Name: 식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 학습하세요 얼음결합단백질을 아이스 친화 정제로 분리하는 방법을 통해 동결내성 식물의 단백질을 식별하는 기술입니다. 이 방법은 복잡한 정제 없이 천연 추출물에서 IBP를 분리하여 식물의 동결 내성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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1. Splat 장치 설정 <ol><li> 온도 조절이 가능한 순환 수 욕조에 에틸렌 글리콜 (물 50 % v / v)을 채우십시오. 참고 : 녹색 자동차 용 에틸렌 글리콜을 사용할 수 있습니다. </li><li> 외부 챔버를 조립하려면 단열 플라스틱 튜브를 사용하여 수조를 이중벽 유리 그릇에 부착하십시오. 유리 그릇을 폴리스티렌 폼으로 절연시키고 플라스틱 페트리 접시 뚜껑으로 덮으십시오. 광원이 유리 챔버를 통해 볼 수 있도록 폴리스티렌 챔버의 바닥에 3-4 인치 구멍을 자르십시오. </li><li> 카메라 포트와 10X 안구 렌즈와 4X 편광 객관적인 렌즈가 장착되어 해부 현미경에 외부 챔버를 탑재하십시오. 외부 챔버 바닥에 편광 필름을 추가로 놓습니다. </li><li> 레토르트 스탠드 위에 1-1.5m 튜브 (직경 ~ 5cm)를 클램핑하고 레토르트 스탠드의 바닥에있는 튜브 아래에 위치한 냉각 블록과 함께 대형 폴리스티렌 컨테이너 안에 넣으십시오. </li></ol> 기본 단백질 2. 준비 IRI 분석을위한 추출 <ol><li> 낮은 조명 조건 (6 시간 광 / 18 시간 어둠)에 따라, 4 ° C에서 최대 1 주 동안 동결 내성 잔디 나 기타 동결 - 내성 식물 종, 저온 적응 식물 IBPS의 발현을 유도한다. 이것은 이미 낮은 온도 조건 및 적응 기간에 노출 된 현장에서 수집 된 샘플에 적용되지 않습니다. </li><li> 스템의 바닥에 절단 잎 조직의 대략 0.1 g을 수득 한 후, 1.5 ㎖의 튜브에 배치했다. 즉시 사용할 때까지 -80 ℃에서 액체 질소에 저장 샘플을 동결 플래시. </li><li> 세포 용균을 액체 질소하에 막자 사발을 사용하여 미세한 분말로 조직 샘플을 분쇄한다. 액체 질소는 균질화 과정에서 증발하지 않도록하십시오. </li><li> 즉시 얼음에 지상 샘플을 배치하고 액체 질소가 완전히 증발 할 수 있습니다. 네이티브 단백질 extracti의 1 ML을 추가합니다사용 직전에 첨가 두 EDTA 프리 프로테아제 억제제 정제와 10 mM의 트리스 -HCl, 25 mM의 염화나트륨 (PH 7.5) 완충액에 함유. 피펫 섞어; 소용돌이하지 않습니다. 참고 : 해물 이차 대사 산물 (토론 참조)이 포함 된 경우 추가 첨가제를 사용할 필요가있다. </li><li> 천천히 4 ℃에서 밤새 샘플 (18-24 시간)을 흔들어. 4 ℃에서의 나머지 단계를 실시한다. </li><li> 5 분 ~ 16,000 XG에 샘플을 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 세포 파편이 지속되면 추가로 5 분 동안 원심 분리하고 수용성 분획을 유지한다. 분명 샘플을 사용할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 경고등 분석 사전 실험 설정 <ol><li> 편광 필름 설정된 외부 챔버에 헥산 100 ㎖를 붓고 수분이 슬라이드 구축 방지 5-6 탈수 비드를 추가한다. 수조를 덮는 플레이트 진공 그리스를 소량 첨가하고 타이트한 밀봉을 보장하고, 헥산을 증발을 방지하기 위해 트위스트. </lI&gt; <li> 실험을 시작하기 전에 27 ° C 사이 및 31 ° C 프로그래밍 수조를 사용하여 약 2-3 시간 헥산 욕 쿨. 실험을 시작하기 전에 온도계 헥산의 온도를 확인해야합니다. </li><li> 바로 아래의 플라스틱 튜브 폴리스티렌 상자 냉각 블록을 넣고, 드라이 아이스와 완전히 실험 시작 40 분 전에 커버. </li><li> 분석을 시작하기 전에, 튜브 레벨인지 확인하십시오. 