Name: 이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 학습하세요 이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 동종 반응성을 측정하는 방법을. 이 기술은 이식 면역학에서 T 세포와 항원 제시 세포 간 면역 시냅스를 고속 분석하여 이식 거부 반응 메커니즘을 이해하고 이식 결과를 예측하는 데 활용됩니다.

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SCJ는 심장에 대한 국제 사회와 폐 이식 연구 활동 및 의사의 왕 대학 및 Fellowship.SM 여행 캐나다 Detweiler의 외과 의사에 의해 지원되었다 심장과 (SCJ에) 폐 이식 경력 개발 수상 국제 사회에 의해 부분적으로 지원되었다. SS는 건강 연구 옥스포드 생물 의학 연구 Centre.JH의 국립 연구소에 의해 지원되었다하는 것은 신장 연구 UK 수석 비 임상 원정대의받는 사람입니다. 웰컴 트러스트 프로그램 그랜트 (082519Z07Z), 영국 심장 재단 프로그램 그랜트 (PG / 10 / 62.28504) 및 EU 프레임 워크 프로그램 7 (; BioDRIM 한 연구) :이 작품은 AB와 KW에 다음과 보조금에 의해 투자되었다. 저자는 같이 ImageStream 마크 X의 악기에 대한 액세스 및 지원을 제공하기 위해 마이클 파슨스와 Lunenfeld - 타넨 바움 연구소에서 유동 세포 계측법 핵심 시설, 시나이 의료 시스템, 토론토 감사드립니다.

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</ol>

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이미징 유동 세포 계측법 단클론 T 세포와 항원 제시 사이 또는 초 항원 24, 25, 26, 27, 28의 존재하에 면역 시냅스 형성을 설명하기 위해 사용되었다. 이 방법은 생산 T 세포 APC 접촉 한 후, T 세포는 접촉 (21)의 위치를 향해 편광 그 액틴 세포 골격 재 배열된다는 사실을 이용한다. 이 재 배열 TCR 시그널링없이 발생하지 않으며, 따라서, T 세포의 활성화 (19), (20), (21)의 초기의 상관 관계이다. 여기에 제시된 방법은 폴리 클로 날 T 세포 개체군 alloreactive T 세포 주파수의 측정에이 방법을 적응시킨다. 따라서, 그것은 미래에 기증자 reactivi에 대한 분석의 개발을위한 기반이 될 수 있습니다<html> 임상 이식에 타이. 직접적인 비교는 아직 이루어지지 않았지만, alloreactive 면역 시냅스의 검출은 기존의 MLR보다 뛰어난 예측 능력을 가지고 나타납니다. 내성 프로토콜은 상술 한 예를 들어, 이전의 연구는 것을 보여 주었다 MLR 결과 확실 그래프트 2 상관 결과 못한다. 이러한 alloantigen에 응답 이펙터 세포의 기능을 측정하지는 않지만 분석법 수많은 인간 9, 10, 11에서의 동작 적 상태에 대한 내성이 개발되어왔다. 반대로, IFNγ ELISPOT 8 계수 이펙터 T 세포 기능 분석되지만, IL-17 (38)와 같은 급성 및 만성 동종 이식 거부 반응과 관련이있다 사이토 카인 분비의 전체 스펙트럼을 캡처 할 수있는,&gt; 39. 노동 집약적 인 제한 희석 분석 4, 쥐를 필요로하는 트랜스 - 생체 분석 (6), 임상 환경에서 자신의 응용 프로그램을 방해 할 중요한 실질적인 한계가 있습니다. MLR에 응답 T 세포의 TCR 서열 분석을 이용하여 세포 증식 분석의 최근 개선이 값이 될 수 있지만 여기에 제시된 분석과 같은, 임상 시험 18 40 추가 검증을 필요로한다. 면역 시냅스 탐지 분석의 추가 개발은 중요한 질문의 번호가 대답하는 것이 필요합니다. 먼저 개발로 분석은 직접 alloreactivity을 측정한다. 직접 경로는 도너 유래 장갑차에 동종 MHC / 펩티드 복합체의 표현을 포함한다. 후자는 일반적으로 이식 후 신속하게 제거하고, 또한 alloantigen 발표되어있다 CARRI그대로 공여 MHC (세미 직접 경로)을 제시받는 장갑차 또는 자기 MHC (간접 경로)에 처리 도너 항원하여 에드. 간접 경로는 만성 동종 이식 거부 (33), (41)의 중요한 드라이버이다. 원칙적으로,이 분석을 이용하여 간접 면역 시냅스를 검출하는 것이 가능해야하지만, 간접적 alloreactive T 세포는 이벤트의 많은 수의 분석이 요구된다는 것을 의미 직접들 (42), (43)보다 훨씬 낮은 주파수를 가지고있다. 두 번째 고려 사항은 우리가 단지 CD8 + T 세포는 항 - 공여 반응의 중요한 구성 요소 인 반면, CD4 + T 세포를 사용하여이 시험을 시험 한 점이다. 다시,이 방법으로 CD8 + T 세포 APC 시냅스를 검출 할 수 있어야한다. 또 다른 한계는 본 방법은 최종 MEMB의 수동 검토 및 세포 영상 분석을 필요로한다는 것이다rane 사용자 연락처 게이트, 우리는 현재이 단계의 자동화에 노력하고 있습니다. 마지막으로, 방법은 인간을 대상으로 테스트 및 개발을 필요로하고, 인간의 샘플 예비 연구는 현재 수행되고있다. 이식 수혜자의 면역 시냅스의 검출과 함께 또한 표현형 T 세포의 부분 집합 분석 (즉, 이펙터, 메모리, 규제 등) alloreactive T 세포 레퍼토리를 특성화하기위한 강력한 접근 방식을 나타내는 것이며, 중요한 초점이 될 것이다 향후 연구.

