Name: 차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 신경줄기세포 및 전구세포에서 1차 섬모 생물학적 발생과 신호단백질 이동을 연구하는 Neurosphere 배양법. 이 기술은 신경발달 및 섬모 관련 질병 연구에 필수적인 기초를 제공합니다.

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S.M. 실험실에서의 연구는 CPRIT (R1220) 및 NIH (1R01GM113023-01)의 모집 보조금으로 지원됩니다.

성인 마우스 뇌에서 neurosphere를 1. 분리 <ol><li> 이소 플루 란의 과다 복용으로 (약 2 개월) 성인 마우스를 안락사. 마우스가 호흡을 중단하고 사망 직후 해부 것을 다시 확인. </li><li> 가위를 사용하여 두개골을 열 수있는 중간 선 절개를합니다. 뇌를 제거합니다. </li><li> 얼음에 10cm 접시에 차가운 PBS의 뇌를 놓습니다. 측뇌실 48에서 SVZ를 얻기 위해 전체 마운트 박리 방법을 따른다. </li><li> 1.5 ㎖의 튜브에 측뇌실 배치 PBS에 0.05 % 트립신 EDTA 500 μL를 추가하고, 수욕에서 37 ℃에서 15 분 동안 튜브를 배양한다. </li><li> 15 분 후, 정지 배지 500 μL를 추가 부드럽게 피펫 20 - 1 mL의 팁 30 회. 피펫 팅하는 동안 공기 방울을 형성하지 마십시오. 참고 :이 단계는 세포 생존에 중요합니다. </li><li> 8 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운. 상등액을 버리고 PBS 1 mL를 넣어 재현 탁의 t완만 한 ML 팁 배를 피펫 팅 그 세포. </li><li> 8 분 동안 500에서 스핀 다운 XG. 1 mL의 팁을 사용하여 상층 액을 제거하고 기본 배지 1 ㎖를 추가한다. </li><li> (선택) 세포 파편이 관찰되면 70 μm의 세포 여과기를 통해 셀을 통과한다. </li><li> 혈구와 세포의 수를 계산; 일반적으로, 약 30,000 - 60,000 세포 / SVZ를 얻을 수있다. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 NSC 배지 및 배양 10 ㎖와 10cm 접시에 한 SVZ에서 세포 접시. </li><li> 구체 (49) 사이의 융합을 피하기 위해 (선택), 5 % CO 2, 37 ℃에서 NSC 매체 문화 1.5 mL로 채워져있다 초저 결합 6- 웰 플레이트의 한 웰에 1,000 세포를 넣어. 주 5 ~ 7 일 후, neurosphere를 (그림 2A)을 관찰 할 수있다. 배양 기간은 마우스의 연령, 유전 적 배경과 다를 수 있습니다. </li><li> 문화를 유지하기 위해 3-4 일마다 NSC 매체의 2 ML을 추가합니다(기존 매체를 제거하지 마십시오). </li></ol> neurosphere를하고 Ciliogenesis 테스트의 차별화 용량 2. 분석 <ol><li> 분화 능력을 분석하는 분화 배지에서 부착 조건 neurosphere를 분석한다. </li><li> 오토 클레이브에 의해 또는 사용 전에 UV 노출을 12mm 원형 커버 슬립을 소독. 점착성 세포 배양 무균 조건 하에서 24 웰 플레이트의 웰에 멸균 12mm 원형 유리 커버를 넣어. </li><li> 코트 0.002 % 폴리 -L- 리신 (PLL) 500 μL와 10 초 동안 커버 유리. 용액을 흡인하고 10-15 분 동안 건조시킨다. </li><li> 라미닌 용액 (5 ㎍ / μL)의 500 μL를 추가합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 커버 유리를 인큐베이션. </li><li> 라미닌을 대기음 분화 배지 또는 NSC 매체 (미분화 대조군)의 500 μL를 추가한다. </li><li> 현미경으로 200 μL 팁 200 μm의 구형 - 분화 분석를 들어, 100을 선택하십시오. 더하다분화 배지 7-10 일 동안 24 웰 플레이트의 배양 웰에 각각 neurosphere를 5-10. </li><li> 미분화 neurosphere를 분석 NSC 매체 1-2 일 동안 24 웰 플레이트의 각 웰 배양 5-10 neurosphere를 추가한다. 