Name: 분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 학습하세요 간 전구세포 부분집합을 유동세포측정법으로 분석하고 새로운 표면 마커 조합을 이용해 고순도로 분리하는 방법을. 이 기술은 간 손상 및 재생 연구에 중요한 세포생물학적 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품은 VLK에 알렉산더 폰 훔볼트 재단 Sofja Kovalevskaja 수상에 의해 지원되었다.

<ol><li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+isolation+of+liver+progenitor+cells+by+aldehyde+dehydrogenase+activity+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice.</a> Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).</li>
<li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+liver+progenitor+cells%3A+a+practical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The quest for liver progenitor cells: a practical point of view.</a> J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+markers+for+the+murine+oval+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Surface markers for the murine oval cell response.</a> Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).</li>
<li>Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductular+reactions+in+human+liver%3A+diversity+at+the+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Ductular reactions in human liver: diversity at the interface.</a> Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).</li>
<li>Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+tracing+of+Sox9%2B+liver+progenitors+in+mouse+oval+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury.</a> Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxl1-Cre-marked+adult+hepatic+progenitors+have+clonogenic+and+bilineage+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential.</a> Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).</li>
<li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).</li>
<li>Font-Burgada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+Periportal+Hepatocytes+Regenerate+the+Injured+Liver+without+Giving+Rise+to+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer.</a> Cell. 162 (4), 766-779 (2015).</li>
<li>Kuramitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+fibrotic+liver+regeneration+in+mice+is+linked+to+a+severe+fibrogenic+response+driven+by+hepatic+progenitor+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation.</a> Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).</li>
<li>Pritchard, M. T., Nagy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis+is+enhanced+and+accompanied+by+robust+oval+cell+activation+after+chronic+carbon+tetrachloride+administration+to+Egr-1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice.</a> Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).</li>
<li>Spee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+liver+progenitor+cell+niche+in+liver+diseases%3A+potential+involvement+of+Wnt+and+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling.</a> Gut. 59 (2), 247-257 (2010).</li>
<li>Eckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podoplanin+discriminates+distinct+stromal+cell+populations+and+a+novel+progenitor+subset+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).</li>
<li>Epting, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+antigen-1+is+necessary+for+cell-cycle+withdrawal+and+myoblast+differentiation+in+C2C12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).</li>
<li>Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+immortalisation+of+hepatic+oval+cells+from+adult+mice+fed+a+choline-deficient%2C+ethionine-supplemented+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD133%2B+liver+stem+cells+for+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li>
<li>Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Change+and+Induction+of+Cytokeratin+Expression+During+In+Vitro+Culture+of+Corneal+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).</li>
<li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+%28MSC%29%3A+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Commun Signal. 9, 12(2011).</li>
<li>Schmelzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cells+from+fetal+and+postnatal+donors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors.</a> J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

간 염증과 다른 기원의 부상 전구 세포 확장 및 활성화 2, 3을 동반하는 간에서 재생 프로세스를 트리거합니다. 이러한 간 전구 세포는 세포의 특성을 가지고 줄기 가능성 각종 간 질환의 pathomechanism에서 중요한 역할을한다. 간 전구 세포의 이질성 오랫동안 제안되어왔다. 다른 표면 마커를 운반 서브 세트를 식별하고 간 손상 12시 염증 관련 유전자들의 고유 한 집합을 표현할 수 CD133 및 gp38의 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 간 선조 부분 집합의 재평가. 여기에 기재된 방법은 희귀 세포 계측법 분석 직접 유동 각종 간 손상 모델에서의 직접적인 비교를 허용한다. 각종 부상 여러 전구 (S)의 활성화를 트리거로 이는 특히 관련ductular 반응 3,...

