Name: Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 마우스 태아 적혈구 전구 세포를 플로우 사이토메트리와 타목시펜 유전자 운명 추적 시스템으로 동정하는 방법입니다. 이 기술은 조직 거주 대식세포의 발달 과정을 연구하는 데 필수적인 프레임워크를 제공합니다.

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저자는 Frederic Geissmann 교수와 Christian Schulz 교수에게 통찰력있는 토론에 감사드립니다. Hannah Garner 박사는 Xavier Montagutelli 박사와 Jean Jaubert 박사와 파스퇴르 인스 트루먼 트의 동물 병원 직원을 대상으로 비료를 읽었습니다. Amgen Scholar의 Pascal Dardenne과 Vytaute Boreikaite는 기술 지원을 담당했습니다. EGP 연구소의 연구는 파스 티르 인스티튜트 (Institut Pasteur), CNRS, Cercle FSER (FRM, Institut Pasteur 및 REVIVE 컨소시엄의 시작 패키지)에서 지원됩니다 .LI는 REVIVE 컨소시엄의 PhD 펠로우쉽에 의해 지원됩니다.

동물 시험은 파스퇴르 연구소 (Institut Pasteur)의 승인 된 기관 동물 보호 및 사용위원회 (CETEA)에 따라 수행되었습니다. 1. Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP 태아의 Utero Pulse Labeling <ol><li> 4- 하이드 록시 타목시펜 (OH-TAM, 50 mg / mL)의 원액을 준비하십시오. <ol><li> 기화기 아래에서 25 mg 바이알의 OH-TAM을 열고 250 μL 에탄올 (100 %)을 첨가하십시오. </li><li> OH - TAM 솔루션을 10 분 최대 속도로 잘린 팁과 소용돌이와 2 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송하십시오. </li><li> sonication 욕조에서 30 분 Sonicate. </li><li> fumehood에서 PEG-35 피마자 기름 250 μL를 첨가하여 50 mg / mL 저장 용액을 얻는다. 주 : PEG-35 피마 자유는 소수성 분자를 결합하고 수용성 용매에 용해시키는 양친 매성 성질을 가진 용매이다. </li><li> 약 5 분 동안 와동최대 속도로 초음파 분쇄기에서 30 분간 초음파 처리한다. </li><li> 분취 량 튜브 당 90 μL (4.5 mg) (주사 1 회분). </li><li> 일주 4 ° C에서 또는 장기 -20 ° C에서 보관 이전 13 설명했다. </li></ol></li><li> 프로게스테론 (10mg / mL)의 원액을 준비하고, <ol><li> fumehood에서 10 mg / 100 μL 현탁액을 제조하기 위해 프로게스테론 25 mg에 100 % 에탄올 250 μL를 첨가하십시오. 부드럽게 소용돌이 치게하십시오. </li><li> 2250 μL의 오토 클레이브 해바라기 오일을 첨가하여 10 mg / ml 프로제스테론 용액을 만듭니다. </li><li> 4 ℃에서 최대 속도, 분액 및 저장시 약 5 분 동안 와동. 솔루션은 저장시 명확합니다. </li></ol></li><li> 타목시펜 투여 참고 : 배아 발달 날짜는 배아 일 (E) 0.5로 간주됩니다. E8.5에서 단일 주사로 재조합이 유도된다.임신 한 Csf1r MeriCreMer 여성 12 . tamoxifen 투여 후 유산 율을 줄이기 위해 OH-TAM에 프로게스테론 1g 당 37.5㎍을 보충하십시오. 오후 1시에 주사하십시오 (아침에 관찰되는 질 플러그에 대해). <ol><li> 주사 아침에 10 분 동안 (또는 완전히 재현 될 때까지) OH-TAM 용액의 분량을 초음파 처리하십시오. </li><li> fumehood 하에서 360 μL NaCl 0.9 %를 첨가하여 10 mg / mL OH-TAM 용액과 vortex를 얻습니다. 용액이 깨끗 해지고 완전히 재현 될 때까지 초음파 처리하십시오 (최소 30 분). </li><li> 프로게스테론을 실온으로 예열합니다. </li><li> Microcentrifuge tube에 OH-TAM 450 μL와 프로제스테론 225 μL를 섞는다. 와동. </li><li> 적어도 10 분간 sonicate하고 25G 바늘로 1 ML 주사기에로드합니다. </li><li> 동물 시설에서 임신 한 여성의 몸무게를 측정하십시오 ( Csf1r MeriCreMer 암컷은 근친 교잡 된 FVB 유전 적 배경에 있고 전형적으로 체중이 다릅니다).ko 25 및 33 g). </li><li> 계산 된 볼륨을 천천히 마우스에 주입하여 복강 내 주사를 수행하십시오. 바늘을 빼낸 후 천천히 찔린 상처를 누르고 복부를 마사지하여 OH-TAM을 분배하십시오. 참고 : OH-TAM 주입량은 75mg / kg이고 프로제스테론 투여 량은 37.5mg / kg입니다. 표 1 은 임산부에게 주입 할 용적을 제공합니다. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 마우스 무게 (g) </td><td> 믹스에서 주입 할 총 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 25 명 </td><td> 281 </td></tr><tr><td> 26 세 </td><td> 292 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 303 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 315 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 326 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 338 </td></tr><tr><td> 31 </td><td> 348 </td></tr><tr><td> 32 </td><td> 360 </td> &lt;/ tr&gt; <tr><td> 33 </td><td> 371 </td></tr><tr><td> 34 </td><td> 382 </td></tr><tr><td> 35 세 </td><td> 394 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 4-OH- 타목시펜 (OH-TAM)의 주입량. 