살아있는 제브라피시 배아의 바이오센싱 운동 뉴런 멤브레인 잠재력

이 절차의 전반적인 목표는 FRET 기반 GEVI와 함께 제브라피시 배아를 사용하여 비침습적 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구하는 것입니다. 이 방법은 뉴런과 같은 흥분성 세포의 생물학에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 이 방법은 신경 장애의 발병기전에서 흥분성에 대한 역할을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

이 접근 방식은 FRET 기반 유전적으로 인코딩된 전압 지표를 발현하는 투명한 제브라피시 배아를 사용합니다. 이 접근 방식을 사용하면 비침습적 방식으로 생체 내에서 세포의 전기적 특성을 측정할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 제브라피시 배아의 척추 뉴런 흥분성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 이미징 연구가 가능한 다른 in-vitro 또는 in-vivo 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 PCR 혼합물을 준비하여 Mermaid 바이오센서 코딩 염기서열을 증폭합니다. PCR 혼합물을 섭씨 95도에서 15초 동안 가열합니다.

섭씨 50도에서 15초 동안 프라임하고 섭씨 72도에서 4분 동안 총 35회 연장합니다. 그 후, 겔은 상용 겔 정제 키트를 사용하여 특정 무딘 PCR 산물을 정제합니다. 그런 다음 DNA 단편을 pCMV-SC 블런트 벡터로 클로닝하고 Mermaid-positive plasmid를 SmaI 제한 효소로 선형화하여 HuC promoter를 삽입합니다.

총 20마이크로리터의 부피로 제한 반응을 설정하고 섭씨 25도에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 그 후, 상업용 겔 정제 키트를 사용하여 분해된 플라스미드를 겔 정제합니다. 그런 다음 PCR은 PFU DNA 중합효소와 제브라피시 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 HuC 프로모터를 증폭합니다.

PCR 혼합물을 설정합니다. 섭씨 95도에서 2분의 초기 단계 후 PCR 혼합물을 섭씨 95도에서 15초 동안 가열합니다. 섭씨 50도에서 15초 동안 프라임하고 섭씨 72도에서 4분 동안 총 35회 연장합니다.

그런 다음 젤은 특정 무딘 PCR 제품을 정제합니다. 총 부피 10 μl에서 1 마이크로리터의 T4 DNA 리가제와 1 마이크로리터의 Specific 10x 완충액을 사용하여 정제된 pCMV-SC Mermaid 및 pHuC DNA의 등몰 양을 접합합니다. 그 후 섭씨 4도에서 16시간 동안 반응을 배양합니다.

5마이크로리터의 ligation 반응으로 competent cells의 부분 표본을 형질전환시킵니다. CEL1-EcoRV 이중 분해에 의해 적절한 방향으로 promoter가 삽입된 pHuC 양성 클론을 선택합니다. 클론을 15mm 튜브에 옮겨 넣고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그 후, 세포에서 플라스미드를 추출하고 CEL1-EcoRV 이중 제한 반응을 설정하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 아가로스 젤에 반응을 실행합니다. 이 절차에서 야생형 또는 sod1G93R 성인 제브라피쉬에서 얻은 수정란을 10mm 페트리 접시로 옮깁니다.

배아를 차가운 생선 물로 헹굽니다. 그런 다음 즉시 200피코그램의 pHuC-Mermaid 플라스미드를 난황에 미세주입합니다. 다음으로, 배아를 페트리 접시로 옮기고 다음 분석을 위해 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 섭씨 28도의 물고기 물에서 배양합니다.

즉흥적인 꼬리 코일링 분석을 위해 배아를 0.2% DMSO를 함유한 물고기 물로 채워진 90mm 원형 페트리 접시로 옮깁니다. 그리고 날카로운 끝이나 바늘이 있는 두 개의 보석상 집게를 사용하여 수동으로 dechorionation하십시오. 그 후, 섭씨 28도에서 5분 동안 배아를 배양합니다.

실체 현미경에 장착된 디지털 카메라를 사용하여 1분 동안 비디오를 녹화하는 동안 실온에서 꼬리가 똬리를 틀고 있는 것을 감지합니다. 다음으로, 초당 30프레임의 시간 해상도로 시계열을 획득합니다. 그런 다음 시간 단위당 굽힘 횟수를 계산하여 자발적인 꼬리 코일링의 빈도를 계산합니다.

