Name: 살아있는 세포를 엔지니어하는 합성 생물학을 사용하여 해당 프로그램 자료와 인터페이스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 학습하세요 유전자 변형된 E. coli를 활용한 합성 생물학 기반 표면 조작 기술로, 생체 재료와의 동적 인터페이스를 구현하는 방법입니다. 이 기술은 분자 의학 및 환경 모니터링에 활용됩니다.

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저자는 기꺼이 미국의 과학 연구의 공군 사무실에서 수상 FA9550-13-1-0108 지원을 인정합니다. 저자는 또한 버지니아 폴리 테크닉 연구소 및 주립 대학에서 중요한 기술 및 응용 과학 연구소에서와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구에서 자금, 미국의 해군 연구소의 사무실에서 수상 N00014-15-1-2502의 지원을 인정 원정대 프로그램, 보너스 번호 1607310.

<ol><li>Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+Surface+Chemistry+with+Engineered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Programming Surface Chemistry with Engineered Cells.</a> ACS Synth. Biol. , (2016).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+graphene+oxide+films+used+as+matrix+of+MALDI-TOF-MS+for+detection+of+octachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165, 1255-1266 (2016).</li>
<li>Bähring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Sensing+Properties+of+a+Self-Assembled+Supramolecular+Oligomer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer.</a> Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).</li>
<li>Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+persistence+and+the+optimality+of+run-and-tumble+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis.</a> Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).</li>
<li>Du, J., Shao, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbial+factories+for+synthesis+of+value-added+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering microbial factories for synthesis of value-added products.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).</li>
<li>Kim, H., Kim, M. J. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7365478/">Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm.</a> IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Heyde, K. C., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Host-Microbiome+Interactions+using+an+in+Silico+Model+of+Biomimetic+Robots+and+Engineered+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells.</a> Sci. Rep. 5, 11988(2015).</li>
<li>Rice, M. K., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+biological+nanomaterials+using+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tech.+Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Creating biological nanomaterials using synthetic biology.</a> Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem. J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Mesulam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramethyl+benzidine+for+horseradish+peroxidase+neurohistochemistry%3A+a+non-carcinogenic+blue+reaction+product+with+superior+sensitivity+for+visualizing+neural+afferents+and+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents.</a> J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).</li>
<li>Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+plug-and-play+methodology+for+constructing+and+modifying+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks.</a> Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Chemical+Synthesis%2C+Assembly%2C+and+Cloning+of+a+Mycoplasma+genitalium+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome.</a> Science. 319, 1215-1220 (2008).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).</li>
<li>Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+use+of+capture+biotin-streptavidin+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Micro%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay.</a> J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).</li>
<li>Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+Nanosensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Biological+and+Chemical+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species.</a> Science. 293, 1289-1292 (2001).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 작용 물질의 표면과 생활 설계 세포를 인터페이스하기위한 새로운 전략을 발표했다. 이 IPTG로 유도 할 때 비오틴 수준 상승을 합성 할 수있는 세포주를 개발함으로써 달성되었다. 비오틴의 상승 된 수준은 기능화 된 표면을 수정하는 데 사용될 수있다. 프로토콜은 대장균 세포 라인을 설계하는 방법에 두 가지 작용 표면을 생성하는 방법을 상세히. 이 프로토콜에서 중요한 단계는 설계 세포주의 구축에 걸쳐 발생한다. 다운 스트림 문제, 모두 성장 곡선으로 설계 세포주의 특성 (그림 2)와 형광 응답 (그림 3)을 방지하기 위해 권장합니다. 절차상의 문제가 발생하는 경우, 이러한 PCR 추출 및 깁슨 조립체 (14)와 같은 다른 분자 클로닝 전략, 여기서 단계 적절한 치환 될 수있다. 비오틴 yie을 최적화조작 된 세포주 LD, DTB 충분한 양의 세포에 제공되는...