프로게스테론 1 g 당 37.5 μg을 첨가 한 OH-TAM 1 g (체중) 당 75 μg의 E8.5에서의 단일 주사에 필요한 용량. 2. Yolk Sac (YS)와 태아 간 (FL)의 절개 참고 : 장기간 배양에 사용하지 않으면 배아를 조작 할 때 엄격한 무균 기술이 필요하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 작업 영역은 깨끗해야하며 흡수성 종이 아래에 호일로 덮여 있어야합니다. <ol><li> 빙냉 인산염 완충 식염수 (PBS)와 소화 혼합 (1mg / ML collagenase D, 100U / mL Deoxyribonuclease I (DNase I) 및 3 % 태아 소 혈청 함유 PBS)을 준비하십시오. </li><li> 임산부를 cer에 의해 희생한다.요구되는 임신일 ( 예컨대, 배아 단계 E10.5)에서의 전위. </li><li> 생식기 바로 위의 피부를 꼬집어 가위로 정중선에 작은 절개를하십시오. 모피없이 몸 벽을 완전히 드러내 기 위해 머리쪽으로 피부를 당깁니다. 복부 근육을 잘라 내 조직을 노출시키고 두 자궁 경적을 노출시키기 위해 창자를 밀어냅니다. </li><li> 중간 크기의 둔기 집게로 난소에 붙어있는 지방 패드를 잡고 부드럽게 자궁을 당깁니다. 자궁 경부의 자궁 경부 수준에서 자르고 복막강에서 뿔을 들어 올리십시오. 지방 패드를 제거하여 자궁 뿔을 완전히 풀어 각면의 난소에서 뿔을 자릅니다. </li><li> 10mm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS에 뿔을 넣으십시오. 신속하게 한쪽 말단 (자궁 경부)에서 자궁 근층을 잡고 근육 층과 탈락 조직 사이의 미세한 가위를 슬라이드하여 주변의 탈락 조직으로 태아를 놓습니다. 참고 : 근육은 빠르게 afte 계약을하는 경향이 있습니다.따라서 추출은 가능한 한 빨리해야합니다. </li><li> Reichert의 멤브레인과 태반을 차단하기 위해 한 쌍의 미세 포셉을 사용하십시오. </li><li> 부드럽게 노른 자루를 꺼내 소화 혼합 0.5 ML와 24 잘 조직 문화 플레이트에 놓으십시오. 참고 :이 단계에서 배아 혈액을 수집 할 수 있습니다. <ol><li> 배꼽과 vitelline 혈관을 절단 직후, 10 MM 얼음 - 차가운 ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA)을 포함하는 12 잘 조직 배양 접시에 배아를 전송하십시오. 날카로운 가위를 사용하여 배아를 처치하고 가능한 한 조직을 팽창시키는 것을 제한하십시오. 10-15 분 동안 얼음에서 품어 혈액과 EDTA를 수집합니다. </li></ol></li><li> 배아 주변의 양막을 제거하십시오. </li><li> 단계 &lt;E11.5의 경우, 배아의 더 나은 병기와 더 나은 시간 분해능 (각 체절 쌍이 ~ 1 시간 30 분 이내에 발달 함)을위한 체절 쌍 수를 세십시오. </li><li> 배아 머리를 잘라내 라.ing 겸자 또는 좋은 가위. 0.5 ML 소화 믹스와 24 잘 접시에 머리를 전송하십시오. 참고 : 나중에 단계에서 신경 외배엽과 뇌는 유세 세포 분석을 위해 더 해부됩니다; 조심스럽게 주변 혈관 신경총을 제거하십시오. </li><li> 뒷다리 위에 배아를 잘라 앞다리를 제거하십시오. </li><li> 간을 분리하려면, 좋은 포셉 한 켤레를 사용하여 흉부를 엽니 다. 앞쪽으로 심장을 꼬집고 두 번째 집게를 사용하여 몸에서 장기를 제거하면서 천천히 당깁니다. <ol><li> 조심스럽게 태아의 간을 심장과 내장에서 분리하십시오. 태아 간을 0.5 ML 소화 믹스와 24 잘 접시에 전송하십시오. 해부 현미경으로 전송을 조심스럽게 모니터링하십시오. </li></ol></li><li> 폴리 메라 이제 연쇄 반응 분석 (PCR)에 의해 genotyping에 대한 꼬리 부분 (또는 다른 배아 부분)을 수집합니다. 참고 : 다른 조직 및 기관은 유세포 분석을 사용하여 유사한 분석을 위해 E10.5 배아에서 수확 할 수 있습니다. 블러드, 헤드 스키n, 대동맥 - 생식기 - 중뇌 골질 영역 (AGM), 심장 및 신경 외배엽은 E10.5에서 수집 될 수있다. 나중 단계에서 폐, 신장, 비장 및 췌장을 수집 할 수 있습니다. 다른 발달 단계에서 AGM의 해부에 대한 자세한 설명은 이전에 설명되어 있습니다 14 . </li></ol> 3. 유동 세포 계측법을위한 배아 조직의 처리 <ol><li> 37 ° C에서 30 분 동안 (소화 믹스에 배치) 장기를 품어. </li><li> FACS 버퍼 (1x PBS에 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 2mM EDTA) 6 ML로 가득 6 잘 조직 배양 접시에 배치 100 μm의 여과기에 조직과 효소 솔루션을 전송합니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 2mL 주사기의 검은 고무 피스톤으로 부드럽게 매시하여 기계적으로 해리합니다. 참고 : 이제부터는 모든 단계를 4 ° C에서 수행해야합니다. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 세포 현탁액을 수집하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 스파이4 ℃ 320 xg에서 7 분간. 흡인으로 상층 액을 버린다. </li><li> 60 μL Fc 차단 버퍼 (FACS 버퍼에 1/50 희석 CD16 / CD32 차단 항체)에 펠렛을 Resuspend. <ol><li> 둥근 바닥 96 멀티 우물 판에서 우물 당 단일 세포 현탁액 50 μL를 전송합니다. 얼음 위에서 적어도 15 분 동안 품어 낸다. 참고 : 염색법은 적은 수의 시료를 처리 할 때 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브에서도 수행 할 수 있습니다. </li><li> 나머지 10 μL를 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브에 옮겨 각 조직에서 시료 풀을 얻습니다. 이 풀은 대조군 ( 즉, 염색되지 않은 샘플 및 각 형광 색소에 대한 형광 마이너스 (FMO) 컨트롤)로 사용됩니다. 