쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

이 twin-spot MARCM 프로토콜의 전반적인 목표는 고해상도 세포 계통 분석과 더 나은 유전자 기능 연구를 수행하는 것입니다. 뇌 조직은 수많은 다양한 뉴런으로 구성되어 있으며, 발달 과정에서 뉴런이 어떻게 함께 조립되는지에 대한 메커니즘을 연구하는 것은 어렵습니다. 이 기술의 주요 장점은 공통 뉴런 전구 세포에서 파생된 뉴런을 두 가지 고유한 색상으로 표시하는 것입니다.

개별 뉴런의 정보 출생을 검색 할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 연구자들이 신경 발달의 기저에 있는 세포 및 분자 메커니즘을 탐구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 오늘 절차를 시연하는 사람은 Pei-Chi Chung입니다.

유 교수 연구실의 기술자. 먼저 쌍둥이 반점 MARCM을 준비한 수컷과 암컷을 플라이 푸드 바이알에 넣고 바이알에 신선한 효모를 넣어 결합합니다. 교차된 쌍둥이 반점 MARCM은 수정란을 채취하기 전에 짝짓기 기회를 높이기 위해 이틀 동안 섭씨 25도에서 비행할 준비가 되어 있습니다.

유충이 부화할 때 과밀을 피하려면 교차된 쌍둥이 반점 MARCM 레디 플라이를 탭하고 갓 효모를 만든 바이알로 옮깁니다. 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 쌍둥이 반점 MARCM 자손을 배양합니다. 여기에서 유충 단계의 파리는 플립파제 발현을 유도하기 위해 열 충격을 가합니다.

플라이 바이알을 섭씨 37도의 수조로 10분, 20분, 30분, 40분, 50분 동안 옮겨 플립파제 발현을 위한 최적의 열 충격을 결정합니다. 관심 있는 twin-spot MARCM 클론을 생성합니다. 열 충격의 타이밍은 제거 생성 단계를 결정하고 열 충격 기간은 얼마나 많은 제거가 생성되는지를 정의합니다.

열로 충격을 받은 쌍둥이 반점 MARCM 동물을 섭씨 25도에서 원하는 발달 단계까지 배양합니다. 그런 다음 염색 및 장착을 진행합니다. 겸자 보호 접시에 PBS를 추가합니다.

그런 다음 쌍둥이 점인 MARCM 동물을 접시로 옮깁니다. 해부 현미경을 통해 보면서 집게를 사용하여 쌍둥이 반점 MARCM 동물의 뇌를 해부합니다. 먼저 파리의 몸통에서 머리를 제거합니다.

그런 다음 뇌를 손상시키지 않고 큐티클을 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 흰색 섬유로 보이는 기관을 조심스럽게 제거합니다. 뇌를 4%포름알데히드와 PBS를 함유한 유리 스폿 플레이트로 옮깁니다.

그리고 실온에서 20분 동안 고정합니다. 1%PBT로 파리 뇌를 세 번 헹구어 염색 절차를 시작합니다. 그런 다음 1 % PBT로 세 번 세척하십시오.

매번 30분씩 흔듭니다. 1차 항체 혼합물로 파리의 뇌를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 파리의 뇌를 1%PBT로 각각 3회 헹구고 세척하되 이전과 같이 흔듭니다.

그런 다음 2차 항체 혼합물로 파리의 뇌를 실온에서 4시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 이전과 같이 뇌를 헹구고 세척한 후 담금질 방지 시약이 있는 마이크로슬라이드에 뇌를 장착합니다. 그런 다음 파리 뇌를 덮고 보호하기 위해 덮개 유리를 놓습니다.

마이크로 커버 유리의 가장자리를 밀봉하고 투명 매니큐어를 사용하여 마이크로슬라이드합니다. 마지막으로, 선택한 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 샘플에서 twin-spot MARCM 클론의 형광 이미지를 캡처합니다. 이 그림은 flippase의 유도에 의해 파생된 VL2p antero dorsal olfactory projection neuron인 twin-spot MARCM clone의 결과를 보여줍니다.

배아 단계에서 adPN 신경 폭발에서 신비한 재조합을 매개합니다. 이 첫 번째 다이어그램은 신경 발생 패턴을 보여줍니다. 이 뇌의 컨포칼 현미경 이미지에서 VL2p adPN은 녹색으로 표시되며 자홍색 색상의 다세포 신경 아세포 adPN과 관련이 있습니다.

이 이미지는 측면 뿔의 세포를 보여줍니다. 더듬이 엽의 신경 형태가 여기에서 볼 수 있습니다. 이 이미지는 DL1 adPN에 대한 데이터를 보여줍니다.

여기에서 볼 수 있듯이 DL1 adPN은 VL2p adPN보다 개발 후반에 나타납니다. DC3 adPN의 twin-spot MARCM 클론의 유도는 이 뉴런 유형이 나중에 발달에서 나타난다는 것을 보여줍니다. 이 이미지는 twin-spot MARCM 이벤트가 adPN 계보 내의 GAL4 음성 뉴런에서 발생함을 보여줍니다.

이 기술을 숙달하면 연구자들이 신경 계통을 분석하고 뉴런과 신경아세포 클론을 구별하는 다양한 마커를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 twin-spot MARCM은 분자 메커니즘을 탐구하기 위해 동형접합 돌연변이 클론을 생산할 수 있습니다. 이형접합적 유전적 배경에서.