여기서, 우리는 조작 세포주에서 화학적 신호에 응답 할 수있는 프로그래밍이 된 기판을 현상하는 절차를보고한다. (1) 우리는 합성 조작 된 대장균 (대장균) 세포에 의해 생성 비오틴에 응답 비오틴 - 스트렙 타비 딘 인터페이스를 작성하여이를 수행합니다. 이전 프로그램은 독소의 표면 검사 2 및 치료 시점 진단 3 방위 및 보안에서 다양한 애플리케이션을 위해 설계되었다. 프로그래머블 표면 센서 및 액추에이터로서 유용 할 수있는 4이지만, 서로 다른 환경 문제에 적응할 수있는 능력을 부여하는로 &#39;똑똑한&#39;할 수있다. 대조적으로, 대장균 심지어 간단한 미생물은 본래 적응성이 있고 정교 종종 예기치 솔루션 과제에 응답 할 수있다. 이 적응성은 E. 사용할 수있다복잡한 유전자 네트워크에 의해 제어 대장균 인구는 비용 효율적으로 자원을 찾아, 5 부가가치 제품, 6, 심지어 전원 마이크로 규모의 로봇을 만들 수 있습니다. 7 프로그래밍 표면을 이용하여 살아있는 세포의 적응 효과를 결합함으로써, 우리는 상이한 환경 조건에 응답 할 수있는 스마트 기판을 생성 할 수있다. 합성 생물학은 생물의 행동을 프로그래밍하는 연구자들에게 새로운 능력을 부여하고있다. 새로운 유전자 조절 네트워크를 포함하는 셀을 설계함으로써, 연구자들은 프로그래밍 동작의 범위를 나타내는 셀을 설계 할 수있다. 기초 연구 너머 (8, 9)는, 이러한 동작은 부가가치 제품을 재 조립을 제어 생물학적 생산과 같은 애플리케이션에 사용될 수있다. 10 여기, 우리가 합성 생물학의 도구를 사용하여 우리 세부 방법 엔유도에 비오틴 합성 대장균 균주 때문에 엔지니어. 이 균주는 플라스미드 pKE1-의 lacI-bioB 조립 제한 효소 클로닝 방법을 사용하여 개발되었다. 대장균 균주 K-12 MG1655로 변환 할 때, 플라스미드는 bioB 비오틴 합성에 필수적인 효소의 상승 된 수준을 발현하는 능력을 부여한다 세포. 형질 전환 된 세포가 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 사이드 (IPTG)를 유도 비오틴 전구체 desthiobiotin (DTB)가 제공되었을 때, 비오틴의 높은 수준이 생성되었다. 스트렙 타비 딘과 비오틴의 결합 상호 작용은 자연에서 발견 강한 비 공유 결합 중 하나입니다. 이와 같이, 비오틴 - 스트렙 트 아비딘 상호 작용은 잘 특성화 높은 바이오 채용 모두이다. 이 원고 (11) 내에서, 우리는 감지 관능면 셀 생산 바이오틴을 검출 바이오틴 - 스트렙 상호 작용을 이용하는 두 가지 전략을 제시한다. 우리&quot;간접적&quot;와 &quot;직접&quot;제어 방식으로 이러한 대조적 인면을 참조하십시오. 간접 제어 방식에서, 셀 생산 바이오틴이 결합하고 결합 부위를 스트렙 타비 딘을위한 폴리스티렌 표면 상에 고정화 된 바이오틴 경쟁. 또한, 스트렙 타비 딘은 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)가 결합된다. HRP 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)을 450 nm의 (OD 450)에서 스펙트럼의 흡광도 (즉, 광학 밀도)을 정량함으로써 모니터링 될 수있는 광 신호 (12)를 생성하기 위하여 변경한다. 따라서, 간접적 인 제어 방식이 연구는 OD 450 attentuation 신호를 모니터링하여 셀 생산 비오틴을 측정 할 수있다. 직접 제어 방식은 재료 표면에 직접 스트렙 타비 딘을 고정화 및 결합 부위를 스트렙 타비 딘 경쟁하는 셀 생산 비오틴 및 비오틴 HRP를 허용하여 스트렙 타비 딘 - 비오틴 이벤트를 이용한다. 다시,셀 생산 비오틴의 상대적 수준은 OD 450 신호를 측정하여 모니터링됩니다. 함께 찍은, 조작 된 세포와 기능화 된 표면은 우리가 살아있는 세포에 네트워크를 유도하여 프로그램 표면의 특성을 제어 할 수 있습니다. 즉, 우리는 함께 이러한 시스템을 연결하여 조작 재 계면의 생물체의 적응성과 신뢰성 사양을 활용하는 시스템을 만들었다.