샘플이 떨어질 냉각 블록, 첫 번째 테스트에서 어디 물로 순서를 결정하고 (후술) 샘플 마커 삭제 위치를 표시한다. </li><li> 냉각 블록의 상단에서 드라이 아이스를 제거하고, 물로 결정된 강하 마크에 유리 현미경 슬라이드 커버를 배치했다. </li><li> 즉시 분석을 시작하기 전에, 광원 켜고 유리 챔버의 바닥에 형성 한 모든 얼음을 긁어. 얼음 결정하지 않는 한에 광원을 유지하지 마십시오헥산 가열 방지 가시화되고있다. </li></ol> 4. 플랫 분석을 실시 <ol><li> 종이 타월이 과잉 오일을 제거하여, 침지 오일 자동 피펫 (1-20 μL)에 부착 된 일회용 팁을 찍어. 이 단계는 샘플 가을보다는 피펫의 외부에 부착 할 수 있습니다. 참고 : 피펫에서 여분의 기름 제거 기름 방울이 시각화 어렵게 얼음 결정에 형성하지 않도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 직접 시료를 방출 전에 플라스틱 배관을 통해 표본 장소 피펫 피펫 10 μL. 샘플은 얼음 결정의 단일 층을 생성, 유리 커버 슬라이드를 칠 때 뚜렷한 &#39;플랫&#39;소리가되어야한다. </li><li> 신속하고 신중하게 편광 필름의 상단에 헥산 욕조에 핀셋과 장소를 사용하여 추위 블록에서 현미경 슬라이드를 제거합니다. </li><li> 현미경으로 보면,보기 및 광고 분야에 현미경 슬라이드를 넣어다만, 대물 렌즈가되도록 교차 편광 높은 콘트라스트 얼음 결정의 시각화를 허용한다. 40 배에 배율을 조정합니다. </li><li> 현미경에 카메라를 부착하고 얼음 결정의 명확한 시각화를 허용하고 이미지를 캡처하는 &quot;매크로&quot;로 설정을 조정합니다. 참고 : 1 시간까지 대기하는 얼음 결정이 명확한 그림을 제공 할 수 있습니다 성장 할 수 있도록합니다. </li><li> 반복 모든 샘플에 대한 4.1-4.5 단계를 반복합니다. 전형적으로, 헥산 챔버 내의 다른 샘플 6 개 슬라이드까지 게재. </li><li> 타이트 밀봉을 보장 광원을 끄고 헥산 욕 위에 플라스틱 판을 놓는다. (특정 분석에서 일관된 어닐링 기간 유지 12-24 시간)을 얼음 결정이 밤새 어닐링 할 수있다. 배양 후, 얼음 영화의 이미지를 캡처 전술 한 바와 같이. 참고 : 일부 샘플은 다른 사람보다 더 빠르게 재결정 할 수있다. 더 재결정 12 시간 후에 명확하지 않는 경우 24 시간까지없는 recrystalli되도록하는 결정이 어닐링 허용zation가 발생합니다. </li></ol> 5. 경고등 분석 데이터 분석 <ol><li> 컴퓨터에 사진을 업로드하고 직접 전 열처리 후 얼음 결정의 크기를 비교합니다. IRI없이 활동이없는 샘플들이 눈에 띄게 더 큰 얼음 결정을 형성하는 반면 재결정 얼음 재결정 활성을 갖는 샘플은 증가하지 않을 것이다. 빛 간섭은 큰 얼음 결정은 약간 다른 색상으로 표시되므로 쉽게 볼 수있다 할 것입니다. </li></ol> 6. 얼음 친화력 정화 장비 설치 <ol><li> 에틸렌 글리콜 온도 프로그래밍 순환 수조를 채운다. 녹색 자동차 에틸렌 글리콜을 사용할 수있다. </li><li> 절연 플라스틱 튜브 (15)를 사용하여 중공, 황동 프로브에 목욕을 연결합니다. </li><li> 150 ㎖의 비이커에 snuggly 들어갈 수있는 폴리스티렌 용기를 구축. 황동 차가운 손가락의 중심에 구멍 용기의 뚜껑을 만듭니다. </li></ol> 7.아이스 친화 정제를위한 시료의 준비 <ol><li> 콜드 적응의 식물 조직은 2.1 절에 설명. </li><li> 20 개 ㎖ 튜브에 접지 매스 (단계 2.3)의 ~ 100-150 g의 수집 즉시 동결 플래시. 샘플은 사용하기 전에 -80 ° C로 유지 될 수있다. </li><li> 2.3-2.5 부분에서 설명한 바와 같이 시료를 준비한다. 잎 조직의 부유를 들면 : 1 비율 (천연 단백질 추출 완충액 용액 mg의 조직 :) 1을 사용한다. 