첨부 neurosphere를 확산 및 단층 (그림 2B)로 성장한다. </li><li> 신중 배지를 제거한 후, RT에서 15 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하고 RT에서 5 분 동안 PBS로 2 회 세척 하였다. 플레이트 1-2 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 참고 : (신경 줄기 / 전구 세포 마커) 네 스틴에 대한 면역 염색을 수행 NSC 매체에서 신경 줄기 / 전구 세포 분화 배지에서 분화 된 세포를 시각화하기 위해, β-tubulin의 III (TUJ1 단일 클론, 신경 세포 마커), GFAP (폐해 섬유 성 산성 단백질 , 성상 세포 마커) 및 O4 (희소 돌기 아교 세포 마커) (도 2B-E). (Arl13b에 대한 주요 CI를 면역 염색을 수행 섬모를 분석하려면리아 마커)과 Gpr161 (섬모 GPCR) (도 3). </li><li> 슬라이드 글라스 위에 용액을 장착하여 커버 유리를 탑재. 여분의 용액을 제거하기 위해 슬라이드 글라스를 기울입니다. </li></ol> neurosphere를에 Ciliogenesis 3. 분석 <ol><li> 면역 neurosphere를 그대로하여 세포를 분석하기 위해, 배양 배지 1 mL의 전송은 1.5 ㎖의 튜브에 복수 neurosphere를 함유하고 8 분 동안 500에서 스핀 다운 XG. 15 분 동안 배지를 제거한 후, 4 % (PFA)와 구를 고정하고 PBS로 세척한다. 8 분 동안 500 XG 분야에서 스핀 다운 상등액을 제거하고, 4 ° C에서 30 %의 자당과 분야 O / N을 배양한다. </li><li> 1 mL의 팁을 사용하여 상층 액을 제거하고 1 mL의 절삭 팁을 사용하여 간섭 단층 용액 500 μL를 추가한다. OCT를 점성이기 때문에, 개구부를 넓게 선단 가장자리를 잘라. </li><li> 일회용 플라스틱 제빙 몰드 (10mm X 10mm X 5mm)로 neurosphere를 함유 OCT의 용액을 전송. </li><li> M 개의 동결적어도 15 분 동안 드라이 아이스에 세. </li><li> (선택 사항) 실험을 중지하고 최대 1 년 동안 -80 ° C의 냉동고에서 금형을 저장합니다. </li><li> 저온 유지 장치 (cryostat)을 가진 부분을 잘라; 부분의 두께는 15 내지 30 μm의이어야한다. </li><li> neurosphere에서 일차 섬모를 시각화하기 Arl13b에 대한 면역 염색 (도 4)을 수행한다. </li></ol> 4. 문화 neurosphere를하고 자기편 관한 지표의 통과 <ol><li> 항로 neurosphere를 구 크기는 100 ~ 200 μm의 사이에있는 동안; neurosphere를가 (300 μm의 이상) 너무 큰 경우, 그들은 실험에 적합하지 않습니다. </li><li> 1 mL의 팁을 사용하여 50 ㎖ 튜브에 neurosphere를 전송하고 8 분 동안 500에서 스핀 다운 XG. </li><li> 흡인기를 사용하여 상청액을 버리고 PBS에 0.05 % 트립신 EDTA 500 μL를 추가하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양한다. 트립신의 양은 구체의 개수에 따라 변한다. </li><li> 부드럽게 혈청 매체와 파이프의 500 μL를 추가1 mL의 팁과 t는 20 회. </li><li> 8 분 동안 500에서 스핀 다운 XG. 1 mL의 팁을 사용하여 상층 액을 제거하고 기본 배지 1 ㎖를 추가한다. </li><li> (선택 사항) 또는 해리되지 않은 세포 파편이 neurosphere를 보이면, 70 μm의 세포 여과기를 통해 셀을 통과한다. </li><li> 통로 NSC 배지에서 10,000 세포 / ㎠의 밀도로 10 cm 접시에 세포; 세포는 일주일 후 다음 통과를 위해 준비가 될 것입니다. </li><li> (선택) 500,000 내지 1,000,000 세포 / ㎖ 현탁액을 생성하기 위해 매체를 추가 동결 세포를 동결. 극저온 냉동 컨테이너를 사용하여 세포를 고정; 해리되지 않은 neurosphere를도 고정 할 수 있습니다. </li><li> 부착 성 배양에 50,000 세포 / PLL- 및 상 cm 2 세포를 1-2 일 동안 dillute NSC 매체로 커버 슬립하고, 배양을 라미닌 코팅. </li></ol> 5. 