96 멀티 웰 플레이트에 각 형광 마이너스 1 (FMO) 컨트롤 (형광색 당 하나)에 대한 풀 50 μL를 전송합니다. 참고 : 각 FMO 컨트롤에는 항체 패널의 모든 형광 색 결합 항체가 포함되어 있지만측정되고있다. FMO는 게이트 경계를 식별하고 다중 색상 패널에서 스펙트럼 겹침을 제어하는 ​​데 사용됩니다. 서로 다른 조직 사이의 백그라운드 및 자기 형광의 변화를 정확하게 해결하려면 각 조직의 샘플 풀에서 이러한 컨트롤을 준비하는 것이 중요합니다. YFP 발현에 대한 적절한 컨트롤은 Cre 유전자 음성 배아의 샘플로 PCR genotyping에 의해 확인됩니다. </li></ol></li></ol> 표면 항원 염색 <ol><li> FACS 버퍼 (표 2)에서 항체 믹스를 준비합니다. 시료 당 50 μL의 항체 혼합물을 준비하십시오. <ol><li> 다음과 같은 형광 결합 항체를 사용하십시오 : 항 -CD45.2 (클론 104); 항 -CD11b (클론 M1 / ​​70); 항 -F4 / 80 (클론 BM8); 항 -AA4.1 (클론 AA4.1); 항 -Kit (클론 2B8); 및 항 -Ter119 (클론 Ter119)를 포함한다. </li><li> FACS 버퍼에서 FMO 컨트롤에 대한 6 가지 항체 믹스를 준비합니다. 대조 샘플 당 50 μL의 항체 혼합물을 준비하십시오. 아니TE : 항체 혼합물의 항체 희석은 물질 표에 표시된 최종 농도보다 2 배 농축되어 있습니다. 6 개의 형광색 결합 항체가있는 패널의 경우 6 개의 FMO 컨트롤이 준비됩니다. 표 2 는 하나의 튜브에 대한 항체 믹스 및 FMO 컨트롤의 구성을 제공합니다. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="7"> 항체의 부피 (μL) (최종 부피 50 μL) </td></tr><tr><td> 항독소 </td><td> 클론 </td><td> 항체 믹스 </td><td> FMO CD45.2 </td><td> FMO CD11b </td><td> FMO F4 / 80 </td><td> FMO AA4.1 </td><td> FMO 키트 </td><td> FMO Ter119 </td></tr><tr><td> 항 -CD45.2 </td><td> 104 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 항 -CD11b </td><td> M1 / 70 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 항 -F4 / 80 </td><td> BM8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 항 -AA4.1 </td><td> AA4.1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 안티 - 키트 </td><td> 2B8 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 안티 Ter119 </td><td> Ter119 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> FACS 완충액 </td><td> 45.5 </td><td> 46.5 </td><td> 46 </td><td> 46.5 </td><td> 46.5 </td><td> 46 </td><td> 46 </td></tr></tbody></table>표 2 : 염색 및 Fluorescent -in- One (FMO) 컨트롤에 사용 된 항체의 부피. 50 μL의 최종 부피에 필요한 항체의 부피 (μL). <ol start="2"><li> 96 - 멀티 웰 플레이트 (얼룩 동안 최종 볼륨 100 μL입니다)에있는 샘플에 항체 믹스의 50 μL를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 두 번 피펫과 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 96 - 멀티 웰 플레이트를 4 분 320 x g에서 7 분간 회전시키고 상등액을 버린다. FACS 버퍼 200 μL에 Resuspend. </li><li> 150 μL FACS 버퍼로 두 번 세척 절차 (단계 4.3)를 반복하십시오. </li><li> 샘플 및 컨트롤 (FMOs 및 unstained 풀 샘플) 70 μm의 여과기를 통해 5 ML 폴리스티렌 튜브로 필터링합니다. 획득 할 때까지 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 5. 유동 세포 계측법에 의한 EMPs 및 YS 유래 대 식세포의 동정 참고 :이 프로토콜은 4 레이저 흐름 cytometer 이퀄라이저를 사용하여 최적화되었습니다405 nm 보라색 레이저, 488 nm 청색 레이저, 562 nm 황색 레이저 및 638 nm 적색 레이저를 사용합니다. <ol><li> 제조사의 지시에 따라 결합 된 각 항체에 대한 보상 비드를 준비하십시오. 레이저 강도를 최적화하려면 염색되지 않은 샘플 및 보정 비드를 사용하십시오. </li><li> 게이트 경계를 확인하려면 각 항체에 대한 FMO (형광 마이너스 1) 컨트롤을 사용하십시오. </li><li> 죽은 세포를 제외하기 위해, 취득하기 전에 1 분 DAPI (1 MG / ML) 튜브 (스테인드 세포 현탁액 200 μL를 포함)에 1 μL를 추가합니다. 강력한 DAPI 신호와 전방 산란 매개 변수 (FSC)를 사용하여 죽은 세포와 잔해를 배제하십시오. 참고 : 수집하는 동안 플로우 cytometer의 소프트웨어를 사용하여 게이트를 그립니다. 보정 매트릭스 및 분석은 다른 상용 소프트웨어를 사용하여 샘플을 수집 한 후에 수행 할 수 있습니다. </li><li> 전방 및 측방 산란 (FSC 대 SSC)을 사용하여 총 사건에서 생존 세포 및 이중 배별을 수행하십시오. </li><li> 로그 - 스케일 축에서 형광 도트 플롯을 만들고 daughter gate를 끌어 와서 적혈구 (Ter119 + )를 제외하고 선조 세포 (Kit + )와 조혈 세포 (CD45 + Kit neg )를 확인합니다 ( 그림 1 참조). </li><li> YS ( 그림 2 ), 태아 간 ( 그림 3 ) 및 뇌 ( 그림 4 )의 서로 다른 확인 된 개체군 중 YFP의 표지 효율을 정량화하기 위해 형광 히스토그램을 만듭니다. </li></ol>