내인성 단백질 분해 효소에 의해 IBPS의 저하를 방지하기 위해 추가 프로테아제 억제제 정제를 사용합니다. 주 : 2 또는 1 : 3 (mg의 조직 : 천연 단백질 추출 완충액 ㎖) 조직 샘플이 지나치게 집중하면 1 비율을 조정한다. </li><li> 세포 파편을 제거하고, 무명천 2 층, 3 회 통하여 분해물 체. 4 ℃에서 40 분 동안 30,000 XG에서 원심 분리하여 파편 펠렛. </li><li> 천연 단백질 추출 완충액을 사용하여 120 mL의 행 샘플의 부피를 증가시킨다. 얼음 친화 정제 즉시에 해물을 사용하여얼음 바인딩 활동의 손실을 피할 수 있습니다. </li></ol> 8. 실시 얼음 화성 정제 <ol><li> 정제하기 전에, -0.04 ° C / H의 속도 C -3 ° -0.5 ° C로 냉각 프로그래머블 수조 세트. 참고 : 냉각 속도는 샘플의 초기 볼륨에 따라 조정할 수 있습니다. </li><li> -0.5 ° C로 얼음 손가락을 냉각시키고,이어서 초기 증류 물을 함유하는 50 ㎖ 튜브로를 잠수하다. 손가락에 형성하는 얼음의 얇은 층을 얼음 핵화를 촉진 할 수 있도록 약간의 얼음 칩을 추가한다. 이 프로세스는 일반적으로 20 내지 30 분 걸린다. 참고 : 얼음 코팅 손가락에 어떤 덩어리 전에 샘플 배치에 장갑을 낀 손으로 부드럽게해야한다. 빙 층은 -0.5 ° C에서 형성되지 않는 경우, -0.75 ° C의 온도를 낮추. </li><li> 자기 교반기 위에 폴리스티렌 용기에 작은 자기 교반 막대를 함유하는 150 ML 글래스 비이커에 넣어 샘플. 얼음 손가락이 있는지 확인중심 및 액체 시료에 적어도 반쯤 낮췄다. 용기를 밀봉합니다. </li><li> 24 시간마다 확인, 프로그램은 약 2 일 동안 실행할 수 있습니다. 샘플의 50 %가 동결되면, 프로그램을 중지합니다. 얼음 반구 IBPS 혼입 &quot;얼음 - 에칭&quot;을 초래할 것이다. 참고 : 정화 실험은 프로그램이 실행이 적절하게 조정하는 시간의 길이와 큰 샘플 볼륨을 사용하여 수행 할 수 있습니다. </li><li> 39 ° C에 프로브를 얼음 반구 가온 제거하기 위해, 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 증류수로 반구 린스 한 후 4 ℃에서 해동. 주 : 대부분 IBPS은 물 및 적절한 버퍼에 안정하지 않은 (즉, 50 mM 트리스 - 염산은 pH가 8의 50 mM 중탄산 암모늄 pH를 8) 해동 과정에서 주기적으로 첨가해야한다 (약 1 ㎖ / 2 시간) . 얼음 반구를 알루미늄 호일로 래핑하고, 종래 해동 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li><li> 얼음 반구가 여전히 포함되어있는 경우의 안료, 또는 샘플 정화 증가를 반복 8.1-8.5 2 ~ 3 번 단계를 반복합니다. 참고 : IBP의 농도가 낮은 정화의 여러 라운드를 다음 수 있지만, 순도 정제 된 샘플은 MS를 이용하여 분석 될 경우 얻을 수보다 더 가치가있다. 충분한 재료를 사용할 수있는 경우, 얼음 친화력 정화의 3 라운드 권장합니다. </li></ol> IBPS 9. 확인 <ol><li> IBPS가 얼음의 융해 반구 다음 다량 함유되어 있기 때문에, 샘플을 농축시킨다. 작은 단백질의 손실을 방지하기 위해 3000 다 분자량 컷오프 농도 원심 튜브를 사용 ~ 1-3 mL의 조직 ~ 100g을 함유하는 샘플을 농축시킨다. </li><li> MS에 대한 샘플을 보내기 전에 같은 BCA 또는 브래드 포드 분석으로 단백질 정량 분석법을 이용하여 단백질 농도를 결정한다. 예로서 SDS-PAGE 겔 전기 영동에 의해 시료의 순도를 추정한다. SE 이전 IRI 활동에 대한 정제 된 단백질을 테스트MS에 대해 웍하면 활성 단백질을 정제 및 농축 단계로 유지되어 있는지 확인한다. </li><li> 질량 분광 분석 (10) 직접 농축 된 시료를 사용합니다. </li></ol>

