Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

이 실험의 전반적인 목표는 마우스 타목시펜 유도 운명 매핑 시스템 및 유세포 분석을 사용하여 생체 내에서 난황낭 조혈 전구 세포와 그 자손을 특성화하는 것입니다. 이는 조혈 줄기 세포와 구별되는 조혈 전구 세포의 발달 및 분화에 관한 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제한된 시간 창 내에 표지된 조혈 전구 세포와 상주 대식세포와 같은 자손을 발달 및 성인기 동안 모니터링할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 배아 조직을 위한 세포의 거래와 동시에 처리된 샘플의 양이 많기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 실험을 시작하기 위해 먼저 해부된 쥐의 자궁 뿔을 약 30밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 10mm 페트리 접시에 옮깁니다. 그 직후, 뿔의 경추 끝에 있는 자궁 근육층을 잡고 근육층과 결정 조직 사이에 가는 가위를 밀어 넣어 배아를 방출합니다.

그런 다음 미세한 집게로 Reichert의 막을 제거하고 태반을 제거합니다. 난황낭을 부드럽게 해부하여 0.5ml의 소화 용액으로 채워진 24-용접 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 배꼽 혈관과 유리체 혈관을 절단한 후 배아를 2밀리리터의 10밀리몰 얼음 냉온 EDTA로 채워진 12-용접 조직 배양 플레이트로 즉시 이동합니다.

날카롭고 가는 가위로 배아에서 머리를 제거한 후 얼음 위에서 몸통과 머리를 10-15분 동안 배양한 후 배아를 제거하고 혈액이 포함된 EDTA를 채취합니다. 다음으로, 배아를 둘러싼 양막을 제거합니다. 그런 다음 배아에서 뒷다리와 외국 팔다리를 제거합니다.

한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 흉부를 엽니다. 그런 다음 심장의 앞쪽을 잡고 조직을 부드럽게 당기면서 두 번째 집게로 몸에서 내부 장기를 풀어줍니다. 해부 현미경으로 태아의 간을 심장 및 장에서 분리합니다.

그리고 장기를 0.5 밀리리터의 소화 용액으로 채워진 24 웰 플레이트로 옮깁니다. 심혈관계와의 해부학적 연결은 태아의 간 식별에 매우 중요합니다. 태아의 간은 아직 이 발달 단계에 있으며 배아가 어릴수록 해부가 더 어려울 수 있습니다.

일차 세포 현탁액을 준비하려면 수집된 장기를 섭씨 37도의 소화 용액에서 30분 동안 배양합니다. 효소 용액의 조직을 10ml의 FACS 완충액으로 채워진 6개의 용접 조직 배양 플레이트의 한 용접 위에 설치된 10마이크로미터 스트레이너에 로드합니다. 2mm sysringe의 검은색 고무 피스톤을 사용하여 부드럽게 으깨서 조직을 해리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

그런 다음 파스퇴르 피펫으로 세포 현탁액을 흡인하고 15ml 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 섭씨 4도에서 320배 G로 7분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡인하고 버립니다.

다음으로, 새로운 Fc 차단 버퍼를 준비하고 펠릿을 60마이크로리터에 재현탁합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 단일 셀 현탁액을 96웰 원형 바닥 플레이트의 웰로 옮깁니다. 얼음 위에서 최소 15분 동안 접시를 배양합니다.

다음으로, 나머지 10마이크로리터의 현탁액을 5밀리리터 폴리스티렌 FACS 튜브로 옮겨 다른 조직에서 파생된 샘플 풀을 얻습니다. 각 형광 색소에 대한 FMO 제어를 위한 풀의 50마이크로리터를 96개의 멀티 웰 플레이트로 이동합니다. 항원 표면 염색을 진행하려면 6개의 플루로크롬 항체 세트를 사용하여 항체 용액과 FACS 완충액을 준비합니다.

그런 다음 FMO 대조군 염색에 사용되는 6개의 항체 용액과 FACS 완충액을 준비합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 항체 용액을 96 멀티 웰 플레이트의 샘플에 첨가합니다. 부드러운 이중 피펫팅으로 샘플을 혼합한 다음 얼음 위에서 플레이트를 30분 동안 배양합니다.

96 멀티 웰 플레이트를 섭씨 4도에서 320배 G로 7분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 200마이크로리터의 FACS 버퍼로 셀을 세척하고 플레이트를 한 번 더 돌립니다. 플레이트 반전으로 상등액을 제거할 때는 특별한 주의를 기울여야 합니다.

96 멀티웰 플레이트는 셀이 느슨해지지 않도록 날카로운 손목 동작으로 한 번 뒤집어야 합니다. 마지막으로 70 마이크로 스트레이너를 사용하여 조직을 여과하고 샘플을 6mm 폴리스티렌 튜브에 넣습니다. 이제 유세포 분석을 수행할 수 있습니다.

살아있는 비적혈구 세포성 낭성 단일 세포의 집단을 전구 마커 키트 및 조혈 세포 마커 CD45의 발현에 대해 분석했습니다. 표적 집단 내에서 3개의 서로 다른 세포 하위 집단이 구별되었습니다. KIT 양성 CD45 음성, KIT 양성 CD45 낮음 및 KIT 음성 CD45 양성.

난황낭 키트 양성 전구세포 중 CD45 음성 및 CD45 저세포 집단 모두 노란색 형광 단백질 또는 YFP를 발현하는 AA4.1 양성 세포를 포함하고 있으며, 이는 미성숙 KIT 양성 전구세포가 CD45 발현에 관계없이 AA4.1을 먼저 발현함을 나타냅니다. 간과 뇌의 AA4.1 양성, YFP 양성 세포는 KIT 양성 CD45 낮은 전구세포 집단에서만 발견되었으며 난황낭 전구세포에서 유래한 순환 전구세포와 가장 일치할 가능성이 높습니다. 대식세포는 키트 음성 CD45 양성 집단에서 발견되었으며 F480 밝은 CD11 B 양성 세포로 확인되었습니다.

난황낭, 간 및 뇌에 있는 대식세포는 ENP 기원을 나타낼 수 있는 단일 4-하이드록시 타목시펜 투여에 의해 효율적으로 표지되었습니다. 일단 숙달되면 세포 분리 및 염색 절차를 적절하게 수행할 경우 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플을 채취하는 즉시 항상 얼음 위에 보관해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

새로운 FACS 버퍼는 매일 준비하고 여과해야 합니다. 이 절차에 따라 Rosa MTMG 또는 Rosa 색종이 조각 라인과 같은 다른 매시 리포터 또는 플럭스 균주를 사용하여 사후 표지된 세포의 비분화 및 프로토 위상 전위에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.