고형 장기 이식은 신장, 간, 심장, 폐의 말기 질환 환자의 치료를 변형시켰다. 면역 억제제를 사용하지 않을 경우 크고 작은 조직 적합성 항원의 불균형으로 인해, 그러나, 동종 이식은 즉시받는 사람 T 세포에 의해 거부됩니다. 이러한 에이전트는 암과 장기 기능 장애에 대한 위험 등 다양한 부작용을 가지고있다. 주요 임상 목표는 동종 이식 거부 반응을 방지하기 위해 필요한 최소 수준으로 면역 억제제의 용량을 절감하는 것이다. 이 수준은 선천성 면역 시스템의 활성화 정도에 따라 달라질 가능성이 높습니다; 기증자받는 사람 alloantigen 불일치의 정도; 면역 기능, 약동학 및 약력학 및 환자 간 차이. 불행하게도, 이식 임상 정확하게 개별 환자의 1에 기증자의 반응성을 평가하기위한 어떤 도구를 필요가 없습니다. 혼합백혈구 반응 (MLR)의 도너 반응성을 검출 할 수 있지만, 확실 그래프트 결과 (2, 3)를 예측하지 못한다. 제한적인 희석 세이, 사이토 카인 ELISPOTs 및 트랜스 - 생체 분석 중 하나는 반응의 제한된 범위를 측정 또는 연산 오차 9, 10, 11에 관련된 4, 5, 6, 7, 8 개 .Gene 발현 프로파일 밝혀냈다 서명은 실용적이지 않다 (12)과 거부 13, 14, 15, 그러나 이들은 항상 인구 16에서 일반화 할 수없는 궁극적으로 개별 환자의 유용성을 제한 할 수 있습니다. 순서 기반 analyMLR 18 말초 혈액 17에서 증식 T 세포의 T 세포 수용체 (TCR)의 SES도 개발하지만 추가 검증을 요구하고있다. 개념적으로 도너 항원에 의해받는 T 세포 활성화에 필요한 초기 단계를 검출하는 분석을 갖는 것이 바람직하다. 유물을 소개 할 수 있습니다합니다 (MLR 같이) 일 동안 세포를 배양하기 때문에, 이러한 테스트는 이상적으로 이러한 확산 또는 이펙터 기능과 다운 스트림 이벤트의 측정을 필요로하지 않을 것입니다. 테스트는 순전히 기술적 인 평가하기 때문에, T - 세포 기능의 일부 요소에 의존하는 동등하게, 그러나, 그것은 또한 바람직 할 것이다 (예를 들면, TCR 시퀀싱) 아네 르기 기능적 T 세포를 구별 할 수 없을 수도있다. 수많은 연구들은 장기간 T-APC 연락 필수 최초 면역 시냅스의 형성에 필요한 것을 나타낼T 세포 반응 19, 20, 21, 22 단계를 포함한다. 마우스의 10 % CD4 + T 세포가 동종 골수 유래 수지상 세포 (BMDCs) (23) 오래 지속되는 접점을 형성 - 우리는 최근 체외 시간 경과 영상, 약 5 동적 동안, 보도했다. 장시간의 접촉 빈도가 마우스에서 이전에 동일한 항원에 대한 내성을 표현하는 반면, 그래프트 거부 동물이 증대하고, 그것을 쥐 untransplanted 23에서 볼 수준에서 유지되었다. 지속적인 상호 작용을받는 Tregs의 존재 하에서 환원들이 없을 증가, 우리는 인간 T 세포와 동종 단핵구 유래 수지상 세포 (MoDCs) (23)를 사용하여 유사한 현상이 관찰되었다. 그러나, 장기간의 콘택트의 열거는 폴리 클로 날 T 세포 populatio 이내에여기서 n은 시간과 노동 집약적이다. 따라서 우리는 이미지의 사용은 동종 면역 시냅스 형성을 검토하는 유동 세포 계측법했다. 이미징 유동 세포 계측법 계측법, 형광 현미경의 단일 셀 이미징 능력을 가진 종래의 흐름 multiparametric 데이터 획득 및 분석 기능을 포함한다. 이 기술은 단일 클론 T 세포 24, 26, 27 또는 초 항원 (28)의 존재 면역 시냅스 형성을 연구하기 위해 다른 연구자에 의해 사용되어왔다. alloreactive T 세포는 일반적으로 전체 T 세포 레퍼토리 29, 30, 31, 32 5-15 %를 차지하도록 예상되는 반면, 이러한 설정에서, 그러나, 응답 T 세포의 빈도는 30-100 %의 범위이다. 