기아와 섬모의 분석 <ol><li> 기아 배지 (표 1)을 준비한다. </li><li> 1-2일 초기 PL 후또 다른 하나 개의 해리도 (제어) 및 기아 배지에서 NSC 매체, 변화도 (실험) 후 부착 세포의 ating. </li><li> 문화 24 시간 동안 자기편 세포. </li><li> RT에서 15 분 동안 PBS 중의 4 % PFA로 세포를 고정시키고 RT에서 5 분마다 PBS로 두 번 세척 하였다. </li><li> (선택 사항) 실험을 중지 1-2 개월 동안 4 ° C에서 PBS에서 커버 슬립으로 24 웰 플레이트를 저장합니다. </li><li> 7 (50)에 대한 면역 염색 프로토콜을 수행한다. </li><li> 장착 솔루션을 사용하여 커버 슬립을 마운트합니다. 어둠 속에서 실온에서 슬라이드 글라스 O / N을 건조. </li><li> 필요한 배율에서 복합 현미경 이미지 획득. 첨부 된 소프트웨어를 사용하여 제어 현미경, 카메라, 및 목표 (40X / 1.3 오일 및 63X / 1.4 오일)를 사용합니다. 0.5-0.8 ㎛의 간격 (도 5)에서 충분한 Z 섹션을 가지고. </li><li> 섬모 현지화의 정량 분석에 대한부착 세포는 DAPI 채널로보고 합류 세포와 3-8 연속 필드에서 이미지의 스택을 획득. ImageJ에 / 피지를 사용하여 차 섬모의 수를 정량화. 일반적으로&gt;는 ImageJ에 플러그인에서 &quot;셀 카운터&quot;도구를 사용 GPCR 양성 섬모를 가진 세포를 계산하는 대화 상자를 분석; 이미지 스택에서 최대 돌기 계산 수출 상업적 동일한 실험에서 모든 이미지 ImageJ에 / Fiji.Use 유사한 이미지 세기 및 콘트라스트 파라미터로부터도 내보낼 수있다. </li></ol> 6. neurosphere를 형질 <ol><li> 부착합니다 24 시간 동안 커버 슬립에 세포를 분해. 24- 웰 플레이트 중 하나의 웰에 500 μL NSC 매체 전형적 75,000 내지 150,000 세포 세포 밀도를 사용한다. </li><li> 5 초 동안 볼 텍싱하여 0.5 ㎖의 마이크로 튜브에 혈청 감소 배지 25 μL와 형질 감염 시약 150 μL를 섞는다. </li><li> 별도의 0.5 mL의 microtub에 독소가없는 플라스미드 DNA 2.5 μg의 추가감소 혈청 미디어의 25 μL를 포함, 5 초 동안 볼 텍싱에 의해 혼합 전자. </li><li> 제 모세관 함유 DNA로 형질 전환 시약 1 μL를 첨가하고 5 초 동안 볼 텍싱하여 혼합한다. </li><li> 제 마이크로 튜브에 DNA 함유 튜브에서 혼합물을 첨가하고 피펫 팅하여 혼합한다. </li><li> RT에서 10 내지 15 분 동안 혼합물을 인큐베이션. 배양 후, 부드럽게 NSC 매체의 상부 (500 μL / 웰)의 웰에 형질 믹스 적가. </li><li> 매체 (NSC 매체) 기아 배지 (500 μL / 웰)을 제어하기 위해 매체 (24) 시간 후 형질 변경. </li><li> 24 시간 후 4 % PFA로 매체를 변경하여 세포를 고정 및 면역 염색을 수행; 통상적으로, 10 %의 형질 도입 효율을이 프로토콜을 이용하여 얻어진다. </li></ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기, 우리는 생성하고 성인 마우스 SVZ에서 neurosphere 문화를 유지하는 방법을 설명합니다. 다음과 같이 문화에 관한 몇 가지 관련 사항입니다. 200 μm의 - 먼저, 구의 크기는 일반적으로 50 사이이다. neurosphere 직경보다 큰 300 μm의를 가져 우리의 경험에서, 계대을위한 최적의 시간이 누락되었습니다. 이 큰 분야는 핵심에있는 죽은 세포가 포함되어 있습니다. neurosphere를 일반적으로 신경 줄기 / 전구 세포를 연구하는 데 사용됩니다 둘째, 이들 세포의 stemness를 유지하기 위해 EGF와 FGF-기본 (bFGF를)를 사용하는 것이 중요합니다. 따라서, FBS로 분화를 유도 요인, neurosphere를 유지하는 동안 피해야한다. 10 % FBS가 아스트로 사이트 (47)에 neurosphere를 구별 할 수 있음을 보여왔다. 셋째, 신경 세포의 분화 정도는 마우스의 나이에 따라 다릅니다 수 있습니다. 하나 neurosphere를 더 많은 신경...