<table><tbody><tr><td>LB 브로스, 밀러&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, 최소 염, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>카사미노산&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘, 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘, 이수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>포도당(D-포도당), 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB 터보 세포주</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N 합성, DSL 정제</td></tr><tr><td>Q5 고충실도 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 반응 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 솔루션 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium 브로마이드, 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>겔 추출 키트</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch 플라스미드 DNA Miniprep Kit</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase 반응 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle 유리 도금 비즈&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-데스티오비오틴 (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>숙시니미딜 트랜스-4-(말리미딜메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-비오틴</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 10x 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin(SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테타아세트산 (EDTA)&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>트윈 80&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500 원심 집중기&nbsp;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨, 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>96웰 폴리스티렌 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

살아있는 세포를 엔지니어하는 합성 생물학을 사용하여 해당 프로그램 자료와 인터페이스

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

우리는 설계 세포 관능 표면의 물성을 제어 할 수있는 생물 적 생물 - 인터페이스를 개발했다. 대장균의 합성 조작 된 균주 및 관능 재 계면이 시스템은 두 개의 모듈을 생성함으로써 만들어진다. 이 논문에서, 우리는 세부 유전자 분자 복제 전략을 사용하여 대장균의 균주 내에서 선택 행동을 설계하기위한 프로토콜. 화학 유도제에 노출 될 때 회 전개,이 균주는 바이오틴의 높은 수준을 생성한다. 또한, 세포 합성 비오틴에 응답 할 수있는 각각의 두 가지 작용 표면을 만들기위한 우리 상세히 프로토콜. 종합하면, 우리는 무생물 재료 기판 상 조성물 및 조립을 제어하는 ​​셀을 설계 허용 연결된, 비 생물 - 생물학적 시스템을 생성하는 방법을 제시한다.

대표 결과 첨부 다섯 수치로 표시됩니다. 리더 시각적 합성 조작 된 대장균 균주를 생성하기위한 중요한 단계를 수행 할 수 있도록 먼저, 그래픽 복제 프로세스 (도 1)을 제시한다. 세포 집단의 동력학을 특성화하기 위해, 우리는 인구의 600 나노 미터 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정함으로써 생성되는 성장 곡선 (도 2)을 제공한다. 그 후, 우리는 조절 유전자 네트워크 우리 광학적 IPTG로 유도시 세포에 의해 생성 될 bioB의 상대적인 양을 측정 할 수 bioB 대한 프록시로서 (도 3) mCherry를 이용하여 검증하는 방법을 보여준다. 다음은 간접적 인 제어 및 직접 제어 작용면에 대해 응답 데이터를 제시한다. 이러한 데이터 그래프 (그림 4)는 무료의 측정 솔루션을 사...

이 논문은 조작 된 세포와 합성 제어 프로그램 재료 표면을 조작하는 대장균을 설계 에이블 작용 표면을 개발하기위한 프로토콜의 시리즈를 제공합니다.

