Name: 쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 학습하세요 쌍둥이 자리 MARCM 프로토콜을 사용하여 신경세포 계보를 고해상도로 분석하고 유전자 기능을 연구하는 방법을. 이 기술은 공통 전구세포에서 유래한 신경세포를 두 가지 색상으로 표시하여 개별 신경세포의 발생 정보를 확인할 수 있습니다.

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이 작품은 과학 기술부에 의해 지원되었다 (MOST 104-2311-B-001-034)과 세포 연구소 유기체 생물학, 중앙 연구원, 대만.

1. 필수 유전자 (11), (13)를 사용하여 tsMARCM 준비 파리 구축 <ol><li> 개별 플라이 (11)에 의해 수행되는 유전자로부터 tsMARCM 준비 파리의 원래 버전을 생성 (표 1 참조). 같은 비행 주식 13에서 여러 유전자를 넣어, 이전에 설명 된 표준 비행 유전자 교차 제도를 실시한다. <ol><li> 한 부모의 라인에서, FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (첫 번째 기자, mCD8 :: GFP의 유전자를 조립, 형질 전환 유전자의 발현이 막 닿는 기자를 생산하는 업스트림 활성화 시퀀스 프로모터의 제어하에 쥐 클러스터 (O)의 발현에 대하여 RNAi에, 녹색 형광 단백질을 융합 단백질의 분화 8 마우스 클러스터)와 UAS-rCD2RNAi (제 리포터의 발현을 억제 레서의F 차별화 2, rcd2) 2 차 염색체의 왼쪽 팔에. 장소 조직 특이 가능한 경우 X 또는 3 번째 염색체에 -GAL4 드라이버. </li><li> 다른 부모의 라인에서, FRT 40A, UAS-rCD2 :: RFP의 유전자 조립 (제 기자, rCD2 :: RFP를, 다른 막 닿는 기자가 적색 형광 단백질 융합 rCD2 단백질로 구성)와 UAS-GFPRNAi (mCD8 :: GFP의 발현을 억제 억압, GFP의 발현에 대한 RNAi의) 2 차 염색체의 왼쪽 팔에. 는 X 또는 제 3 염색체 가능한 경우에 열 충격 (HS) -FLP 또는 조직 특정 - FLP를 놓습니다. </li></ol></li><li> 개별 파리 (14)에 의해 수행되는 유전자에서 tsMARCM 준비 파리의 새 버전을 생성 (표 1 참조). P는 설명 된 표준 비행 유전자 교차 제도를 실시reviously, 동일한 플라이 주식 13에서 여러 유전자를 넣어. <ol><li> 한 부모 행에서 같은 팔에 함께 FRT 사이트와 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (mCD8 :: GFP 및 rCD2의 발현 :: RFP를 억제하는 서프 레서의 결합 된 유전자)의 유전자를 조립 2 차 또는 3 차 염색체 (FRT와 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i의 유전자들의 적절한 쌍이 표 1에 나타내었다). 가능하면, 선택한 FRT 사이트의 염색체 이외의 다른 염색체에 조직 특이-GAL4 드라이버를 놓습니다. </li><li> 다른 부모의 라인에서, FRT 사이트와 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (다른 결합 rCD2의 유전자 :: RFP 및 mCD8 :: GFP의 발현 억제 서프 레서) 같은 팔을의 유전자를 조립 FRT의 도입 유전자의 2 차 또는 3 차 염색체 (적절한 쌍 </EM&gt;와 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi)은 표 1에 표시됩니다. 