일차 섬모는 미세 소관 기반의 동적 세포 내 구획하다는 태아 신경원 발달 (1, 2) 동안 소닉 헤지 호그 (쉬) 경로를 비롯한 세포 신호 전달 경로를 조정 감각 안테나, 성인 신경 기능 3 실형 세포 내 시그널링 4로서 기능 . 예 5 패치 (patch) 쉬 수용체 이들 경로의 구성 요소를 시그널링; 통로 활성제 평활화 (SMO) 6; 및 Gpr161 7 부정적인 쉬 경로를 조절 고아 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)가 동적 방식으로 속눈썹에 지역화. 다수의 GPCR은 10 뇌 7, 8, 9에서 신경 세포의 섬모에 지역화보고되었다 </SUP&gt; 11, 12, 13, 14, 15, 16. 섬모 및 섬모 생성 신호 전달 경로의 여러 결함이 조직에 영향을 총칭 ciliopathies 17, 18, 19로 알려져있다. ciliopathy 질환 스펙트럼 흔히 안면 이상 20, 21, 22 등의 신경 발달 결함을 포함한다. 또한, 시상 하부 뉴런의 일차 섬모 중앙 포만 경로를 조정하고 결함 등 Bardet Biedel 증후군 24 syndromic ciliopathies 비만 미러링 복부 비만 23 초래한다. 또한, 시그널링 섬모 신경 펩타이드 수용체를 조절 CENTR알 물림 14, 11 경로. 예컨대 해마 뉴런 소마토스타틴 수용체 3과 아데 닐 레이트 사이 클라 III (ACIII)의 GPCR과의 섬모 제이션은 새로운 물체 인식 결함 25, 26 기억력 결핍의 결과와 모양체 (27)의 완전성이 부족 평행. 섬모 생성 시그널링 발달 측면 밀접 조직 항상성에 연결된다; 특히, 섬모는 소뇌 (28), (29)에서 과립 전구 세포에서 발생하는 쉬 - 서브 타입 medulloblastomas의 진행에 중요하다. 따라서, 차 섬모는 배아, 출생, 성인 신경 개발 및 기능 중에 중요한 역할을한다. 신경줄 기세포 (NSCs의)의 뇌실 영역 측뇌실의 (SVZ), 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 subgranular 영역 및 상주포유류 30, 31, 32 시상 하부에서의 제 3 뇌실 심실 영역. 관한 지표는 다 능성 있습니다 자기 갱신 능력을 소유하고, 두뇌 발달 및 재생 의학 (30)에 대한 중요하다. SVZ에서 대부분 관한 지표가 대기하고, 많은 경우에, 측면 뇌실 (33)에게 확장하는 고독한 차 섬모를 가지고있다. 특히 쉬, TGFβ 및 수용체 티로신 키나제 경로 2, 34, 35, 36에 대하여 하류 세포 반응을 유도하는 다양한 수용체의 위치 파악을 통해 일차 섬모 신호. 일차 섬모가 측뇌실 내로 연장하기 때문에,이 일차 섬모는 뇌척수액 (CSF) 37 NSCs을 활성화하는 사이토 카인이 검출되는 것으로 가정 </s&gt;까지. 최근의 연구는 쉬 신호 전달 경로 및 기본 섬모는 후각 상피 세포, 폐, 신장 38, 39, 40, 41 등의 여러 조직의 수리에 줄기 세포의 활성화 및 재생을위한 중요한 것이 좋습니다. 그러나, CSF 의해 NSCs의 메커니즘과 통신 일차 섬모 여부를 알 수없는 관여한다. 문화 자기편 관한 지표는 섬모된다 이러한 섬모의 SMO 및 Gpr161로 쉬 경로 구성 요소를 로컬 화; 42 반응 쉬입니다. 따라서 관한 지표는 쉬 경로를 연구하는 중요한 모델 시스템, 섬모 인신 매매 및 신경 세포 분화 경로 역할을 할 수 있습니다. 또한, NSCs의 차별화 된 신경 세포는 섬모 인신 매매 분석에 사용할 수 있습니다. neurosphere를이 neura의 확산에서 발생하는 자유 부동 세포의 클러스터로 구성되어있다특정 성장 인자와 비 접착면 (43), (44)의 존재하에 성장 L 줄기 / 선조 세포. neurosphere를 정상적인 개발 및 질병 31, 45, 46, 47에서 신경 줄기 / 전구 세포를 연구하기 위해 체외 배양 모델에서 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 신경 줄기 / 선조 세포를 배양 및 신경 / 신경교로의 분화를위한 neurosphere 기반 분석법을 설명한다. 우리는 특히 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포 (그림 1)의 섬모 구성 요소를 신호의 인신 매매를 강조한다. 차 신경 세포를 배양 반대로, 차 neurosphere를은 문화에 상대적으로 쉽게 여러 구절 의무가 있고 사이클 해동의 동결 및 신경 / 교세포로 분화를받을 수 있습니다. 