Name: 인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 배우세요 인간 다능성 줄기 세포를 융모 세포로 분화시키는 방법을 BMP4와 신호 경로 억제제를 사용하여. 이 기술은 태반 형성과 조기 발달 연구에 효율적인 세포 생산을 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 펜실베니아 건강 연구 포뮬러 펀드의 지원을 받았습니다.

참고 : 영양막 세포의 전구 세포에 하나 hESCs는 또는 hiPSCs의 분화를 들어, 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 성장 hPSCs는 BMP4 / A / P와 분화를 시작하기 전에이 구절에 대한 조건없는 공급기로 전환된다. 이 과정은 분화 된 세포의 MEF 오염을 제거한다. 여기서는 hESC의 분화를위한 프로토콜을 제공하고, 동일한 프로토콜 hiPSCs에 적용될 수있다. 1. 문화 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포에 hESCs는의 복구 (MEFs에) (준비) <ol><li> MEFs에의 감마 조사 <ol><li> 10 % FBS, 2 mM L- 글루타민, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)를 DMEM, 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA) 다음 MEFs에 배양 용 배지 500 mL로. </li><li> 기본 MEFs에 하나 바이알을 해동하고, 세포를 배양 MEF 매체를 사용한다. MEF 문화 매체를 이용하여 30 판에 기본 MEFs에를 확장합니다. 주 : 산소 농도가이 단계에 대한 중요하지, 그래서어느 인큐베이터 내에서 4 % 생리 또는 주위 (20 %)의 조건을 사용할 수있다. </li><li> MEFs에 수확. 플레이트로부터 제거하고 MEFs에 원추형 튜브에 세포를 전송하기 위해 0.25 % 트립신을 사용한다. 조사 악기로 MEFs에 배치하고 3,500 회색에 세포를 노출합니다. 주 : 시간의 양이 조사부 부 내부 소스의 활성에 의존 할 것이다. </li><li> MEF 배양액을 조사 MEFs에 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산. </li><li> 원심 분리기를 이용하여 펠렛 MEFs에 50 % MEF 배지 및 배지 (80 % FBS와 20 % MEF 배지)를 50 % 동결 세포를 추가한다. 나누어지는 유리 병 당 1 × 10 6 세포. </li><li> 하룻밤 -80 ° C 냉장고에 조사 MEF 튜브를 배치하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 전송. </li></ol></li><li> 문화 냉동 MEFs에와 hESCs는 해동 <ol><li> hESC의 매체의 500 ml의 확인 : DMEM을 / F-12와 20 % 혈청 REPLAC장담, 0.1 mM의 NEAA, 2 mM의 L 글루타민, 10 NG / ㎖의 bFGF, 0.1 MM의 β-머 캅토 에탄올 및 1X 펜 / 패 혈성. </li><li> hESCs는 해동 전에 MEFs에 1 일 한 병을 녹여. 코트 각 웰에 1 ml의를 사용하여 0.1 % 젤라틴과 6 웰 플레이트. 실온에서 적어도 20 분 동안 배양 한 다음, 젤라틴을 제거한다. </li><li> 액체 질소 저장에서 MEFs에의 병을 제거하고 37 ° C의 물을 욕조에 유리 병을 담그지. 단지 작은 얼음 결정이 남아 간헐적 때까지 병을보세요. 신속 15ml의 원뿔형 튜브 내부 MEF 배지 9 ml의 바이알의 내용물을 옮긴다. </li><li> 5 분 동안 200 × g으로 원심 분리하여 세포 펠렛. 뜨는을 기음과 MEF 매체에서 세포 펠렛을 resuspend. 6 웰 플레이트에 균등하게 MEFs에 나누어지는. 하룻밤 37 ℃로 낮은 산소 (4 %) 배양기에 플레이트를 넣습니다. </li></ol></li><li> MEFs에에 hESCs는의 일상 문화 <ol><li> 액체 질소에서 hESC의 유리 병을 제거하고 신속하게 3를 사용하여 병을 해동7 ° C의 물을 욕조. 조심스럽게 hESC의 매체의 9 ml의를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브로 hESCs는 피펫 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운. 배지를 제거하고 hESC의 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 단계 1.2.4에서 제조 된 판에서 MEF 매체를 기음과 hESC의 배지 1 ㎖를 추가합니다. hESC의 매체에 바위 억제제 Y-27632 (10 μM)를 추가합니다. MEFs에 상 hESCs는을 전송합니다. </li><li> 하룻밤 37 ° C 낮은 산소 (4 %) 인큐베이터로 세포를 놓습니다. 매일 hESC의 매체를 교체합니다. 4 배에서 직립 현미경으로 시각화 파스퇴르 피펫으로 차별화 된 세포를 긁어. </li><li> 통로 hESCs는 모든 4-6일, 세포 생장 및 hESC의 콜로니의 크기에 따라. 계대 전날 MEFs에 접시를 준비합니다. 