중요한 것은, 우리는 이미징 흐름 세포 계측법 AV를 생성 할 수 있음을 보여 주었다ERY alloreactive T 셀 (23)의 주파수 및 폴리 클로 날 T 세포 집단 내에서 시냅스 주파수의 변화 그래프트 결과 (23)의 예측되는 것을 비교 측정. 현재,이 방법은 원칙적으로 CD4 + T 세포의 직접 alloreactivity을 측정하기 위해 최적화되었지만, 또한 CD8 + T 세포와 간접 경로를 조사하기 위해 개발 될 수있다. 간접 alloreactivity는 이식 후 33 긴 시간에 점점 더 관련 될 것으로 추정된다. 우리는 현재 환자에서 테스트 할 수 있도록 인간의 세포를 사용하려면이 방법을 개발하고있다. 따라서, 미래에 전반적인 접근 방식은 이식 전에 이식에 T 세포 반응의 기능 평가에 유용 할 수있다; 즉시 이식 후; 그리고 장기적으로, 경우에 약물 최소화 중요한 목표된다.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>다양한</td><td>에</td><td></td></tr><tr><td>틸렌디아메네테트라아세트산, 0.5M 용액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 비이온성 세제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F1635</td><td>용액은 37 % 포름 알데히드이므로 1.5 % 용액에 대해 25 번 희석해야합니다</td></tr><tr><td>세포 여과기, 70 &mu; m 기공 크기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-fluorescein isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomycin D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>Reconstitute in DMSO</td></tr><tr><td>Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>퍼시픽 블루는 eFluor 450</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse MHC class II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 안티 마우스 CD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>안티 비오틴 마이크로비즈</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 자기 세포 분리기</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF&베타; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>인간 TGF&beta; 1은 마우스 세포에 활성이 있습니다</td></tr><tr>.<td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>이미징 유세포 분석기; 자세한 내용은 http://www.emdmillipore.com/ IDEAS Software에서 확인 가능</td></tr> <tr><td></td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>무료 다운로드 (등록 필요): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>세포 배양 배지&nbsp;</td><td></td><td></td><td>다양</td></tr> 함 <tr><td>태아 혈청</td><td>다양</td> 다양<td>함</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트</td><td>다양 함</td> 다양<td>함</td><td></td></tr></tbody></table>