중요한 것은, 우리는 neurosphere 파생 신경을 결정줄기 / 선조 세포 및 분화 된 신경 세포 배양에서 섬모하고 이들 구획 섬모 기능에 중요한 신호 분자 지역화. Neurosphere 기반의 배양 방법은 NSCs의 차별화 된 신경 세포에서 ciliogenesis 및 섬모 인신 매매를 연구하기위한 이상적인 모델 시스템 역할을 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>12mm 라운드 커버 유리</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>95 mm x 15 mm 페트리 접시, 미끄러질 수 있는 뚜껑</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>10 cm 접시</td></tr><tr><td>70 &micro; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>당나귀 안티 토끼, Alexa 488 2 차 항체</td></tr><tr><td>Arl13B, 클론 N295B / 66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50X), 무 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>B27</td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Thermo scientific</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>코닝</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 데옥시리보뉴클레아제</td><td>I 시그마</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마</td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>일회용 비닐 표본 금형</td><td>사쿠라 티슈-텍 크라이오몰드</td><td>4565</td><td>10 mm x 10 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수 10X, 수정됨, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine science tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 솔루션</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>마운팅 솔루션</td></tr><tr><td>GFAP</td>, <td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr>, <tr><td>염소 안티 마우스 IgG1, 2차 항체, Alexa Fluor 555 접합체,</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td>, <td>염소 안티 마우스 IgG1, Alexa 555 2차 항체</td></tr>, <tr><td>염소 안티 마우스 IgG2a, 2차 항체, Alexa Fluor 555 접합체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>염소 안티 마우스 IgG2a, Alexa 555 2 차 항체</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>집에서 만든</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>인간 bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>FGF</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific</td><td>0.100 mm 깊이</td><td>개선 된 neubauer</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm 육종 기저막</td>의 Isofluorane Laminin <td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Laminin</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection 시약</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OCT compound</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>OCT 