세포가 통과 할 준비가되면, hESC의 매체를 제거하고 PBS 1 ㎖로 잘 씻는다. </li><li> 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제를 추가 (37 ° C로 미리 예열), 5 분 동안 37 ℃에서 배양하고, 콜라게나 제를 제거합니다. WPBS로 세포를 웰 당 화산재 hESC의 배지 1 mL를 넣고 5 ㎖ 수동 피펫의 끝을 사용하여 작은 덩어리로 세포를 긁어. 새로운 MEF 코팅 잘 (들)에 일시 중단 된 세포 덩어리를 전송합니다. </li></ol></li></ol> MEFs에에서 hESCs는 2. 전환은 공급없이하는 세포 외 매트릭스 코팅 된 플레이트에 조건을 <ol><li> 준비 MEF 중간 (CM)를 금연실 <ol><li> 90~100%의 포화 상태에서 T75 플라스크에 조사 MEFs에 플레이트; 치밀 MEFs에 도금하는 것이 중요하다. 들이 플라스크의 바닥에 부착 여부를 결정하기 위해 현미경을 사용하여 세포를 관찰 (MEFs에 도금 또는 다음날 약 6 시간 후에 부착). 참고 : 현미경을 사용하여 관찰 할 때 붙어 있지 않은 세포가 중간에 떠. 다음 날, MEF 매체를 제거하고 B-FGF가없는 hESC의 매체의 25ml를 추가합니다. </li><li> 배양 24 시간 후 조정 배지를 수집합니다. 십이일의 최대 매일 새로운 배지로 교체하십시오. </l난&gt; <li> 0.22 μM 필터를 사용하여 수집 된 CM 필터. 앞서, 사용하는 CM에 신선한 B-FGF를 추가합니다. 참고 : CM은 -80 ° C에서 냉동 1 년까지 저장할 수 있습니다. 또한, 2 주 4 ° C에서 CM을 저장합니다. </li></ol></li><li> 전환 MEFs에에 문화에서 hESCs는이 피더 무료로하는 세포 외 기질 코팅 플레이트. <ol><li> 코팅 조직 배양 플레이트에 대한 세포 외 매트릭스의 제조 <ol><li> 얼음에 세포 외 기질의 분취 량 (약 3 ~ 4 시간)을 해동. 얼음처럼 차가운 팁, 일, 차가운 50 ML 원뿔 튜브 및 DMEM / F12 매체, 전송 얼음처럼 차가운 DMEM 24 ml의에 세포 외 기질의 2 mg의 사용 / F-12 (희석는 공급 업체에서 세포 외 기질 농도에 따라 달라집니다 ). </li><li> 즉시 얼음에 50 ㎖에게 원뿔 튜브를 전송하고 4 ℃에서 보관합니다. 코팅 조직 배양 플레이트의 웰에 희석 된 세포 외 기질의 적당량을 추가 (예컨대, 6 웰 플레이트에 웰 당 1 mL) 중. 코팅 플레이트 소용돌이 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다. </li></ol></li><li> B-FGF (10 NG / ㎖)를 함유하는 CM을 사용 MEFs에 발 (단계 1.3)을 통과 hESCs는. <ol><li> 대기음은 새로운 판에서 세포 외 기질을 제거하고 B-FGF를 포함하는 CM을 추가 할 수 있습니다. 피펫을 사용하여 MEF 플레이트에서 긁어 세포 덩어리를 전송하고 세포 외 기질 코팅 된 플레이트로 나누어지는. 밤새 37 ℃로 저산소 배양기에서 품어. </li><li> 매일 B-FGF 매체와 CM 교체; 매체의 크기는 배양 플라스크의 크기에 의존 할 것이다. 한 6 잘 잘위한 매체 2 ㎖를 사용합니다. 파스퇴르 피펫으로 차별화 된 세포를 긁어. </li><li> 통로 hESCs는 현미경으로 볼 때 식민지가 밝은 모든 6~7일. 참고 : 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 성장 hESC의 식민지가 MEF-배양 된 세포보다 큰 성장한다. </li><li> 공급 장치가없는 세포가 통과 할 준비가되면, 광고에 의해 세척, 매체를 제거PBS를 제거하기 위해 피펫, 기음을 사용하여 PBS의 땡 1 ㎖를 추가, 0.5 ㎎ / ㎖ 디스 파제 피펫으로 (37 ° C로 미리 예열), 5 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 잘 당 PBS 2 ㎖를 추가하고 나중에 흡입에 의해 PBS로 세포를 씻으십시오. 물론 당 CM의 1 ML을 추가하고 수동 5 ml를 피펫의 팁을 사용하여 작은 덩어리로 세포를 긁어. </li><li> 새로운 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 일시 중단 된 세포 덩어리 플레이트; 세포는 24 시간 후 준수해야합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> BMP4 / A / P를 사용하여 hESCs는 3. 차별화 <ol><li> 분화 매체를 준비합니다. 사용 CM은 (B-FGF 결여)와 추가 (신선한) BMP4 (50 NG / ㎖) A83-01 (1 μM), 및 PD173074 (0.1 μM). 사용하기 전에 CM 이러한 억제제를 추가합니다. </li><li> 4 % 산소로 설정 인큐베이터 내 배양 한 통과를 위해 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 성장 공급 장치가없는 hESCs는을 사용합니다. 세포 외 기질 코팅 된 플레이트 상에 제 1 통로 후,세포는 24 시간 동안 부착 할 수 있습니다. 다음 날, 분화를 시작합니다. (B-FGF를 포함) 형상을 제거하고 BMP4 / A / P (6 웰 플레이트에 웰 당 2 ml)에 포함 된 CM로 교체합니다. 