살아있는 세포를 엔지니어하는 합성 생물학을 사용하여 해당 프로그램 자료와 인터페이스

이 절차들의 전반적인 목표는 유전자 변형과 표면 기능화 전략을 결합하여, 합성적으로 설계된 E.coli를 이용해 프로그래밍 가능한 재료 표면을 제어하고 조작하는 것입니다. 이 방법은 분자 의학 및 환경 모니터링과 같은 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 유전적으로 프로그래밍된 세포가 국소 환경을 해석하고 그에 따라 기능화된 재료를 수정하도록 함으로써, 다양한 응용 분야에 적용 가능한 모듈형 도구를 제공하고자 합니다.

이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포가 기능화된 인터페이스를 통해 주변 환경의 조건을 읽고, 처리하고, 기록할 수 있는 동적 센서로 작용할 수 있다는 점입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용액을 준비하고 biotin 생성 E.coli로부터 biotin이 풍부한 상층액을 수집한 후, 20 µL의 streptavidin 또는 SA 용액에 1.4 µL의 SPDP 용액을 첨가합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 상온에서 1시간 30분 동안 배양하여 SPDP 가교제가 아미노기를 통해 SA와 결합하여 pyridyldithio-활성화된 SA를 형성하게 합니다. 배양 후, 튜브에 2.4 µL의 DTT 용액을 첨가하고 샘플을 상온에서 1시간 동안 배양하여 pyridine-2-thione 절단이 일어나 sulfhydryl-활성화된 SA가 생성되도록 합니다. 다음으로, 72 µL의 HRP 용액에 7.5 µL의 SCC 용액을 첨가하고, 알루미늄 호일로 감싼 뒤 상온에서 1시간 30분 동안 배양합니다.

그 결과 아미노기에 의해 결합된 maleimide-activated HRP가 생성됩니다. 17 µL의 LC-LC biotin 용액을 200 µL의 BSA 용액과 섞고, 튜브를 호일로 감싼 뒤 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다. 이 단계에서 biotin이 아미드 결합을 통해 BSA에 접합됩니다.

SA-SPDP 용액, HRP-SMCC 및 BSA-접합 biotin 용액을 각각 별도의 스핀 튜브용 원심분리 농축기에 옮깁니다. SA-SPDP를 10,000 ×g에서 튜브 부피가 100 µL가 될 때까지 또는 16분 동안 원심분리한 후, PBS-EDTA를 사용하여 스핀 튜브를 500 µL까지 채우고, 이 원심분리 및 PBS-EDTA 첨가 과정을 5회 더 반복합니다. 용액을 100 µL까지 농축시킨 후, 스톡 용액을 4 °C에서 보관하십시오.

HRP SMCC의 경우, 부피가 25 µL가 될 때까지 또는 16분 동안 10,000 ×g에서 튜브를 원심 분리합니다. PBS를 사용하여 스핀 튜브를 4500 µL까지 채운 후, 원심 분리와 PBS 첨가 과정을 5회 더 반복합니다. 용액을 100 µL까지 농축한 후, 스톡 용액을 4 °C에서 보관하십시오.

BSA biotin의 경우, 샘플을 10,000 ×g에서 부피가 100 µL가 될 때까지 또는 12분 동안 원심분리한 후, PBS를 사용하여 스핀 튜브를 500 µL까지 채웁니다. 원심분리와 PBS 첨가 과정을 4회 더 반복한 후, 부피가 100 µL가 될 때까지 또는 12분 동안 튜브를 원심분리하고, 튜브에 100 µL의 PBS를 추가하여 스톡을 4 °C에서 보관합니다. 다음으로, 10 mg/mL HRP 25 µL와 10 mg/mL SA 용액 25 µL를 혼합하여 튜브를 4 °C에서 하룻밤 동안 보관한 후, 490 µL의 PBS에 BSA biotin 스톡 10 µL를 추가하여 PBS에 희석한 BSA biotin 분주액 두 개를 준비합니다.

96-well 플레이트의 각 웰에 용액 100 µL를 피펫팅합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그다음, 각 웰에 0.5% Tween 80 및 BPS 200 µL를 첨가합니다.

플레이트를 상온에서 2분 동안 배양한 후, 액체를 흡입하여 제거합니다. 세척 과정을 3회 반복한 다음, 각 웰에 0.5% casing solution 200 µL를 첨가하고 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 다시 한번 세척 과정을 거친 후, 0.5% casing solution 12 mL와 0.5% Tween 80 7.5 µL를 혼합합니다. 그다음 이 용액을 사용하여 SA-HRP 스톡 용액을 1:10,000로 희석합니다.

