셀 마이그레이션 연구에서 수직 화학 산소 그라디언트에 대한 폴리 디메틸 실록산 - 폴리 카보네이트 미세 유체 장치

본 실험의 전반적인 목표는 다양한 조합의 수직 화학 및 산소 구배 하에서 포유류 세포 이동을 관찰하기 위한 폴리디메틸실록산-폴리카보네이트 미세유체 장치를 구축하는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 유형의 세포 또는 특정 유전자를 가진 세포의 이동에 이러한 구배가 미치는 영향을 포함하여, 포유류 세포 이동 연구의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 번거로운 설정이나 거대한 장비 없이도 전반적인 실험 설정을 일반적인 배양기 내에서 수행하여 최적의 세포 배양 조건을 유지할 수 있다는 점입니다.

이 기술의 영향은 암세포의 전이 능력 진단으로 확장될 수 있는데, 이는 미세유체 장치를 사용하여 세포 운동성과 다양한 생리학적 관련 구배를 특성화할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 포유류 세포 이동에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 약물 농도와 산소 분압의 조합에 따른 인비트로(in vitro) 세포 기반 약물 테스트와 같은 다른 세포 연구에도 적용될 수 있습니다.

상단 레이어의 유체 채널 패턴이 있는 몰드 위에 2g의 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane) 또는 PDMS 프리폴리머를 옮겨 얇은 PDMS 층을 형성합니다. 그 다음, PDMS의 기포를 제거하기 위해 몰드를 데시케이터 장치에 넣고 60분 동안 탈기합니다. 탈기 후, PDMS 경화를 위해 몰드를 60°C 오븐에 넣고 하룻밤 동안 둡니다.

몰드가 수평면에 놓여 있는지 확인하십시오. 몰드를 실온으로 냉각한 후, 13g의 PDMS 프리폴리머를 몰드 위에 추가로 붓고, 데시케이터 장치에서 60분 동안 PDMS의 기포를 제거하십시오. 그 다음, 가스 확산 차단막으로 사용할 1mm 두께의 폴리카보네이트(PC) 필름을 새로 부은 PDMS 층에 천천히 매립하십시오.

내부에 있는 기포를 모두 제거합니다. 그 다음, 몰드를 60°C 오븐에 넣고 하룻밤 동안 보관합니다. 이때 몰드가 수평면에 놓여 있는지 확인하십시오.

경화된 PDMS를 실온까지 냉각시킨 후, 모든 채널 패턴을 덮을 수 있도록 메스로 약 5.5 by 5 cm² 영역으로 장치를 절단합니다. 그런 다음, 몰드에서 PDMS 랩을 벗겨냅니다. 이어서 2 mm 직경의 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 입구와 출구를 위한 구멍을 뚫습니다.

제작된 상단 PDMS-PC 층은 이후 조립을 위해 주변 먼지가 없는 곳에 보관하십시오. 장치를 조립하려면, 먼저 제작된 PDMS-PC 상단 층과 스핀 코팅된 PDMS 막이 있는 웨이퍼를 접합면이 위를 향하도록 산소 플라즈마 표면 처리 장치에 넣습니다. PDMS 표면을 90 watts의 산소 플라즈마로 40초 동안 처리하십시오.

산소 플라스마 표면 처리 직후에 상층을 PDMS 막 위에 접합하십시오. 접합된 층 위에 무게추를 올려놓고 60°C 오븐에 하룻밤 동안 보관하여 접합을 촉진하십시오. 접합된 층이 실온으로 식으면, 메스를 사용하여 상층에 접합된 막을 약 5.5 x 5 cm² 면적으로 절단하십시오.

접합된 구조물을 실리콘 웨이퍼에서 떼어내고, 직경 2mm의 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 화학 농도 구배 채널의 입구와 출구에 구멍을 뚫습니다. 그 다음, 접합면이 위를 향하도록 막(membrane)이 접합된 상층과 제작된 PDMS 하층을 산소 플라즈마 표면 처리 장치에 넣습니다. PDMS 표면을 활성화하기 위해 90W의 플라즈마를 40초 동안 사용합니다.

표면 처리 직후 상층과 하층을 접합을 위해 서로 부착합니다. 접합된 장치 전체의 상단에 무게추를 올려놓고 60°C 오븐에서 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 제작된 장치 전체를 오븐에서 꺼내 실온으로 냉각합니다.

텍스트 프로토콜에 기술된 대로 장치 내 세포 준비 과정을 통해 미세유체 세포 이동 분석을 시작합니다. 2일 차에, 0일 차부터 배양한 세포에서 배지를 흡입하고 5 mL의 DPBS로 세포를 2회 세척합니다. DPBS를 흡입하고 2 mL의 Trypsin-EDTA를 첨가한 후, 세포가 플라스크 표면에서 떨어지도록 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.

세포가 떨어져 용액에 부유되면, 플라스크에 8 mL의 무혈청 배지를 추가합니다. 모든 액체를 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮기고 실온에서 140 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 최종 세포 밀도가 10⁶ cells/mL가 되도록 적절한 양의 무혈청 배지를 추가합니다.

