이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

이 실험 절차의 전체적인 목표는 이미징 유세포 분석법(imaging flow cytometry)을 사용하여 T 세포의 동종반응성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 수혜자의 T 세포 중 어느 정도의 비율이 공여자의 동종항원에 반응하는지와 같은 이식 면역학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 유세포 분석의 다매개변수 정량 분석 능력과 형광 현미경의 이미징 기능을 결합하여, 개별 T 세포와 항원 제시 세포의 시냅스를 고효율로 검사할 수 있게 합니다.

실험 절차의 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Sajad Moshkelgosha가 진행하겠습니다. 먼저 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 0.5 × 10⁶개의 수지상 세포를 분주하고, 이어서 1 × 10⁶개의 T 세포를 넣은 뒤, 각 웰의 최종 부피가 50 µL가 되도록 배양액을 채워줍니다.

냉각된 배양물을 37°C, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 각 웰에 PBS에 희석한 1.5% formaldehyde를 배양물 부피의 3배만큼 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시킵니다. 고정이 완료되면, 각 웰의 세포를 해당하는 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.

차광 상태의 실온에서 100 µL의 세척 완충액에 적절한 형광색소 접합 항체를 사용하여 세포를 30분 동안 염색합니다. 다음으로, 1 mL의 세척 완충액으로 세포를 세척하고 phalloidin FITC가 포함된 투과/세척 완충액에 펠렛을 재부유시킵니다. 차광 상태의 실온에서 다시 30분 동안 반응시킨 후, 1 mL의 신선한 투과/세척 완충액으로 세포를 세척합니다.

펠렛을 원하는 핵 염색제가 포함된 perm/wash buffer에 재현탁하고, 빛이 차단된 상온에서 30분 동안 최종 배양합니다. 1 mL의 perm/wash buffer로 세포를 세척한 후, wash buffer만으로 한 번 더 세척합니다. 그 다음, 50에서 100 µL의 신선한 wash buffer에 세포를 재현탁합니다.

세포를 캡이 달린 작은 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 간 상호작용을 분석하기 위해, 먼저 명시야 이미지 획득을 위한 채널 하나를 확보하고 첫 번째 대조군 튜브를 로딩합니다. 명시야 채널을 끈 상태에서 워크스페이스 창에 면적 대비 종횡비로 사용되는 각 채널에 대한 새로운 산점도를 생성합니다.

가로세로 비율(aspect ratio)이 1에 가까운 싱글렛(singlets) 영역에 게이트를 설정하십시오. 각 형광색소에 대해 양성 집단을 확인하고, 필요에 따라 조명 상자에서 레이저 전압을 조정하십시오. 채널 상자에서 염색에 사용된 형광색소에 적합한 채널을 선택하십시오.

그런 다음 기록(record)을 클릭합니다. 이벤트 수가 지정된 임계값에 도달하면 획득이 자동으로 중지됩니다. 모든 단일 염색 대조군 획득이 완료되면, 첫 번째 실험 샘플 튜브를 로드하고 명시야 채널을 포함한 적절한 분석 채널에서 수만 개의 이벤트를 획득합니다.

보정 행렬을 생성하려면 단일 염색 대조군 데이터 파일을 보정 마법사(compensation wizard)로 불러온 후, 실험에 적합한 형광 채널을 선택하십시오. 올바른 양성 군집이 선택되었는지 확인한 후, 행렬 내의 값을 더블 클릭하여 각 채널의 그래프를 분석 영역에 추가하십시오. 완료를 클릭하여 보정 행렬을 CTM 파일로 저장하십시오.

RIF 파일을 적절한 분석 소프트웨어에 로드합니다. RIF 파일을 데이터 분석용 DAF 파일로 변환합니다. 첫 번째 샘플 파일을 엽니다.

명시야 채널의 영상 강도 변화율의 제곱 평균 제곱근(root mean square)을 도식화하십시오. 그다음, 항원 제시 세포 마커의 면적 대비 종횡비를 도식화하십시오. 단일 항원 제시 세포를 포함하는 이중체(doublet)를 게이팅하십시오.

T 세포 마커의 종횡비 대 면적을 도표로 나타냅니다. 단일 T 세포를 포함하는 더블렛(doublets)을 게이팅합니다. 서로 접촉하고 있는 세포를 식별하기 위해, 분석 메뉴에서 마스크 옵션을 사용하여 마스크 관리자를 열고, 새 마스크의 이름을 T 세포 객체 마스크로 지정합니다.

함수 버튼을 클릭하고 대화 상자에서 객체(object)를 선택하십시오. T 세포 마커가 검출되는 채널을 선택하고 확인을 클릭하십시오. 동일한 방식으로 적절한 채널에서 항원 제시 세포 마커를 위한 마스크를 생성하십시오. 항원 제시 세포 객체 마스크 내의 T 세포 마커 형광 강도를 T 세포 객체 마스크 내의 항원 제시 세포 형광 강도에 대해 도식화하십시오.

그 다음, 서로 접촉하고 있는 세포들만 포함하도록 게이트를 설정합니다. 마지막으로, 태그 이미지 기능을 사용하여 이 이미지들을 표시함으로써, 이 게이트 내 이벤트들의 phalloidin FITC 이미지를 수동으로 검토하여 성숙한 면역 시냅스와 단순한 세포 간 접촉을 구분합니다. 여기에서는 이식 7일 후 B6 심장 동종이식 수혜자(내성 유도 및 비유도군)로부터 얻은 비장 CD4 양성 T 세포를 B6 골수 유래 수지상 세포와 공동 배양했을 때의 막 접촉 게이트가 예시와 같이 표시되어 있습니다.

녹색 십자선으로 표시된 시냅스 및 비시냅스 이벤트입니다. 명시야 및 형광 채널 분석을 통해 개별 시냅스 및 비시냅스 이벤트를 시각화할 수 있습니다. 실제로, B6 심장을 이식받은 비내성 및 내성 CDA 수혜자의 시냅스는 T 세포와 항원 제시 세포 계면의 조밀한 FITC 양성 릿지(ridge) 존재 여부를 통해 비시냅스 접촉부와 쉽게 구별됩니다.

추가적인 개발을 거치면 이 기술은 인간 이식 수혜자의 면역 억제제 감소 또는 중단, 혹은 이식편 결과 예측과 같은 임상 환경에 적용될 수 있을 것입니다.