희석된 SA-HRP 80 µL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 피펫으로 분주한 후, 준비된 비오틴 샘플 20 µL를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 이 단계에서는 유리 비오틴과 고정화된 BSA 비오틴이 SA-HRP 결합 부위를 두고 경쟁적으로 결합하게 됩니다.

이후 이전과 같이 플레이트를 세 번 세척한 다음, 50 millimolar sodium acetate, 1%TMB 및 3%hydrogen peroxide를 1,000:10:1 비율로 혼합하여 20 milliliter 용액을 준비합니다. 플레이트의 각 웰에 이 용액을 200 microliters씩 첨가하고, 호일로 감싼 후 실온에서 15분 동안 배양합니다. 반응을 중단시키기 위해 각 웰에 2 molar sulfuric acid 50 microliters를 피펫으로 넣고, 플레이트 리더를 사용하여 OD 450를 측정합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 용액을 준비한 후, 7.5 µL의 LC-LC biotin을 72 µL의 HRP에 첨가합니다. 용액을 호일로 감싸고 실온에서 1시간 30분 동안 교반하며 배양합니다. 이 단계에서 biotin이 아미드 결합을 통해 HRP와 접합됩니다.

용액을 스핀 튜브 내의 원심분리 농축기로 옮기고, 부피가 100 µL가 될 때까지 또는 12분 동안 10,000 ×g에서 원심분리하십시오. 그 다음, 스핀 튜브에 PBS를 채워 500 µL로 만든 후 원심분리와 버퍼 추가 과정을 4회 반복하십시오. 이어서, 96-웰 플레이트의 각 웰에 PBS에 희석된 0.17 µg/mL SA 100 µL를 추가하십시오. 플레이트를 호일로 감싸고 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오.

플레이트의 웰을 세척하려면, 각 웰에 0.5% Tween 80 200 µL를 피펫으로 분주합니다. 플레이트를 상온에서 2분 동안 배양한 후 액체를 따라 버립니다. 세척 과정을 3회 더 반복한 후, 웰에 0.5% 케이싱 용액 200 µL를 추가합니다.

플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양한 후, 이전과 동일하게 웰을 3회 세척합니다. 미리 준비한 세척 및 농축된 biotin HRP 용액을 사용하여 biotin HRP 스톡 용액을 1:10,000으로 희석한 다음, 96-웰 플레이트의 각 웰에 해당 용액 80 µL를 첨가합니다. 준비된 biotin 샘플 20 µL를 플레이트의 각 웰에 넣고, 고정된 SA 결합 부위에 대해 유리 biotin과 biotin HRP 간의 경쟁적 결합이 일어나도록 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.

이전과 같이 웰을 세 번 세척한 후, 50 millimolar sodium acetate, 1% TMV, 3% hydrogen peroxide가 1,000:10:1 비율로 혼합된 20 milliliter 용액을 준비합니다. 플레이트의 각 웰에 해당 용액 200 microliters를 넣고 호일로 덮은 뒤, 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그 후, 각 웰에 2 molar sulfuric acid 50 microliters를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 마지막으로, 플레이트 리더를 사용하여 OD 450을 측정합니다.

엔지니어링된 유도성 E.coli MG1655 야생형 세포를 최소 배지와 DTB 및/또는 IPTG가 첨가된 최소 배지에서 배양하고 관찰하였습니다. 이 그래프들은 24시간 동안 5분마다 측정한 OD 600 값을 나타냅니다. 본 실험에서는 엔지니어링된 세포를 IPTG로 유도했을 때 유도 프로파일을 측정하기 위해 bioB 유전자 대신 형광 단백질 mCherry를 사용하였습니다.

이 결과들은 유도성 유전자 네트워크의 효능을 입증합니다. 여기에 간접 및 직접 기능화 표면 방식 모두에 대해 biotin 농도 변화에 따른 OD 450에서의 광학 신호가 도식화되어 있습니다. 이 실험에서는 유도된 엔지니어링 세포의 생성물을 사용하여 기능화된 표면을 화학적으로 수정하였습니다.

야생형 세포, pKE1-lacI-bioB 플라스미드를 포함하는 비유도 세포 및 pKE1-lacI-bioB 플라스미드를 포함하는 유도 세포에 대해 간접 제어 체계 기능화 표면으로 측정한 서로 다른 비오틴 농도를 나타냈습니다. 숙달되면 세포를 2일 만에 유전적으로 조작할 수 있으며, 직접 및 간접 표면 기능화 기술은 적절히 수행될 경우 각각 5시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 박테리아 세포 배양의 오염을 방지하고, 기능화 과정 중 광퇴색을 방지하기 위해 표면을 덮어두는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후에는 직접 및 간접 제어 방식 모두에 대해 표면을 기능화하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.