페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF 단백질, CF</td><td>R 및 D 시스템</td><td>236-EG-200</td><td>EGF</td></tr> 가<tr><td>위 정밀</td><td>과학 도구</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>슬라이드</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액 (10X)</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>트립신</td></tr><tr><td>COSTAR 6-웰 플레이트, 뚜껑 포함 평평한 바닥 초저 부착 표면 폴리스티렌, 멸균</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>초저 결합 6-웰 플레이트</td></tr><tr><td>&베타;-tubulin III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

차 섬모를 연구에 차 neurosphere 문화를 사용하여

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

일차 섬모는 신경 줄기/전구 세포의 증식과 배아, 출생 후 및 성체 기간 동안의 신경 세포 분화에 근본적으로 중요합니다. 또한, 대부분의 분화된 뉴런은 G-단백질 결합 수용체(G-protein-coupled receptor)와 같은 신호 수용체(signaling receptor)와 아데닐릴 시클라제(adenylyl cyclase)와 같은 신호 분자를 수용하는 원발성 섬모(primary cilia)를 가지고 있습니다. 일차 섬모는 배아 신경 발달 중 음파 고슴도치 경로를 포함한 여러 발달 경로의 활동을 결정하고 성인 신경 세포 기능 동안 구획화된 세포 내 신호를 촉진하는 기능도 합니다. 당연히, 일차 섬모의 생물 발생 및 기능의 결함은 뇌의 발달 이상, 중심 비만, 학습 및 기억 결핍과 관련이 있습니다. 따라서 1차 섬모의 생물 발생과 섬모 이동을 신경 줄기/전구 세포 및 분화된 뉴런의 맥락에서 연구하는 것이 필수적입니다. 그러나 1차 뉴런에 대한 배양 방법은 상당한 전문 지식이 필요하며 동결-해동 주기에 적합하지 않습니다. 이 프로토콜에서는 1차 신경구를 사용하여 신경 줄기/전구 세포의 혼합 집단에 대한 배양 방법에 대해 논의합니다. 신경구 기반 배양 방법은 1차 신경줄기세포/전구세포를 연구하는 데 있어 여러 계대 및 동결-해동 주기에 대한 민감성, 뉴런/신경교세포로의 분화 가능성, 형질주입 가능성과 같은 이점을 제공합니다. 중요한 것은 신경구 유래 신경줄기세포/전구세포와 분화된 뉴런이 배양에서 섬모화되고 이러한 구획에서 섬모 기능과 관련된 신호 분자를 국소화한다는 것을 확인했습니다. 이러한 배양을 활용하여 신경 줄기/전구 세포 및 분화된 뉴런에서 섬모 형성 및 섬모 이동을 연구하는 방법을 추가로 설명합니다. 이러한 신경구 기반 방법을 통해 신경 줄기/전구 세포 및 분화된 뉴런의 맥락에서 G 단백질 결합 수용체 및 음파 고슴도치 신호 전달을 포함한 섬모 조절 세포 경로를 연구할 수 있습니다.

일주일 NSC 매체에 SVZ에서 세포 도금 후 부동 neurosphere를는 (도 2A)를 관찰 하였다. 구체의 크기는 50 ~ 200㎛ 사이에서 변화. 구체는 신경 줄기 / 전구 세포에서 파생 된 경우 검사하려면 neurosphere를가 PLL-과에 도금 된 2 일 동안 NSC 매체의 커버 슬립을 라미닌 코팅. 그들은 다음 신경 줄기 / 전구 세포 마커, 네 스틴에 대한 면역 염색되었다. 이틀은 구체가 커버 슬립에 부착하고 세포의 단층으로 성장 할 수 있도록 필요했다. 세포의 단층은 네 스틴 (도 2B)에 양성이었다. neurosphere를의 분화 능력을 검사하기 위해, 우리는 PLL-과에 2 장에 설명 된 단계에 따라 그들을 도금 7~10일에 대한 분리하지 않고 차별화 매체에서 커버 슬립을 라미닌을 코팅. 그것은 차별화를 위해 적어도 일주일에 걸립니다. neurosphere를은 커버 슬립에 부착 확장에드는...

일차 섬모 신경 전구 세포의 증식, 신경 세포 분화, 성인 신경 기능에 근본적으로 중요하다. 여기서 우리는 ciliogenesis 및 기본 neurosphere 문화를 사용하여 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포의 섬모에 신호 단백질의 인신 매매를 연구하는 방법을 설명합니다.