릴루졸이라는 약물의 효과를 평가하기 위해, 5마이크로몰의 릴루졸이 들어 있는 물고기 물로 채워진 90mm의 새로운 페트리 접시에 배아를 이식한다. 그런 다음 섭씨 28도에서 5분 동안 배아를 배양한 후 1분 분량의 비디오를 녹화하고 행동 분석을 수행합니다. 이제 20-24 hpf 배아를 섭씨 37도의 35mm 유리 바닥 이미징 접시 안에 물고기 물의 1% 저융점 아가로스에 장착합니다.

배아를 옆으로 향하게 하고 아가로스가 실온에서 응고될 때까지 기다립니다. 다음으로, 이미징 접시를 컨포칼 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 488 나노미터 아르곤 레이저를 가진 단량체 Umikinoko-Green을 여기시켜 바이오센서를 발현하는 운동 뉴런을 확인합니다.

그런 다음 방출을 495에서 525 나노 미터 사이로 설정하고 기록을 누릅니다. FRET 측정을 위해 Fret 쌍의 공여체인 mUKG를 488 나노미터 레이저로 흥분시킵니다. 두 개의 광 증배관을 동시에 사용하여 공여체에서 방출되는 형광과 단량체 Kusibira-Orange 수용체에서 방출되는 형광을 감지합니다.

실험을 시작할 때 mUKG 형광이 기록되는 광전자 증배관의 이득과 오프셋을 최적화하고 세션 내내 일정하게 유지합니다. 오프셋을 설정하려면 Q 조회 테이블을 사용하여 이미지의 색상을 강도 값으로 변경합니다. 레이저를 끈 상태에서 스캔하는 동안 오프셋 슬라이더를 사용하여 배경 픽셀의 강도가 0보다 약간 높도록 합니다.

동일한 조회 테이블을 사용하여 레이저를 켭니다. 스캔하는 동안 게인 슬라이더를 사용하여 신호 대 잡음 비율을 최대화하고 포화된 픽셀을 피하도록 주의하십시오. 소프트웨어 획득 창의 드롭다운 메뉴에서 xyt 획득 모드와 512 x 64 픽셀의 이미지 필드 크기를 선택합니다.

그런 다음 배아 척수 뉴런 전압의 변화를 기록하여 1분 동안 30밀리초마다 단일 XY 평면을 획득하도록 설정합니다. 동일한 뉴런의 막 탈분극에 대한 릴루졸 투여의 효과를 평가하기 위해 5마이크로몰 릴루졸이 포함된 물고기 물을 첨가한 후 5분 후에 새로운 데이터 세트를 획득합니다. 이 영화에서 자발적인 코일링에서는 꼬리 끝을 머리로 가져오는 전신 수축으로만 구성된 운동 반응이 일반 물고기 배지에서 20-24 hpf 단계에서 기록되었습니다.

이 영화는 5마이크로몰 릴루졸에서 배양 후 배아가 자발적으로 코일링하는 것을 보여줍니다. 척추 운동 뉴런의 전기적 활동의 변화가 자발적 코일링 주파수의 릴루졸 유도 변화의 기초가 되는지 여부를 테스트하기 위해 배아 척추 운동 뉴런의 막 전위는 머메이드 바이오센서의 기증자-수용체 FRET 쌍의 형광 강도 비율을 측정하여 완전히 비침습적인 방식으로 연구되었습니다. 바이오센서를 발현하는 1차 척추 운동 뉴런을 확인하고 이들의 기초 자발적 탈분극 활성을 기록했습니다.

꼬리 코일링 움직임의 빈도 감소와 함께, 릴루졸 투여는 자발적인 탈분극 현상의 빈도를 감소시켰습니다. 이 접근 방식을 마스터하면 연구자들은 발달 중인 기능 시스템에서 세포 간 상호 작용의 복잡성을 완전히 보존하는 온전한 배아의 신경망의 전기적 특성을 연구할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 척추 뉴런의 전기 활동이 자발적인 꼬리 코일링의 빈도와 어떤 상관 관계가 있는지 잘 이해하게 될 것입니다.