장소 HS-FLP 또는 가능하면, 선택한 FRT 사이트의 염색체 이외의 다른 염색체에 조직 특이-FLP. </li></ol></li></ol> 2. 크로스 tsMARCM 준비는 그들의 자손에 tsMARCM 클론을 생성 (으)로 운항하는 항공사 <ol><li> 함께 간 tsMARCM 준비 파리 신선한와 플라이 식품 유리 병에 (예를 들어, 함께 단계 1.1.2 또는 1.2.2에서 날아 단계 1.1.1 또는 1.2.1 및 20 ~ 30 버진 여성에서 10 ~ 15 남성 파리를 넣어) 유리 병의 벽에 - 만든 효모 붙여 넣기. </li><li> 수정 된 알을 수집하기 전에 상대의 기회를 향상시키기 위해 2 일 동안 25 ° C에서 넘어 tsMARCM 준비 파리를 유지한다. </li><li> 자주 전송을 용이하게하기 위해 (군집 피 파리를 누르거나 파리를 마취하는 이산화탄소를 사용하는 갓 yeasted 유리 병에 넘어 tsMARCM 준비 파리를 전송;를 통해 10 mL의 플라이 식품에 80-100 수정란보다 더 이상 유지하지난) 너무 많은 부화 유충을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 문화 tsMARCM 동물 (즉, 수정란, tsMARCM 동물의 유전자형의 예를 들어, 그림 3에서 사용이며, HS-FLP [22], w / w, UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT (40A) , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A, + 그들은 원하는 단계 (예를 들어, 배아, 유충에 개발 될 때까지 25 ° C에서 직렬로 전송 유리 병에 배치 된 +), 또는 번데기). </li><li> 를 생성 FLP의 발현을 유도하는 열 충격을 최적의 시간을 결정하기 위해 전송 (10) 37 °의 C 수조, 20, 30, 40와 동일한 발달 단계에서 tsMARCM 동물을 포함 바이알에서 50 분간 배치 관심 tsMARCM 클론. 조직 특정 - FLP는 tsMARCM 실험에 사용하는 경우이 단계를 건너 뜁니다 (HS-FLP는 신경 계통에 대한 선호 분석,이 설정에 대한 이유는 이전에 15 설명 하였다). 참고 : 관심이 더 tsMARCM 클론이 원하는 경우 향후 tsMARCM 실험에서 열 충격의 최적의 시간을 사용하여 단계를 반복 2.5; 일반적으로, 더 FLP 표현이 비교에서 HS-FLP [22] 유도 HS-FLP [1] 같은 열 충격 시간. </li><li> 문화는 25 ° C에서 열 충격 tsMARCM 동물을 적절한 발달 단계에 도달 한 다음 3 단계로 진행 될 때까지. </li></ol> 3. 얼룩을 준비하고 마운트 플라이 두뇌는 tsMARCM 클론을 포함하는 <ol><li> 집게 보호 요리를 준비합니다. 파트 A (30g) 및 활성탄 (0.25 g)와 실리콘 엘라스토머 키트의 부품 B (3 g)을 섞는다. 해당 요리에 혼합물을 부어. </li><li> 해부 현미경을 통해 볼 집게 보호 접시에 집게를 사용 1X 인산 완충 식염수에 tsMARCM 동물 (PBS) 중 애벌레, 번데기, 또는 성인의 뇌를 해부하다. 참고 : 플라이 뇌 해부를위한 프로토콜은 내림차순하고있다이전 16 ribed. </li><li> 1X PBS을 실온에서 20 분간 4 % 포름 알데히드를 함유하는 유리 스폿 접시 플라이 머리를 고정한다. 단계의 나머지 부분이 유리 자리 접시에 플라이 뇌를 처리합니다. </li><li> 제거 PBT :; 세척 PBT를 제거하고 신속하게 새로운 PBT를 추가 플라이 뇌를 1 % PBT (1X PBS 1 % 트리톤 X-100 포함) 및 1 % PBT (씻어 30 분 동안 그들에게 각각 세 번 씻어로 3 회 씻어 새로운 PBT를 추가하고, 궤도 쉐이커를 사용하여 새 PBT에서 플라이 두뇌)를 품어. </li><li> 밤새 4 ℃ 또는 실온에서 4 시간 동안 일차 항체의 혼합물 플라이 뇌 인큐베이션. 