Name: 개발 메타 리지 움 anisopliae Mycoinsecticide로서의 : 분리에서 현장 성능까지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: 배우세요 Metarhizium anisopliae를 이용한 마이코살충제 개발 방법을. 토양에서 분리한 균주를 선별하고 효능을 평가하여 지속 가능한 농업 해충 관리를 위한 생물학적 방제제를 제조하는 전 과정을 확인하세요.

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저자들은 뉴 델리 생명 공학과의 ISCB (Indo-Swiss Collaboration in Biotechnology) 프로그램과 스위스 베른 (Berne)의 스위스 개발 및 협력기구에서 협력자가 기여한 점을 인정합니다. Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane 및 Abhijeet Lande를 포함한 마이코 살충제 개발에 참여한 프로젝트 학생 및 직원의 공헌을 인정합니다. EKP와 SGT는 인도의 대학 보조금위원회와 인도의 과학 산업 연구 협의회 (CSIR)에서 연구 펠로우 십에 감사를 표합니다. MVD는 뉴 델리 명예 과학자 계획 산업 과학 연구위원회 (Council of Industrial and Scientific Research)의지지를 표합니다. 저자들은 ISCB 및 SBIRI 프로그램에 따른 재정적 지원에 대해 인도 뉴 델리의 생물 공학과 (Department of Biotechnology)에 감사드립니다. 우리는 감사하고 있습니다.검토 자에게 제공합니다.

