식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

이 프로토콜의 전반적인 목표는 얼음 결합 활성을 테스트하고 얼음 친화성 정제를 사용하여 천연 펩타이드를 분리하여 식물에서 새로운 얼음 결합 단백질 또는 IBP를 식별하는 것입니다. 이 방법은 식물 동결 내성, 특히 얼음 결합 단백질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 복잡한 정제 방법을 사용하지 않고도 천연 추출물에서 얼음 결합 단백질을 분리할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 장치 설정을 개념화하기 어려울 수 있으므로 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 splat 장치 설정으로 이 프로토콜을 시작합니다. 동결에 강한 잔디 또는 기타 동결에 강한 식물 종에서 얼음 결합 단백질 또는 IBP의 발현을 유도하기 위해 저조도 조건에서 섭씨 4도에서 최대 1주일 동안 식물에 추위에 적응시킵니다.

줄기 바닥을 자른 다음 1.5ml 튜브에 넣어 약 0.1g의 잎 조직을 얻습니다. 즉시 샘플을 액체 질소에 급속 동결하고 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 세포를 용해시키려면 모르타르와 유봉을 사용하여 조직 샘플을 미세한 분말로 분쇄하고 액체 질소 아래에서 유봉

균질화 과정에서 액체 질소가 증발하지 않도록 하십시오. 즉시 분쇄 샘플을 얼음 위에 놓고 액체 질소가 완전히 증발하도록 합니다. 그런 다음 1ml의 천연 단백질 추출 버퍼와 피펫을 추가하여 혼합합니다.

섭씨 4도에서 밤새 샘플을 부드럽게 흔든 후 동일한 온도에서 나머지 단계를 수행합니다. 다음날, 5 분 동안 대략 1, 600 시간 G에 표본을 원심 분리해서 세포질 파편을 제거하십시오. 용해성 분획을 유지하고 세포 파편이 지속되는 경우 추가로 5분 동안 원심분리합니다.

정화된 샘플은 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. 편광 필름으로 설정된 외부 챔버에 100ml의 헥산을 붓고 5-6개의 건조 비드를 추가하여 슬라이드에 수분이 축적되는 것을 방지합니다. 그런 다음 수조를 덮고 있는 플레이트에 소량의 진공 그리스를 추가하고 비틀어 단단히 밀봉하고 헥산의 증발을 방지합니다.

실험을 시작하기 40분 전에 냉각 블록을 플라스틱 튜브 바로 아래에 있는 폴리스티렌 상자에 넣고 드라이아이스로 완전히 덮습니다. 분석을 시작하기 전에 튜브가 수평인지 확인하십시오. 그런 다음 콜드 블록 상단에서 드라이 아이스를 제거합니다.

먼저 이 절차를 물로 테스트하여 냉각 블록의 어느 위치에 샘플이 떨어질지 확인합니다. 자동 피펫에 부착된 일회용 팁을 이멀젼 오일에 담그면 샘플이 피펫 외부에 달라붙지 않고 떨어질 수 있습니다. 종이 타월을 사용하여 과도한 기름을 제거하십시오.

그런 다음 10마이크로리터의 물을 흡입합니다. 물을 배출하기 전에 플라스틱 튜브 바로 위에 피펫을 놓으십시오. 물이 냉각 블록에 부딪혀 단층의 얼음 결정을 생성할 때 뚜렷한 펑 소리가 들려야 합니다.

다음으로, 물로 측정된 드롭 마크에 유리 현미경 커버 슬라이드를 놓습니다. 분석을 시작하기 직전에 광원을 켜고 유리 챔버 바닥에 형성된 얼음을 긁어냅니다. 그런 다음 물에 대해 수행한 것처럼 샘플로 스플랫 분석을 수행하여 10마이크로리터의 샘플을 유리 커버 슬라이드에 방출하여 얼음 결정의 단층을 생성합니다.

핀셋을 사용하여 콜드 블록에서 현미경 슬라이드를 빠르고 조심스럽게 제거하고 편광 필름 위에 있는 헥산 수조에 넣습니다. 현미경 아래를 보면 현미경 슬라이드를 시야에 넣고 대물 렌즈를 조정하여 교차 편광을 통해 고대비 얼음 결정을 시각화할 수 있습니다. 카메라를 현미경에 부착하고 설정을 매크로로 조정하여 얼음 결정을 명확하게 시각화하고 이미지를 캡처할 수 있습니다.

