Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

본 실험의 전반적인 목적은 마우스 타모キシ펜 유도 운명 지도 작성 시스템(tamoxifen induced fate mapping system)과 유세포 분석법을 사용하여 생체 내 난황낭 조혈 전구세포 및 그 후손 세포들의 특성을 분석하는 것입니다. 이는 조혈 줄기세포와 구별되는 조혈 전구세포의 발달 및 분화와 관련된 면역학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제한된 시간 범위 내에서 표지된 조혈 전구세포와 상주 대식세포와 같은 그 후손 세포들을 발달 단계 및 성체 시기에 걸쳐 모니터링할 수 있다는 점입니다.

일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 배아 조직을 위한 세포 처리량과 동시에 처리해야 하는 시료의 많은 양으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 실험을 시작하려면, 먼저 절제한 마우스 자궁각을 약 30 milliliters의 ice cold PBS가 채워진 10 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 그 직후, 자궁각의 경부 쪽 자궁 근육층을 잡고 미세 가위를 근육층과 탈락막 조직 사이에 밀어 넣어 배아를 분리합니다.

그 다음 미세 핀셋을 사용하여 라이헬트 막(Reichert's membrane)과 태반을 제거합니다. 난황낭을 조심스럽게 박리하여 0.5 milliliters의 소화액이 채워진 24-well 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 제대 혈관과 정맥관 혈관을 절단한 후, 배아를 2 milliliters의 10 millimolar 얼음처럼 차가운 EDTA가 채워진 12-well 조직 배양 플레이트로 즉시 옮깁니다.

날카로운 미세 가위로 배아의 머리를 제거한 후, 몸통과 머리를 얼음 위에서 10~15분 동안 배양합니다. 그 다음 배아를 꺼내어 혈액이 포함된 EDTA를 수집합니다. 이어서 배아를 둘러싸고 있는 양막을 제거합니다. 마지막으로 배아에서 뒷다리와 이물질이 섞인 사지를 제거합니다.

미세 핀셋을 사용하여 흉강을 엽니다. 그런 다음 심장의 앞부분을 잡고, 다른 핀셋으로 체내 장기들을 분리하면서 조직을 부드럽게 당깁니다. 해부 현미경 하에서 태아 간을 심장 및 장에서 분리합니다.

그런 다음 장기를 0.5 milliliters의 소화액이 채워진 24 well plate로 옮깁니다. 심혈관계와의 해부학적 연결은 태아 간 식별에 매우 중요합니다. 태아 간은 여전히 이 발달 단계에 있으며, 배아가 어릴수록 박리가 더 어려울 수 있습니다.

일차 세포 현탁액을 준비하려면, 수집한 장기를 소화 용액에 넣고 37 °C에서 30분 동안 배양하십시오. 1 mL의 FACS 버퍼가 채워진 6-웰 조직 배양 플레이트의 한 웰 위에 설치된 10 µm 스트레이너에 효소 용액에 담긴 조직을 넣으십시오. 2 mm 시린지의 검은색 고무 피스톤을 사용하여 조직을 부드럽게 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻도록 분리하십시오.

그런 다음, 파스퇴르 피펫으로 세포 현탁액을 흡입하여 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 4 degrees Celsius에서 320 ×g로 7분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다.

다음으로, 신선한 Fc 블로킹 버퍼를 준비하고 펠릿을 60 µL로 재현탁합니다. 그런 다음, 단일 세포 현탁액 50 µL를 96-well 라운드 바텀 플레이트의 웰로 옮깁니다. 플레이트를 얼음 위에서 최소 15분 동안 배양합니다.

다음으로, 서로 다른 조직에서 유래된 샘플 풀을 얻기 위해 현탁액의 나머지 10 µL를 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브로 옮깁니다. 각 형광색소에 대한 FMO 대조군용 풀 50 µL를 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 항원 표면 염색을 진행하기 위해, 6종의 형광색소 항체 세트를 사용하여 항체 용액과 FACS 버퍼를 준비합니다.

그런 다음 FMO 대조군 염색에 사용할 6가지 항체 용액과 FACS 버퍼를 준비합니다. 이후 96-웰 멀티 플레이트에 담긴 샘플에 항체 용액 50 µL를 각각 첨가합니다. 부드럽게 두 번 파이펫팅하여 샘플을 혼합한 다음, 플레이트를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

96웰 플레이트를 4°C에서 320 ×g로 7분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거합니다. 200 µL의 FACS 버퍼로 세포를 세척하고 플레이트를 한 번 더 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 상청액을 제거할 때 특별히 주의해야 합니다.

세포가 떨어지는 것을 방지하기 위해 손목을 한 번에 빠르게 움직여 96-웰 플레이트를 뒤집어야 합니다. 마지막으로, 70 µm 스트레이너를 사용하여 조직 및 대조군 샘플을 6 mm 폴리스티렌 튜브에 여과합니다. 이제 유세포 분석을 수행할 수 있습니다.

살아있는 비적혈구 단일 세포 집단에서 전구세포 마커 KIT와 조혈 세포 마커 CD45의 발현을 분석하였습니다. 표적 집단 내에서 KIT 양성 CD45 음성, KIT 양성 CD45 low, 그리고 KIT 음성 CD45 양성의 세 가지 서로 다른 세포 하위 집단이 구별되었습니다.

난황낭 kit 양성 전구세포 중에서, CD45 음성 및 CD45 low 세포 집단 모두 황색 형광 단백질(YFP)을 발현하는 AA4.1 양성 세포를 포함하고 있었으며, 이는 미성숙 KIT 양성 전구세포가 CD45 발현 여부와 상관없이 AA4.1을 먼저 발현함을 나타냅니다. 간과 뇌에서 발견된 AA4.1 양성, YFP 양성 세포는 KIT 양성 CD45 low 전구세포 집단에서만 발견되었으며, 이는 난황낭 전구세포에서 유래하여 순환하는 전구세포일 가능성이 가장 높습니다. 대식세포는 kit 음성 CD45 양성 집단에서 발견되었으며, F480 bright CD11 B 양성 세포로 식별되었습니다.

난황낭, 간 및 뇌의 대식세포는 단 한 번의 4-hydroxy tamoxifen 투여로 효율적으로 표지되었으며, 이는 이들의 ENP 기원을 나타낼 수 있습니다. 숙달되면, 세포 분리 및 염색 과정은 적절히 수행될 경우 3~4시간 이내에 완료될 수 있습니다. 이 실험 절차를 시도할 때, 샘플을 수집하는 즉시 항상 얼음 위에 보관해야 함을 기억하는 것이 중요합니다.

신선한 FACS 버퍼는 매일 조제하여 필터링해야 합니다. 이 절차 이후, Rosa MTMG 또는 Rosa confetti 라인과 같은 다른 mash 리포터 또는 flux 균주를 사용하여 표지된 세포의 역분화 및 원형(proto) 단계 잠재력에 관한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다.