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

이 절차들의 전반적인 목표는 유전자 변형과 표면 기능화 전략을 결합하여, 합성적으로 설계된 E.coli를 이용해 프로그래밍 가능한 재료 표면을 제어하고 조작하는 것입니다. 이 방법은 분자 의학 및 환경 모니터링과 같은 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 유전적으로 프로그래밍된 세포가 국소 환경을 해석하고 그에 따라 기능화된 재료를 수정하도록 함으로써, 다양한 응용 분야에 적용 가능한 모듈형 도구를 제공하고자 합니다.이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포가 기능화된 인터페이스를 통해 주변 환경의 조건을 읽고, 처리하고, 기록할 수 있는 동적 센서로 작용할 수 있다는 점입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용액을 준비하고 biotin 생성 E.coli로부터 biotin이 풍부한 상층액을 수집한 후, 20 µL의 streptavidin 또는 SA 용액에 1.4 µL의 SPDP 용액을 첨가합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 상온에서 1시간 30분 동안 배양하여 SPDP 가교제가 아미노기를 통해 SA와 결합하여 pyridyldithio-활성화된 SA를 형성하게 합니다. 배양 후, 튜브에 2.4 µL의 DTT 용액을 첨가하고 샘플을 상온에서 1시간 동안 배양하여 pyridine-2-thione 절단이 일어나 sulfhydryl-활성화된 SA가 생성되도록 합니다. 다음으로, 72 µL의 HRP 용액에 7.5 µL의 SCC 용액을 첨가하고, 알루미늄 호일로 감싼 뒤 상온에서 1시간 30분 동안 배양합니다.그 결과 아미노기에 의해 결합된 maleimide-activated HRP가 생성됩니다. 17 µL의 LC-LC biotin 용액을 200 µL의 BSA 용액과 섞고, 튜브를 호일로 감싼 뒤 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다. 이 단계에서 biotin이 아미드 결합을 통해 BSA에 접합됩니다.SA-SPDP 용액, HRP-SMCC 및 BSA-접합 biotin 용액을 각각 별도의 스핀 튜브용 원심분리 농축기에 옮깁니다. SA-SPDP를 10,000 ×g에서 튜브 부피가 100 µL가 될 때까지 또는 16분 동안 원심분리한 후, PBS-EDTA를 사용하여 스핀 튜브를 500 µL까지 채우고, 이 원심분리 및 PBS-EDTA 첨가 과정을 5회 더 반복합니다. 용액을 100 µL까지 농축시킨 후, 스톡 용액을 4 °C에서 보관하십시오.HRP SMCC의 경우, 부피가 25 µL가 될 때까지 또는 16분 동안 10,000 ×g에서 튜브를 원심 분리합니다. PBS를 사용하여 스핀 튜브를 4500 µL까지 채운 후, 원심 분리와 PBS 첨가 과정을 5회 더 반복합니다. 용액을 100 µL까지 농축한 후, 스톡 용액을 4 °C에서 보관하십시오.BSA biotin의 경우, 샘플을 10,000 ×g에서 부피가 100 µL가 될 때까지 또는 12분 동안 원심분리한 후, PBS를 사용하여 스핀 튜브를 500 µL까지 채웁니다. 원심분리와 PBS 첨가 과정을 4회 더 반복한 후, 부피가 100 µL가 될 때까지 또는 12분 동안 튜브를 원심분리하고, 튜브에 100 µL의 PBS를 추가하여 스톡을 4 °C에서 보관합니다. 다음으로, 10 mg/mL HRP 25 µL와 10 mg/mL SA 용액 25 µL를 혼합하여 튜브를 4 °C에서 하룻밤 동안 보관한 후, 490 µL의 PBS에 BSA biotin 스톡 10 µL를 추가하여 PBS에 희석한 BSA biotin 분주액 두 개를 준비합니다.96-well 플레이트의 각 웰에 용액 100 µL를 피펫팅합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그다음, 각 웰에 0.5% Tween 80 및 BPS 200 µL를 첨가합니다.플레이트를 상온에서 2분 동안 배양한 후, 액체를 흡입하여 제거합니다. 세척 과정을 3회 반복한 다음, 각 웰에 0.5% casing solution 200 µL를 첨가하고 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 다시 한번 세척 과정을 거친 후, 0.5% casing solution 12 mL와 0.5% Tween 80 7.5 µL를 혼합합니다. 그다음 이 용액을 사용하여 SA-HRP 스톡 용액을 1:10,000로 희석합니다.희석된 SA-HRP 80 µL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 피펫으로 분주한 후, 준비된 비오틴 샘플 20 µL를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 이 단계에서는 유리 비오틴과 고정화된 BSA 비오틴이 SA-HRP 결합 부위를 두고 경쟁적으로 결합하게 됩니다.