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<li>Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+Tissue-Resident+Macrophages+Except+Microglia+Are+Derived+from+Fetal+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells.</a> Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).</li>
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조혈 전구 세포의 다른 파동은 짧은 시간 내에 부분적으로 겹쳐서 발달 조혈의 각 파가 면역 세포에 기여하는 것을 기술적으로 매우 도전적으로 분석합니다. Tamoxifen-inducible Cre 시스템은 ex vivo 또는 in vitro 배양이나 이식을하지 않아도 일시적으로 유도 가능한 방식으로 특정 세포에 태그를 지정하고 배아 또는 성인에서 계통 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다. 타목시펜 - 유도 성 Cre 균주에서 박테리아 Cre 재조합 효소와 인간 에스트로겐 수용체 (CRE-ER)의 리간드 결합 도메인의 돌연변이 형태 사이에 또는 개선 된 단일 점 돌연변이 Cre와 2 개의 마우스 에스트로겐 수용체 사이에 융합 유전자가 생성된다 (Mer-iCre-Mer). Cre의 에스트로겐 수용체와의 융합은 Hsp90에 의한 Cre의 세포질 분리를 유도하여 핵 Cre- 매개 재조합을 방지한다. 타목시펜 (TAM)은 the- 간을 4- 하이드 ...

개발 중에는 골수 계통의 자손이 성인으로 남아있는 여러 가지 연속적인 조혈 전구 세포가 있습니다. 첫째, 단 독성 &quot;원시&quot;전구 세포는 E7.5-E8.25 사이의 마우스 난황낭 1 , 2 에서 출현하고 단핵구 중간체가없는 배아 대 식세포를 일으킨다. 원시 전구 세포로부터 유래 된 대 식세포가 성숙한 뇌에서 미 글로글 리아 (microglia)로 지속되는지는 적극적인 조사 대상으로 남아 있는지 여부. 둘째로, Erythro-myeloid Precursors (EMPs)는 E8.5에서 난황낭에서 발생하고, 혈류에 들어가서 배아를 식민시킨다. EMPs는 Runx1 의존 내피 - 조혈 전이 3 , 4 에서 난황낭 hemogenic endothelium에서 나온다. EMP는 난황낭 내에서 대 식세포로 분화 할 수 있지만 태아 간세포 (E) 9 5 에서 태아 간을 식민지화하고 differen적혈구, 거핵구, 대 식세포, 단구 과립구 및 비만 세포 6 . EMP로부터 유도 된 대 식세포는 발달 및 성인 조직에서 증식능을 나타낸다. 여부 EMP-파생 된 대 식세포는 거의가 분화 경로 7, 8에 대해 알려진대로 차별화의 단핵구 단계는 여전히 논란이 우회. 마지막으로, 조혈 줄기 세포 (HSC)는 대동맥 - 생식기 - 중뇌 골 소 구역에서 적절한 배아 내에서 E10.5로 출현하여 태아 간으로 이동한다. 장기 재 축적 용량을 가진 HSC는 E11 (42 체절 쌍 스테이지에서) 후에 만 ​​검출됩니다 9 . 그곳에서 E12.5와 확연히 구분되는 조혈이 골수로 이동하기 시작할 때까지 분화되어 출생 후 10 일 동안 혈액 세포 생산의 주요 부위가됩니다. SP면역 반응 및 표현형 마커의 공통점뿐만 아니라 출현시의 일시적 및 일시적 중첩은 지금까지 배아 조혈 전구 세포의 이러한 파동의 특정 기여를 구별하는 우리의 능력을 방해했다. EMP와 HSC 모두 Runx1 의존적 인 방식으로 생성되고 전사 인자 Myb와 성장 인자 수용체 Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor라고도 함)을 표현하는 반면, EMP는 HSC 는 생체 외 (in vitro) 와 생체 내 (in vivo) 모두 에서 림프 성 잠재력이 결여되어 있으며, 장기간 재생산 가능성이 없으며 계통 마커 Sca- 11 의 표면 발현이 부족합니다. 유전 적 운명지도 작성 모델은 세포 특이 적 및 시간별 방식으로 배아 선조를 표적으로 할 수 있으므로 대 식세포의 개체 발생을 특성화하는 데 필요합니다. 여기서 우리는 두 혈통을 구별하기 위해 실험실에서 사용 된 운명 매핑 프로토콜을 제시합니다대부분의 성인 조직에서 발견되는 대 식세포 : HSC 유래 침윤성 대 식세포 및 HSC 독립적 인 상주 대 식세포. 티슈 상주 식세포 Csf1r 12 사이토 카인 수용체를 발현 MYB 독립적 전구 세포로 역 추적 세 상보 운명 맵핑 전략을 사용하여 6-E8.5 E10.5에서 배아에 존재하고있다. 태아 조혈 모세포를 표지하지 않고 난황낭 조혈을 연구하기 위해 우리는 &#39;개선 된&#39;Cre recombinase와 2 개의 마우스 에스트로겐 수용체 (Mer-iCre-Mer)의 tamoxifen 유도 성 융합 단백질을 발현하는 형질 전환 균주 Csf1r MeriCreMer를 사용한다. Csf1r 프로모터. 따라서 Cre recombinase는 제한된 시간 동안 Csf1r 발현 세포에서 활성화 될 것이다. lox-STOP-lox 카세트 (Rosa26 LSL-eYFP )의 형광 단백질 하류의 형광 단백질을 포함하는 리포터 스트레인과 함께 사용하면,유도시 존재하는 세포뿐만 아니라 그들의 자손의 유전 적 표지. 난황낭 특이성 &quot;원시&quot;전구 세포 또는 태아 조혈 전구 세포를 표지하지 않고 활성 형태의 타목시펜, 4- 하이드 록시 타목시펜 (OH-TAM), EMP 및 대 식세포 표지의 E8.5에서의 투여. 따라서, 우리는 EMPs와 그들의 자손의 immunophenotype을 배아 발달 동안 특성화하고 노른자낭 유래 대식구가 성인 대 식세포에 기여하는지를 평가했다. 