셀 마이그레이션 연구에서 수직 화학 산소 그라디언트에 대한 폴리 디메틸 실록산 - 폴리 카보네이트 미세 유체 장치

이 실험의 전반적인 목표는 수직 화학 및 산소 구배의 다양한 조합에서 포유류 세포로의 폴리디메틸실록산-폴리카보네이트 미세유체 장치를 확립하는 것입니다. 이 방법은 포유류 세포 이동 연구에서 다양한 유형의 세포 또는 오테 유전자를 가진 세포의 이동에 대한 이러한 구배의 영향을 포함하여 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 지루한 설정과 부피가 큰 기기 없이 최적의 세포 배양 조건을 위해 기존 인큐베이터에서 전체 실험 설정을 수행할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 세포 운동성 및 다양한 생리학적으로 관련된 구배가 미세유체 장치를 사용하여 특성화될 수 있기 때문에 암세포 전이 능력의 진단으로 확장되었습니다. 이 방법은 포유류 세포 이동에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 약물 농도와 산소 장력의 조합에 대한 체외 세포 기반 약물 검사와 같은 다른 세포 연구에도 적용할 수 있습니다.

2g의 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 프리폴리머를 최상층 유체 채널 패턴이 있는 금형에 전사하여 얇은 PDMS 층을 만듭니다. 그런 다음 금형을 데시케이터 설정에 놓고 60분 동안 PDMS의 가스를 제거합니다. 가스를 제거한 후 PDMS 경화를 위해 금형을 섭씨 60도 오븐에 밤새 넣습니다.

금형이 수평면에 있는지 확인하십시오. 금형을 실온으로 냉각한 후 추가로 13g의 PDMS 프리폴리머를 금형에 붓고 60분 동안 데시케이터 설정에서 PDMS의 가스를 제거합니다. 1mm 두께의 폴리카보네이트 또는 PC 필름을 가스 확산 장벽으로 새로운 PDMS 층에 천천히 삽입합니다.

존재하는 모든 거품을 배출합니다. 그런 다음 금형을 섭씨 60도 오븐에 밤새 넣습니다. 금형이 수평면에 있는지 확인하십시오.

경화된 PDMS를 실온으로 냉각한 후 메스로 장치를 모든 채널 패턴을 커버할 수 있는 약 5.5 x 5제곱센티미터의 영역으로 자릅니다. 그런 다음 금형에서 PDMS 실험실을 벗겨냅니다. 다음으로, 직경 2mm의 생검 펀치를 사용하여 입구와 출구의 구멍을 뚫습니다.

나중에 조립할 수 있도록 제작된 상단 PDMS-PC 레이어를 주변 먼지로부터 멀리 보관하십시오. 장치를 조립하려면 먼저 제작된 PDMS-PC 상층과 스핀 코딩된 PDMS 멤브레인이 있는 웨이퍼를 접합 표면이 위를 향하도록 산소 플라즈마 표면 처리 기계에 배치합니다. PDMS 표면을 90와트의 산소 플라즈마로 40초 동안 처리합니다.

산소 플라즈마 표면 처리 직후 PDMS 멤브레인에 최상층을 접착합니다. 접착된 층 위에 추를 놓고 섭씨 60도의 오븐에 밤새 넣어 접착을 촉진합니다. 접합 된 층이 실온으로 냉각되면 메스로 최상층에 결합 된 멤브레인을 약 5.5 x 5 평방 센티미터의 영역으로 자릅니다.

실리콘 웨이퍼에서 결합된 구조를 벗겨내고 2mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 화학적 구배 채널의 입구와 출구에 있는 펀치 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 멤브레인 접합 최상층과 제작된 PDMS 하단 층을 접합 표면이 위를 향하도록 산소 플라즈마 표면 처리 기계에 놓습니다. PDMS 표면을 활성화하려면 90와트의 플라즈마를 40초 동안 사용합니다.

표면 처리 직후 접착을 위해 상단 및 하단 레이어를 함께 부착하십시오. 접착된 전체 장치 위에 추를 놓고 섭씨 60도의 오븐에서 밤새 그대로 둡니다. 다음날 제작된 장치 전체를 오븐에서 꺼내 실온으로 식히십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 장치에서 세포를 준비하여 미세유체 세포 이동 분석을 시작합니다. 2일차에는 0일차부터 배양된 세포에서 배지를 흡인하고 5ml의 DPBS로 세포를 두 번 세척합니다. DPBS를 흡인하고 2ml의 트립신-EDTA를 첨가한 다음 인큐베이터에서 세포를 5분 동안 배양하여 플라스크 표면에서 세포를 분리합니다.