포함하고, 마우스 항 Bruchpilot (BRP) 항체 (1시 50분) 1 % PBT에서 : 토끼 항을 DsRed 항체 (800 1) 일차 항체의 혼합물의 예는 쥐 항 CD8 항체 (1 : 100) 인 5 % 정상 염소 혈청 (NGS). </li><li> 플라이 두뇌 1 %의 PBT로 3 회 씻어, 다음 1 % PBT와 30 분마다 그들에게 세 번 씻는다. </li><l난&gt; 밤새 4 ℃ 또는 실온에서 4 시간 동안 2 차 항체의 혼합물로 즉시 뇌를 부화. 및 염소 항 - 마우스 - 황색 형광 염료 (800 1)와 접합 염소 항 - 토끼 IgG 항체 : 이차 항체의 혼합물의 예는 녹색 형광 염료 (800 1)와 접합 된 염소 항 - 래트 IgG 항체 인 5 % NGS를 포함하는 1 % PBT에서 : IgG 항체는 멀리 붉은 형광 염료 (800 일)와 결합. </li><li> 플라이 두뇌 1 %의 PBT로 3 회 씻어, 다음 1 % PBT와 30 분마다 그들에게 세 번 씻는다. 반 담금질 시약 마이크로 슬라이드를 탑재합니다. 플라이 머리를 커버하고 보호하기 위해 마이크로 슬라이드에 마이크로 커버 유리를 넣습니다. 투명한 매니큐어를 사용하여 마이크로 커버 유리 마이크로 슬라이드의 가장자리를 밀봉. 이러한 장착하고 4 ℃에서 뇌 표본을 비행 밀봉 보관하십시오. </li></ol> 4. 프로세스를 가지고, 그리고 tsMARCM 클론의 형광 이미지 분석 <ol><li> tsMARCM 클론의 FR의 형광 이미지를 캡처OM 샘플을 원하는 초점 현미경 시스템을 이용하여 단계 380에서 생성. </li><li> 두 차원에 tsMARCM 공 초점 형광 이미지의 프로젝트 스택은, 선택의 공 초점 현미경 시스템과 함께 제공되는 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 평평 (그림 3B 참조 - 평평의 예 3T - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, 3 분기를 공 초점 형광 이미지). </li><li> 적절한 화상 처리 소프트웨어 (ImageJ에 17 예, &quot;셀 카운터&quot;기능을 이용하여 tsMARCM 클론의 다세포-NB 측의 세포 수를 세어 상기 셀의 예는도 3e, 3J, 3O 및 3T 참조 신경 세포의 시체). </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

프로토콜 내에서 중요한 단계 2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 단계, 3.2 좋은 tsMARCM 결과를 얻기위한 중요합니다. 신경 전구 세포에서 GAL4을 표현하지 않는 조직 별 -GAL4 드라이버 단계 1.1.1과 1.2.1 바람직하다. 단계 2.3에서 플라이 식품 유리 병에서 자란 동물을 과도하게 몰려 마십시오. 유도 지연, 열충격시 FLP의 발현 수준 및 신경 전구 세포 (즉, 새로운 기지국과 GMCs)의 평균 분할 시간이 알려져 있지 않기 때문에, 상기 열충격 시간을 변경하는 것이 최상이다 (10, 20, 30 단계 250에서 동일한 유전자형 및 발달 단계의 상이한 샘플에 대해, 40, 50 분). 이것은 관심 tsMARCM 클론의 최고 비를 얻기 위해 최적의 열 쇼크 시간의 결정을 허용한다. 또한, 그대로 뇌 샘플을 얻기 위해 단계 3.2 플라이 뇌 해부하는 동안주의; 이 정확하게 신경 세포 수를 계수 중요하다. rese에 대한<em...