4 %의 산소 농도를 이용하여 세포를 배양 계속. </li><li> BMP4 / A / P를 포함하는 CM (2 ㎖ / 잘위한 6 웰 플레이트) 2 일마다 교체합니다. 대기음은 기존의 매체를 제거하고 피펫을 사용하여 새 CM을 추가 할 수 있습니다. B-FGF (고려 차별화 하루 2) BMP4을 추가 및 제거에 이어 두 번째 날에, 세포 형태는 현미경을 이용하여 관찰 할 때 더 큰 나타나는 변경됩니다. 참고 : 밝은 둥근 모서리를 보이는 미분화 세포는 존재하지 않습니다. </li><li> 원하는 시간 지점에서 세포를 수집합니다. 차별화 된 세포는 약 2 주 후에 분할 중단됩니다. 이 기간 동안 형질 세포 (다음 섹션 참조). </li></ol> siRNA를 또는 플라스미드 DNA와 융모 세포의 4. 형질 <ol><li> 형질 전환을위한 융모 세포를 준비 </강한&gt; <ol><li> MEFs에 그들을 전송 후 세포 외 기질에 두 구절에 대한 문화 hESCs는 (단계 2.2 참조). B-FGF를 포함 hESC의 매체를 사용합니다. </li><li> 차별화 전에 새로운 세포 외 기질 플레이트 일일 위에 hESCs는 분할합니다. 다음날 적어도 50 % 컨 플루을 보장하는, 잘 / 새로운 판에 1 : 높은 휴대 포화 상태가 중요하므로 세포 1을 분할합니다. 저산소 배양기에서 세포를 밤새 인큐베이션. 참고 : hESCs는이 단계에서 계산 할 필요가 없습니다. </li><li> 다음날, 분화 배지로 배지 교환 (CM 6 웰 플레이트 ㎖ / 웰 BMP4 / A / P를 함유하고 B-FGF 결여, 2를 이용). 흡인에 의해 기존의 매체를 제거하고 피펫을 사용하여 새로운 매체 (2 ml)에 전송합니다. 밤새 낮은 산소 인큐베이터 (4 % 산소)에 세포를 놓습니다. </li></ol></li><li> 형질 유전자 파쇄 된 siRNA를 이용하여 또는 플라스미드 DNA를 사용하여 <ol><li> 원하는 시간 -까지 세포 분화(일 1과 14 사이)을 가리 킵니다. 트랜 스펙 션 하루 전에 5 분 동안 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 Trypsinize. 젤라틴 코팅 플레이트 상에 원하는 컨 플루 (형질 감염 시약 프로토콜에 따라 다름)에 플레이트 (제거하는 20 분 및 흡인을위한 조직 배양 접시에 0.1 % 젤라틴 추가). (B-FGF가없는) BMP4 / A / P를 포함하는 CM을 추가하고 밤새 품어. </li><li> 다음날, 세포에 신선한 차별화 매체를 추가 할 수 있습니다. siRNA와 형질 감염 시약을 사용하여 siRNA를 형질 감염. 플라스미드 DNA를 들어, 적절한 리포 펙 타민 시약을 사용한다. </li><li> 각 형질 전환 시약에 기재 한 바와 같이 제품 프로토콜을 따르십시오. 저산소 배양기에서 밤새 셀, 셀의 각 웰 / 플레이트로 siRNA에 리포 펙 타민 단지 이동을 부드럽게 혼합하고 배양. 참고 : 일부 형질 전환 시약이 CM은 펜 / 연쇄상 구균이 부족 필요 항생제에 의해 억제된다. </li><li> 다음날, 신선한 분화 용지로 교체합니다. </li><li> 욕망에서 세포를 수확(D) 타임 포인트 (예를 들면, 24 시간, 48 시간 및 72 시간)을 정량적 RT-PCR을 사용하여 유전자 파쇄 효율을 확인한다. 수확 셀, 웰 당 1 ml에 첨가하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양하고, 0.05 % 트립신을 사용한다. 트립신을 중화 잘 당 MEF 매체의 5 ML을 추가합니다. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운하고 RNA의 분리를위한 세포 펠렛을 사용한다. </li></ol></li></ol> 융모 세포의 5 병원체 감염 : 센다이 바이러스 성 감염 <ol><li> 차별화 hESCs는 준비 <ol><li> MEFs에의 전송 후 세포 외 기질에 두 구절에 대한 문화 hESCs는 (단계 2.2 참조). B-FGF를 포함 hESC의 매체를 사용합니다. </li><li> 차별화 전에 새로운 세포 외 기질 플레이트 일일 위에 hESCs는 분할합니다. 다음날 적어도 50 %의 포화 상태를 확인하는 새로운 판 / 웰,에 1 : 높은 휴대 포화 상태가 중요하므로 분할 세포 1입니다. 저산소 배양기 (4 %의 산소)에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션. &lt;BR /&gt; 참고 : hESCs는이 단계에서 계산 할 필요가 없습니다. </li><li> 다음 날, 낮은 산소 인큐베이터 (4 % 산소)의 분화 배지 (CM 포함 BMP4 / A / P 및 부족 B-FGF)과 하룻밤 문화 매체를 교체합니다. </li></ol></li><li> 융모 세포의 센다이 바이러스 감염 <ol><li> 어느 날 원하는 차별화 하루 전에 5 분 동안 0.05 % 트립신을 사용하여 (단일 세포) 분화 세포를 Trypsinize 및 젤라틴 코팅 플레이트로 전송. 차별화 매체를 추가하고 저산소 배양기에서 하룻밤 품어. </li><li> 다음날, (이 바이러스에 따라 달라집니다) 감염 매체를 추가합니다. 6 웰 플레이트 잘 하나 0.5 ml에 사용 BMP4 / A / P를 포함하는 펜 / 연쇄상 구균이 결여 사용 CM. MOI는 저산소 배양기에서 8 시간 동안 1 품어을 = 센다이 바이러스를 추가합니다. </li><li> 추가 시간 포인트가 필요한 경우, 4 시간 후 바이러스 함유 배지를 제거하고 BMP4 / A / P의 CM으로 대체. 세포를 수집RNA 분리하는 셀 스크레이퍼를 사용. </li><li> 바이러스 반응 (18)에 관여하는 유전자에 대한 QRT-PCR을 수행하여 바이러스 감염의 효율성을 확인합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+biomedicine+online%22%5BJournal%5D)">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li>