1. Entomopathogenic 곰팡이의 분리 <ol><li> 토양 희석법 <ol><li> 다른 작물 장에서 토양 표본과 진균 성 곤충을 수집하십시오 ( 표 1 ). 토양 희석 도금 방법 8을 사용하여 토양 샘플에서 곤충 병원성 진균을 분리합니다. 주 : 본 연구에서는 Pune (18 ° 31&#39;13&#39;&#39;N; 73 ° 51&#39;24&#39;&#39;E)과 Buldhana (19 ° 58&#39;36&#39;&#39;N 76 ° 30&#39;30&#39;&#39;E ) 지구, Maharashtra, 인도. </li><li> 각 토양 시료 10g을 달아 무균의 0.1 % (w / v) Tween-80 90mL에 따로 따로 첨가한다. </li><li> 토양 입자에 부착 된 포자를 방출하기 위해 60 분 동안 자기 교반기를 사용하여 시료를 철저하게 섞는다. </li><li> 혼합 후, 각 샘플에서 (g / L) : 펩톤, 10을 포함하는 선택 배지에 100 내지 200 μL 분취 량을 퍼뜨린다. 글루코오스, 20; 한천, 18 세; 스트렙토 마이신 0.6; 테트라 사이클린, 0.05; 싸이클로 헥사 마이드, 0.05; 및 도딘, 0.1 mL; pH 7.0 9 . 28에서 플레이트를 품어 ° C. 3-7 일. </li><li> 순수 배양 물을 얻기 위해 동일한 배지에서 개별 포자 형성 콜로니를 선택하고 계대 배양하십시오. </li></ol></li><li> 진균류 곤충에서 <ol><li> 들판에서 mycosed 곤충을 수집합니다. 참고 : 단단한 애벌레 몸체는 곤충 병원성 균에 감염 될 가능성이 있습니다. 세균성 또는 바이러스 성 감염으로 죽은 곤충 몸체는 부드럽습니다. </li><li> 비정상적인 행동, 빈약 한 조정 및 불규칙한 움직임으로 살아있는 곤충을 모으십시오. </li><li> 28 ° C와 70-80 % RH에서 추가 균종과 포자 성화가 일어날 때까지 곤충을 사체에 보관하고 촉촉한 방으로 옮기십시오. </li><li> 위에서 언급 한 선택 배지에 포자 모양의 포자에서 포자를 줄기 및 같은 매체에 2-3 배 더 subculturing하여 순수 문화를 얻을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 미끼 법 <ol><li> 안에유리 병 (3.85 x 6.0 cm)에 토양 시료 60 g을 넣고 벼 유충 ( Corcyra cephalonica ) 4 개를 넣고 25 ± 2 ° C에 14 일 동안 보관합니다. </li><li> 매일 바이알을 뒤집어 놓습니다. 14 일 후, 진균류 나방 유충의 존재에 대한 토양 샘플을 조사하십시오. 선택적 배지에 포자를 포자에서 줄기로 entomopathogenic 곰팡이를 분리. </li><li> 순수한 배양 물을 얻은 후, 분리 균주를 감자 덱스 트로 오스 한천 (PDA) 배설물에 옮기고 28 ° C 및 70-80 % RH에서 7 일 동안 배양하여 포자 균을 허용한다. 포자를 낳은 후 사용하기 전까지 모 배양을 8 ° C로 유지하십시오. </li></ol></li></ol> 2. Entomopathogenic 곰팡이의 식별 <ol><li> 형태 학적 특성 ( 즉, 무성 포자의 크기와 형태, 분생 포자의 포자 배열)을 관찰하여 곤충 병원성 진균을 확인한다. 3 개의 주요 속의 분리, Metarhizium , Beauv<html> 에리아, 노무 라이아 등을 확인할 수 있습니다. </li><li> Metarhizium 균주의 분자 동정을 위해, DNA isolation kit를 이용하여 균사체 바이오 매스로부터 게놈 DNA를 추출한다. 제조업체의 지침을 따르십시오 ( 재료 표 참조). 0.8 % 아가 로스 겔에서 전기 영동을 수행하여 게놈 DNA의 품질을 확인하십시오. <ol><li> ITS1-5.8S - ITS2 및 26S rDNA 영역을 PCR 증폭. ITS1 포워드 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)와 ITS4 리버스 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) 프라이머 10 으로 genomic DNA를 template로 사용하십시오. </li><li> 겔 추출 키트를 사용하여 예상 크기의 앰플 리콘을 겔에서 용리하고 정제하십시오. 제조업체의 지침을 따르십시오 ( 재료 표 참조). 정제 된 amplicon과 서열을 정량하십시오. </li><li> 소프트웨어를 사용하여 서열을 읽고 편집하고 NCBI GenBank 데이터 라이브러리의 염기 서열을 BLAST 검색하여 가까운 상 동성을 분석하십시오= &quot;xref&quot;&gt; 11. </li><li> 접근 번호를 검색하기 위해 NCBI GenBank 데이터베이스에 식별 된 entamopathogenic 분리의 시퀀스를 입금. </li></ol></li></ol> Metarhizium 3. 심사는 반대 H.의 armigera 격리 된 것 <ol><li> 곤충 사육 <ol><li> 현장에서 곤충의 건강한 유충 및 번데기를 모아서 H. armigera 의 초기 양식을하십시오. </li><li> 응원, 10 분 (12) (3.85 X 50 cm 6.0 ㎖의 용량) 멸균 폴리 프로필렌 튜브에서 각각 0.5 % 살균 오크라의 조각을 포함하는 (v / v)의 차아 염소산 나트륨을 유충 성장. </li><li> 양육 중에 놓인 곤충 알을 모으고 0.5 % (v / v) 차아 염소산 나트륨으로 표면 살균하십시오. </li><li> 25 ± 2 ° C 및 65 ± 5 % RH에서 유충 유지. </li></ol></li><li> 곤충 생물 분석 참고 : 곤충 생물 분석을 위해, 포자의 생산,달리 명시되지 않는 필드의 성능 시험은 mycosed H. armigera의 유충에서 Metarhizium 균주의 첫번째 계대 배양을 사용 하였다. <ol><li> 곤충 생물 분석을 위해서는 H. armigera 의 III-instar 유충을 사용하십시오. </li><li> 별도로 언급하지 않는 한 Metarhizium 분리 물 (1 x 10 7 포자 / mL, 생존률&gt; 90 %)의 10-mL 포자 현탁액에 개별적으로 30 개의 유충 한 세트를 5 초 동안 3 회 담근다. </li><li> 처리 후 식인 풍습을 피하기 위해 각 유충을 개별적으로 멸균 바이알에 옮깁니다. 각 바이알에 촉촉한 Whatmann 여과지 1 번과 소독 된 오크라 조각을 사료로 첨가하십시오. 대체 요일에 용지와 공급을 변경하십시오. </li><li> 유충을 25 ± 2 ° C, 65 ± 5 % RH 및 16 : 8의 가벼운 곳에 보관하십시오 : 14 일 동안 또는 그들이 죽을 때까지 어둡게하십시오. </li><li> 죽은 유충을 축축한 면봉이 들어있는 멸균 페트리 플레이트에 옮기고 균사체와 포자를 허용하도록 3-7 일 동안 28 ° C와 70-80 % RH에서 보관하십시오시체 위로 형성. </li><li> 대조군의 경우, 멸균 증류수에 0.1 % (w / v) Tween-80을 3 회에 걸쳐 30 마리의 유충을 처리하십시오. </li><li> 신선하게 준비된 포자 현탁액을 사용하여 모든 실험을 3 회 실시하십시오. 평균값을 얻기 위해 세 번의 실험에서 사망률에 대한 데이터를 수집하고 저장합니다. Abbott의 공식을 사용하여 보정 된 사망률을 계산하십시오 13 . </li><li> 무작위로 완성 된 블록 설계 (RCBD) 레이아웃을 사용하여 실험을 수행하십시오. 각각의 처리에는 30 개의 애벌레가 3 세트로 포함되어 있습니다. H. armigera 에 대한 사망률을 기준으로 상업 생산을위한 최고의 분리 균주에 대한 추가 스크리닝을 위해 Metarhizium 분리주를 선택하십시오. </li><li> H. armigera III-instar 유생에 대해&gt; 90 %의 사망률을 나타내는 격리 균주를 선택하십시오. 참고 : 여기에서 12 균주가 선택되었습니다. </li><li> 이 분리 균의 LT 50 을 결정하고 분리 균을 선택하십시오.가장 빠른 살인 등급 (짧은 시간 내). 참고 : 여기서 가장 고립 된 12 개의 분리주에서 5 개의 분리주가 선택되었습니다. </li><li> 포자 현탁액의 4 가지 농도 (즉, 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 및 1 × 10 9 포자 / mL)를 사용하여 선택된 분리 물의 LC 50 값을 결정합니다. </li><li> H. armigera 의 III-instar 유충에 대한 Metarhizium 균주의 LC 50 을 측정하여 단회 투여 만 사용하는 경우에는 발견되지 않을 높은 사망률 값을 가진 격리 균의 독성의 차이를 확인할 가능성을 높입니다. </li></ol></li></ol> 4. 현장 성능 연구를위한 Metarhizium Isolate의 포자 생산 <ol><li> SSF에 의한 Metarhizium 포자 생산 <ol><li> SSF 들어, Metarhizium 분리 2 x 10 7 포자를 추가하여 inoculum을 준비YPG (0.3 % 효모 추출물, 0.5 % 펩톤 및 1.0 % 글루코스) 배지 200㎖를 첨가 하였다. 48 시간 동안 흔들어 (180 rpm) 28 ° C에서 flasks를 품어. </li><li> SSF에 의한 포자의 대량 생산을 위해서는 별도의 언급이없는 한 밥을 기질로 사용하십시오. </li><li> SSF의 경우 2kg의 쌀과 함께 오토 클레이브 백 (type / 14, 0.5μm의 단일 미세 여과기 필터, 용량 2kg, 64x36cm)을 채 웁니다. 