방대한 수의 뉴런 다양한 형태로 구성 뇌가, 지각 처리와 외부 세계로부터의 도전에 대응하는 능력을 동물 부여한다. 성인 초파리 중앙 뇌의 신경 세포는 신경 줄기 세포의 수가 제한으로부터 유도되는 현상 (1, 2) 동안 호출 neuroblasts (NBS). 새로운 기지국이 초파리의 뇌 신경에 참여하는 대부분의 자기 갱신 NBS 및 신경절 어머니 세포 (GMCs)를 생성하는 비대칭 분열을 받아야하고, GMCs는 (그림 1A를 신경 세포 3로 분화 두 개의 딸 세포를 생산하는 부문의 또 다른 라운드 통과 ). 때문에 신경 형태의 복잡함과 특정 신경 세포, 긍정적 인 모자이크 레이블 기술하는 repressible 세포 마커 (MARCM) 모자이크 분석을 식별과 관련된 문제의의 visualizat 수 있도록 발명되었다하나의 신경 세포 또는 주변, 레이블이없는 뉴런 (4)의 인구 중 신경 세포의 작은 부분 집합의 이온. MARCM는 flippase (FLP) 식 일반적으로 리포터 유전자 4의 발현을 억제하는 리프레 서 유전자의 이형 접합 대립 유전자를 운반하는 분할 전구 세포 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 중재하기 / FLP 인식 대상 (FRT) 시스템을 사용합니다. 유사 분열 분할 한 후, 재조합 염색체가 더 이상없는 하나의 셀은 동형 접합 리프레 유전자의 대립 유전자와 다른 세포가 더 리프레 서 유전자 - 더 그 셀 (및 그 자손)에 기자의 발현이 없습니다를 포함하도록, 트윈 세포로 분리된다 (4)를 차단했습니다. FLP가 확률 적 NBS 또는 GMCs 유도 할 때 세 가지 클론 패턴은 일반적으로 MARCM 실험에서 발견된다 : 단일 셀 resolutio에서 신경 세포의 형태를 묘사 단일 셀 및 2 셀 - GMC 클론을,일반적인 NB (그림 1B)에서 파생 된 신경 세포의 전체 형태 학적 패턴을 보여 n 및 다세포-NB 클론. MARCM 기술이 널리 뇌 전체의 배선 네트워크를 재구성 신경 유형 식별을 포함하여, 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어, 신경 계통은 신경 세포 운명 사양에 관여하는 유전자의 기능 표현형 특성의 개발 역사를 공개에 대해 분석하고, 신경 세포의 형태 형성 분화는 5, 6, 7, 8, 9, 10 연구. 종래 MARCM 만 유도 분열 재조합 이벤트 이후 개의 딸세포 (및 계통) 중 한 라벨 때문에, 표시되지 않은 측면에서 잠재적으로 유용한 정보가 손실된다. 이 제한은 기본 M의 적용을 배제고해상도로 ARCM 시스템은 빠른 템포 세포 운명 전환 많은 신경 계통 분석 또는 다른 동물 정밀도 11, 12의 동일한 뉴런 유전자 기능 분석한다. 트윈 스폿 MARCM (tsMARCM)는 이렇게 원래 MARCM 시스템 (11)의 한계 (극복 트윈 셀의 양측에서 유용한 정보의 회복을 가능하게 두 개의 별개의 색상이 공통 조상으로부터 유래 신경 라벨 고급 시스템이다 그림 2A - 2C). tsMARCM 시스템에서, 두 개의 RNA 간섭 (RNAi) 억제제는 전구 세포 내에서 상동 염색체의 트랜스 위치에 놓인다 기반, 이러한 억제제의 발현이 독립적으로 각각의 기자 (도 2B)의 발현을 억제한다. FLP / FRT 시스템을 통해 매개되는 부위 특이 적 분열 재결합 후, TWO가 RNAi를 기반 억제 별개 기자 (도 2B)의 발현을 허용하는 트윈 세포로 분리. 두 클론 패턴 다세포-NB 클론과 연관된 단일 세포 클론과 두 셀 GMC와 연관된 단일 셀은 전형적 tsMARCM 실험 (도 2c)에서 볼 수있다. 정보는 출생 데이트 표지 뉴런 신경 혈통 분석 고해상도를 가능 타측에 대한 기준으로서 이용 될 수있는 트윈 셀의 한쪽에서 유래하고, 표현형은 정확한 조사 다른 동물에서 동일 뉴런 분석 신경 유전자 기능 (11), (12). 여기서, 우리는 (가능한 경우뿐만 아니라, 다른 조직의 발달) 초파리 신경 발달 공부 범위를 확장하기 위해 다른 실험실에서 사용될 수있는 tsMARCM 실험을 수행하는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>이산화탄소(CO2)</td><td>현지 공급업체</td> n.a.Anesthetize <td></td><td>fly</td></tr><tr><td>CO2pad</td><td>Local vendor</td><td>n.a.Sort</td><td>, cross and transfer fly</td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Uniregion Bio-Tech (or other