간 재생 주로 간세포의자가 재생산 능력과 관련된다. 그럼에도 불구하고, 만성 간 손상은 간세포 및 담관 1, 2, 3, 4로 분화 할 수있는 능력과 관련이있는 전구 세포 활성화 및 확장으로 발생한다. 만성 상처 중에 간세포 증식 효과가없는 경우가 있기 때문 특히 적합하다. 전구 세포를 표적 다중 유전자 추적 연구에도 불구하고, 간 재생에서의 역할은 5, 6, 7, 8 논란이 남아있다. 또한, 전구 세포의 활성화는 부상 9시 자신의 정확한 역할에 대한 질문을 제기 간에서 증가 섬유 성 반응에 연결되어 있습니다10. 선조 세포 구획의 이질적인 성질 긴 미세 절제 또는 세포 분류 기반의 방법 (1) (11)를 사용하여 단일 표면 마커를 발현하는 전구 세포를 격리 유전자 발현의 연구에 의해 제안되고있다. 실제로, 최근 새로운 표면 마커 조합하여 gp38 (podoplanin)는 명백하게 다양한 서브 세트들 (12) 선조 세포의 이전 단일 마커 링크. 중요한 것은, 이러한 서브 세트는 그들의 표면 마커의 발현에 차이가없는 아니라 부상 12시 기능적 변화를 나타냈다. 여러 동물 모델은 전구 세포의 활성화, 간 재생을 조사하기 위해 사용되어왔다. 다양한 부상 유형은 전구 세포 (12)의 하위 집합을 서로 다른의 활성화를 촉진 것으로 보인다. 이는 pH를 설명 할 수있을인간 4에서 관찰 ductular 반응 enotypic 발산. 따라서, 전구 세포의 표현형 복잡한 기능적 분석은 부상 역할 및 간 질환의 ductular 반응의 참된 의미를 이해하는 피봇된다. 표면 마커 조합 외에, 세포 격리 프로토콜의 중요한 차이는 또한 이전의 연구 (2)에 기초하여 결론을 복잡. 연구의 상당한 양을 크게들이 분리 프로토콜 상이한 전구 세포 (예, 간 분리 (효소 결합 프로세스의 기간), 밀도, 매질 및 원심 분리 속도)의 역할이 해결. 최적화 된 분리 기술, 희귀 세포 집단에 대한 더 나은 가능성을 제공하고 일부 조성물의 반사가 개발하고 최근 12 게시되었습니다. 이 문서의 목적은 더 DET을 제공하는 것입니다이 간세포 분리 절차 및 일부 분석 ailed 프로토콜 기술의 적절한 재생을 허용한다. 또한, 프로토콜은 새로운 프로토콜과 비교하여 차이를 설명하기 이전의 분리 방법과의 비교를 포함한다.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 프리 DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 P</td><td>시그마-알드리치</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>시그마-알드리치</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>17105041</tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>1% 원액 준비</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 헹굼 솔루션</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>0.5% (v/v) BSA를 첨가하고 얼음에 보관</td></tr><tr><td>페놀 레드 프리 DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1145</td><td></td></tr><tr><td>계수 비드 카운트 Bright</td><td>Life Technologies</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>PI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단 시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>사체 제거 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>CD64 Purified</td><td>BioLegend</td><td>139302</td><td>희석: 1:100</td></tr><tr><td>CD16/32 정제된</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>희석: 1:100</td></tr><tr><td>CD45 APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>희석: 1:200, 조혈 세포 표시</td></tr><tr><td>CD31 Biotin</td><td>BioLegend</td><td>102504</td><td>희석: 1:200, 내피 세포</td></tr><tr><td>표시 ASGPR1 Purified</td><td>Bio-Techne</td><td>AF2755-SP</td><td>희석: 1:100, 간세포</td></tr><tr><td>표시 Podoplanin APC</td><td>BioLegend</td><td>127410</td><td>희석 : 1 : 1,400, 전구 세포 표시</td></tr><tr><td>Podoplanin Biotin</td><td>BioLegend</td><td>127404</td><td>희석 : 1 : 1,400</td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-210</td><td>3 &micro 사용; L, 전구 세포</td></tr><tr><td>표시 CD133 Biotin</td><td>BioLegend</td><td>141206</td><td>희석: 1:100</td></tr><tr><td>CD34 Biotin</td><td>eBioScience</td><td>13-0341-81</td><td>희석: 1:100</td></tr><tr><td>CD90.2 Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>140306</td><td>희석: 1:800</td></tr><tr><td>CD157 PE</td><td>BioLegend</td><td>140203</td><td>희석: 1:600</td></tr><tr><td>EpCAM Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>118225</td><td>희석: 1:100</td></tr><tr><td>Sca-1 Biotin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-885</td><td>사용 10 &micro; L</td></tr><tr><td>마우스 IgG2b, &kappa; PE</td><td>BioLegend</td><td>400311</td><td></td></tr><tr><td>쥐 IgG1 PE</td><td>BioLegend</td><td>400407</td><td></td></tr><tr><td>쥐 IgG2b, &kappa; APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>400624</td><td></td></tr><tr><td>쥐 IgG2a, &kappa; 비오틴</td><td>BioLegend</td><td>400504</td><td></td></tr><tr><td>쥐 IgG2a, &kappa; 브릴리언트 바이올렛 421</td><td>BioLegend</td><td>400535</td><td></td></tr><tr><td>시리아 햄스터 IgG APC</td><td>BioLegend</td><td>402012</td><td></td></tr><tr><td>시리아 햄스터 IgG 비오틴</td><td>BioLegend</td><td>402004</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 IgG 제어 정제</td><td>Bio-Techne</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td>희석 : 1:800</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>S32351</td><td>희석: 1:400</td></tr><tr><td>100 &마이크로; m 필터 메쉬</td><td>A. Hartenstein</td><td>PAS3</td><td></td></tr><tr><td>LS 열</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaTMIII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 소프트웨어</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 원형 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy plus 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RLT 용해 완충액이 포함되어 있습니다.</td></tr></tbody></table>

