분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

본 간 조직 소화 프로토콜의 전반적인 목적은 유세포 분석을 통해 다양한 간 전구세포 하위 집합을 평가하고, 새로운 표면 마커 칵테일을 사용하여 이러한 세포들을 고순도로 분리하여 후속 분석에 활용하는 것입니다. 이 방법은 예를 들어 전구세포 하위 집합의 특이적 특징은 무엇인지, 간 손상 시 원거리 원인은 무엇인지와 같이 간 전구세포의 생물학에 관한 다양한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외 분석에 중요한 전구세포의 고순도 및 높은 생존율을 유지하며 분리할 수 있다는 점입니다.

이 소화 기법은 전구세포 생물학에 대한 통찰을 제공하지만, 실제로는 조혈 세포 및 내피 세포 집단의 분리를 위해 활용될 수 있습니다. 마우스 간에서 단일 세포 현탁액을 준비하려면, 간 엽을 건조된 페트리 접시에 옮긴 후 메스를 사용하여 조직을 약 2mm³ 크기의 균일한 정육면체 조각으로 자릅니다. 절단된 조직 조각들을 간 하나당 2.5mL의 소화 완충액이 들어 있는 두 개의 15mL 원추형 원심분리 튜브에 나누어 옮깁니다.

그런 다음 샘플을 37 °C 항온수조에 넣고 5분과 10분 간격으로 가볍게 흔들어 줍니다. 15분간 소화를 진행한 후, 팁 끝을 자른 1,000 µL 피펫을 사용하여 간 조각들을 부드럽게 파이펫팅합니다. 그 후 튜브를 다시 수조에 넣고 조각들이 2분 동안 가라앉도록 둡니다.

다음으로, 800 µL의 수집 버퍼로 미리 적신 100 µm 스트레이너를 통해 상층액 약 700 µL를 두 번 나누어 여과합니다. 그리고 제거한 상층액의 양만큼 신선한 소화 버퍼로 채워줍니다. 간 조직이 더 이상 보이지 않을 때, 소화 튜브의 모든 상층액을 필터에 통과시킵니다.

그리고 원심분리를 통해 모든 세포를 수집합니다. 상온에서 1 mL의 염화암모늄 칼륨 용해 버퍼로 펠렛을 재현탁하고, 1분 후 5 mL의 신선한 수집 버퍼를 첨가하여 용해를 중단시킵니다. 다시 한번 원심분리를 통해 세포를 수집합니다.

그 다음, 느슨하게 형성된 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그리고 얼음 위에서 4 mL의 신선한 수집 버퍼로 세포를 재현탁합니다. 유세포 분석법으로 간 샘플의 세포 수를 측정하려면, 먼저 1.5 mL 폴리스티렌 튜브에 간 세포 현탁액 20 µL와 PBS 174 µL, 그리고 propidium iodine 6 µL를 혼합합니다.

세포 정량을 가능하게 하는 카운팅 비즈를 추가하고, 비즈와 세포 혼합물을 유세포 분석기에 로딩합니다. 파편을 제거하기 위해 전방 산란(forward-scatter) 파라미터에 따른 측방 산란(side scatter)으로 게이트를 설정합니다. 전방 산란 높이 대 전방 산란 면적 게이트를 통해 더블렛(doublets)을 제외하고, 프로피듐 아이오다이드(propidium iodine) 양성인 사멸 세포를 제외합니다.

그 다음, 30 µL의 샘플을 유세포 분석기에 로딩하고 이벤트를 기록합니다. 전구세포 하위 집단의 유세포 분석을 위해 간세포를 염색하려면, 2x10^5개의 세포 분주액을 1.5 mL 반응 튜브에 옮깁니다. 그리고 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다.

펠렛을 Fc block에 재부유시킨 후 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 그 다음, 각 튜브에 원하는 세포 표면 염색 항체 칵테일 50 µL를 첨가하고, 빛이 차단된 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플당 400 µL의 염색 버퍼로 세척합니다.