원시 전구 세포 유래 대 식세포가이 접근법을 사용하여 표지되는지 여부와 그들이 성인 대식 세포 풀에 기여할 수 있는지 여부를 특성화하기위한 추가 연구가 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>#5 직선 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>MC19/B Pascheff-Wolff 스프링 가위&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>8.5cm 스트레이트 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Kit-PE(클론 2B8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553355</td><td>FACs Buffer에서 1/200 희석</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7(클론 104)</td><td>Sony</td><td>1149120</td><td>FACs Buffer에서 1/100 희석</td></tr><tr><td>Anti-Mouse AA4.1-APC(CD93, 클론 AA4.1)</td><td>eBioscience</td><td>17-5892</td><td>FACs Buffer의 1/100 희석</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>560512</td> FACs Buffer Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8)의 <td>1/200 희석</td></tr> BD <tr><td></td><td>Pharmingen</td><td>123137</td><td>FACs Buffer의 1/100 희석</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>552850</td><td>FACs Buffer</td></tr><tr><td>의 1/200 희석안티-마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록, 클론 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fischer Scientific</td><td>12559069</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fischer Scientific</td><td>11570506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td>6웰 조직 배양 플레이트</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12웰 조직 배양 플레이트</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353224</td><td></td></tr><tr><td>24웰 조직 배양 플레이트</td><td>Fischer Scientific</td><td>11874235</td><td></td></tr><tr><td>96웰 U자형 바닥 조직 배양 플레이트 플레이트</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 주사기 Plastipak 2 mL&nbsp;</td><td>Dutscher Dominique</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>나일론 그리드 100 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>나일론 그리드 70 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 팔콘 튜브</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GP Millipore 여과 키트, 0.2 &mu; m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg</td><td>시그마</td><td>H7904-25MG</td><td>타목시펜 및 그 유도체를 준비하고 작업할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오</td></tr>. <tr><td>프로게스테론</td><td>Sigma</td><td>P3972</td><td>항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오</td></tr>. <tr><td>PEG-35 캐스터 오일 (Kolliphor/Cremophor EL)</td><td>Sigma</td><td>C5135</td><td></td></tr><tr><td>해바라기 오일</td><td>Sigma</td><td>S5007-250ML</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>24103-1L-R-D</td><td>항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 연기 아래에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 1 ML (물 속 1 MG/ML)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10116287</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 플로우 사이토미터</td><td>Beckman Coulter</td><td>B75408</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 일일 QC 형광구</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>B53230</td><td></td></tr><tr><td>VersaComp 항체 캡처 비드 키트 (2x5 mL)</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>B22804</td><td></td></tr><tr><td>FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J</td><td>잭슨 연구소</td><td>19098</td><td></td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>잭슨 연구소</td><td>6148</td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (erythromyeloid progenitors)와 그 자손의 동정