세포가 분리되어 용액에 부유되면 8ml의 무혈청 배지를 플라스크에 추가합니다. 모든 액체를 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 실온에서 5분 동안 140배 G로 원심분리합니다. 원심분리 후 상등액을 흡인하고 최종 세포 밀도가 밀리리터당 100만 세포가 되도록 적절한 양의 무혈청 배지를 추가합니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 첫날에 준비된 미세유체 장치를 꺼냅니다. 뭉툭한 14게이지 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용하여 매체가 입구의 두 바늘에서 모두 흘러나올 때까지 화학적 구배 채널의 배출구를 통해 무혈청 매체를 주입합니다. 그런 다음 화학적 구배 채널의 출구에서 200마이크로리터의 세포 현탁액을 주입합니다.

현미경으로 장치의 세포 배양 챔버를 관찰하여 세포가 미세유체 채널에 도입되었는지 확인합니다. 그런 다음 장치를 습한 용기에 넣고 세포 배양 인큐베이터에 5시간 동안 보관하여 장치 표면에 세포가 접착되도록 합니다. 한편, 무혈청 배지에서 원하는 농도로 화학 물질을 준비합니다.

화학 물질이 있거나 없는 무혈청 매체를 고순도 튜브에 연결된 두 개의 별도 3ml 주사기로 끌어들입니다. 그런 다음 나중에 사용할 수 있도록 분당 1마이크로리터의 유속으로 주사기 펌프에 주사기를 설정합니다. 다음으로, 15 밀리리터의 1 몰 수산화 나트륨 용액과 15 밀리리터의 200 밀리그램 피로 갈롤 용액을 만듭니다.

수산화나트륨 용액을 고순도 PFTE 튜브에 연결된 15ml 주사기에 넣고 피로갈롤 용액을 고순도 튜브에 연결된 15ml 주사기에 넣습니다. 나중에 사용할 수 있도록 분당 5마이크로리터의 유속으로 주사기 펌프에 주사기를 설정합니다. 5시간의 배양 후 전체 장치를 꺼내 직경 15cm의 페트리 접시에 놓습니다.

접착 퍼티를 사용하여 페트리 접시에 장치를 고정한 다음 페트리 접시를 인큐베이터의 라이브 셀 이미징 현미경으로 옮깁니다. 화학적 구배를 생성하기 위해 주사기의 튜브를 화학적 구배 채널의 입구에 연결합니다. 그런 다음 배출구를 폐기물 저장소로 연결되는 튜브에 연결합니다.

화학적 구배 생성을 위해 주사기로 주사기 펌프를 켭니다. 다음으로, 염화나트륨과 피로갈롤이 포함된 주사기의 고순도 튜브를 산소 구배 채널의 입구에 연결합니다. 튜브를 배출구에 연결하여 폐기물을 수거하고 산소 구배 생성을 위해 주사기와 함께 주사기 펌프를 켭니다.

페트리 접시에 약 15ml의 이중 증류수를 추가하여 장치를 촉촉하게 유지하십시오. 그런 다음 타임 랩스 이미지 캡처를 위해 라이브 셀 이미징 현미경을 설정하고 15분마다 이미지를 촬영합니다. 데이터 수집 및 분석을 수행하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 그래디언트의 특성화를 수행합니다.

여기에 보이는 것은 세포 이동을 위한 microfluidic 장치 내에서 생성된 화학적 구배의 대표적인 결과입니다. 수치 시뮬레이션 결과는 플루오레세인 용액을 화학 물질로 사용한 실험적 특성화와 잘 일치합니다. chemokine SDF-1 alpha와 같은 다른 화학 물질의 기울기도 시뮬레이션을 사용하여 미리 추정할 수 있습니다.

장치 내에서 생성된 산소 구배는 산소에 민감한 형광 염료를 사용하여 실험적으로 특성화할 수 있습니다. 일반적으로 업스트림에서 1%에서 다운스트림에서 16%까지의 산소 구배는 장치 내에서 안정적으로 설정될 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 라이브 셀 이미징 현미경을 사용하여 실험하는 동안 수집된 일반적인 타임 랩스 이미지입니다.

이미지 분석 후 A549 세포의 이동 궤적과 평균 움직임을 계산할 수 있습니다. 그래디언트가 없으면 셀은 무작위 이동을 보이고 평균 움직임은 0에 가깝습니다. SDF-1 알파 케모카인 구배만 있으면 세포는 화학주성 거동을 보이고 예상대로 높은 케모카인 구배 방향으로 이동합니다.

산소 구배만으로 세포는 저산소 방향으로 이동하며 포유류 세포에 대해 잘 연구되지 않은 공중 전술 행동을 보입니다. 흥미롭게도, 케모카인 구배와 산소 구배를 모두 사용하면 세포가 저산소 구배로 이동하여 산소 구배가 지배적인 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 이 관찰은 추가 연구가 필요합니다.

이 절차를 시도하는 동안, 제조 중에 장치의 수평을 잘 맞추고 세포 이동 실험 중에 미세 유체 장치 설정 내의 기포를 제거하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 PDMS-PC 미세유체 장치를 준비하고 화학적 및 산소 구배의 조합에서 포유류 세포 이동을 연구하기 위한 실험을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.