<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-four+fertilized+human+ova%2C+good%2C+bad+and+indifferent%2C+recovered+from+210+women+of+known+fertility%3B+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li>
<li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v229/n5280/abs/229132a0.html">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li>
<li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li>
<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes%3A+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li>
<li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li>
<li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li>
<li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li>
<li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li>
<li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Human+reproduction%22%5BJournal%5D)">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li>
<li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li>
<li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells%3A+to+be+or+not+to+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li>
<li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2Fnodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li>
<li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082(2009).</li>
<li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li>
<li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li>
<li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li>
<li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotrophoblastic+cell%2C+a+mononuclear+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycosylated+hCG%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leucocyte+antigen+%28HLA%29+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%2C+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 영양막 세포의 전구 세포로 hESCs는 차별화를위한 기본 단계를 제시했다. 이 프로토콜은 최근 융모 세포의 분화를 증가시키고 통상적 BMP4 단독 치료로 관찰 중배엽 전구 세포의 생성을 방지 빠르게 티빈 / 노달 시그널링 억제제의 추가 hESCs는 차별화하기 위해 최적화되었다. BMP4 모델 시스템은 인간의 영양막 세포 계보 사양 및 확장의 초기 단계의 시험을 허용한다. 또한,이 BMP4 모델 시스템은 융모막 암종 세포주 및 extravillous 영양막 세포주를 사용 불가능 특정 하위 계통에 융모 세포의 분화를 조사하는데 유용하다. 생체 유래 융모 상피 세포에서 siRNA를도 19을 사용하여 기능 상실 실험에 사용될 수있다. 또한, hESCs는 또는 hiPSCs 유전자 transgen의 유도 발현을 수정할 수 있습니다<html> ES 19 내인성 유전자좌 20...