그 후 펠렛을 100 µL의 적절한 2차 항체 칵테일에 재현탁하여 빛이 차단된 얼음 위에서 20분 동안 둡니다. 그런 다음 400 µL의 염색 완충액으로 세포를 세척합니다. 그리고 propidium iodide가 포함된 300 µL의 염색 완충액에 펠렛을 재현탁합니다.

유세포 분석기(flow cytometer)를 사용하여 샘플을 측정합니다. 자기 마이크로비드 기반 분리를 통해 전구세포 집단을 농축하려면, 1.5-2x10^6개의 세포를 적절한 수의 15 milliliter 원뿔형 튜브에 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 펠렛을 BSA가 첨가된 400 microliters의 HBSS에 재현탁합니다.

그리고 40 µL의 anti-CD31 Microbeads와 30 µL의 anti-CD45 Microbeads를 첨가하고 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, BSA가 포함된 5 mL의 HBSS로 세포를 세척합니다. 그리고 펠릿을 100 µL의 dead cell removal beads에 재현탁하여 상온에서 15분 동안 배양합니다.

세포를 배양하는 동안, 간 하나당 적절한 크기의 양성 선택 컬럼 하나를 3 mL의 BSA가 포함된 HBSS로 평형화합니다. 그런 다음 세포에 900 µL의 BSA 포함 HBSS를 추가하고, 100 micron 폴리아미드 필터 메쉬를 통해 세포를 여과합니다. 비드가 처리된 여과 세포를 컬럼에 로딩하고 용출액을 원심분리 튜브에 수집합니다.

모든 세포가 컬럼을 통과하면, HBSS plus BSA 3 mL로 컬럼을 3회 세척합니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고, 100 µL의 세척 버퍼와 Fc block으로 세포 펠렛을 재현탁합니다. 4~6개의 간에서 얻은 세포 펠렛 또는 1x10^6개 미만의 음성 선택된 세포를 회수합니다.

5분 후, anti-GP38 biotinylated 항체로 세포를 10분 동안 얼음 위에서 라벨링합니다. 배양이 끝나면, 원심분리를 통해 세포를 수집하여 400 µL의 세척 완충액과 5 µL의 Anti-Biotin Microbeads에 재현탁합니다. 4 °C에서 15분 동안 반응시킨 후, 즉시 5 mL의 세척 완충액으로 세포를 세척합니다.

그 다음 펠렛을 1 mL의 신선한 세척 완충액에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 냉각된 15-랙에 놓고 자동 자기 분리를 시작합니다. 이어서 상층액을 원심 분리하고, 펠렛을 계획된 하위 실험 분석에 적합한 용액에 재현탁합니다.

CD45, CD31 및 asialoglycoprotein one receptor에 음성인 세포를 게이팅함으로써 간 전구세포를 선택하며, 이후 이 세포들을 glycoprotein 38 및 CD133 발현에 따라 그룹화할 수 있습니다. gp38 양성 CD133 양성 세포와 gp38 음성 CD133 양성 세포는 건강한 성체 마우스 간의 CD45 음성 CD31 음성 ASGPR1 음성 세포 중 가장 풍부한 세포군을 나타내며, 이들은 이전에 전구세포와 연관된 것으로 알려진 다양한 표면 마커의 발현에서 뚜렷한 차이를 보입니다. 방금 시연한 바와 같이, 자기 비드 기반의 이 전구세포 분리법을 통해 높은 생존율과 함께 90% 이상의 순도를 가진 간 세포를 얻을 수 있습니다.

이러한 희귀 세포들을 분리할 때는 간 소화 단계에서 사용되는 효소를 고려하는 것이 중요합니다. 사용하는 효소에 따라 특정 전구세포 하위 집단이 우선적으로 얻어질 수 있으며, CD133 발현 수준이 크게 감소할 수 있기 때문입니다. 세포의 순도와 회수율은 간 단일 세포 현탁액을 얼마나 조심스럽게 준비하느냐에 달려 있다는 점을 유념해야 합니다. 또한, 다량의 세포 파편과 사멸 세포 오염은 이 프로토콜의 성공 여부에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.