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

만성 간 손상 동안 전구 세포는 염증 세포의 침윤과 상피 세포 활성화의 모양을 수반 ductular 반응이라는 프로세스에 확장. 이러한 염증 반응 동안 전구 세포 인구는 대부분 조직 학적 분석이나 유동 세포 계측법 기반 기술에 의해 하나, 하나의 표면 마커를 사용하여 조사되었다. 그러나, 새로운 표면 마커가 간 전구 내에서 다양한 기능적으로 별개의 하위 집합을 식별 / 셀 구획 줄기. 여기에 제시된 방법은 분리 및 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 선조 세포 계측법 분석 서브 세트의 상세한 흐름을 설명한다. 또한, 다양한 전구 세포 서브셋 고순도 자기 자동화 사용하여 FACS 정렬 기반의 방법으로 분리 될 수 있는지 보여준다. 중요한 간 새롭고 단순화 분해 효소는 높은 생존력 이러한 희귀 세포군의 분리를 허용즉 기존의 방법에 비해 우수하다. 이는 시험관 내에서 상기 전구 세포 연구 또는 유전자 발현 프로파일을 분석하는 고품질의 RNA를 분리하는 데 특히 적합하다.

실질 비 실질 간세포 (도 1 및도 2a)를 포함하는 단일 세포 현탁액 효소 결과의 신규 한 혼합물을 사용하여 간 소화 여기 제시된 방법. 적혈구의 ACK-용균 후, 단일 세포 현탁액 계측법 분석 직접적인 유동이 가능 (도 1 및 2)이다. 게이팅 전략은 이중선과 죽은 세포 (그림 2a)의 배제를 포함한다. CD45, CD31, 및 ASGPR1 마이너스 된 세포 게이팅된다. 이것은 인구 간 전구 세포를 포함하고 자신의 gp38 및 CD133의 발현 (도 2a)에 기초하여 그룹화 될 수있다. gp38 + CD133 +와 gp38 - 건강한 성인 마우스 리브 셀 - CD31 - -</su...