모든 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다. 일반적으로 헥산 챔버에 다른 샘플과 함께 최대 6개의 슬라이드를 배치합니다. 완료되면 광원을 끕니다.

그런 다음 헥산 수조 위에 플라스틱 플레이트를 놓고 단단히 밀봉하고 얼음 결정이 밤새 어닐링되도록 합니다. 배양 후 이전과 같이 얼음 필름의 이미지를 캡처합니다. 이전과 같이 식물 조직을 저온 순응시킨 후 20ml 튜브에 약 100-150g의 분쇄 바이오매스를 수집합니다.

샘플을 즉시 급속 동결하고 사용하기 전에 섭씨 영하 80도로 유지하십시오. 잎 조직의 재현탁액을 위해 1:1 비율을 사용하여 이전과 같이 샘플을 준비합니다. 내인성 프로테아제에 의한 IBP의 분해를 방지하기 위해 추가 프로테아제 억제제 정제를 사용하십시오.

세포 파편을 제거하려면 두 겹의 무명천을 통해 용해물을 체로 세 번 칩니다. 30, 000 시간 G에 원심 분리에 의하여 파편을 4 섭씨 온도에 40 분 동안 펠릿으로 만드십시오. 그런 다음 기본 단백질 추출 버퍼를 사용하여 샘플의 부피를 120ml로 늘리고 얼음 친화성 정제를 위해 즉시 lysade를 사용하여 얼음 결합 활성의 손실을 방지합니다.

얼음 손가락을 섭씨 영하 0.5도까지 냉각한 후 차가운 증류수가 담긴 50ml 튜브에 담급니다. 얼음 핵 형성을 촉진하고 손가락에 얇은 얼음 층이 형성되도록 얼음 조각을 몇 개 추가합니다. 이 프로세스는 일반적으로 20분에서 30분 정도 걸립니다.

작은 자기 교반 막대가 들어 있는 150ml 유리 비커에 샘플을 넣고 자기 교반기 상단의 폴리스티렌 용기에 넣습니다. 얼음 손가락이 중앙에 있고 액체 샘플의 절반 이상 내려져 있는지 확인하십시오. 그런 다음 용기를 밀봉하십시오.

프로그램을 약 2일 동안 실행하며 24시간마다 확인합니다. 샘플의 50%가 얼면 프로그램을 중지합니다. IBP를 얼음 반구에 통합하면 얼음 에칭이 발생합니다.

얼음 반구를 제거하려면 프로브를 섭씨 4도로 예열하십시오. 그런 다음 증류수로 반구를 헹구어 결합되지 않은 단백질을 제거하고 섭씨 4도에서 해동합니다. 얼음 반구에 여전히 색소가 포함되어 있거나 샘플 정제를 증가시키려면 정제 단계를 2-3회 반복합니다.

여기에 표시된 것은 IBP가 결핍된 완충 방제군에서 수집된 추출물과 IBP를 포함하지 않는 야생형 애기장대 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 추출한 추출물입니다. 18시간 후에는 완충액 대조군과 A.thaliana 추출물이 얼음 결정 성장을 제한할 수 없습니다. 대조적으로, 저온 적응된 Lolium perenne에서 IBP를 발현하는 형질전환 A.thaliana 추출물에서 볼 수 있는 작은 얼음 결정은 얼음 결정 성장을 실질적으로 제한합니다.

첫 번째 정제 후 반구 표면의 높은 수준의 얼음 에칭은 IBP가 얼음에 흡착되어 얼음 결정의 성장을 변형했음을 나타냅니다. 추가적인 용질, 색소 및 오염 단백질을 제거하기 위해 두 번째 얼음 친화도를 사용하여 더 깨끗한 얼음 반구를 만들었습니다. 이 절차에 따라 얼음 결합 단백질을 추가로 특성화하기 위해 나노리터 삼투압계를 사용하여 얼음 형성 및 열 히스테리시스를 평가할 수 있습니다.

또한 펩타이드 염기서열을 식별하기 위해 질량 분석기를 위해 분리된 분획을 보낼 수 있습니다.