봉지의 쌀 증류수 1,000 mL를 첨가하고, 밤새 14 소크. 121 ° C에서 담근 쌀로 백을 45 분 동안 오토 클레이브합니다. 15 . </li><li> 48 시간 된 균사체 접종 물 (10 % 접종 물, 2kg 쌀의 경우 200mL)을 접종하고 28 ° C 및 70-80 % RH에서 14 일 동안 배양하십시오. </li><li> 0.1 % Tween-80을 사용하여 액체 추출에 의해 포자를 수확하십시오. 이를 위해 백의 내용물을 0.1 % Tween-80 (쌀 1kg 당 3L)에 넣고 철저히 혼합하고 원심 분리하여 액체와 포자를 분리 한 다음 37 ℃에서 2 일 동안 건조시킵니다 &lt;<html> / li&gt; <li> 또는 수분 함량을 줄이기 위해 37 ° C에서 2 일 동안 포자와 일부 균사가있는 쌀이 들어있는 백을 건조시킵니다 (&lt;20 %). myco-harvester 또는 vibro-sifter를 사용하여 포자를 수확하십시오. </li></ol></li><li> 생존 능력 연구 <ol><li> 다른 방법을 사용하여 수확 된 포자의 생존율을 결정하십시오 15 . 이를 위해 포자 현탁액을 0.1 % (w / v) Tween-80으로 준비하고 1 x 10 3 포자 / mL로 조정하십시오. </li><li> PDA 플레이트에 포자 현탁액 (0.1 ML)을 3 배로 퍼 내고 72 시간 동안 28 ° C 및 70-80 % RH에서 배양합니다. </li><li> 격리 된 식민지를 수동으로 계산하고 각각의 샘플에 대한 전체 생존 수를 결정합니다. </li></ol></li><li> 포자 침강 속도 <ol><li> 균일 한 복용량을 위해 균질 한 포자 현탁액이 필요합니다. 설명 된대로 Metarhizium 균주의 포자 침강 속도를 결정하십시오.&quot;xref&quot;&gt; 16. 0.2 M 황산 암모늄과 0.1 % Tween-80에서 포자의 침강 속도를 확인하십시오. </li><li> 540 nm에서 0.6의 초기 흡광도를 얻으려면 ~ 7 × 10 7 포자 / mL로 포자 현탁액의 수를 조정하십시오. 포자가 안정화되도록 큐벳을 6 시간 동안 그대로 두십시오. </li><li> 최대 6 시간 동안 흡광도를 기록하십시오. 침강 속도를 %로 표현하고 50 % 침강에 필요한 시간을 계산하십시오 (ST 50 ). 갓 준비한 포자 현탁액을 사용하여 실험을 세 번 반복하십시오. </li></ol></li></ol> 5. 비둘기 완두에서 H. armigera 를 통제하기 위하여 선택된 M. anisopliae 분리 물의 능력에 관한 현장 성능 연구 <ol><li> M. anisopliae M 34412 포자의 습윤 분말 제형 <ol><li> 포자와 활석을 혼합하여 2.5-5 % 습윤성 분말 제제를 준비합니다. </li><li> 최종 생존 수 (TVC)를 1 x 10 12 spo로 조정하십시오.입술 1 킬로그램 당 입술. </li></ol></li><li> M. anisopliae M 34412 포자의 현장 수행 연구 <ol><li> 비둘기 완두에서의 H. armigera 감염을 통제하기 위해 선택된 M. anisopliae 분리 물의 능력에 대한 현장 성능 연구를 위해, 4 번의 복제로 RCBD를 사용하십시오. 참고 : 여기 Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E)에서 공연. </li><li> 포자 (5 x 10 12 포자 / 3 L의 디젤 : 해바라기 유, 7 : 3)와 Tween-80 (0.1 %)의 수성 제제의 오일 제제 인 두 가지 다른 스프레이 제제를 사용하십시오. 배수 분무기 (5 x 10 12 포자, 500 L / ha)로 수성 배합물을 초 저량 (ULV) 분무기 (70 분; 3 L / 헥타르)로 분무합니다. 참고 : 여기에서, 유생 개체수는 분무하기 하루 전과 무작위로 선정한 5 개의 식물에 각 분무를 적용한 후 3 일과 7 일 후에 기록했습니다. 전체 인구는 t통계 분석을 위해 n + 1의 제곱근으로 변환됩니다. <ol><li> 비둘기 완두 농작물에 대한 농업 관행에 따르면, 산란 후 10 일에서 15 일 사이에 첫 번째 살포를 수행하고 14 일 간격으로 2 번 더 살포하십시오. 16:00에서 18:00시 사이에 분무를 수행하십시오. 바람 방향을 모니터하고 필요할 경우 천 커튼을 사용하여 포자가 인접한 플롯으로 이동하지 않도록하십시오. </li></ol></li><li> 비교를 위해 손 살포 배낭 분무기로 화학 살충제를 분무하십시오. </li><li> 살포 후 0, 3, 5, 7, 14 일에 H. armigera 유충을 채집하여 현장에서 접종 균의 지속성을 결정합니다. </li><li> 이 애벌레를 14 일 동안 관찰 한 후 사후 보관 한 후 젖은 여과지가 들어있는 플라스틱 병에 옮깁니다. mycosis를 관찰하기 위해 25 ± 2 ° C 및 70 ± 10 % RH에서 인큐베이션하십시오. </li><li> p에 근거하여 유충 개체군의 접종 물 지속성을 결정합니다.<html> 살포 후 현장에서 채집 한 유충의 사상충도 자료. </li><li> 유효성 % 17 , 포드 (pod) 손상 % 및 수확량 퍼센트 18을 기준으로 현장 조사를 평가하십시오. 참고 : 여기서 온도, 습도, 풍속 (km / h), 햇빛 (h), 강우량 (mm), 비오는 날 및 증발량 (mm)과 같은 매개 변수에 대한 데이터는 농업 대학 (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li></ol></li><li> 농민 참여 프로그램 <ol><li> 시범 재판을 위해 농부 수를 선택하십시오. 비둘기 완두 종자 (BSMR - 736)를 농부들에게 비료와 함께 공급하십시오. 참고 : 본 연구에서는 20 명의 농부가 참여했습니다. 마을 : Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). </li><li> 단계 5.2에서와 동일한 스프레이 배합 및 스프레이 수를 사용하십시오. </li></ol></li></ol>tle &quot;&gt; 6. 비 표적 생물에 미치는 영향 <ol><li> 비둘기 완두 잎에 mycoinsecticide 스프레이가 있으면 그 영향을 관찰하십시오. </li><li> 미 처리 플롯과 M. anisopliae로 처리 한 플롯에서 각 처리 후 1 일 후에 토양 주거 arthropods와 잎에 서식하는 곤충을 수집하십시오. </li><li> 처리 후 24 시간 이내에 함정에 빠진 함정이있는 토양에 사는 절지 동물을 모으고 치료 후 아침 ( 예 : 치료 후 약 15-18 시간)에 소엽이있는 곤충을 수집합니다. </li><li> 직경 3.5cm, 높이 4.0cm 인 원통형 플라스틱 박스에 개별적으로 보관하십시오. 곤충에 매일 감염이 있는지 확인하고 적절한 음식을 먹이십시오. </li><li> M. anisopliae 의 존재를 기록하고, 곰팡이를 분리하십시오. </li></ol> 7. 품질 관리 매개 변수의 식별 <ol><li> 28 °에서 PDA의 포자 발아율을 측정하여 포자 생존 능력을 확인하십시오;기음. </li><li> 이전 15 바와 같이, YPG 키틴 매체 제조 예 키틴, 키틴 데 아세틸 라제, chitosanase, 프로테아제, 리파제 등의 표피 분해 효소 활동을 측정. </li><li> 실험실 생물 분석에서 H. armigera의 사망률을 결정합니다 15 . </li><li> M. anisopliae의 독성 속성으로 Chitinases ( Chit 1 , 2 및 4 ) 및 protease ( Pr1A ) 유전자의 PCR-RFLP 패턴과 같은 분자 마커를 사용합니다. <ol><li> DNA 격리 키트 15를 사용하여 균사체 바이오 매스에서 게놈 DNA를 추출합니다. Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCCATAT) 및 Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA) 프라이머 쌍을 이용하여 게놈 DNA를 주형으로하여 Chit1 및 Chit2 유전자 단편을 PCR 증폭한다. Chit4 들어 , 프라이머 쌍 Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG). </li><li> Pr1A 유전자의 증폭을 위해서는 METPR2와 METPR5 프라이머 쌍 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG)을 사용하십시오. </li><li> BsaJI , BstUI 및 ScrFI로 Chit1 유전자의 제한 효소 절단 19 를 수행하십시오. ALUI, HpyCH4IV 및 HpyCH4V,와 BstUI, HaeIII, 그리고 MboI와 Chit4 유전자의 Chit2 유전자. Pr1A 유전자의 소화에는 RsaI , DdeI 및 MspI 20을 사용하십시오 . </li><li> 대부분의 독성 균주 (&gt; 90 % 사망률)에 대해 각 유전자에 대한 전기 영동으로 1.5 % 아가 로스 겔에서 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 패턴을 관찰한다. 이것은 M. anisopliae 의 선택을위한 병독성 마커로 사용될 수있다. </li></ol></li></ol>