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IBPS의 성공적인 분석 및 정제를 들어,이 단백질의 일부의 온도에 민감한 특성을 이해하는 것이 중요합니다. 특정 식물 IBPS는 전개, 침전 및 활동의 결과로, 0 ° C 이상의 온도에서 불안정해질. IBPS 활성을 얻기 위해서는 식물은 냉장실 (~ 4 ° C)에서 처리되고, 샘플은 실험하는 동안 얼음에서 유지되는 것이 종종 중요하다. 전체 셀 원유 해물을 사용하여 내생 단백질 분해 효소에 의한 단백질의 분해가있을 때 또 다른 요인은 고려해야합니다. 식물에서 IBPS의 표현은 일반적으로 낮고, 따라서 단백질 수율 손실은 향후 실험 또는 분석을위한 불충분 한 물질이 발생할 수 있습니다. 신뢰할 수있는 프로테아제 억제제 칵테일의 추가와 함께, 단백질 추출하는 동안 신속하게 작업 단백질의 손실을 줄일 수 있습니다. 또한,이 추위에 적응 기간이 실험실 성장의 IBPS의 가장 큰 축적에 최적화하는 것이 중요합니다식물. IBPS 작업 또 다른 일반적인 문제는 분석의 대부분은 온도와 습...

ICP (Ice-binding proteins)는 식물 1 , 곤충 2 , 어류 3 , 미생물 4 등 여러 유기체에서 발견 된 다양한 보호 단백질 군입니다. 이 단백질의 핵심 특징은 얼음 결정에 특이하고 효율적으로 흡착되어 성장을 수정하는 독특한 능력입니다. IBP는 몇 가지 문서화 된 성질을 가지고 있는데, 가장 잘 특징 지어지는 두 가지는 열 히스테리시스 (TH)와 얼음 재결정 억제 (IRI)입니다. TH 활성은 동결 - 내성이없는 동물에서 생산 된 IBP에서보다 쉽게 ​​관찰된다. 이 활동으로 인해 동결을 방지하기 위해 유기체의 순환 또는 간질 유체의 응고점이 낮아집니다. 대조적으로, 영하의 온도에서 필연적으로 동결 될 동결 내성 유기체에서, IBPs는 TH 활성이 낮게 나타난다. 낮은 TH 활동에도 불구하고, 얼음 울기를 제한하는 높은 IRI 활동STAL 성장은 종종 이러한 단백질과 관찰된다. 동결 내성 미생물의 경우,이 IRI의 활동은 아마도 세포 외 구획 얼음의 조절되지 않는 성장 세포를 보호하는 데 도움이됩니다. 은 &quot;매트리스 버튼&quot;모델 IBPS 얼음 결정 (5)의 성장을 방지하는 메커니즘을 설명하는 데 사용될 수있다. 이 모델에서는 IBPS 특히 물 분자에만 결합 IBPS 사이의 공간에 성장 얼음 결정 격자로 통합 할 수 있도록 간격으로 얼음 결정 표면에 흡착. 이 부가 물 분자의 결합이 불리하게 곡률, 깁스 - 톰슨 효과 (6)에 의해 설명 될 수있는 이벤트를 생성한다. 앵커 포접 물 가설 얼음 결정 표면에 IBPS의 특이 적 결합을위한 메커니즘을 제공 됨으로써 REO에 특이 단백질 결합 부위 얼음에 위치 대전 잔기의 존재는 결과물 분자가 얼음 결정 격자의 하나 이상의 평면과 일치하도록한다. TH 활성은 IBP의 존재하에 단일 빙 결정의 용융 및 응고 온도의 차이를 측정함으로써 정량화 될 수있다. TH 활성은 IBP의 활성을 평가하는 널리 받아 들여지는 방법이지만, 식물 IBP에 의해 생성되는 낮은 TH 갭 (일반적으로 단지 일부 정도)은 일반적으로 높은 단백질 농도, 특수 장비 및 조작자 경험을 필요로한다. 비 IBP는 얼음 결정 성장을 제한 할 수 있지만 모든 IBP가 공유하는 특성이므로 IRI 활동에 대한 테스트는 IBP의 존재에 대한 효과적인 초기 화면, 특히 TH 활동이 낮은 사람들을위한 효과적인 초기 화면입니다. 이 활동을 테스트하는 데 사용되는 방법론은 &#39;splat assay&#39;로 알려져 있으며, 단백질 샘플을 얼음으로 얼려서 작은 얼음 결정의 단일 층을 생성하고 일정 기간 동안 관찰하여얼음 결정 성장이 제한됩니다. IBPS 존재하는 소스 조직 샘플을 스크리닝하는데 사용하는 다른 방법과는 달리,이 기술은 10-100 ng의 범위의 낮은 단백질 농도에 적용 가능하다 쉽게 제작 된 장비를 이용하여, 신속하고 간편하게 해석 데이터를 생성한다. 그러나, 상기 분석은 TH 결정 얼음 결정 형성 와야 IBPS위한 초기 화면을 제공하는 것을 강조하는 것이 중요하다. 천연 단백질의 분리는 종종 관심의 단백질의 구조적, 생화학 적 특성에 관한 정보를 필요로 도전하고있다. 아이스 IBPS의 친화 정제 목적을 위해 기판으로서 아이스를 사용하여 이러한 단백질의 격리를 허용한다. 분자의 대부분이 얼음 결정 성장, 고도로 정제 된 샘플의 IBP 샘플 결과의 존재 하에서 얼음 반구 저성장 큰 quantit없는 동안에 앞서 빙수 경계 가압되므로단백질 및 용질을 오염 IES. 이 방법은 곤충, 8, 9, 10, 11 박테리아, 식물 및 어류 12 13 14 IBPS를 식별하는데 사용되었다. 또한,이 방법을 통해 달성 IBP - 풍부 분획은 또한 하류 생화학 적 분석에 이용 될 수있다. 이 논문은 IBPS 유도 추출 통해 식물 IBPS의 식별을 설명, IRI 활동 분석은 단백질의 존재 및 얼음 친 화성 정제를 사용하여 단백질의 분리를 확인한다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>조절 가능한 실험실 잭</td><td>Fisher</td><td>S63080</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Desaga MC2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>황동 프로브</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카메라/카메라 포트</td><td>Canon</td><td></td><td>Canon Power Shot SX110 디지털 카메라; 맞춤형 현미경 포트</td></tr><tr><td>치즈클로</td><td>스 Purewipe/Fisher Scientific</td><td>06-665-25A</td><td></td></tr><tr><td>농축 튜브(0.5 mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>농축 튜브(15 mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브(50 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12502</td><td></td></tr><tr><td>냉각 블록</td><td>VWR</td><td>13259</td><td>금속 가열 블록 사용</td></tr><tr><td>제습기</td><td>Whirlpool</td><td></td><td>50 파인트 에너지 스타 제습기; 현지 공급업체로부터 구매</td></tr><tr><td>Dessciation beads</td><td>t.h.e. Dessicant/VWR</td><td>EM-DX0017-2</td><td>6-8 메시 크기; 100% 해</td></tr><tr><td>부 현미경</td><td>Olympus Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이중 벽 유리 그릇</td><td>일반</td><td></td><td>현지 실험실 유리 공급 업체에서 구매</td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td>Generic</td><td></td><td>현지 공급 업체 사용; 위험한&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA-프로테아제 억제제 정제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Roche cOmplete mini</td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜</td><td>Generic</td><td></td><td>Green 자동차 에틸렌 글리콜은 모든 지역 철물점(i.e. Home Depot)에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090</td><td>무수, 95%; 위험한</td></tr><tr><td>침지 오일</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56822</td><td></td></tr><tr><td>JA10/20 원심분리기</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대형 플라스틱 페트리 접시</td><td>일반</td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>일반</td><td></td> 현지 <td>공급 업체; 위험한&nbsp;</td></tr><tr><td>자기 교반 플레이트</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI190M</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 튜브</td><td>일반</td><td></td><td>현지 철물점에서 PVC 파이프 구매</td></tr><tr><td>편광 필름</td><td>Edmund Optics</td><td>43-781</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 폼</td><td>일반</td><td></td><td>폴리스티렌 배송 상자에서 구성 가능</td></tr><tr><td>Poreclain 모르타르 및 유봉</td><td>Fisher</td><td>FB961</td><td></td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77627</td><td>110 &micro; m 입자 크기</td></tr><tr><td>레토르트 스탠드</td><td>Fisher</td><td>12-000</td><td></td></tr><tr><td>소형 교반 막대</td><td>Fisher</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>온도 프로그래밍 가능한 수조</td><td>VWR</td><td>13271-118</td><td></td></tr><tr><td>진공 그리스</td><td>Dow Corning/Sigma Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>비닐 튜빙</td><td>일반</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