이후 이전과 같이 플레이트를 세 번 세척한 다음, 50 millimolar sodium acetate, 1%TMB 및 3%hydrogen peroxide를 1,000:10:1 비율로 혼합하여 20 milliliter 용액을 준비합니다. 플레이트의 각 웰에 이 용액을 200 microliters씩 첨가하고, 호일로 감싼 후 실온에서 15분 동안 배양합니다. 반응을 중단시키기 위해 각 웰에 2 molar sulfuric acid 50 microliters를 피펫으로 넣고, 플레이트 리더를 사용하여 OD 450를 측정합니다.텍스트 프로토콜에 따라 용액을 준비한 후, 7.5 µL의 LC-LC biotin을 72 µL의 HRP에 첨가합니다. 용액을 호일로 감싸고 실온에서 1시간 30분 동안 교반하며 배양합니다. 이 단계에서 biotin이 아미드 결합을 통해 HRP와 접합됩니다.용액을 스핀 튜브 내의 원심분리 농축기로 옮기고, 부피가 100 µL가 될 때까지 또는 12분 동안 10,000 ×g에서 원심분리하십시오. 그 다음, 스핀 튜브에 PBS를 채워 500 µL로 만든 후 원심분리와 버퍼 추가 과정을 4회 반복하십시오. 이어서, 96-웰 플레이트의 각 웰에 PBS에 희석된 0.17 µg/mL SA 100 µL를 추가하십시오. 플레이트를 호일로 감싸고 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오.플레이트의 웰을 세척하려면, 각 웰에 0.5% Tween 80 200 µL를 피펫으로 분주합니다. 플레이트를 상온에서 2분 동안 배양한 후 액체를 따라 버립니다. 세척 과정을 3회 더 반복한 후, 웰에 0.5% 케이싱 용액 200 µL를 추가합니다.플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양한 후, 이전과 동일하게 웰을 3회 세척합니다. 미리 준비한 세척 및 농축된 biotin HRP 용액을 사용하여 biotin HRP 스톡 용액을 1:10,000으로 희석한 다음, 96-웰 플레이트의 각 웰에 해당 용액 80 µL를 첨가합니다. 준비된 biotin 샘플 20 µL를 플레이트의 각 웰에 넣고, 고정된 SA 결합 부위에 대해 유리 biotin과 biotin HRP 간의 경쟁적 결합이 일어나도록 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.이전과 같이 웰을 세 번 세척한 후, 50 millimolar sodium acetate, 1% TMV, 3% hydrogen peroxide가 1,000:10:1 비율로 혼합된 20 milliliter 용액을 준비합니다. 플레이트의 각 웰에 해당 용액 200 microliters를 넣고 호일로 덮은 뒤, 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그 후, 각 웰에 2 molar sulfuric acid 50 microliters를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 마지막으로, 플레이트 리더를 사용하여 OD 450을 측정합니다.엔지니어링된 유도성 E.coli MG1655 야생형 세포를 최소 배지와 DTB 및/또는 IPTG가 첨가된 최소 배지에서 배양하고 관찰하였습니다. 이 그래프들은 24시간 동안 5분마다 측정한 OD 600 값을 나타냅니다. 본 실험에서는 엔지니어링된 세포를 IPTG로 유도했을 때 유도 프로파일을 측정하기 위해 bioB 유전자 대신 형광 단백질 mCherry를 사용하였습니다.이 결과들은 유도성 유전자 네트워크의 효능을 입증합니다. 여기에 간접 및 직접 기능화 표면 방식 모두에 대해 biotin 농도 변화에 따른 OD 450에서의 광학 신호가 도식화되어 있습니다. 이 실험에서는 유도된 엔지니어링 세포의 생성물을 사용하여 기능화된 표면을 화학적으로 수정하였습니다.야생형 세포, pKE1-lacI-bioB 플라스미드를 포함하는 비유도 세포 및 pKE1-lacI-bioB 플라스미드를 포함하는 유도 세포에 대해 간접 제어 체계 기능화 표면으로 측정한 서로 다른 비오틴 농도를 나타냈습니다. 숙달되면 세포를 2일 만에 유전적으로 조작할 수 있으며, 직접 및 간접 표면 기능화 기술은 적절히 수행될 경우 각각 5시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 박테리아 세포 배양의 오염을 방지하고, 기능화 과정 중 광퇴색을 방지하기 위해 표면을 덮어두는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후에는 직접 및 간접 제어 방식 모두에 대해 표면을 기능화하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 5 일간의 프로토콜은 모든 단계, 장비 및 기반의 효율적인 내생 대장균 처음부터 TX-TL의 무 세포 발현 시스템을 구축 및 실행에 필요한 추가 소프트웨어를 설명합니다. 시약, 프로토콜은 8 셋업 시간 이하의 반응, 수집, 및 프로세스 데이터를 걸린다.