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<html> 1880 년대에, 첫 번째 시도는 스카 랍 비틀 ( Anisoplia austriaca) 과 사탕무 관상어 인 Cleonis punctiventris 21 을 통제하기 위해 Metarhizium 을 사용하려는 첫 시도였다. 이 프로토콜에서 선행 조건 중 하나는 토양 또는 감염된 곤충으로부터 독성 균주를 분리하는 것이 었습니다. 실제로 LC 50 , LT 50 및 ST 50 과 같은 다른 매개 변수는 제품 22 , 23 의 비용 효율성에 크게 기여했습니다. 포자 생산의 최적화를 위해, 포자, 생존의 수, 독성 사이의 미묘한 균형은 24 maintainend했다. 농업은 대량...

<html> 인도에서 1940 년대에 유기 염소 살충제의 도입에서, 살충제의 사용은 작물 해충은 여전히 농업 생산의 수율 손실의 측면에서 매년 루피 2 수십억을 비용으로 많은 배 (1) 증가했다. 합성 농약의 광범위하고 비 현명한 사용은 환경과 인간의 건강 (1)에 대한 지속적인 위협이다. 농약의 무차별적인 사용은 토양의 잔류 물과 자연 해충 포식자의 고갈로 이어진다. 또한 저항 1의 개발로 이어지는, 해충 인구의 유전 적 구성을 변경하기위한 강력한 선택 압력으로 작용한다. 비료와 살충제 같은 높은 투입물을 요구하는 녹색 혁명의 엄청난 이익에도 불구하고, 해충은 주요한 생물학적 제약이 계속되고 있습니다. 인도 및 전세계의 연간 작물 손실 기록에 대한 일반적인 추정치는 120 억 달러EF &quot;각각&gt; 2 USD 2,000 억 3. 화학 살충제가 해충을 방제 할 때 해로운 영향을 미칠 경우 생태 학적으로 건전하고 신뢰할 수 있으며 경제적이며 지속 가능한 대체 방법을 찾아야합니다. 생물학적 방제는 적절한 대안을 제공하며 기생충, 포식자 및 미생물 병원균의 사용을 포함합니다 4 . 예를 들어 곰팡이는 나비목, hymenopterans, coleopterans 및 dipterans를 비롯한 광범위한 해충을 감염시키는 것으로 알려져 있으며, 종종 자연적인 감염증을 초래합니다. 또한, 다른 바이러스 및 박테리아, 곤충 방제 제는 달리, 곤충 병원성 진균의 작용 모드는 접촉자 (5)가된다. 이 곰팡이는 100 종 이상의 이종 그룹으로 구성되어 있으며, 약 750 종이 서로 다른 곤충들 사이에서보고됩니다. 중요한 곰팡이 병원균은 다음과 같습니다 : Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea의 rileyi, Lecanicillium의 lecanii 및 Hirsutella 특검팀은., 6 몇 이름을 지정합니다. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin은 생물학적 방제에서 두 번째로 널리 사용되는 곤충 병원성 균이다. 200 종 이상의 곤충을 공격하는 것으로 알려져 있습니다 7 . 이 연구에서는 M. anisopliae를 이용한 mycopesticide의 지식 기반 개발과 관련된 여러 단계가 제시됩니다. 1) 병원성 곤충 병원체에 대한 원천 ( 즉, 토양 또는 균사체 곤충) 확인, 2) 곤충 병원체 식별 및 선택, 3) 실험실 생물 분석 및 현장에서의 독성 및 유효성 유지 전략 5) 독성 물질 준비를위한 독창적 인 품질 관리 매개 변수의 개발, 6) 생물 조사 및 부가가치.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Hi-Media</td><td>RM666</td><td>시약</td></tr><tr><td>황산 암모늄</td>;<td>토마스 베이커</td><td>11645</td><td>시약</td></tr><tr><td>DNA 분석기&nbsp;</td><td>응용 바이오시스템</td><td>ABI 프리즘 3730&nbsp; &nbsp;</td><td>악기</td></tr><tr><td>DNA islation 키트</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>시약</td></tr><tr><td>Dodine</td><td>Sigma</td><td>45466</td><td>시약</td></tr><tr><td>젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>시약</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Hi-Media</td><td>GRM077</td><td>시약</td></tr><tr><td>Knapsac sparyer</td><td>Kaypee</td><td>HY-16L (1004)</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Hi-Media</td><td>RM006-500G</td><td>시약</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 바이알&nbsp;</td><td>Laxbro</td><td>SV-50</td><td>플라스틱 그릇</td></tr><tr><td>감자 포도당 한천 (PDA)&nbsp;</td><td>Hi-Media</td><td>M096-500G</td><td>시약</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>SRL</td><td>28940</td><td>시약</td></tr><tr><td>초저용량 스파리어</td><td>Matabi</td><td>INSECDISK</td><td>악기</td></tr><tr><td>유니콘 가방&nbsp;</td><td>유니콘</td><td>UP-140024-SMB</td><td>Autoclavalbe 백SSF</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Hi-Media</td><td>RM027-500G</td><td>시약</td></tr><tr><td>Chromas 2.1</td><td></td><td></td><td>소프트웨어</td></tr></tbody></table>

