 단층 성장에 따라 단일 세포를 해리 했다. 이 메서드는 생산 하는 동종 hPSC 파생 된 세포, 유전자 조작 및 심사에 적합 합니다.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

학습하세요 iCRISPR 플랫폼을 활용한 hPSC 게놈 편집 및 췌장 세포로의 유도 분화 방법을 통해 인간 췌장 발달과 당뇨병의 유전적 기전을 연구하는 기술입니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

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