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 t 세포 alloreactivity의 측정

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

이식에서 공여 항원에 대한 면역 반응의 측정은 성공적으로 감소 또는 면역 억제의 철수에 중요한 될 가능성이 높습니다. 혼합 백혈구 반응 (MLR), 제한 희석 분석 및 트랜스 생체 지연 형 과민 (DTH) 분석이 모든 문제에 적용되어 왔지만,이 방법은 예측 기능 및 / 또는 유용성을 줄이는 중요한 실용적인 한계를 제한. 이미징 유동 세포 계측법 계측법, 형광 현미경의 이미징 기능과 흐름의 양적 multiparametric 전력을 결합하는 기술이다. 최근 도너 항원 제시 세포 (APC를) 성숙한 면역 시냅스를 형성 할 수있는 수신자 T 세포의 비율을 정의하는 촬상 유세포 방식을 사용했다. 잘 특성화 된 마우스 심장 이식 모델을 사용하여, 우리는 결과에 의하면 T-APC의 membr 중 체외 면역 시냅스의 주파수메탄 연락처 이벤트가 강하게 동종 이식 거부, 허용 오차의 결과 및 이식 생존을 유도 규제 T 세포에 의존하는 상황을 예측했다. T-APC 연락처의 주파수는 급성 거부 반응 동안 마우스로부터 T 세포를 증가 alloantigen하는 응답 렌더링 마우스로부터 T 세포를 감소. 시험 관내 시스템 조절 T 세포의 첨가는 장기간 T-APC 접점을 감소시켰다. 결정적으로, 이러한 효과는 또한 자연적으로 인간형 마우스 모델에서 인체 조직의 거부 반응을 제어하기 위해 공지 된 조절 T 세포를 발생 확장 인간 polyclonally으로 보였다. 이 방법의 추가 개발은 이식의 alloreactive T 세포 구획의 깊은 특성을 허용 할 수있다. 향후 발전과 인간의 세포를 사용하여이 방법의 평가는 면역 최소화를위한 환자를 선택하기 위해 사용되는 분석의 기초를 형성 할 수 있고, tolerogen의 영향을 측정하는데 사용될 수있다IC는 병원에서 치료.