개발<em&gt; 메타 리지 움 anisopliae</em&gt; mycoinsecticide로서의 : 분리에서 현장 성능까지

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

상업용 살균제 개발시 주요 관심사는 화학 살충제에 비해 살균 속도입니다. 따라서 신속히 작용하는 독성이 강한 곤충 병원성 균의 선발을위한 격리 및 스크리닝은 중요한 단계입니다. 접촉으로 작용하는 Metarhizium , Beauveria, Nomurea 와 같은 병원균은 곤충 해충에 의해 섭취되어야하는 Bacillus thuringiensis 또는 핵 다당체 바이러스 (NPV)보다 더 적합합니다. 현재 연구에서 우리는 토양 희석 및 미끼 방법을 사용하여 감염된 곤충으로부터 68 개의 Metarhizium 균주를 분리했다. 분리 균주는 ITS1-5.8S-ITS2 및 26S rDNA 영역의 증폭 및 시퀀싱에 의해 동정되었다. Metarhizium anisopliae 의 가장 독성이있는 균주는 Helicoverpa armigera 의 III-instar 유충에 대한 곤충 생물 검정에서 얻은 중간 치사 농도 (LC 50 )와 시간 (LT 50 )을 기준으로 선정되었습니다 .선정 된 균주에 의한 포자 대량 생산은 벼를 기질로 사용하여 14 일 동안 고체 발효 (SSF)로 수행되었다. 포자는 0.1 % 트윈 -80을 사용하여 포자 포자 된 바이오 매스로부터 추출되었고 포자의 상이한 제제가 제조되었다. 비둘기 완두에서의 H. armigera 감염의 조절을위한 제제의 현장 시험은 무작위 블록 설계에 의해 수행되었다. 기름과 수성 제형 (각각 78.0 %와 70.9 %)으로 얻은 침입 방제 수준은 화학 농약으로 얻은 63.4 %보다 낫습니다.

수사 중에 Metarhizium, Beauveria 및 Nomuraea 상이한 균주 Metarhizium 균주로서 14 H.의 armigera 펄스 6 무서운 해충 (14)를 제어하기에 더 효과적인 것으로 밝혀졌다 (데이타는 미도시) 6, 다양한 분리 방법에 의해 분리 하였다 , 다른 작물들과 곤충들로부터 Metarhizium 균주들을 분리하기위한 추가 격리가 표적되었다 ( 표 1 ). 얻어진 Metarhizium 분리 균 68 개를 문화적, 형태 학적 특성과 ITS 1-5.8S-ITS 4 sequencing으로 확인 하였다. 실험실 생물 분석에서 H. armigera 의&gt;...

여기서는 농업에서 해충 방제를위한 &quot;최적의&quot;곤충 병원성 균류 인 Metarhizium anisopliae 의 분리, 확인, 스크리닝 및 선택을 포함한 효과적인 제균제 개발에 관한 지식 기반 개발과 관련된 여러 단계를보고합니다 .