태반은 임신 중 태아의 성장과 생존에 필요한 산모와 태아 순환 사이의 가스, 영양소, 노폐물, 호르몬의 교환을 용이하게한다. 포유류 배아 발생 동안 형성된 제 기관 6-7 일을 인간 임신 후 생쥐 1, 2, 3, 4 일 3.5-4.5 개발 시작 태반이다. 융모 세포는 태반의 가장 중요한 세포이며, 이러한 세포는 포유 동물 배아의 초기 계통 분화 이벤트 중 하나를 나타낸다. 그들은 착상 전 배반포의 외부 여분의 배아 trophectoderm 세포에서 발생한다. 태반 개발 초기 단계의 우리의 지식은 초기 인간 발달을 모델링에 대한 윤리적, 물류 제한에 의해 제한된다. 배아 이식, trophoblasts 중임산부 상피 세포를 침공하고 전문 전구 세포 (5)로 분화. Cytotrophoblasts (CTBS)의 융합 및 syncytiotrophoblasts (않은 SYN) 및 extravillous 침입 trophoblasts (EVTs)로 분화, 미분화 전구 세포를 단핵하는 앵커 자궁 태반을. 않은 SYN은 임신 유지에 필요한 호르몬을 합성 말기 분화 세포를 다핵 있습니다. 융모 세포에 손상이 유산, 전자 간증, 자궁 내 성장 제한 한 결과로 EVTs 및 않은 SYN을 생성 초기 분화 이벤트는, 태반 형성에 필수적이다. 개발 된 인간 영양막 세포주의 종류 CTBS 태반 호르몬 및 디스플레이 속성 침습 6 생산 융모 상피암를 불멸화 포함한다. 인간의 첫 번째 임신의 태반에서 차 융모 세포는 고립하지만, 세포 빨리 DIF 할 수 있습니다ferentiate 및 체외에서 증식 중지합니다. 중요한 변형 일차 세포주는 종양 및 영양막 불멸화 세포주 정확하게 차 trophoblasts 7 표현되지 않을 수 있음을 나타내는 다른 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 또한,이 라인은이 세 번째 학기를 통해 첫 번째 이후의 단계에서 파생되기 때문에 태반의 영양막 세포 줄기 세포 전구 세포를 닮은 않을 것이다. 태반의 형성 및 기능의 초기 사건을 연구하기 위해 초기 단계 인간 trophoblasts의 체외 배양 시스템에서 강력한 필요성이있다. 착상 전 배아의 내부 세포괴와 속성을 공유하는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)은, 종종 조기 태반의 형성을 포함한 초기 인간 현상을 모델링하기 위해 사용된다. 두 사람의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 및 hESCs는 뼈 모르를 사용하여 체외에서 trophoblasts로 분화 될 수있다phogenic 단백질 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4을 이용한 융모 세포로 다 능성 세포의 이러한 변환은 인간 세포에 특이하고 초기 인간 배아 구 (16)에 대한 액세스를 필요로하지 않기 때문에 널리 초기 인간 태반의 개발을 연구하는데 사용된다. 최근에는 발견되었다는 억제제의 첨가 A83-01 (A) 및 된 Smad2 / 3, MEK1 / 2의 신호 전달 경로를 차단 PD173074 (P)는, trophectoderm 같은 조상 주로 않은 SYN으로 hPSC 분화의 효율을 증대 및 중배엽, 내배엽, 또는 외배엽 세포 9, 17의 광범위한 세대가없는 EVTs, </suP&gt;. 십이일 인간 포배 단계의 배아로부터 단리 trophectoderm 세포와 유사한 유전자 발현 프로필을 가지며 각종 태반 특정한 성장 호르몬 분비에 대한 이러한 매질 조건을 이용하여, hESCs는이 시험 관내 모델 시스템 (9), (11)의 유효성을지지 차별화. 여기서는 BMP4 / A / P 배지를 이용하여 인간 전구 세포 영양막에 hPSCs의 생체 외 분화에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이러한 조건은 리포 펙션 - 매개 형질 전환을 사용하여 RNA 서열, 유전자 파괴 된 siRNA를 이용하여, 병원체 감염, 유전 적 변형을 포함한 다양한 애플리케이션에 세포 과잉수 생산.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>이 프로토콜에서는 이를 "혈청 대체"라고 합니다.</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV형</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Rock inhibitor Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>방사선 조사 CF1 MEF</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEF는 배아 13.5일 배아부터 생성되어 방사선 조사될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>0.22 & 마이크로; m 주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i 저산소 인큐베이터</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>산소 농도를 조절할 수 있는 용량이 있는 모든 조직 배양 인큐베이터로 충분합니다.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D 시스템</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>83-01</td><td>R& D 시스템</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R & D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol은 총 RNA를 분리하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>이 프로토콜에서는 이를 "세포외 기질"이라고 합니다.</td></tr></tbody></table>