vendors)</td><td>PBS001</td><td>Disssection, rinse, wash and immunostain fly brain</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>파리 뇌 수정</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>헹굼, 세척 및 면역 염색 파리 뇌</td></tr><tr><td>일반 염소</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>005-000-121</td><td>면역스테인 플라이 브레인</td></tr><tr><td>혈</td><td></td><td></td><td></td>청</tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD8 항체</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0800</td><td>Immunostain 플라이 브레인</td></tr><tr><td>토끼 안티 DsRed 항체</td><td>Clonetech</td><td>632496</td><td>Immunostain 플라이 브레인</td></tr><tr><td>마우스 안티 Brp 항체</td><td>개발 연구 Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Immunostain 플라이 브레인</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Immunostain fly brains</td>와 결합된 염소 항-</tr><tr><td>쥐 IgG 항체 Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Immunostain fly brains와</td></tr> 결합된 <tr><td>염소 anti-mouse IgG 항체 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Immunostain fly brains</td></tr><tr><td>SlowFade gold antifade reagent</td><td>Molecular Probes</td><td>S36936</td><td>파리 뇌를 장착하고 형광 담금질을 보호하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>PYREX 9 우울증 유리 스폿 플레이트</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>파리 뇌 해부, 헹굼, 세척 및 면역 염색 실</td></tr><tr><td>가드 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>뇌 해부 중 집게를 보호하기 위해 검은색 실가드 접시 만들기</td></tr><tr><td>활성탄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-250G</td><td>검은색 실가드 접시 만들기</td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science 도구</td><td>11252-30</td><td>해부 및 마운트 플라이 브레인</td></tr><tr><td>마이크로 슬라이드</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td>마운트 플라이 브레인</td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리 No. 1.5</td><td>VWR International</td><td>48366-205</td><td>마운트 플라이 브레인</td></tr> 네<tr><td>일 폴리</td>시 <td>현지 공급업체</td><td>사용 불가</td><td>밀봉 마이크로 슬라이드</td></tr><tr><td>인큐베이터&nbsp;</td><td>Kansin Instruments</td><td>LTI603</td><td>문화는 25도에서 비행합니다. C</td></tr> <tr><td>(또는 다른 공급 업체)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>수조</td><td>Kansin Instruments</td><td>WB212-B2</td>는 <td>37 °C에서 파리에 열 충격을 유발합니다. C</td></tr> <tr><td>(또는 다른 공급 업체)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>궤도 쉐이커</td><td>Kansin