개발<em&gt; 메타 리지 움 anisopliae</em&gt; Mycoinsecticide로서의 : 분리에서 현장 성능까지

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

합성 살충제의 무분별한 사용은 환경과 인류 건강에 지속적인 위협이 되고 있습니다. 박테리아, 바이러스 및 곰팡이를 이용한 생물학적 제어는 농업 분야의 다양한 해충을 방제하기 위한 적절한 대안입니다. 박테리아나 바이러스와 달리, 곤충 병원성 곰팡이는 접촉을 통해 효과적으로 작용합니다.Metarhizium 종은 가장 효과적인 곤충 병원성 곰팡이 중 하나입니다. 이는 200종 이상의 해충을 공격하는 것으로 알려져 있습니다. 당사는 토착 Metarhizium 분리주의 포자를 이용한 균제 살충제를 개발하였습니다.본 영상에서는 지역 곰팡이 분리균의 분리 및 동정 프로토콜, 더 강력한 균주를 선별하고 선택하기 위한 곤충 생물검정, 선택된 Metarhizium 균주의 포자 생산, 그리고 현장 적용을 위한 경제적인 균류 살충제 제형 제작 프로토콜을 보여드립니다. 또한 상업적 생산 과정에서 취해야 할 품질 관리 조치에 대해서도 강조할 예정입니다. 곤충 병원성 곰팡이의 분리는 세 가지 방법으로 수행할 수 있습니다.먼저, 토양으로부터 분리합니다. Metarhizium은 대부분의 토양에서 자연적으로 발생하는 곰팡이입니다. 다양한 분리주를 얻기 위해, 서로 다른 종류의 작물이 재배되는 들판과 멀리 떨어진 지역의 토양을 수집합니다.토양 시료는 지표면에서 4~6인치 아래에서 채취합니다. 현장에서 채취한 시료는 라벨이 부착된 봉투에 수집하며, 이후 실험실에서 각 시료 10g을 바이알에 옮깁니다. Metarhizium은 토양 희석 평판법을 통해 분리합니다.토양 시료 10 g을 멸균된 0.1% Tween 80 90 ml에 옮깁니다. 슬러리를 마그네틱 교반기로 60분 동안 교반합니다. 그동안 단계 희석을 위해 Tween 80 900 µL 분취액들을 준비합니다.슬러리의 상층액을 Tween 80 분주액에 순차적으로 희석합니다. 각 시료에서 100 µL를 취하여 Keller 등이 기술한 배지에 도말합니다. 플레이트를 28 °C에서 3~7일 동안 배양합니다.개별 포자 형성 콜로니는 이후 동일한 배지에 계대 배양하여 순수 배양물을 얻습니다. 곤충 병원성 곰팡이를 분리하기 위해 포장에서 죽은 곤충을 수집합니다. 균사체 사체로부터 포자는 Tween 80으로 옮긴 후 볼텍싱하여 분리합니다.그 후 포자 현탁액을 한천 배지에 도말합니다. 동일한 배지에서 추가로 계대 배양하여 순수 배양물을 얻습니다. 토양에서 곤충 병원성 곰팡이를 유인하기 위해 벼 멸구 유충을 사용합니다.쌀 누룩 애벌레 4마리를 60 g의 토양 샘플이 담긴 바이알에 넣습니다. 바이알을 28 °C에서 배양합니다. 이 애벌레들은 보통 토양 깊숙이 이동하므로, 애벌레가 토양 내의 곰팡이 포자와 잘 접촉할 수 있도록 최대 14일 동안 매일 바이알을 거꾸로 뒤집어 줍니다.죽은 유충을 주기적으로 꺼내어 습도 배양기에 넣고 포자 형성을 유도합니다. 균주 분리 과정은 곤충 사체에 사용되는 방법과 동일합니다. 순수 배양물을 얻은 후, 분리균은 PDA 사면 배지에서 유지하며, 모균주는 사용 전까지 8°C에서 보관합니다.균류 식별을 위해 균사체 바이오매스에서 게놈 DNA를 추출합니다. Metarhizium 분리주의 식별에는 5', 3', ITS1 및 ITS4 프라이머를 사용합니다. 예상 크기의 증폭 산물을 젤에서 회수하여 정량화한 후 시퀀싱합니다.분리균주의 종 수준 식별을 위해 서열을 NCBI GenBank 데이터베이스와 대조하여 확인하였습니다. 인도 마하라슈트라주 푸네 및 불다나 지역에서 수집한 토양 샘플과 죽은 곤충으로부터 68종의 서로 다른 Metarhizium 분리균주를 얻었습니다. 이 중 58종은 토양에서, 10종은 곤충에서 분리되었습니다.55개는 Metarhizium anisopliae, 8개는 Metarhizium flavoviridae, 5개는 Metarhizium robertsii였습니다. 사면배지(slant)의 포자를 10 ml의 Tween 80에 첨가하고 볼텍싱합니다. 곤충 생물학적 분석을 위해 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 포자 수를 측정합니다.포자 농도를 ml당 10⁷개로 조정합니다. 30마리의 유충으로 구성된 3개 반복군을 각각의 Metarhizium 분리주가 포함된 10 ml 포자 현탁액에 5초 동안 개별적으로 침지시킵니다. 곤충 생물 검정에는 Helicoverpa armigera의 2령 후기 또는 3령 초기 유충이 사용됩니다.처리 후, 각 유충을 습윤한 Whatman 1번 여과지와 먹이용 소독 오크라 조각이 들어 있는 멸균 바이알로 옮깁니다. 멸균 증류수에 0.1% Tween 80을 처리한 30마리의 유충 세트를 3반복으로 준비하여 대조군으로 사용합니다. 유충이 죽을 때까지 유지하며, 최대 14일 동안 모니터링합니다.이 단계들을 68개 모든 분리균에 대해 반복하였습니다. 폐사율은 죽은 유충과 살아있는 유충의 수를 세어 계산합니다. 죽은 유충은 멸균 페트리 접시에 옮겨 담으며, 이때 접시에는 면봉을 함께 넣어 28 °C, 상대 습도 70~80% 조건에서 3~7일 동안 유지하여 곰팡이성 질환 및 포자 형성을 관찰합니다.세 차례의 실험에서 얻은 폐사율 데이터를 수집하여 평균값을 구한 후, Abbott 공식을 사용하여 보정하였습니다. 90% 이상의 폐사율을 보인 12종의 Metarhizium 분리주를 선정하여 Helicoverpa armigera 3령 유충에 대한 반치사 시간(median lethal time)을 결정하였습니다. LT 50 값을 기준으로 곤충을 더 빠르게 사멸시키는 5종의 분리주를 확인하였습니다.확인된 5가지 분리주의 반치사 농도(LC 50)를 결정하기 위해 네 가지 서로 다른 농도의 포자 현탁액을 사용하였습니다. LC 50 값을 기준으로, 고체 발효를 통한 포자 생산을 위해 세 가지 Metarhizium 분리주를 선정하였습니다. YPD 배지를 제조한 후 121°C에서 20분간 오토클레이브로 멸균합니다.