얼음 - 결합 단백질 (IBPS)이 영하의 온도에 노출 특정 미생물에 의해 합성되어 스트레스 - 유도 단백질의 패밀리에 속한다. 세포 외 얼음 결정이 성장하면 식물에서 동결 손상은 세포막 가능한 세포 죽음의 파열의 결과로 발생합니다. 얼음 결정으로 IBPS의 흡착되어 세포 손상을 감소 얼음 재결정 억제 (IRI)으로 알려진 공정에 의해 상기 성장을 제한한다. IBPS은 평형 융점 이하 용액, 열 이력 (TH) 활성 알려진 속성의 빙점을 누를 수있는 능력을 입증한다. 이러한 보호 특성으로 인해, 산업, 의료 및 농업 분야에서 자신의 잠재적 인 사용에 새로운 IBPS의 식별에 대한 관심을 제기했다. 이 논문은 1 내지 IBPS 공장의 식별) 유도 추출 IBPS의 식물 조직에서, 2) IRI 활성에 대한 스크리닝 추출물, 3)을 정제 및 분리를 설명IBPS의 가스화. 낮은 온도에 노출하여 IBPS 유도 후, 추출물을 표준 광학 현미경을 이용하여 얼음 결정 성장을 관찰 할 수있는 &#39;플랫 분석&#39;을 이용 IRI 활성에 대해 시험된다. 이 분석은 낮은 단백질 농도가 필요하며 빠르게 수득 쉽게 얼음 결합 활성의 초기 화면을 제공하고, 해석 결과를 생성한다. IBPS이어서 &#39;얼음 화성 정제&#39;이라는 기술을 통해 얼음을 흡착 IBPS의 속성을 이용하여 단백질을 오염으로부터 격리 될 수있다. 식물 추출물에서 수집 한 세포 용 해물을 사용하여, 얼음 반구 천천히 황동 프로브에 성장시킬 수있다. 이는 다결정 얼음의 결정 구조에 IBPS를 통합합니다. 아니오 IBP의 선험적 생화학 적 또는 구조적 기술을 요구하는이 방법은 단백질의 활성 회복을 허용한다. 아이스 정제 단백질 분획 격려의 식별을 포함하여 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다질량 분석 및 천연 단백질의 생화학 적 분석에 의한 조수 시퀀스.

