인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

이 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 태반 형성 및 기능의 초기 사건을 연구하기 위해 뼈 형태 생성 4 및 활성 및 결절 신호 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포를 인간 영양막 세포로 분화시키는 것입니다. 이 방법은 영양막 세포 기능과 이러한 세포가 어떻게 형성되는지에 대한 연구에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전학을 포함한 다양한 응용 분야를 위해 풍부한 영양막 세포를 생산할 수 있고 세포 기능 분석을 가능하게 한다는 것입니다.

실험을 시작하려면 얼음 위에서 세포외 기질의 분취액을 3-4시간 동안 해동합니다. 얼음처럼 차가운 팁을 사용하여 50ml 원뿔형 튜브 1개와 Dulbecco의 변형 등가 배지 또는 DMEM F12 배지를 사용하여 2mg의 세포외 기질을 24ml의 얼음처럼 차가운 DMEM F12로 전달합니다. 즉시 50ml 원뿔형 튜브를 얼음에 옮겨 넣고 섭씨 4도에서 보관하십시오.

조직 배양 플레이트를 코팅하려면 6웰 플레이트의 웰당 1ml의 희석된 세포외 기질을 추가합니다. 플레이트를 소용돌이쳐 웰을 코팅하고 최소 1시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 새 플레이트에서 세포외 기질을 흡인하고 마우스 배아 섬유아세포 컨디셔닝 배지 또는 bFGF를 포함하는 MEFCM을 추가합니다.

피펫을 사용하여 MEF 플레이트에서 스크랩된 세포 클램프를 옮기고 세포외 기질 코팅 플레이트로 분취합니다. 그런 다음 플레이트를 배양합니다. 파스퇴르 피펫으로 분화된 세포를 긁어낸 후 매일 1웰에 2ml의 배지를 사용하여 MEFCM을 bFGF 배지로 교체합니다.

현미경으로 군체가 크고 밝게 보이면 6-7일마다 hESC를 통과시킵니다. feeder-free cell이 계대 준비가 되면 배지를 제거하고 피펫을 사용하여 PBS 1ml를 추가하여 세포를 세척합니다. PBS를 흡입하고 피펫으로 예열 된 dispase의 밀리리터당 0.5mg으로 교체합니다.

세포를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 웰당 2ml의 PBS를 첨가하여 PBS로 세포를 세척하고 PBS를 흡인합니다. 웰당 1ml의 CM을 추가하고 5ml 피펫의 팁을 사용하여 세포를 작은 덩어리로 수동으로 긁어냅니다.

다음으로, 부유 세포 덩어리를 새로운 세포외 기질 코팅된 플레이트에 플레이트합니다. 분화 매체를 준비합니다. bFGF 없이 CM을 사용하고 사용 전에 새로운 억제제를 추가하십시오.

5% 산소로 설정된 인큐베이터 내부에서 배양된 하나의 계대에 대해 세포외 기질 코팅 플레이트에서 자라는 피더 없는 hESC를 사용합니다. 세포외 기질이 코팅된 플레이트에 첫 번째 통로를 통과한 후 세포가 24시간 동안 부착되도록 합니다. 다음 날, bFGF가 포함된 CM을 제거하고 6웰 플레이트에서 웰당 2밀리리터의 BMP4/A/P를 포함하는 CM으로 교체하여 차별화를 시작합니다.

4%산소 수준을 사용하여 세포를 계속 배양하십시오. 기존 배지를 흡인하고 BMP4/A/P를 포함하는 새 배지를 추가하여 BMP4/A/P를 포함하는 CM을 이틀에 한 번씩 교체합니다. 원하는 시점에 세포를 수집합니다.

bFGF를 포함하는 hESC 배지를 사용하여 MEF에서 전달한 후 세포외 기질의 두 계대에 대한 hESC를 배양합니다. 높은 세포 밀도가 중요하므로 hESC를 새 플레이트로 일대일로 분할하여 다음 날 최소 50%의 포화도를 보장합니다. 저산소 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.

다음 날, 배지를 분화 배지 웰당 2밀리리터로 교체하십시오. 세포를 저산소 인큐베이터에 밤새 넣습니다. 트랜스펙션하기 전에 접시에 0.1%젤라틴을 첨가하여 젤라틴을 코팅합니다.

접시를 휘저어 접시를 코팅한 다음 접시를 실온에 두십시오. 20분 후 젤라틴을 제거합니다. 원하는 시점까지 세포를 구별합니다.

형질주입 전날, 0.05%트립신을 사용하여 5분 동안 세포를 트립신화합니다. 세포를 젤라틴으로 코팅된 플레이트에 원하는 농도로 플레이트합니다. bFGF가 결핍된 BMP4/A/P를 함유한 CM을 추가하고 하룻밤 동안 배양을 배양합니다.

다음날, 세포에 새로운 분화 배지를 추가합니다. siRNA transfection 시약을 사용한 siRNA transfection. 혈장 DNA의 경우 적절한 리포펙타민 시약을 사용합니다.

각 transfection 시약에 대해 설명된 제품 프로토콜을 따릅니다. siRNA 리포펙타민 복합체를 세포의 각 웰 또는 플레이트로 옮기고 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 저산소 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.

다음 날, 배지를 새로운 분화 미디어로 교체하십시오. 원하는 시점에 세포를 채취하여 정량적 RT-PCR을 이용하여 유전자 파괴 효율을 확인합니다. 마지막으로, 세포를 수확하기 위해 웰당 1ml의 0.05%트립신을 첨가하고 세포를 배양합니다.

트립신을 중화하기 위해 웰당 5ml의 MEF 배지를 추가합니다. 5분 동안 200배 g의 속도로 세포를 스핀다운하고 세포 펠릿을 RNA 분리에 사용합니다. 이 기술을 사용하면 형태학적 변화를 명확하게 볼 수 있습니다.

분화 1일차의 세포는 0일차의 세포보다 큽니다. 분화가 진행됨에 따라 세포는 분열하고 군체의 중심에서 확장되어 바깥쪽 방향으로 자랍니다. 개별 군체는 5일째 되는 날에 분화까지 서로 합쳐지며 세포는 서로 겹쳐서 자랍니다.

QRT-PCR 분석에 따르면 BMP4로 세포를 배양할 때 분화 1일 후 만능 C-marker NANOG의 상대적 발현 수준이 75% 감소하고 BMP4/A/P가 있는 경우 90% 감소하는 것으로 나타났습니다. 분화 2일차까지 BMP4 단독 또는 BMP4/A/P에서 배양된 세포의 NANOG 수치는 베타 FGF를 포함하는 hESC CM 배지의 세포에 비해 매우 낮습니다. GFP 플라스미드를 사용하여 수행하고 분화 1일차와 3일차에 BMP4/A/P 처리한 세포에 도입한 transfection은 transfection 후 24시간에 30-50%의 transfection 효율을 달성했습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 in vitro에서 인간 만능 세포를 영양막 세포로 분화하는 방법과 유전자 발현을 조작하기 위한 DNA 구조를 도입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.