사면배지(slant)의 포자를 0.1% Tween 80으로 옮깁니다. 선택된 세 가지 Metarhizium 분리균주의 포자 현탁액을 YPD 배지에 첨가합니다. 이후 플라스크를 진탕 배양기에 넣고 배양합니다.2kg의 쌀을 채운 오토클레이브 가능 Unicorn 백을 1L의 증류수에 하룻밤 동안 담근 후, 121°C에서 45분간 오토클레이브 멸균합니다. 쌀, 수수, 옥수수, 밀과 같은 기질을 사용하여 고체 발효를 테스트하였습니다. 테스트한 기질 중에서 쌀이 Metarhizium 분리주의 최대 포자 형성을 지원하였습니다.배지에 48시간 된 10% 균사체 바이오매스를 접종합니다. 이를 잘 혼합한 후 14일 동안 배양합니다. 포자는 다양한 방법으로 수확할 수 있습니다.Mycoharvester와 Vibrosifter를 이용한 분리를 위해, 포자 형성 균사가 포함된 백을 37 °C에서 이틀 동안 건조하여 수분 함량을 20% 미만으로 낮춥니다. 액체 추출법이 더 효율적인 방법입니다. 포자가 포함된 쌀을 대형 용기에 넣습니다. 0.1% Tween 80을 용기에 붓고 혼합물을 잘 섞어줍니다.상층액을 여과하여 쌀 입자를 제거합니다. 원심분리를 통해 포자를 농축 및 분리합니다. 그 후 포자를 37 °C에서 이틀 동안 건조합니다.이 포자들은 사용 전까지 영하 80°C에서 보관할 수 있습니다. 보관 중 유효 기간을 늘리기 위해 탈쿰(talcum)을 첨가하여 포자와 혼합합니다. 효과를 얻기 위해서는 포자가 생존해 있어야 하므로, 최대 수의 생존 포자를 생성하는 분리주를 확인해야 합니다.포자 현탁액은 0.1% Tween 80로 준비하며, 농도는 ml당 10⁷ spores로 조정합니다. 10 µL의 포자 현탁액을 PDA 슬라이드에 3회 반복하여 도말한 후 배양합니다. 12시간 이내에 생존 가능한 포자들이 발아하기 시작합니다.12시간 후, 발아관을 형성하는 포자를 현미경으로 계수합니다. 포자의 친수성은 곰팡이가 곤충의 큐티클에 부착하는 데 중요합니다. 황산암모늄과 Tween 80이 포함된 포자 현탁액을 큐레트로 취합니다.포자가 포함되지 않은 다른 큐벳은 대조군으로 사용합니다. 포자 현탁액의 농도는 540 nm에서 초기 흡광도가 0.6이 되도록 mL당 약 7×10⁷개의 포자로 조정합니다. 포자가 가라앉을 수 있도록 큐벳을 약 6시간 동안 그대로 둡니다.흡광도를 측정하고 50% 섭식에 소요되는 시간을 계산합니다. 결과에 따라 한 가지 균주를 현장 적용 대상으로 선정하며, 나머지 두 균주는 백업 균주로 활용합니다.비둘기콩 작물에서 Helicoverpa armigera의 피해를 조절하기 위해 선정된 Metarhizium 분리주 M34412 포자의 현장 성능 평가를 4회 반복의 랜덤화 블록 설계로 수행하였습니다. 두 가지 서로 다른 살포 제형이 사용되었습니다. 0.1% Tween 80 제형은 배낭형 분무기로 살포하였습니다.포자의 오일 제형을 초저용량 분무기로 살포합니다. 분무는 오전 또는 오후에 수행합니다. 1차 분무는 개화기에 실시하며, 14일 간격으로 2회 더 반복합니다.살포 후 0일, 3일, 5일, 7일 및 14일에 Helicoverpa armigera를 수집하여 균사성 병 증상을 관찰하기 위해 습도 챔버에 보관합니다. 콩(pigeon pea) 내 Helicoverpa armigera 방제를 위한 현장 시험 결과, Metarhizium anisopliae M34412 처리 시 70% 이상의 효능이 나타났습니다. Metarhizium anisopliae를 처리한 구역의 꼬투리 피해는 화학 농약을 처리한 구역 및 무처리 대조구 구역과 비교하여 가장 적은 것으로 확인되었습니다.디젤 해바라기유 제형의 마이코인섹티사이드(mycoinsecticide)로 인한 영향이 있는지 확인하기 위해 퉁콩 잎을 조사하였습니다. Metarhizium anisopliae 처리 구역에서 토양 거주 절지동물과 잎에 서식하는 곤충을 수집하였습니다. 비표적 절지동물에 대해서는 어떠한 유해한 영향도 관찰되지 않았습니다.시연 시험은 20명의 농민이 참여한 가운데 doo-lally-pra-va-da 마을에서 수행되었습니다. 이 제제는 기름진거세미, 꼬투리나방, 가루깍지벌레, 솜진딧물 및 모기와 같은 다른 해충들에 대해서도 효과적입니다. 본 실험들을 통해 균류 살충제 생산 시 필수적인 품질 관리 매개변수를 식별할 수 있었습니다.포자 발아로 측정된 포자의 생존율은 28°C, 상대 습도 70~80% 조건의 PDA 배지에서 16시간 후 90% 이상이어야 합니다. 실험실 생물 검정 시 10⁷개의 포자를 처리했을 때 Helicoverpa armigera의 치사율은 90% 이상이어야 합니다. 인공 실험실 배지에서 반복적으로 계대 배양할 경우, 해당 미생물은 독성을 상실합니다.키틴 배지에서 곰팡이를 72시간 동안 배양한 후, 키티나제, 키틴 탈아세틸화 효소, 키토산화 효소, 프로테아제 및 리파아제와 같은 큐티클 분해 효소의 활성을 측정합니다. 이들은 병원성의 생화학적 마커로 활용됩니다. 키티나제 유전자의 제한효소 절단을 위해 서로 다른 네 가지의 제한효소 3종 세트가 사용되었습니다.90% 이상의 치사율을 보인 분리주들은 세 가지 유전자 모두에서 특정한 패턴을 나타냈습니다. 이러한 패턴은 Metarhizium 분리주가 세포 외로 분비하는 큐티클 분해 효소 프로파일과 유의미한 상관관계를 보입니다. 본 연구를 통해 우리는 키틴분해효소(chitinase) 활성과 키틴분해효소 유전자의 PCR 패턴을 병원성 마커로 제시하는 바입니다.이는 상업적 규모의 생산을 위한 품질 지표로 활용될 수 있습니다. 제품의 경제성을 높이기 위해 균사체 바이오매스 핵심 식물 뿌리 촉진법을 사용할 수 있습니다. 또한, 헬스케어 응용 분야를 위한 키토사니베이스(chitosanase) 분리에 활용될 수도 있습니다.이러한 부가가치 제품들은 이 Metarhizium 기반 곰팡이 살충제의 수익성을 더욱 높여줄 것입니다.