셋업의 편의를 위해, 그림 1과 도 2는 각각 IRI 분석 얼음 화성 정제에 사용되는 장비의 시각적 표현을 포함한다. IBPS와없이 겨자 식물로부터 수집 된 추출물을 사용 IRI 분석 결과는도 3에 도시된다. 이러한 결과는 동결 허용되지 겨자 잡초에서 수집 추출물이 때문에 IBPS 존재의 부족으로 얼음 결정 성장을 제한 할 수 없습니다 것을 보여준다. 대조적으로, 작은 아이스 결정은 트랜스 제닉 식물은 실질적 얼음의 결정 성장을 제한 다년생 라이 그래스로부터 IBPS을 함유하는 볼. 도 4는 정제의 두 라운드 후에 IBPS 표현 다년생 라이 그라스 추출물을 이용하여 성장 된 얼음 반구를 나타낸다. 정제의 첫번째 라운드 고차 ...

이 논문은 얼음 재결정 억제 활성과 얼음 화성 정제를 사용하여 원시 IBPS의 후속 분리의 평가를 통해 동결 내성 식물 얼음 - 결합 단백질의 동정을 설명합니다.

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

본 프로토콜의 전반적인 목적은 얼음 결합 활성을 테스트하고 얼음 친화성 정제를 통해 천연 펩타이드를 분리함으로써 식물로부터 새로운 얼음 결합 단백질(IBP)을 식별하는 것입니다. 이 방법은 식물의 내동성, 특히 얼음 결합 단백질 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복잡한 정제 방법 없이도 천연 추출물에서 얼음 결합 단백질을 분리할 수 있다는 점입니다.장치 설정 개념을 이해하기 어려울 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 스플랫(splat) 장치 설정을 통해 이 프로토콜을 시작하십시오. 내한성 그라스 또는 기타 내한성 식물 종에서 빙결 방지 단백질(ice-binding proteins, IBPs)의 발현을 유도하려면, 저광 조건의 4 °C에서 최대 일주일 동안 식물을 저온 순응시키십시오.줄기 기부를 절단하여 약 0.1 g의 잎 조직을 얻은 후 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 샘플을 즉시 액체 질소로 급속 냉동하고 사용 전까지 -80 °C에서 보관합니다. 세포를 용해하기 위해, 액체 질소 조건에서 막자와 막자사발을 사용하여 조직 샘플을 고운 가루가 될 때까지 갑니다.균질화 과정 동안 액체 질소가 증발하지 않도록 하십시오. 분쇄된 샘플을 즉시 얼음에 두고 액체 질소가 완전히 증발하도록 합니다. 그 다음 native 단백질 추출 버퍼 1 mL를 추가하고 피펫팅하여 혼합합니다.샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 섞어주고, 나머지 단계들도 동일한 온도에서 수행합니다. 다음 날, 샘플을 약 1,600 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거합니다. 가용성 분획을 회수하고, 세포 잔해가 남아 있는 경우 5분 동안 추가로 원심분리합니다.정제된 시료는 사용할 때까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 편광 필름이 설치된 외부 챔버에 100 mL의 헥산(hexane)을 붓고, 슬라이드에 수분이 생기는 것을 방지하기 위해 건조제 비드 5~6개를 넣습니다. 그런 다음 배스(bath)를 덮는 플레이트에 진공 그리스를 소량 바르고 돌려서 밀폐하여 헥산의 증발을 방지합니다.실험 시작 40분 전에 냉각 블록을 플라스틱 튜브 바로 아래의 폴리스티렌 상자에 넣고 드라이아이스로 완전히 덮어줍니다. 분석을 시작하기 전, 튜브가 수평인지 확인하십시오. 그런 다음 냉각 블록 상단의 드라이아이스를 제거합니다.먼저, 샘플이 냉각 블록의 어느 지점에 떨어지는지 확인하기 위해 이 절차를 물로 테스트하십시오. 자동 피펫에 장착된 일회용 팁을 침수액(immersion oil)에 담그면, 샘플이 피펫 외벽에 달라붙지 않고 아래로 떨어지게 됩니다. 페이퍼 타월을 사용하여 과도한 오일을 제거하십시오.그런 다음 10 µL의 물을 흡입합니다. 물을 분사하기 전 피펫을 플라스틱 튜브 바로 위에 위치시키십시오. 물이 냉각 블록에 닿을 때 특유의 튀기는 소리가 나야 하며, 이를 통해 얼음 결정의 단층이 형성됩니다.다음으로, 물로 결정된 드롭 마크 위에 유리 현미경 커버 슬라이드를 놓습니다. 