Instruments</td><td>OS701</td><td>세척 및 면역 염색 파리 뇌</td></tr> <tr><td>(또는 기타 공급 업체)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>EZ4</td><td>정렬, 교차 및 전송 파리; 파리 뇌 해부, 헹굼, 세척 및 면역 염색</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss(또는 기타 공급업체)</td><td>LSM 700(또는 기타 모델)</td><td>이미지 tsMARCM은</td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어 1 (예: , Zeiss LSM 이미지 브라우저)를</td> 복제합니다.<td>Zeiss</td><td>사용 불가</td><td>컨포칼 이미지</td></tr><tr><td>프로젝트 스택 이미지 처리 소프트웨어 2 (예: , ImageJ)&nbsp;</td><td>사용할 수 없음</td>: <td>사용할 수 없음</td><td>: tsMARCM 클론의 셀 수</td></tr></tbody></table>

쌍둥이 자리 marcm를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

M은 R의 epressible C의 엘 m 개의 arker와 nalysis (MARCM) 널리 복잡 모폴로지를 도시하고, 그렇지 않으면 표시되지 않은 및 교란 내 뉴런의 서브 세트에서 유전자의 기능을 조작하는 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어 포지티브 모자이크 표시 시스템이다 osaic 생물. MARCM 시스템에서 발생하는 유전 모자이크는 유사 분열하는 동안 모두 표시 (MARCM 클론) 및 표시되지 않은 딸 세포를 생성하는 전구 세포를 분할 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 통해 매개된다. MARCM 방법의 확장이라는 쌍둥이 자리 MARCM (tsMARCM)는, 두 가지 색상으로 공통 조상에서 유래 쌍둥이 세포의 두 레이블. 이 기술은 모두 헤미 계통에서 유용한 정보의 검색을 가능하게하기 위해 개발되었다. 종합적 tsMARCM 클론의 다른 쌍을 분석함으로써, tsMARCM 시스템은 고해상도 신경 계통 mappin 허용g는 일반 전구 세포에서 생성 된 레이블 뉴런의 정확한 출생 순서를 공개합니다. 또한, tsMARCM 시스템은 또한 다른 동물 동일한 뉴런 표현형 분석을 허용하여 유전자 기능 연구를 확장한다. 여기, 우리는 초파리에서 신경 발달의 연구를 용이하게하기 위해 tsMARCM 시스템을 적용하는 방법에 대해 설명합니다.

tsMARCM 시스템은 공통 NBS 유래의 신경 세포에 대한 중요한 정보를 입수하여 신경 혈통 분석하여 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 사용되어왔다. 이 시스템은 신경 세포의 종류 (모든 경우) 대부분을 식별 각각의 신경 세포 유형의 세포 수를 결정하고,에 tsMARCM를 사용하여 이러한 신경 세포의 출생 순서 11, 12, 18 (자세한 내용은 토론 섹션을 참조를 확인하는 데 사용되었습니다 신경 계통을 실시하는 것은) 분석이나 유전자 기능 연구. 여기, 우리는 tsMARCM 실험 1, 2를 수행하는 방법을 설명하기 위해 예로서 GAL4-GH146으로 표시 ante...

여기서 우리는 두 가지 색상으로 일반 전구 세포에서 파생 된 신경 세포의 시각화를 허용하는 모자이크 라벨 기술에 대한 프로토콜을 제시한다. 이것은 다른 사람의 동일한 뉴런에서 출생 데이트 개별 뉴런의 기능과 공부 유전자 기능과 신경 계통 분석을 용이하게한다.

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

본 twin-spot MARCM 프로토콜의 전반적인 목표는 고해상도 세포 계보 분석을 수행하고 유전자 기능을 더욱 정밀하게 연구하는 것입니다. 뇌 조직은 방대한 수의 다양한 뉴런으로 구성되어 있어, 발달 과정에서 뉴런들이 어떻게 함께 조립되는지에 대한 기저 메커니즘을 연구하는 것은 매우 어렵습니다. 이 기술의 주요 장점은 공통 뉴런 전구세포에서 유래한 뉴런들을 두 가지 서로 다른 색상으로 표지할 수 있다는 점입니다.이를 통해 개별 뉴런의 생성 시기 정보를 회수할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 연구자들이 신경 발달의 기초가 되는 세포 및 분자 기전을 탐구하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 오늘 이 절차를 시연할 사람은 Pei-Chi Chung입니다.Yu 교수 연구실의 테크니션입니다. 