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

대 식세포는 면역 체계의 본능적 인 팔에서 유래 한 전문적인 식균입니다. 정상 상태에서, 정착 성 대 식세포는 성인 조직에서 발견되며, 감염 및 조직 손상의 전조선 파수꾼으로 작용합니다. 다른 면역 세포가 골수에 위치한 조혈 모 및 전구 세포 (HSPC)로부터 지속적으로 재생되는 동안, 상주 대 식세포로 알려진 대 식세포의 혈통은 골수 HSPC로부터의 입력없이 조직 내에서 자체 유지되는 것으로 나타났다. 이 혈통은 뇌에있는 미 글로리아 (microglia), 간에서의 쿠퍼 (Kupffer) 세포 및 표피에서의 랑게르한스 (Hangerhans) 세포에 의해 예시된다. 장 및 결장 고유 층은 HSPC- 독립적 인 상주 대 식세포가없는 유일한 성인 조직이다. 최근의 연구에 따르면 상주 대 식세포는 태아 조혈 모세포 (HSC)와는 별개로 존재하는 전구 세포로부터의 난황낭 조혈 (extra-embryonic yolk sac hematopoiesis)에 기원한다. 난황낭 중 명확한 조혈, eRYthromyeloid progenitors (EMP)는 적혈구 및 골수 양 세포, 특히 상주 대 식세포를 일으킨다. EMP는 난황낭 내에서만 E8.5와 E10.5 일 사이에 발생하며 순환이 연결되면 일찍 태아 간으로 이동하여 적어도 E16.5까지 팽창하고 분화한다. 이들의 자손에는 적혈구, 대 식세포, 호중구 및 비만 세포가 포함되지만 EMP에서 유도 된 대 식세포 만 조직에서 성충까지 지속됩니다. EMP 출현의 일시적인 성격과 HSC 세대와의 일시적인 중첩은 이러한 선조의 분석을 어렵게 만든다. 우리는 유세포 분석기 로 생체 내에서 EMP 및 EMP 유래 세포를 특성화하기 위해 대 식세포 사이토 카인 수용체 Csf1r 프로모터의 발현에 기초한 타목시펜 유도 성 운명 매핑 프로토콜을 확립했다.