구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

여기, 모듈형 DNA "장치" 어셈블리 액체 처리 로봇에 모듈형 복제 DNA 어셈블리 메서드를 사용 하 여 수행 하는 자동화 된 워크플로 제공 됩니다. 프로토콜 조합 DNA 장치 라이브러리 생성, 우리는 두 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 설명 하는 액체 처리기 선택 목록 생성 하기 위한 소프트웨어 도구를 사용 합니다.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

PDMS 기반의 제조 과정, 다층, 체외 전사 및 번역(IVTT) 반응이 장기간 수행될 수 있도록 하는 미세유체 장치. 또한 장기간 이러한 반응을 자동화하고 유지하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어에 대한 포괄적인 개요가 제공됩니다.

장기간 무세포 유전자 발현의 전도를 위한 다층 미세유체 플랫폼

이 프로토콜은 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 상향식 준비를 위한 방법, 물질, 장비 및 단계를 설명합니다. 합성 세포의 내부 수성 구획은 지질 이중층(즉, 안정한 리포솜) 내에 캡슐화된 S30 세균 용해물을 함유하고, 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하였다.

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

잘 특성화 된 유전 부분은 새로운 유전 회로의 설계에 필요합니다. 여기에서는 유전 부분을 신속하게 특성화하기 위한 비용 효율적이고 처리량이 높은 방법을 설명합니다. 당사의 방법은 무세포 용해물, 복제를 방지하기 위한 선형 DNA, 처리량을 늘리고 반응량을 줄이기 위한 음향 액체 처리를 결합하여 비용과 시간을 줄입니다.

무세포 시스템을 사용한 유전 부분의 신속한 특성 분석

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

여기에서는 테트라사이클린 제어 기반 유도 합성 회로를 설계, 구축 및 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 기생충 제거 및 사이토카인 발현에 대한 합성 회로의 영향은 제시된 파이프라인을 채널화하여 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 전염병의 합성 회로 기반 치료법을 연구하는 연구자와 관련이 있습니다.

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

이 문서 biofabrication 접근 방식을 설명합니다 : 세포 또는 단백질과 기능화 수 biocompatible 영화를 만드는 편견 전극의 존재에 자극 - 반응 다당류의 증착. 우리는 실험실 - 온 - 칩 애플 리케이션을위한 인터랙티브 biofunctionalized 표면을 만들기위한 영화뿐만 아니라 그들의 기본적인 용도의 생성을위한 벤치 최고 전략을 보여줍니다.

Biofabrication와 바이오 전자 인터페이스 브리지

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

학습하세요 유전자 변형된 E. coli를 활용한 합성 생물학 기반 표면 조작 기술로, 생체 재료와의 동적 인터페이스를 구현하는 방법입니다. 이 기술은 분자 의학 및 환경 모니터링에 활용됩니다.

살아있는 세포를 엔지니어하는 합성 생물학을 사용하여 해당 프로그램 자료와 인터페이스

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