이 방법은 이소성 심장 동종 이식하기 전에 공여자 alloantigens 내성 렌더링 마우스에서 CD4 + T 세포 alloreactivity을 조사 하였다. CBA 마우스 (H-2 k)는 (H-2 B B6) 비 - 고갈 CD4 항체 일개월 결합 수혈 전에 B6 심장 이식의 수신에 도너 특정 이루어진 내성 프로토콜을 받았다. Foxp3의 + T 조절 세포 (36) (37)에 의존 장기 이식 생존율이 프로토콜 결과. tolerized B6 및 심장 동종 이식 비 tolerized받는 공동 배양이 프로토콜에 따른 B6 골수 유래 수지상 하였다로부터 이식 후 7 일 후에는, 비장 CD4 + T 세포를 얻었다. 도 2는이 실험의 대표 데이터를 도시한다. 멤브레인 컨택 게이트는도 2에 도시A, 녹색 십자선 시냅스 이벤트에 배치하여 (좌측 패널 (1)) 및 비 이벤트에 시냅스 (오른쪽 패널). 도 2b는이 이벤트의 시야와 형광 채널을 나타낸다. 편견을 줄이기 위해, 데이터 처리 할당 (23)에 눈을 멀게 관찰자에 의해 분석 하였다. 모두 비 tolerized에서도 3에 여러 실시 예에 도시 된 바와 같이 (도 3A-B) 및 tolerized (도 3C-D) B6 하트 CBA 수신자는 시냅스는 T-APC 계면에서 고밀도 FITC 양성 리지의 존재에 의하여 비 시냅스 접촉으로부터 쉽게 구별된다. 이러한 결과는 수신자 T 세포에 의한 면역 시냅스 시각적 검출 수신자에 alloreactivity 정도에 트랙을 보여준다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> 막과 T-APC는 이중의 그림 2. 확인연락처 및 면역 시냅스 형성. 최종 이중 게이트 (도 1F)의 이벤트는 분석된다. 는 APC 객체 마스크 A. T 세포 마커 형광은 DC 객체 마스크 APC 형광 마커에 대해 도시된다. 일부 이중 이벤트가 세포 - 세포 접촉없이 APC와 T 세포가 있고 플롯의 왼쪽 하단 모서리에 표시 (이미지가 표시되지 않음). 멤브레인 컨택 게이트 따라서 T 세포와 항원 제시가 접촉하는 유일한 이중선를 포함 그려 질 수있다. 이 게이트의 각 이벤트의 이미지는 팔로이 딘-FITC 채널에서 액틴 세포 골격 재 배열 증거 검토 및 분석 소프트웨어를 사용하여 태그 될 수있다. 왼쪽 패널은 오른쪽 패널 면역 시냅스 형성없이 막 접촉 이벤트를 나타내는 반면, 면역 시냅스 이벤트 (1로 표시된 녹색 십자선으로 나타냄)를 나타내는 (2로 라벨링 및 녹색 십자선으로 나타냄). 시냅스 형성의 결정은 이들의 수동 검토가 필요이미지, B. B.에 도시 윗줄은 면역 시냅스와 이중선 대한 시야와 형광 채널 영상을 나타낸다 (A 이벤트의 1에 해당); 하단 행 막 접촉하지만 부족한 시냅스 형성 (A 2의 이벤트에 대응)와 이중선을 나타낸다. 데이터 처리 할당에 대하여 맹검 방식으로 분석하고 이전에 출판 실험 23가 됨. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> T-APC 시냅스 형성의 그림 3. 예. CBA 마우스는 (하나 없음 전처리 (AB) 후, 또는 비 - 고갈 항 CD4 항체의 언더 커버 B6 전혈 내성 유도 후 B6 공여자 심장 동종 이식을받은 <st<html> 룽&gt; CD). 7 일 후, 비장 CD4 + T 세포와 수지상 B6 시냅스 형성에 대해 시험 하였다. A. 비 tolerized 동물에서 막 접촉 비 시냅스 이중선의 세 가지 예를 도시한다. B. 비 tolerized 동물에서 면역 시냅스의 세 가지 예. C. tolerized 동물에서 막 접촉 비 시냅스 이중선의 세 가지 예를 도시한다. D. tolerized 동물에서 면역 시냅스의 세 가지 예. 시냅스 형성은 T-APC 인터페이스 (CH03)에서 밝은 FITC 양성 리지의 존재에 의해 표시된다. 데이터 처리 할당에 대하여 맹검 방식으로 분석하고 이전에 출판 실험 23가 됨. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> AYS &quot;&gt; <tbody><tr><td> 항체 / 염료 </td><td> 형광 색소 </td><td> 채널 </td><td> 집중 </td></tr><tr><td> 중 CD11c </td><td> eF450 </td><td> CH02 </td><td> 5 ㎍ / ㎖, 경험적 적정 </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> CH06 </td><td> 5 ㎍ / ㎖, 경험적 적정 </td></tr><tr><td> Phalloidin의 </td><td> FITC </td><td> CH03 </td><td> 0.05-0.5 ㎍ / ㎖의 </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> CH05 </td><td> 25 ㎍ / mL의 </td></tr></tbody></table> 표 1. 항체이 연구에 사용 된 염료. 형광 색소 - 복합 된 항체, 염료, 공급자, 권장 농도는 표에 제시된다. 각각의 형광 색소를 검출하기 위해 사용 된 채널 사이토 촬상 유량은 표에 도시된다.