간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

본 간 조직 소화 프로토콜의 전반적인 목적은 유세포 분석을 통해 다양한 간 전구세포 하위 집합을 평가하고, 새로운 표면 마커 칵테일을 사용하여 이러한 세포들을 고순도로 분리하여 후속 분석에 활용하는 것입니다. 이 방법은 예를 들어 전구세포 하위 집합의 특이적 특징은 무엇인지, 간 손상 시 원거리 원인은 무엇인지와 같이 간 전구세포의 생물학에 관한 다양한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외 분석에 중요한 전구세포의 고순도 및 높은 생존율을 유지하며 분리할 수 있다는 점입니다.이 소화 기법은 전구세포 생물학에 대한 통찰을 제공하지만, 실제로는 조혈 세포 및 내피 세포 집단의 분리를 위해 활용될 수 있습니다. 마우스 간에서 단일 세포 현탁액을 준비하려면, 간 엽을 건조된 페트리 접시에 옮긴 후 메스를 사용하여 조직을 약 2mm³ 크기의 균일한 정육면체 조각으로 자릅니다. 절단된 조직 조각들을 간 하나당 2.5mL의 소화 완충액이 들어 있는 두 개의 15mL 원추형 원심분리 튜브에 나누어 옮깁니다.그런 다음 샘플을 37 °C 항온수조에 넣고 5분과 10분 간격으로 가볍게 흔들어 줍니다. 15분간 소화를 진행한 후, 팁 끝을 자른 1,000 µL 피펫을 사용하여 간 조각들을 부드럽게 파이펫팅합니다. 그 후 튜브를 다시 수조에 넣고 조각들이 2분 동안 가라앉도록 둡니다.다음으로, 800 µL의 수집 버퍼로 미리 적신 100 µm 스트레이너를 통해 상층액 약 700 µL를 두 번 나누어 여과합니다. 그리고 제거한 상층액의 양만큼 신선한 소화 버퍼로 채워줍니다. 간 조직이 더 이상 보이지 않을 때, 소화 튜브의 모든 상층액을 필터에 통과시킵니다.그리고 원심분리를 통해 모든 세포를 수집합니다. 상온에서 1 mL의 염화암모늄 칼륨 용해 버퍼로 펠렛을 재현탁하고, 1분 후 5 mL의 신선한 수집 버퍼를 첨가하여 용해를 중단시킵니다. 다시 한번 원심분리를 통해 세포를 수집합니다.그 다음, 느슨하게 형성된 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그리고 얼음 위에서 4 mL의 신선한 수집 버퍼로 세포를 재현탁합니다. 유세포 분석법으로 간 샘플의 세포 수를 측정하려면, 먼저 1.5 mL 폴리스티렌 튜브에 간 세포 현탁액 20 µL와 PBS 174 µL, 그리고 propidium iodine 6 µL를 혼합합니다.세포 정량을 가능하게 하는 카운팅 비즈를 추가하고, 비즈와 세포 혼

isolation-enrichment-liver-progenitor-subsets-identified-novel

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 우리는 전체 murine 간, 조직 소화, 세포 강화, 그리고 유동세포계측법 절연을 요구하는 과정에서 CD133 표현 간 줄기 세포와 암 줄기 세포의 절연을 설명합니다. 우리는 고급 단일 세포 분리 및 clonal 확장 메서드를 포함합니다.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.

간 질환 연구를 위한 말초 혈액의 인간 간 스페로이드

만능 줄기 세포에서 유래한 간세포는 미토콘드리아 및 활성 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM, CD166이라고도 함) 염색을 사용하여 세포 분류를 통해 정제할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용

학습하세요 간 전구세포 부분집합을 유동세포측정법으로 분석하고 새로운 표면 마커 조합을 이용해 고순도로 분리하는 방법을. 이 기술은 간 손상 및 재생 연구에 중요한 세포생물학적 통찰을 제공합니다.

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

더 많은 동영상 탐색