유전 적 운명 매핑은 Rosa26-LSL-eYFP 리포터를 수컷과 교배 한 Csf1r-Mer-iCre-Mer 암컷으로 OH-TAM의 E8.5 투여에 의해 달성되었다. OH-TAM의 존재 하에서, 정지 카세트의 절제는 Csf1r을 발현하는 세포에서 YFP의 영구 발현을 유도한다 . 우리는 두 개의 조혈 조직, 즉 난황낭과 태아 간, 그리고 E10.5의 태아에서 조혈 모세포 이외의 조혈 조직, 즉 신경 외배엽을 채취했다. 단일 세포 현탁액은 효소 적 및 기계적 해리에 의해 얻어졌으며 샘플은 형광 결합 항체로 염색 한 후 유세포 분석에 의해 분석되었다. 죽은 세포와 이중 덩어리를 배제한 후, 단일 세포 현탁액을 분석했다 ( 그림 1 ). 모든 게이트는 Fluorescence Minus One (FMO) 컨트롤을 사용하여 정의되었습니다. 분석의 명확성을 향상시키기 위해 적혈구 배제 (Ter119 +</su...

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

본 실험의 전반적인 목적은 마우스 타모キシ펜 유도 운명 지도 작성 시스템(tamoxifen induced fate mapping system)과 유세포 분석법을 사용하여 생체 내 난황낭 조혈 전구세포 및 그 후손 세포들의 특성을 분석하는 것입니다. 이는 조혈 줄기세포와 구별되는 조혈 전구세포의 발달 및 분화와 관련된 면역학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제한된 시간 범위 내에서 표지된 조혈 전구세포와 상주 대식세포와 같은 그 후손 세포들을 발달 단계 및 성체 시기에 걸쳐 모니터링할 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 배아 조직을 위한 세포 처리량과 동시에 처리해야 하는 시료의 많은 양으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 실험을 시작하려면, 먼저 절제한 마우스 자궁각을 약 30 milliliters의 ice cold PBS가 채워진 10 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 그 직후, 자궁각의 경부 쪽 자궁 근육층을 잡고 미세 가위를 근육층과 탈락막 조직 사이에 밀어 넣어 배아를 분리합니다.그 다음 미세 핀셋을 사용하여 라이헬트 막(Reichert's membrane)과 태반을 제거합니다. 난황낭을 조심스럽게 박리하여 0.5 milliliters의 소화액이 채워진 24-well 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 제대 혈관과 정맥관 혈관을 절단한 후, 배아를 2 milliliters의 10 millimolar 얼음처럼 차가운 EDTA가 채워진 12-well 조직 배양 플레이트로 즉시 옮깁니다.날카로운 미세 가위로 배아의 머리를 제거한 후, 몸통과 머리를 얼음 위에서 10~15분 동안 배양합니다. 그 다음 배아를 꺼내어 혈액이 포함된 EDTA를 수집합니다. 이어서 배아를 둘러싸고 있는 양막을 제거합니다. 마지막으로 배아에서 뒷다리와 이물질이 섞인 사지를 제거합니다.미세 핀셋을 사용하여 흉강을 엽니다. 그런 다음 심장의 앞부분을 잡고, 다른 핀셋으로 체내 장기들을 분리하면서 조직을 부드럽게 당깁니다. 해부 현미경 하에서 태아 간을 심장 및 장에서 분리합니다.그런 다음 장기를 0.5 milliliters의 소화액이 채워진 24 well plate로 옮깁니다. 심혈관계와의 해부학적 연결은 태아 간 식별에 매우 중요합니다. 태아 간은 여전히 이 발달 단계에 있으며, 배아가 어릴수록 박리가 더 어려울 수 있습니다.일차 세포 현탁액을 준비하려면, 수집한 장기를 소화 용액에 넣고 37 °C에서 30분 동안 배양하십시오. 1 mL의 FACS 버퍼가 채워진 6-웰 조직 배양 플레이트의 한 웰 위에 설치된 10 µm 스트레이너에 효소 용액에 담긴 조직을 넣으십시오. 2 mm 시린지의 검은색 고무 피스톤을 사용하여 조직을 부드럽게 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻도록 분리하십시오.그런 다음, 파스퇴르 피펫으로 세포 현탁액을 흡입하여 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 4 degrees Celsius에서 320 ×g로 7분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다.다음으로, 신선한 Fc 블로킹 버퍼를 준비하고 펠릿을 60 µL로 재현탁합니다. 그런 다음, 단일 세포 현탁액 50 µL를 96-well 라운드 바텀 플레이트의 웰로 옮깁니다. 플레이트를 얼음 위에서 최소 15분 동안 배양합니다.