차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 1차 섬모 생물 발생 및 이동을 연구하기 위해 1차 신경 줄기 및 전구 세포에 대한 신경구 기반 배양 방법을 활용하는 것입니다. 이 방법은 섬모 생물 발생 및 섬모 분자를 1차 섬모로 이동하는 것과 같은 1차 섬모 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 1차 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포 및 뉴런.

이 기술의 주요 장점은 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포 및 뉴런의 1차 세포 기준을 사용하여 1차 섬모의 맥락에서 생물 발생 및 섬모 경로를 분석할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 신경 줄기 세포를 배양하는 것이 초보자에게 기술적으로 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 우리는 이 방법의 시연이 매우 중요한데, 측면 심실의 해부와 신경구 배양 및 원발성 섬모의 정량화와 같은 단계는 중요한 단계를 관찰함으로써 쉽게 배울 수 있기 때문입니다.

전체 마운트 해부 방법을 사용하여 성인 마우스에서 절개된 외측 심실의 심실 아래 영역부터 이 절차를 시작합니다. SVZ가 들어있는 조직을 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. PBS에 0.05%Trypsin-EDTA 500마이크로리터를 첨가하고 수조에서 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후 500마이크로리터의 정지 매체를 추가하고 1ml 팁을 사용하여 20-30회 부드럽게 피펫팅합니다. 파이펫팅 중 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 그런 다음 8분 동안 500배 G로 셀을 스핀다운합니다.

상층액을 버리고 PBS 1ml를 첨가하고 1ml 팁을 사용하여 5회 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 500배 G에서 8분 동안 원심분리기를 사용합니다. 그런 다음 1ml 팁을 사용하여 배지를 흡입하고 1ml의 기초 배지를 추가합니다.

세포를 계수한 후 하나의 SVZ에서 10cm 접시에 10ml의 NSC 배지를 넣고 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양합니다. 5일에서 7일 후에는 신경구를 관찰할 수 있습니다. 면역염색을 통해 부착된 신경구의 세포를 분석하려면 여러 신경구체를 포함하는 배지 1ml를 1.5ml 튜브에 옮기고 500배 G로 8분 동안 스핀다운합니다.

매체를 제거한 후 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 구를 고정합니다. 파라포름알데히드를 제거한 후 하룻밤 사이에 30%자당으로 구체를 배양합니다. 그런 다음 다시 원심 분리기를 사용합니다.

PBS로 세척하십시오. 그런 다음 이전과 같이 원심 분리 후 상층액을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 1ml 팁을 자른 피펫과 500마이크로리터의 OCT 용액을 신경구에 피펫으로 끼웁니다.

신경구를 포함하는 OCT 용액을 일회용 플라스틱 냉동 금형으로 옮깁니다. 그런 다음 드라이아이스에 곰팡이를 최소 15분 동안 얼립니다. 저온 유지 장치로 단면을 절단합니다.

신경구의 줄기세포를 시각화하기 위해 줄기세포 마커 Nestin에 대해 면역염색을 수행합니다. 신경구에서 원발성 섬모를 시각화하려면 ARL13B에 대한 면역염색을 수행합니다. Poly-L-Lysine 및 Laminin 코팅된 커버 슬립에 부착성 해리 신경 줄기 세포를 파종한 후 1-2일 후에 이 실험을 시작합니다.

실험용 우물의 매체를 기아 매체로 변경하고 제어 우물에서 새로운 NSC 배지로 변경합니다. 24시간 더 배양합니다. 다음날, PBS에 4%파라포름알데히드로 세포를 실온에서 15분 동안 고정합니다.

고정 후 PBS로 실온에서 5분씩 2회 세척합니다. 그런 다음 표준 프로토콜을 사용하여 면역형광을 수행합니다. 장착 솔루션으로 커버 슬립을 장착하십시오.

그런 다음 슬라이드 유리를 어두운 곳에서 실온에서 밤새 말리십시오. 다음 날, 복합 현미경에서 필요한 배율로 이미지를 획득합니다. 현미경 카메라와 대물렌즈는 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 제어해야 합니다.

0.5 - 0.8 미크론 간격으로 충분한 z-섹션을 취합니다. 부착 세포의 섬모 국소화에 대한 정량적 분석을 위해 DAPI 채널을 확인하여 융합 세포가 있는 3-8개의 연속된 필드를 선택합니다. 각 필드에서 이미지 스택을 획득합니다.

ImageJ를 사용하여 1차 섬모의 수를 정량화합니다. Plugins Analyze(플러그인 분석) 대화 상자를 열고 Cell Counter 도구를 선택하여 GPCR 양성 섬모가 있는 세포를 계산합니다. 계산 및 내보내기 목적으로 동일한 실험의 모든 이미지에 대해 유사한 이미지 강도 및 대비 매개변수를 사용합니다.

NSC 배지 또는 기아 배지에서 해리된 세포를 배양한 후 24시간 후에 세포를 고정하고 녹색으로 표시된 GPR161, 빨간색으로 표시된 ARL13B, 파란색으로 표시된 DNA에 대해 면역 염색했습니다. GPR161 양성 섬모는 왼쪽의 대조 세포에서, 오른쪽의 굶주린 세포에서 관찰됩니다. 이 확대 된 모습에서 볼 수 있듯이.

흰색 화살표와 화살촉은 각각 GPR161 양성 및 음성 섬모를 나타냅니다. 이 이미지는 ARL13B 양성 섬모 세포의 정량화를 보여줍니다. 정량화는 두 개의 시야에서 수행되며, 각 필드는 단일 실험의 두 가지 기술적 반복에서 수행됩니다.

ARL13B 양성 섬모 세포의 비율은 굶주림에 따라 증가합니다. 이 이미지는 대조군 및 기아 세포에서 ARL13B 양성 섬모에서 국소화되는 GPR161의 정량화를 보여줍니다. ARL13B 양성 섬모에서 국소화되는 GPR161의 비율도 굶주림 시 증가합니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라, 종양 발생에서 섬모의 역할과 같은 추가 질문에 답하기 위해 원발성 종양 유래 세포를 배양하는 또 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 1차 섬모 분야의 연구자들이 1차 신경권 기반 시스템에서 섬모 생물 발생 및 거래를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 신경권 기반 배양에서 파생된 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포 및 뉴런의 1차 섬모를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.