분석을 시작하기 직전에 광원을 켜고 유리 챔버 바닥에 형성된 얼음을 긁어냅니다. 그런 다음 물에서와 동일하게 샘플을 사용하여 스플랫 분석(splat assay)을 수행하며, 샘플 10 µL를 유리 커버 슬라이드 위에 떨어뜨려 얼음 결정의 단층을 형성합니다.핀셋을 사용하여 콜드 블록에서 현미경 슬라이드를 빠르고 조심스럽게 꺼내 편광 필름 위의 헥산 배스(hexane bath)에 놓습니다. 현미경으로 관찰하면서 슬라이드를 시야에 넣고, 교차 편광을 통해 고대비의 얼음 결정이 시각화되도록 대물렌즈를 조정합니다. 카메라를 현미경에 부착하고 설정을 매크로로 조정하여 얼음 결정을 선명하게 시각화한 후 이미지를 촬영합니다.모든 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다. 일반적으로 서로 다른 샘플이 담긴 슬라이드를 최대 6개까지 헥산 챔버에 배치합니다. 작업이 완료되면 광원을 끕니다.그런 다음 헥산 배스 위에 플라스틱 판을 덮어 밀폐시킨 후, 하룻밤 동안 얼음 결정이 어닐링되도록 둡니다. 배양 후, 이전과 동일하게 얼음 박막의 이미지를 캡처합니다. 이전과 동일하게 식물 조직을 저온 순응시킨 후, 분쇄된 바이오매스 약 100에서 150 g을 20 mL 튜브에 수집합니다.샘플을 즉시 급속 냉동하고, 사용 전까지 -80°C에서 보관하십시오. 이전과 동일하게 샘플을 준비하되, 잎 조직의 재현탁을 위해 1:1 비율을 사용하십시오. 내인성 프로테아제에 의한 IBP의 분해를 방지하기 위해 추가적인 프로테아제 억제제 정제를 사용하십시오.세포 잔해를 제거하기 위해, 용해물을 두 겹의 치즈클로스에 세 번 걸러냅니다. 4°C에서 30,000 ×g로 40분 동안 원심분리하여 잔해를 침전시킵니다. 그 다음, 네이티브 단백질 추출 버퍼를 사용하여 시료의 부피를 120 mL로 늘리고, 얼음 결합 활성의 손실을 방지하기 위해 즉시 얼음 친화성 정제(ice-affinity purification)에 사용하십시오.아이스 핑거를 -0.5 °C까지 냉각시킨 후, 차가운 증류수가 담긴 50 mL 튜브에 담급니다. 얼음 핵 생성을 촉진하기 위해 얼음 조각을 몇 개 넣고, 핑거 표면에 얇은 얼음층이 형성되도록 합니다. 이 과정은 일반적으로 20분에서 30분 정도 소요됩니다.작은 마그네틱 바가 들어 있는 150ml 유리 비커에 시료를 넣고, 이를 마그네틱 교반기 위의 폴리스티렌 용기에 배치합니다. 아이스 핑거(ice finger)가 중앙에 위치하며 액체 시료의 최소 절반 이상까지 내려갔는지 확인하십시오. 그 후 용기를 밀봉합니다.프로그램을 약 2일 동안 실행하며 24시간마다 확인하십시오. 샘플의 50%가 동결되면 프로그램을 중단하십시오. IBP가 얼음 반구에 포함되면 아이스 에칭(ice etching)이 발생합니다.얼음 반구를 제거하려면 프로브를 4°C까지 가온하십시오. 그다음, 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 반구를 증류수로 헹구고 4°C에서 해동하십시오. 얼음 반구에 여전히 색소가 남아 있거나 시료 정제도를 높이려면, 정제 단계를 2~3회 반복하십시오.여기에 제시된 것은 IBP가 없는 버퍼 대조군에서 수집한 추출물과 IBP를 포함하지 않는 야생형 Arabidopsis thaliana의 추출물입니다. 18시간 후, 버퍼 대조군과 A.thaliana 추출물은 얼음 결정의 성장을 억제하지 못합니다. 이와 대조적으로, 저온 순응된 Lolium perenne의 IBP를 발현하는 형질전환 A.thaliana 추출물에서 관찰되는 작은 얼음 결정들은 얼음 결정의 성장을 상당히 억제합니다.1차 정제 후, 반구 표면에 나타난 높은 수준의 얼음 식각(ice etching)은 IBP가 얼음에 흡착되어 얼음 결정의 성장을 변화시켰음을 나타냅니다. 추가적인 용질, 색소 및 오염 단백질을 제거하기 위해 2차 얼음 친화성 정제를 수행하였으며, 그 결과 더 투명한 얼음 반구가 형성되었습니다. 이 절차 이후, 얼음 결합 단백질의 특성을 추가로 분석하기 위해 나노리터 삼투압계(nanoliter osmometer)를 사용하여 얼음 모양 형성과 열 히스테리시스(thermal hysteresis)를 평가할 수 있습니다.또한, 분리된 분획물들을 질량 분석법으로 보내 펩타이드 서열을 확인할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