이 논문 계측법 촬상 흐름을 사용하여 T 세포의 혼합 집단에서 alloreactivity를 측정하는 방법을 설명한다.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 이미징 유세포 분석법(imaging flow cytometry)을 사용하여 T 세포의 동종반응성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 수혜자의 T 세포 중 어느 정도의 비율이 공여자의 동종항원에 반응하는지와 같은 이식 면역학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 유세포 분석의 다매개변수 정량 분석 능력과 형광 현미경의 이미징 기능을 결합하여, 개별 T 세포와 항원 제시 세포의 시냅스를 고효율로 검사할 수 있게 합니다.실험 절차의 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Sajad Moshkelgosha가 진행하겠습니다. 먼저 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 0.5 × 10⁶개의 수지상 세포를 분주하고, 이어서 1 × 10⁶개의 T 세포를 넣은 뒤, 각 웰의 최종 부피가 50 µL가 되도록 배양액을 채워줍니다.냉각된 배양물을 37°C, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 각 웰에 PBS에 희석한 1.5% formaldehyde를 배양물 부피의 3배만큼 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시킵니다. 고정이 완료되면, 각 웰의 세포를 해당하는 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.차광 상태의 실온에서 100 µL의 세척 완충액에 적절한 형광색소 접합 항체를 사용하여 세포를 30분 동안 염색합니다. 다음으로, 1 mL의 세척 완충액으로 세포를 세척하고 phalloidin FITC가 포함된 투과/세척 완충액에 펠렛을 재부유시킵니다. 차광 상태의 실온에서 다시 30분 동안 반응시킨 후, 1 mL의 신선한 투과/세척 완충액으로 세포를 세척합니다.펠렛을 원하는 핵 염색제가 포함된 perm/wash buffer에 재현탁하고, 빛이 차단된 상온에서 30분 동안 최종 배양합니다. 1 mL의 perm/wash buffer로 세포를 세척한 후, wash buffer만으로 한 번 더 세척합니다. 그 다음, 50에서 100 µL의 신선한 wash buffer에 세포를 재현탁합니다.세포를 캡이 달린 작은 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 간 상호작용을 분석하기 위해, 먼저 명시야 이미지 획득을 위한 채널 하나를 확보하고 첫 번째 대조군 튜브를 로딩합니다. 명시야 채널을 끈 상태에서 워크스페이스 창에 면적 대비 종횡비로 사용되는 각 채널에 대한 새로운 산점도를 생성합니다.가로세로 비율(aspect ratio)이 1에 가까운 싱글렛(singlets) 영역에 게이트를 설정하십시오. 각 형광색소에 대해 양성 집단을 확인하고, 필요에 따라 조명 상자에서 레이저 전압을 조정하십시오. 채널 상자에서 염색에 사용된 형광색소에 적합한 채널을 선택하십시오.그런 다음 기록(record)을 클릭합니다. 이벤트 수가 지정된 임계값에 도달하면 획득이 자동으로 중지됩니다. 모든 단일 염색 대조군 획득이 완료되면, 첫 번째 실험 샘플 튜브를 로드하고 명시야 채널을 포함한 적절한 분석 채널에서 수만 개의 이벤트를 획득합니다.보정 행렬을 생성하려면 단일 염색 대조군 데이터 파일을 보정 마법사(compensation wizard)로 불러온 후, 실험에 적합한 형광 채널을 선택하십시오. 올바른 양성 군집이 선택되었는지 확인한 후, 행렬 내의 값을 더블 클릭하여 각 채널의 그래프를 분석 영역에 추가하십시오. 완료를 클릭하여 보정 행렬을 CTM 파일로 저장하십시오.RIF 파일을 적절한 분석 소프트웨어에 로드합니다. RIF 파일을 데이터 분석용 DAF 파일로 변환합니다. 첫 번째 샘플 파일을 엽니다.명시야 채널의 영상 강도 변화율의 제곱 평균 제곱근(root mean square)을 도식화하십시오. 그다음, 항원 제시 세포 마커의 면적 대비 종횡비를 도식화하십시오. 단일 항원 제시 세포를 포함하는 이중체(doublet)를 게이팅하십시오.T 세포 마커의 종횡비 대 면적을 도표로 나타냅니다. 단일 T 세포를 포함하는 더블렛(doublets)을 게이팅합니다. 서로 접촉하고 있는 세포를 식별하기 위해, 분석 메뉴에서 마스크 옵션을 사용하여 마스크 관리자를 열고, 새 마스크의 이름을 T 세포 객체 마스크로 지정합니다.함수 버튼을 클릭하고 대화 상자에서 객체(object)를 선택하십시오. T 세포 마커가 검출되는 채널을 선택하고 확인을 클릭하십시오. 동일한 방식으로 적절한 채널에서 항원 제시 세포 마커를 위한 마스크를 생성하십시오. 항원 제시 세포 객체 마스크 내의 T 세포 마커 형광 강도를 T 세포 객체 마스크 내의 항원 제시 세포 형광 강도에 대해 도식화하십시오.그 다음, 서로 접촉하고 있는 세포들만 포함하도록 게이트를 설정합니다. 마지막으로, 태그 이미지 기능을 사용하여 이 이미지들을 표시함으로써, 이 게이트 내 이벤트들의 phalloidin FITC 이미지를 수동으로 검토하여 성숙한 면역 시냅스와 단순한 세포 간 접촉을 구분합니다. 여기에서는 이식 7일 후 B6 심장 동종이식 수혜자(내성 유도 및 비유도군)로부터 얻은 비장 CD4 양성 T 세포를 B6 골수 유래 수지상 세포와 공동 배양했을 때의 막 접촉 게이트가 예시와 같이 표시되어 있습니다.녹색 십자선으로 표시된 시냅스 및 비시냅스 이벤트입니다. 명시야 및 형광 채널 분석을 통해 개별 시냅스 및 비시냅스 이벤트를 시각화할 수 있습니다. 실제로, B6 심장을 이식받은 비내성 및 내성 CDA 수혜자의 시냅스는 T 세포와 항원 제시 세포 계면의 조밀한 FITC 양성 릿지(ridge) 존재 여부를 통해 비시냅스 접촉부와 쉽게 구별됩니다.추가적인 개발을 거치면 이 기술은 인간 이식 수혜자의 면역 억제제 감소 또는 중단, 혹은 이식편 결과 예측과 같은 임상 환경에 적용될 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Tregs는 면역 시스템의 강력한 진압하고 있습니다. 그들을 정의하는 독특한 표면 마커의 부족이있다, 그러므로, Tregs의 정의는 주로 기능입니다. 여기서 우리는 최적화된...