먼저 신선한 효모가 들어 있는 파리 먹이 바이알에 twin-spot MARCM 준비가 된 수컷과 암컷을 함께 넣어 교배를 시작합니다. 수정란을 수집하기 전, 교배 확률을 높이기 위해 교배된 twin-spot MARCM 준비 파리들을 25 °C에서 이틀 동안 유지합니다.유충이 부화했을 때 과밀 상태가 되는 것을 방지하기 위해, 교차 twin-spot MARCM 준비 파리들을 가볍게 두드려 기절시킨 후 신선한 효모가 들어있는 바이알로 옮깁니다. twin-spot MARCM 후손들이 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 본 실험에서는 유충 단계의 파리들에게 열 충격을 가하여 flippase 발현을 유도합니다.flippase 발현을 위한 최적의 열충격 시간을 결정하기 위해 초파리 바이알을 37 °C 항온수조에 10, 20, 30, 40, 50분 동안 각각 옮겨 둡니다. 이는 목적하는 twin-spot MARCM 클론을 생성하기 위함입니다. 열충격의 시점은 제거 세대의 단계를 결정하며, 열충격 기간은 생성될 제거 횟수를 결정합니다.열 충격을 가한 twin-spot MARCM 동물을 25 °C에서 원하는 발달 단계까지 배양하십시오. 그 다음 염색 및 마운팅 단계를 진행합니다. 포셉 보호 디쉬에 PBS를 추가하십시오.그런 다음, twin-spot MARCM 개체들을 배양 접시로 옮깁니다. 해부 현미경으로 관찰하며 핀셋을 사용하여 twin-spot MARCM 개체로부터 뇌를 해부합니다. 먼저 초파리의 몸통에서 머리를 분리합니다.그런 다음 뇌가 손상되지 않도록 주의하며 큐티클을 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 흰색 섬유 형태로 보이는 기관을 조심스럽게 제거합니다. 뇌를 4%formaldehyde와 PBS가 들어 있는 유리 스팟 플레이트로 옮깁니다.그 후 실온에서 20분 동안 고정합니다. 초파리 뇌를 1%PBT로 세 번 헹구어 염색 과정을 시작합니다. 그런 다음 1%PBT로 세 번 세척합니다.매회 30분 동안 흔들어 줍니다. 초과 항체 혼합액과 함께 초파리 뇌를 4°C에서 하룻밤 동안 또는 상온에서 4시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 흔들어 주면서 1% PBT로 초파리 뇌를 각각 3회씩 헹구고 세척합니다.그다음 초파리 뇌를 2차 항체 혼합물과 함께 실온에서 4시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 뇌를 헹구고 세척한 후, 항소광 시약을 사용하여 마이크로슬라이드에 뇌를 마운팅합니다. 그런 다음 커버 글라스를 덮어 초파리 뇌를 보호합니다.투명 매니큐어를 사용하여 마이크로 커버 글라스와 마이크로 슬라이드의 가장자리를 밀봉합니다. 마지막으로, 선택한 공초점 현미경 시스템을 사용하여 샘플에서 twin-spot MARCM 클론의 형광 이미지를 캡처합니다. 이 그림은 flippase 유도로 인해 생성된 VL2p 전배측 후각 투사 뉴런인 twin-spot MARCM 클론의 결과를 보여줍니다.배아 단계의 adPN 신경모세포에서 유사분열 재조합을 매개하기 위함입니다. 이 첫 번째 도식은 신경발생 패턴을 보여줍니다. 뇌의 이 공초점 현미경 이미지에서 VL2p adPN은 녹색으로 표시되며, 자홍색으로 표시된 다세포 신경모세포 adPN과 연관되어 있습니다.이 이미지는 외측각(lateral horn)의 세포들을 보여줍니다. 여기서 촉각엽(antennal lobe)의 뉴런 형태학을 확인할 수 있습니다. 이 이미지는 DL1 adPNs의 데이터를 보여줍니다.여기서 볼 수 있듯이, DL1 adPN은 VL2p adPN보다 발달 과정에서 더 나중에 나타납니다. DC3 adPN의 twin-spot MARCM 클론 유도는 이 뉴런 유형이 발달 후기에 나타남을 입증합니다. 이 이미지는 adPN 계보 내의 GAL4 음성 뉴런에서 twin-spot MARCM 이벤트가 발생했음을 보여줍니다.이 기술을 숙달하면 연구자는 신경 계통을 분석하고, 신경세포를 신경모세포 클론과 구별할 수 있는 다양한 마커를 제공받을 수 있습니다. 또한, twin-spot MARCM을 통해 이형 접합 유전적 배경에서 동형 접합 돌연변이 클론을 생성하여 분자적 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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