살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

이 절차의 전체적인 목표는 FRET 기반의 GEVI를 사용하여 제브라피쉬 배아의 비침습적 생리적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구하는 것입니다. 이 방법은 뉴런과 같은 흥분성 세포의 생물학에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 이 방법은 신경계 질환의 병인에서 흥분성의 역할을 분석하는 데 사용될 수 있습니다.

이 접근법은 FRET 기반의 유전적 부호화 전압 지표를 발현하는 투명한 제브라피쉬 배아를 이용합니다. 이 방법은 비침습적인 방식으로 생체 내(in vivo) 세포의 전기적 특성을 측정할 수 있게 해줍니다. 따라서 본 방법은 제브라피쉬 배아의 척수 뉴런 흥분성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

또한, 이미징 연구가 가능한 다른 인비트로(in-vitro) 또는 인비보(in-vivo) 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 Mermaid 바이오센서 코딩 서열을 증폭하기 위한 PCR 혼합물을 준비하십시오. PCR 혼합물을 95 °C에서 15초 동안 가열하십시오.

50 °C에서 15초 동안 프라이밍하고 72 °C에서 4분 동안 신장시키는 과정을 총 35회 반복합니다. 그 후, 상용 젤 정제 키트를 사용하여 특정 blunt PCR 생성물을 젤 정제합니다. 그런 다음 해당 DNA 단편을 pCMV-SC blunt 벡터에 클로닝하고, HuC 프로모터를 삽입하기 위해 SmaI 제한 효소로 Mermaid 양성 플라스미드를 선형화합니다.

총 부피 20 µL로 제한 효소 반응을 설정하고 25 °C에서 1시간 동안 반응시킵니다. 그 후, 상용 겔 정제 키트를 사용하여 절단된 플라스미드를 겔 정제합니다. 그런 다음 PFU DNA polymerase와 제브라피쉬 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 HuC 프로모터를 PCR 증폭합니다.

PCR 혼합물을 준비합니다. 95°C에서 2분간 초기 단계를 거친 후, PCR 혼합물을 95°C에서 15초 동안 가열합니다. 50°C에서 15초 동안 프라이머 결합을 수행하고, 72°C에서 4분 동안 신장시키며, 이를 총 35회 반복합니다.

그다음 특정 blunt PCR 산물을 젤 정제합니다. 정제된 pCMV-SC Mermaid와 pHuC DNA를 동일 몰량으로, 1 µL의 T4 DNA ligase와 1 µL의 Specific 10x buffer를 사용하여 총 부피 10 µL에서 결합시킵니다. 이후 반응물을 4 °C에서 16시간 동안 배양합니다.

컴피턴트 세포의 분취량에 5 µL의 라이게이션 반응액을 넣어 형질전환합니다. CEL1-EcoRV 이중 소화를 통해 프로모터가 적절한 방향으로 삽입된 pHuC 양성 클론을 선택합니다. 선택한 클론들을 15 mL 튜브로 옮겨 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그 후 세포에서 플라스미드를 추출하고 CEL1-EcoRV 이중 제한효소 반응을 설정한 뒤 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 반응물을 아가로스 겔에서 전기영동합니다. 이 과정에서는 야생형 또는 sod1G93R 성체 제브라피시로부터 얻은 수정란을 10 mm 페트리 접시에 옮깁니다.

배아를 차가운 어류 용수로 헹굽니다. 그 후 즉시 200 picograms의 pHuC-Mermaid 플라스미드를 난황에 미세주입합니다. 다음으로 배아를 페트리 접시에 옮기고, 이후 분석을 위해 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 28 °C의 어류 용수에서 배양합니다.

자발적 꼬리 말림 분석을 위해 배아를 0.2% DMSO가 포함된 물고기수로 채워진 90mm 원형 페트리 접시에 옮깁니다. 그 다음 끝이 날카로운 두 개의 정밀 핀셋이나 바늘을 사용하여 수동으로 난막을 제거합니다. 이후 배아를 28°C에서 5분 동안 배양합니다.

실체 현미경에 장착된 디지털 카메라를 사용하여 1분간의 비디오 녹화 동안 상온에서 꼬리 말림(tail coiling)을 감지합니다. 그다음, 초당 30프레임의 시간 해상도로 시계열 데이터를 획득합니다. 그런 후, 시간 단위당 굴곡 횟수를 세어 자발적 꼬리 말림의 빈도를 계산합니다.