또한 부동액 단백질로 알려진 아이스 바인딩 단백질 (IBPs)는, 얼음의 성장을 억제하고 조직의 cryopreservation에서 사용할 수있는 유망 첨가제입니다. IBPs을 조사하는 데 사용되는 주요 도구는 nanoliter의 osmometer입니다. 우리는 광학 현미경에 장착 홈 디자인 냉각 단계를 개발하고 맞춤형 LabVIEW 루틴을 사용하여 제어. nanoliter의 osmometer는 매우 민감한 방식으로 샘플 온도를 조작 여기에 설명했다.

아이스 바인딩 단백질 수사 LabVIEW 운영하는 소설 Nanoliter의 Osmometer

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

부동액 단백질(AfP)은 얼음 의 특정 평면에 결합하여 얼음 성장을 방지하거나 느리게 합니다. 형광계 얼음 비행기 선호도(FIPA) 분석은 AFP 바인딩 된 얼음 비행기의 측정을위한 원래 얼음 에칭 방법을 수정한 것입니다. AFP는 형광으로 표시되고, 거시적 단일 얼음 결정에 통합되고, UV 빛 아래에서 시각화됩니다.

형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정

여기에서는 고해상도 적외선 열화상(HRIT)을 사용하여 식물의 얼음 형성 부위와 얼음 전파 경로를 시각화할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

식물의 얼음 핵 얼음 전파의 연구에 대한 고해상도 적외선 체열 (HRIT)의 사용

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

이 프로토콜 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 모 세관 젤 전기 이동 법 및 충전된 ligands에 대 한 빠른 바인딩 심사를 단백질 샘플의 특성을 결합합니다. 그것은 본질적으로 무질서 단백질 등 유연한 구조를 가진 단백질에 대 한 다른 conformers에 대 한 바인딩 차이 확인 하려면 권장.

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

본 프로토콜은 미세유체 장치에서 미세한 얼음 결정 및 포접 수화물의 결정화를 설명하여, 형성된 결정 주위에서 액체 교환을 가능하게 한다. 이것은 억제제의 결정화 과정과 결합 메커니즘을 검사할 수 있는 비할 데 없는 가능성을 제공합니다.

얼음 및 포접 수화물 결정화 연구를 위한 미세유체 접근법

여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

학습하세요 얼음결합단백질을 아이스 친화 정제로 분리하는 방법을 통해 동결내성 식물의 단백질을 식별하는 기술입니다. 이 방법은 복잡한 정제 없이 천연 추출물에서 IBP를 분리하여 식물의 동결 내성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

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