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

태반은 배아 발생 동안 처음 개발 기관이며, 배아의 생존을 위해 필요하다. 태반이 착상 전 배반포의 여분의 배아 trophectoderm 세포로부터 분화 다양한 융모 세포로 구성되어 있습니다. 이와 같이, 인간 태반의 초기 분화 이벤트에 대한 우리의 이해 때문에 인간 배아의 분리 및 조작에 대한 윤리적, 법적 제한으로 제한됩니다. 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)은 인간 발달을 조사하기위한 견고한 모델 시스템이며 또한 다양한 영양막 세포 유형의 마커를 발현 융모 세포로 생체 외에서 분화 될 수있다. 여기서, 우리는 뼈 형태 형성 단백질 (4) 및 티빈 / 노달 신호 전달 경로의 저해제를 사용하여 세포 내로 융모 hPSCs를 구별하기위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜 된 siRNA로 형질 감염 될 수있는 다양한 영양막 세포 유형을 생성손실의 기능 표현형을 조사 또는 병원균에 감염 될 수있다합니다. 또한, hPSCs는 유전자 변형 될 수 있고, 당시의 기능 이득 분석을 위해 영양막 세포의 전구 세포로 분화. hPSCs부터 인간 trophoblasts를 발생이 체외 분화 방법은 초기 인간 배아 작업의 윤리적 법적 제한을 극복하고,이 시스템은 약물 발견 및 줄기 세포 연구를 포함한 다양한 용도에 사용될 수있다.

hPSCs의 체외 분화의 개요 이 체외 분화 프로토콜은 하나의 통로 (그림 1A)에 대한 조건없는 공급기로 전환하는 MEFs에 성장 미분화 hESCs는 시작됩니다. 우리는이 프로토콜에 hESCs는의 분화를 설명하는 동안, 우리는 성공적으로 융모 세포로 hiPSCs를 구별하기 위해이 프로토콜을 사용했다. 세포 외 매트릭스로의 전환은 인간 융모 성 세포의 순수 인구 요구 분석을위한 바람직하지 않다 조사 된 MEFs의 대부분을 제거한다. 미분화 hPSCs는 세포 외 기질에 성장 식민지가 계대 (약 1 주일)에 대한 준비가 될 때까지 CM은 B-FGF를 포함하는 배양한다. 이것은 BMP4 / A / P - 매개 분화를 유도하기 전에 능성 상태를 유지한다. 식민지는 ~의 덩어리로 50 ~ 100 세포를 파괴하는디...