그런 다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1일 차에 준비한 미세유체 장치를 꺼냅니다. 14게이지 둔침이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 화학 농도 구배 채널의 배출구(outlet)를 통해 무혈청 배지를 주입하며, 배지가 입구(inlets)의 양쪽 바늘 모두에서 흘러나올 때까지 계속합니다. 이어서, 화학 농도 구배 채널의 배출구로부터 200µL의 세포 현탁액을 주입합니다.

현미경으로 장치 내의 세포 배양 챔버를 관찰하여 세포가 미세유체 채널로 도입되었는지 확인합니다. 그런 다음, 세포가 장치 표면에 부착되도록 장치를 습윤 용기에 넣어 세포 배양 인큐베이터에서 5시간 동안 유지합니다. 그동안 무혈청 배지에서 원하는 농도로 화학 물질을 준비합니다.

화학 물질이 포함된 무혈청 배지와 포함되지 않은 무혈청 배지를 각각 고순도 튜빙에 연결된 두 개의 3mL 시린지에 채웁니다. 그런 다음, 나중에 사용할 수 있도록 유량을 1µL/min으로 설정하여 시린지 펌프에 장착합니다. 다음으로, 1M 수산화나트륨 용액 15mL와 200mg/mL 피로갈롤 용액 15mL를 조제합니다.

고순도 PTFE 튜빙이 연결된 15밀리리터 주사기에 수산화나트륨 용액을 흡입하고, 고순도 튜빙이 연결된 15밀리리터 주사기에 피로갈롤 용액을 흡입한다. 이후 사용을 위해 주사기 펌프에 주사기들을 설치하고 유량을 분당 5마이크로리터로 설정한다. 5시간의 배양 후, 장치 전체를 꺼내어 지름 15센티미터의 페트리 접시에 놓는다.

접착제 퍼티를 사용하여 페트리 접시의 장치를 고정한 다음, 페트리 접시를 인큐베이터 내의 생세포 이미징 현미경으로 옮깁니다. 화학적 농도 구배를 생성하기 위해 시린지에서 화학적 농도 구배 채널의 입구까지 튜빙을 연결합니다. 그런 다음, 출구를 폐액 저장조로 연결되는 튜빙에 연결합니다.

화학 농도 구배 생성을 위한 시린지가 장착된 시린지 펌프를 켭니다. 다음으로, sodium chloride와 pyrogallol이 들어 있는 시린지에서 연결된 고순도 튜브를 산소 농도 구배 채널의 입구에 연결합니다. 폐액을 수집하기 위해 출구에 튜브를 연결하고, 산소 농도 구배 생성을 위한 시린지가 장착된 시린지 펌프를 켭니다.

장치의 습윤 상태를 유지하기 위해 페트리 접시에 약 15 milliliters의 이중 증류수를 추가합니다. 그런 다음, 타임랩스 이미지 캡처를 위해 라이브 셀 이미징 현미경을 설정하고 15분마다 이미지를 촬영합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 데이터 수집 및 분석과 농도 구배의 특성 분석을 수행합니다.

여기에 세포 이동을 위해 미세유체 장치 내에서 생성된 화학적 구배의 대표적인 결과가 제시되어 있습니다. 수치 시뮬레이션 결과는 형광물질 용액을 화학 물질로 사용한 실험적 특성 분석 결과와 잘 일치합니다. 케모카인 SDF-1 alpha와 같은 다른 화학 물질의 구배 또한 시뮬레이션을 통해 사전에 추정할 수 있습니다.

장치 내에서 생성된 산소 구배는 산소 민감성 형광 염료를 사용하여 실험적으로 특성화할 수 있습니다. 일반적으로 장치 내에서는 상류의 1%에서 하류의 16%까지의 산소 구배를 안정적으로 형성할 수 있습니다. 여기 제시된 것은 라이브 셀 이미징 현미경을 사용하여 실험 중에 수집한 전형적인 타임랩스 이미지입니다.

이미지 분석 후, A549 세포의 이동 궤적과 평균 이동 거리를 계산할 수 있습니다. 농도 구배가 없는 상태에서 세포는 무작위로 이동하며 평균 이동 거리는 0에 가깝습니다. SDF-1 alpha 케모카인 농도 구배만 있는 경우에는 세포가 화학성 행동을 보이며 예상대로 케모카인 농도가 높은 방향으로 이동합니다.

산소 농도 구배만 존재하는 경우, 세포는 저산소 방향으로 이동하며 포유류 세포에서는 그동안 충분히 연구되지 않은 기택성(aerotactic) 행동을 보입니다. 흥미롭게도, 케모카인과 산소 농도 구배가 모두 존재할 때 세포는 저산소 구배 방향으로 이동하며, 이는 산소 농도 구배가 지배적인 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 이러한 관찰 결과에 대해서는 추가적인 연구가 필요합니다.

이 절차를 수행할 때, 제작 과정 중 장치의 수평을 잘 맞추고 세포 이동 실험 중 마이크로플루이딕 장치 설정 내의 기포를 제거하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 PDMS-PC 마이크로플루이딕 장치를 준비하고, 화학 및 산소 기울기 조합 하에서 포유류 세포 이동을 연구하기 위한 실험 설정 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.