development-metarhizium-anisopliae-as-mycoinsecticide-from-isolation

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 프로토콜은 곰팡이 entomopathogen을 소개하는 두 접종 방법을...

Endophytes로 곰팡이 Entomopathogens 구축 : Endophytic 생물학적 방제 향해

여기서 우리는 토양 샘플에서 entomopathogenic 균류 (EPF)를 분리하고 선택하는 데 사용 된 식사 벌레 (Tenebrio molitor)-미끼 시스템을 기반으로 프로토콜을 제시합니다. 효과적인 코니디아 번호(ECN) 포뮬러는 현장에서 해충 미생물 조절을 위한 생리적 특성에 기초하여 높은 스트레스 내성 EPF를 선택하는 데 사용된다.

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

Entomopathogenic 진균은 농업 곤충 해충의 생물학적 방제제로서 중요성을 얻고있다. 이 연구에서, 곤충 해충에 대한 상업적 적용을 위해 Metarhizium robertsii 및 M. pinghaense 둘 다의 남아프리카 단리물의 충분한 수의 탄력적 감염성 프로파굴레의 대량 생산은 농산물 곡물 제품을 사용하여 성공적으로 수행되었다.

곤충 해충에 대한 상업적 적용을위한 Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii 및 Metarhizium pinghaense의 대량 생산

엔토모병원성 진균 콜로니는 테네브리오 미끼, 갤러리아 미끼 및 선택적 인공 배지, 즉 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천을 사용하여 열대 토양 샘플로부터 분리된다.

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

이 프로토콜은 단일유전학적 곤충인 겨자 진딧물(Lipaphis erysimi (Kalt .))에 대한 곤충병원성 곰팡이(EPF)의 효과를 평가하기 위해 최적화된 분리형 잎 생물검정 시스템을 제공합니다. 이 방법은 페트리 접시 실험 중 데이터 수집 프로세스를 간략하게 설명하여 연구원이 겨자 진딧물 및 기타 단일유전 곤충에 대한 EPF의 독성을 일관되게 측정할 수 있도록 합니다.

Parthenogenetic 곤충, 겨자 진딧물, Lipaphis erysimi (Kalt.)에 대한 곤충 병원성 곰팡이의 무균 효과 평가

여기에서 우리는 숲 나무 천공충에서 곤충병원성 균류를 얻기 위한 프로토콜과 딱정벌레목 모델 곤충을 사용하여 곤충병원성 활성을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 자연 산림에서 나무를 뚫는 곤충 해충으로부터 곤충 병원성 곰팡이 자원을 탐사하는 데 효율적이고 편리합니다.

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer(포레스트 우드 보어의 곤충병원성 곰팡이의 격리, 행동 식별 및 병원성 평가)

레이크 부영양화 중요한 영양소 소스를 식별하고 제어 할 필요성을 만들어 전세계 수질 문제이다. 침전물 코어에서 인 방출 비율의 실험실 판정 내부 인 로딩의 역할을 결정하고 관리 결정을 안내하기위한 유용한 방법이다.

호수 퇴적물에서 실험실 결정 인 플럭스 내부 인 로딩의 측정으로

여기에서는 외딴 해양 환경에서 유기 및 무기 영양소 가용성과 미생물 및 바이러스 군집의 풍부함 및 구조를 평가하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

자세한 방법은 상업 이소 크리 시스 속에서 미세 조류에서 가치 로서도으로 alkenones의 공동 격리와 함께 바이오 디젤의 생산을 위해 제공됩니다.

상업에서 로서도으로 Alkenones의 분리와 바이오 디젤 생산을위한 실험 프로토콜<em&gt; 이소 크리 시스 속</em&gt; 해조 바이오 매스

작물의 절지 동물 풍요의 평가는 인구 역학과 종 상호 작용을 조사하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 쌀의 절지 동물의 흡입 샘플링 잎 송풍기 - 진공 청소기의 수정 및 응용 프로그램을 설명합니다.

수정 및 절지 동물의 필드 샘플링을위한 잎 송풍기 - 진공 청소기의 적용

배우세요 Metarhizium anisopliae를 이용한 마이코살충제 개발 방법을. 토양에서 분리한 균주를 선별하고 효능을 평가하여 지속 가능한 농업 해충 관리를 위한 생물학적 방제제를 제조하는 전 과정을 확인하세요.

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