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

본 프로토콜의 전체적인 목표는 bone morphogenic 4와 active 및 nodal 신호 전달 경로 억제제를 사용하여 인간 다능성 줄기세포를 인간 영양막 세포로 분화시켜, 인간 태반 형성 및 기능의 초기 과정을 연구하는 것입니다. 이 방법은 영양막 세포의 기능과 이러한 세포가 형성되는 방식에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전학을 포함한 매우 다양한 응용 분야에 사용할 수 있는 풍부한 영양막 세포를 생성하고 세포 기능 분석을 가능하게 한다는 점입니다.실험을 시작하려면, 세포외 기질(extracellular matrix) 분주액을 얼음 위에서 3~4시간 동안 해동합니다. 얼음처럼 차가운 팁, 차가운 50 milliliter 원추형 튜브 및 Dulbecco's modified equal medium(또는 DMEM F12 배지)를 사용하여, 2 mg의 세포외 기질을 24 mL의 차가운 DMEM F12로 옮깁니다. 즉시 50 milliliter 원추형 튜브를 얼음으로 옮겨 4 °C에서 보관합니다.조직 배양 플레이트를 코팅하려면, 6-웰 플레이트의 웰당 1 mL의 희석된 세포외 기질을 추가합니다. 플레이트를 흔들어 웰을 코팅하고 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 새 플레이트에서 세포외 기질을 흡입하여 제거하고, bFGF가 포함된 마우스 배아 섬유아세포 조건 배지(MEFCM)를 추가합니다.피펫을 사용하여 MEF 플레이트에서 긁어낸 세포 덩어리를 옮겨 세포외 기질이 코팅된 플레이트에 분주합니다. 그런 다음 플레이트를 배양합니다. 매일 Pasteur 피펫으로 분화된 세포를 긁어낸 후, 웰당 2 mL의 배지를 사용하여 MEFCM을 bFGF 배지로 교체합니다.현미경 상에서 콜로니가 크고 밝게 보이면, 6~7일마다 hESC를 계대 배양하십시오. 무피더 세포의 계대 배양 준비가 되면, 배지를 제거하고 피펫을 사용하여 1 mL의 PBS를 첨가해 세포를 세척하십시오. PBS를 흡입하여 제거하고, 피펫으로 미리 데워둔 0.5 mg/mL dispase로 교체하십시오.세포를 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 웰당 2mL의 PBS를 첨가하여 세포를 세척하고 PBS를 흡인하여 제거합니다. 웰당 1mL의 CM을 첨가하고 5mL 피펫 팁을 사용하여 세포를 작은 덩어리로 수동 스크래핑합니다.다음으로, 부유된 세포 덩어리를 새로운 세포외 기질 코팅 플레이트에 분주합니다. 분화 배지를 준비합니다. bFGF가 포함되지 않은 CM을 사용하며, 사용 직전에 신선한 억제제를 첨가합니다.5% 산소 농도로 설정된 인큐베이터 내에서 배양되어 세포외 기질(extracellular matrix)이 코팅된 플레이트에서 한 번의 계대 배양을 거친 피더 프리(feeder-free) hESC를 사용하십시오. 세포외 기질 코팅 플레이트로의 첫 번째 계대 배양 후, 세포가 24시간 동안 부착되도록 둡니다. 다음 날, bFGF가 포함된 CM을 제거하고 BMP4/A/P가 포함된 CM으로 교체하여 분화를 유도하며, 6-웰 플레이트의 웰당 2 mL씩 분주합니다.4% 산소 농도에서 세포 배양을 계속합니다. 이틀마다 기존 배지를 흡입하여 제거하고 BMP4/A/P가 포함된 새 배지를 추가함으로써 BMP4/A/P가 포함된 CM을 교체합니다. 원하는 시점에 세포를 수집합니다.bFGF가 포함된 hESC 배지를 사용하여 MEF로부터 분리한 hESC를 세포외 기질 위에서 2회 계대 배양합니다. 높은 세포 밀도가 중요하므로, 다음 날 최소 50%의 합류도(confluency)가 확보될 수 있도록 hESC를 새 플레이트에 1:1 비율로 분할하여 접종합니다. 세포를 저산소 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 배지를 웰당 2 mL의 분화 배지로 교체합니다. 세포를 저산소 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. transfection 전, 디쉬에 0.1% gelatin을 첨가하여 gelatin 코팅을 수행합니다.디쉬를 흔들어 플레이트를 코팅한 다음, 플레이트를 상온에 둡니다. 20분 후, 젤라틴을 제거합니다. 원하는 시점까지 세포를 분화시킵니다.형질전환 전날, 0.05% trypsin을 사용하여 세포를 5분 동안 trypsin 처리합니다. 젤라틴이 코팅된 플레이트에 세포를 원하는 밀도로 분주합니다. bFGF가 제외되고 BMP4/A/P가 포함된 CM을 첨가한 후, 배양물을 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 세포에 신선한 분화 배지를 추가합니다. siRNA transfection 시약을 사용하여 siRNA를 transfection합니다. plasma DNA의 경우, 적절한 lipofectamine 시약을 사용하십시오.각 transfection 시약에 대해 설명된 제품 프로토콜을 따르십시오. siRNA lipofectamine 복합체를 세포가 담긴 각 웰 또는 플레이트로 옮기고 부드럽게 혼합합니다. 그 후, 저산소 인큐베이터에서 세포를 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 배지를 신선한 분화 배지로 교체합니다. quantitative RT-PCR을 사용하여 유전자 결손 효율을 확인하기 위해 원하는 시점에 세포를 수확합니다. 마지막으로, 세포를 수확하려면 웰당 0.05% trypsin 1 mL를 첨가하고 세포를 배양합니다.트립신을 중화하기 위해 웰당 5 mL의 MEF 배지를 추가합니다. 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 침전시킨 후, 이 세포 펠렛을 RNA 분리에 사용합니다. 이 기술을 사용하면 형태학적 변화를 명확하게 확인할 수 있습니다.분화 1일 차의 세포는 0일 차의 세포보다 크기가 큽니다. 분화가 진행됨에 따라 세포는 분열하며 콜로니의 중심부에서 바깥쪽 방향으로 확장하며 성장합니다. 분화 5일 차가 되면 개별 콜로니들이 서로 병합되며 세포들이 서로 겹쳐서 성장하게 됩니다.QRT-PCR 분석 결과, hESC CM 배지에서 beta FGF를 포함하여 배양한 세포와 비교했을 때, BMP4와 함께 배양하여 분화시킨 지 1일 후에는 다능성 C-마커인 NANOG의 상대적 발현 수준이 75% 감소하였으며, BMP4/A/P 존재 하에서는 90% 감소한 것으로 나타났습니다. 분화 2일 차에는 BMP4 단독 또는 BMP4/A/P로 배양한 세포의 NANOG 수준이 매우 낮았습니다. 분화 1일 차와 3일 차에 GFP 플라스미드를 사용하여 BMP4/A/P 처리 세포에 도입한 형질전환 결과, 형질전환 24시간 후 30~50%의 형질전환 효율을 얻었습니다.이 영상을 시청하고 나면, 인간 다능성 세포를 체외에서 영양막 세포로 분화시키는 방법과 유전자 발현 조절을 위해 DNA 구조체를 도입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