다음으로, 서로 다른 조직에서 유래된 샘플 풀을 얻기 위해 현탁액의 나머지 10 µL를 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브로 옮깁니다. 각 형광색소에 대한 FMO 대조군용 풀 50 µL를 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 항원 표면 염색을 진행하기 위해, 6종의 형광색소 항체 세트를 사용하여 항체 용액과 FACS 버퍼를 준비합니다.그런 다음 FMO 대조군 염색에 사용할 6가지 항체 용액과 FACS 버퍼를 준비합니다. 이후 96-웰 멀티 플레이트에 담긴 샘플에 항체 용액 50 µL를 각각 첨가합니다. 부드럽게 두 번 파이펫팅하여 샘플을 혼합한 다음, 플레이트를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.96웰 플레이트를 4°C에서 320 ×g로 7분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거합니다. 200 µL의 FACS 버퍼로 세포를 세척하고 플레이트를 한 번 더 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 상청액을 제거할 때 특별히 주의해야 합니다.세포가 떨어지는 것을 방지하기 위해 손목을 한 번에 빠르게 움직여 96-웰 플레이트를 뒤집어야 합니다. 마지막으로, 70 µm 스트레이너를 사용하여 조직 및 대조군 샘플을 6 mm 폴리스티렌 튜브에 여과합니다. 이제 유세포 분석을 수행할 수 있습니다.살아있는 비적혈구 단일 세포 집단에서 전구세포 마커 KIT와 조혈 세포 마커 CD45의 발현을 분석하였습니다. 표적 집단 내에서 KIT 양성 CD45 음성, KIT 양성 CD45 low, 그리고 KIT 음성 CD45 양성의 세 가지 서로 다른 세포 하위 집단이 구별되었습니다.난황낭 kit 양성 전구세포 중에서, CD45 음성 및 CD45 low 세포 집단 모두 황색 형광 단백질(YFP)을 발현하는 AA4.1 양성 세포를 포함하고 있었으며, 이는 미성숙 KIT 양성 전구세포가 CD45 발현 여부와 상관없이 AA4.1을 먼저 발현함을 나타냅니다. 간과 뇌에서 발견된 AA4.1 양성, YFP 양성 세포는 KIT 양성 CD45 low 전구세포 집단에서만 발견되었으며, 이는 난황낭 전구세포에서 유래하여 순환하는 전구세포일 가능성이 가장 높습니다. 대식세포는 kit 음성 CD45 양성 집단에서 발견되었으며, F480 bright CD11 B 양성 세포로 식별되었습니다.난황낭, 간 및 뇌의 대식세포는 단 한 번의 4-hydroxy tamoxifen 투여로 효율적으로 표지되었으며, 이는 이들의 ENP 기원을 나타낼 수 있습니다. 숙달되면, 세포 분리 및 염색 과정은 적절히 수행될 경우 3~4시간 이내에 완료될 수 있습니다. 이 실험 절차를 시도할 때, 샘플을 수집하는 즉시 항상 얼음 위에 보관해야 함을 기억하는 것이 중요합니다.신선한 FACS 버퍼는 매일 조제하여 필터링해야 합니다. 이 절차 이후, Rosa MTMG 또는 Rosa confetti 라인과 같은 다른 mash 리포터 또는 flux 균주를 사용하여 표지된 세포의 역분화 및 원형(proto) 단계 잠재력에 관한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다.

identification-erythromyeloid-progenitors-their-progeny-mouse-embryo

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

이 의정서는 세포 계측법, 다중 분광 영상의 흐름에 의해 정색 적혈구 모세포를 탈핵 적혈구 모세포의 핵의 제거 프로세스의 시각화를 제공하는 인구를 식별하는 새로운 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

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흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

여기에서는 심장 및 근육 전구 세포와 그 미세환경의 생물학을 연구하기 위해 인두궁을 배양하는 프로토콜을 제시합니다.

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

배우세요 마우스 태아 적혈구 전구 세포를 플로우 사이토메트리와 타목시펜 유전자 운명 추적 시스템으로 동정하는 방법입니다. 이 기술은 조직 거주 대식세포의 발달 과정을 연구하는 데 필수적인 프레임워크를 제공합니다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

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