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

면역 세포 기능과 확산을 모니터하기위한 셀 추적 염료의 성공적인 사용은 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 우리가 방법을 설명합니다 : 1) 막 염료를 갖춘 밝고 균일 재현 라벨 - ING 획득, 2) fluorochromes 및 데이터 수집 조건을 선택을하고, 3) 염료 희석에 따라 세포 증식을 수량화 할 수있는 모델을 선택.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

이 동영상은 면역학적 시냅스 형성으로 이어지는 동종 항원 운반 수지상 세포와의 상호 작용을 관찰하여 혼합 T 세포 집단에서 동종 반응을 평가하는 방법을 보여줍니다. 유세포 분석을 통한 시냅스 함유 이중항의 차등 염색 및 정량화는 T 세포 동질활성을 나타냅니다.

T세포가 혼합된 집단에서 동종반응성 측정(Measuring alloreactivity in a Mixed Population of T Cells)

이 비디오는 in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte 또는 CTL 생산을 모니터링하는 면역학적 방법을 보여줍니다. 마우스에는 유전자 조작된 증식성 염료 염색 공여체 CD8+ T 림프구가 사전 주입됩니다. 보조제와 함께 오브알부민을 피하 주사하면 세포독성 CD8+ T 림프구가 생성되며, 이는 면역염색 및 유세포 분석을 통해 수확 후 확인됩니다.

보조 매개 세포독성 T 림프구 생성을 모니터링하기 위한 면역학적 기술

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

여기에서는 간단한 수동 단백질 침전 단계와 온라인 컬럼 추출을 사용하여 건조된 혈액 반점에서 면역억제제 타크로리무스를 정량화하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS) 분석에 대해 설명합니다.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.

Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

본 프로토콜은 전처리된 종양 세포를 사용한 동종 공동 배양 시스템에서 인간 T 세포 자극의 생체 외 분석을 가능하게 하는 실험 워크플로우를 설명합니다.

전처리된 종양 세포의 동종 공동 배양 환경에서의 인간 T 세포 활성 분석

학습하세요 이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 동종 반응성을 측정하는 방법을. 이 기술은 이식 면역학에서 T 세포와 항원 제시 세포 간 면역 시냅스를 고속 분석하여 이식 거부 반응 메커니즘을 이해하고 이식 결과를 예측하는 데 활용됩니다.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

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