in-vitro-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 고립과 blastocysts에서 trophoblast의 줄기 세포의 유도를 보여줍니다. 우리는 또한 줄기 세포 속성의 유지 보수뿐만 아니라 문화에 분화의 유도에 대한 조건을 설명합니다.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

이 프로토콜에서는, 우리는 Percoll 기울기를 사용하여 trophoblast 세포의 분리에 이어 임신 d10.5에 마우스에서 placentae의 절개를 설명합니다. 우리는 matrigel의 침공 분석에서 분리 된 세포의 사용을 보여줍니다.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

전통적인 2 차원 세포 배양 기술은 종종 차별화 마커, 크린 시토킨 및 성장 요인과 관련하여 변경된 특성의 결과. extravillous trophoblast 세포 라인과 함께 그림과 같이 회전 세포 배양 시스템의 세 가지 차원 세포 배양 (RCCS)는 이러한 요소 중 많은 표현 reestablishes.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

이 원고는 저산소증/재산소화 하에서 배양된 면역정제된 인간 융모 세포영양아세포 세포의 독특한 체외 모델을 제시합니다. 이 모델은 멜라토닌과 같은 유망한 치료법이 산화 스트레스 증가 및 태반 기능 변화와 관련된 임신 합병증에 대한 보호 효과를 연구하는 데 적합합니다.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

영양막 거대 세포(TGC)는 태반에서 건강한 임신을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다. 우리는 착상 후 배아의 저온 유지 절편에서 초기 형광 제자리 교잡 또는 배아 7일차 외부 태반 원뿔의 단기 배양에 의해 TGC에서 유전자의 전사 상태를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

의 초기 RNA 물고기에 의해 전사 분석<em&gt; 생체</em&gt; 영양막 세포 거대 세포 또는<em&gt; 체외</em&gt; Ectoplacental 콘의 Explants의 단기 문화

여기, 우리는 3 개의 생체 외 분석 실험을 사용 하 여 인간의 trophoblast 셀에 셀 운동 평가 위한 매우 액세스할 수 있는 프로토콜 제시: 스크래치 분석 결과, transwell 침략 분석 결과 및 세포 확산 분석 실험.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

배반포와 같은 세포를 효율적으로, 시기 적절하고, 순차적으로 생성하는 인간 블라스토이드의 형성을 요약하는 프로토콜.

인간 배반포 모델링 배반포 개발 및 이식을 위한 프로토콜

현재 프로토콜은 영양막 세포와 같은 세포가 세포외 기저막 매트릭스 층에 걸쳐 모세관 같은 구조로 조직되는 고전적인 체외 혈관 형성 분석에서 형성된 튜브와 같은 구조를 복구할 수 있도록 합니다. 회수된 구조는 다양한 생화학 분석을 위한 RNA 및 단백질 분리에 사용됩니다.

분화 마커 발현 분석을 위한 Angiogenesis-Tube Formation Assay에서 영양막 세포 회수

배우세요 인간 다능성 줄기 세포를 융모 세포로 분화시키는 방법을 BMP4와 신호 경로 억제제를 사용하여. 이 기술은 태반 형성과 조기 발달 연구에 효율적인 세포 생산을 가능하게 합니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

더 많은 동영상 탐색