약물 riluzole의 효과를 평가하기 위해, 5 µM riluzole이 포함된 어류수로 채워진 새로운 90 mm Petri dish로 배아를 옮깁니다. 그다지 28 °C에서 배아를 5분 동안 배양한 후, 1분간 비디오를 녹화하고 행동 분석을 수행합니다. 이제 20~24 hpf 배아를 37 °C에서 1% 저융점 아가로스가 포함된 어류수로 35 mm 유리 바닥 이미징 디쉬 내에 고정합니다.

배아를 옆으로 눕혀 배치하고 아가로스가 실온에서 응고될 때까지 기다립니다. 그 다음, 이미징 디쉬를 공초점 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 488 nanometer 아르곤 레이저로 monomeric Umikinoko-Green을 여기시켜 바이오센서를 발현하는 운동 신경세포를 식별합니다.

그런 다음 방출 파장을 495에서 525 nanometers 사이로 설정하고 기록 버튼을 누릅니다. FRET 측정을 위해 Fret 쌍의 공여체인 mUKG를 488 nanometer 레이저로 여기시킵니다. 두 개의 광증배관을 동시에 사용하여 공여체에서 방출되는 형광과 단량체 Kusibira-Orange 수용체에서 방출되는 형광을 검출합니다.

실험 시작 시, mUKG 형광을 기록하는 광증배관 1의 게인(gain)과 오프셋(offset)을 최적화하고, 세션 전체 동안 이를 일정하게 유지하십시오. 오프셋을 설정하려면 Q 룩업 테이블을 사용하여 이미지의 색상을 강도 값으로 변경하십시오. 레이저가 꺼진 상태에서 스캔하면서 오프셋 슬라이더를 조절하여 배경 픽셀의 강도가 0보다 약간 높게 설정하십시오.

동일한 룩업 테이블을 사용하여 레이저를 켭니다. 스캔하는 동안 게인 슬라이더를 사용하여 신호 대 잡음비를 최대화하되, 픽셀 포화가 발생하지 않도록 주의하십시오. 소프트웨어 획득 창의 드롭다운 메뉴에서 xyt 획득 모드와 512 by 64 픽셀의 이미지 필드 크기를 선택하십시오.

그 다음, 배아 척수 뉴런 전압 변화 기록 설정을 통해 30밀리초마다 하나의 XY 평면을 1분 동안 획득하도록 합니다. 동일한 뉴런에서 riluzole 투여가 막 탈분극에 미치는 영향을 평가하기 위해, 5µM riluzole이 포함된 어류 용수를 첨가하고 5분 후에 새로운 데이터 세트를 획득합니다. 이 영상에서는 일반 어류 배지로 20~24 hpf 단계에서 꼬리 끝이 머리에 닿을 정도로 전신이 수축하는 동작으로만 구성된 운동 반응인 자발적 코일링(spontaneous coilings)을 기록하였습니다.

이 영상은 5 µM riluzole에서 배양한 후 배아에서 나타나는 자발적 꼬임 현상을 보여줍니다. riluzole로 인해 유도된 자발적 꼬임 빈도의 변화가 척수 운동 신경세포의 전기적 활성 변화에 기인한 것인지 확인하기 위해, Mermaid 바이오센서의 공여체-수용체 FRET 쌍의 형광 강도 비율을 측정하여 배아 척수 운동 신경세포의 막 전위를 완전히 비침습적인 방식으로 연구하였습니다. 바이오센서를 발현하는 일차 척수 운동 신경세포를 식별하고, 이들의 기저 자발적 탈분극 활성을 기록하였습니다.

릴루졸(riluzole) 투여로 인해 꼬리 말림 운동의 빈도가 감소함과 동시에 자발적 탈분극 현상의 빈도 또한 감소했습니다. 이 방법이 숙달되면, 연구자들은 발달 중인 기능적 시스템 내의 세포 간 상호작용의 복잡성을 온전히 보존한 상태로 온전한 배아 신경망의 전기적 특성을 연구할 수 있을 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 척수 뉴런의 전기적 활동이 자발적 꼬리 말림 빈도와 어떻게 연관되는지 충분히 이해하게 될 것입니다.