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 일차 신경 줄기세포 및 전구세포의 뉴로스피어 기반 배양법을 활용하여 일차 섬모의 생성 및 수송을 연구하는 것입니다. 이 방법은 섬모의 생성 및 일차 섬모로의 섬모 분자 수송과 같이 일차 섬모 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 일차 신경 줄기세포, 신경 전구세포 및 뉴런에서 적용 가능합니다.이 기술의 주요 장점은 신경 줄기세포, 신경 전구세포 및 뉴런의 일차 세포 기준을 사용하여 일차 섬모의 맥락에서 생물 형성 및 섬모 경로를 분석할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 신경 줄기세포 배양이 초보자에게 기술적으로 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 외측 뇌실의 해부, 뉴런구(neurospheres) 배양 및 일차 섬모의 정량화와 같은 단계들은 핵심 단계를 관찰함으로써 쉽게 익힐 수 있으므로, 이 방법의 시연 과정이 매우 중요합니다.전체 마운트 박리법(whole mount dissection method)을 사용하여 성체 생쥐의 외측 뇌실에서 박리한 뇌실하구역(subventricular zone)으로 본 절차를 시작합니다. SVZ가 포함된 조직을 1.5 milliliter 튜브에 넣습니다. PBS에 희석한 0.05% Trypsin-EDTA 500 microliters를 첨가하고 37 degrees Celsius의 항온수조에서 15분 동안 배양합니다.배양 후, 정지 배지 500 µL를 첨가하고 1 mL 팁을 사용하여 20~30회 부드럽게 피펫팅합니다. 피펫팅 중에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 그 후, 세포를 500 ×g에서 8분 동안 원심 분리합니다.상층액을 제거한 후 PBS 1 milliliter를 첨가하고, 1 milliliter 팁을 사용하여 부드럽게 다섯 번 파이펫팅하여 세포를 재부유시킵니다. 500 times G에서 8분 동안 원심분리합니다. 그 다음 1 milliliter 팁을 사용하여 배지를 흡입하여 제거하고 기초 배지 1 milliliter를 첨가합니다.세포 수를 센 후, 하나의 SVZ에서 얻은 세포를 10 mL의 NSC 배지가 담긴 10 cm 디쉬에 분주하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 5~7일 후면 뉴로스피어(neurospheres)를 관찰할 수 있습니다. 면역염색을 통해 부착된 뉴로스피어 내의 세포를 분석하려면, 여러 개의 뉴로스피어가 포함된 배지 1 mL를 1.5 mL 튜브로 옮기고 500 ×g에서 8분 동안 원심분리합니다.배지를 제거한 후, 4% paraformaldehyde로 15분 동안 구체를 고정합니다. paraformaldehyde를 제거한 후, 30% sucrose와 함께 구체를 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 다시 원심분리합니다.PBS로 세척합니다. 그런 다음, 이전과 동일하게 원심분리한 후 상층액을 제거하여 버립니다. 이어서 1 mL 팁의 끝을 자른 피펫을 사용하여 신경구(neurospheres) 위에 OCT 용액 500 µL를 분주합니다.뉴로스피어가 포함된 OCT 용액을 일회용 플라스틱 동결 몰드에 옮깁니다. 그 후, 몰드를 드라이아이스 위에서 최소 15분 동안 동결시킵니다. 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 섹션을 절단합니다.뉴로스피어 내의 줄기세포를 시각화하려면 줄기세포 마커인 Nestin에 대해 면역염색을 수행하십시오. 뉴로스피어 내의 일차 섬모를 시각화하려면 ARL13B에 대해 면역염색을 수행하십시오. Poly-L-Lysine과 Laminin이 코팅된 커버슬립에 부착성으로 해리된 신경 줄기세포를 파종한 후 1~2일 뒤에 이 실험을 시작하십시오.실험군 웰의 배지를 기아 배지로 교체하고, 대조군 웰의 배지는 신선한 NSC 배지로 교체합니다. 24시간 동안 추가로 배양합니다. 다음 날, PBS에 희석된 4% paraformaldehyde를 사용하여 실온에서 15분 동안 세포를 고정합니다.고정 후, 실온에서 PBS로 5분씩 2회 세척합니다. 그 다음 표준 프로토콜에 따라 면역형광 염색을 수행합니다. 마운팅 용액을 사용하여 커버슬립을 마운팅합니다.그 다음, 슬라이드 글라스를 실온의 암소에서 하룻밤 동안 건조합니다. 다음 날, 복합 현미경을 사용하여 필요한 배율로 이미지를 획득합니다. 현미경 카메라와 대물렌즈는 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 제어해야 합니다.0.5에서 0.8 micron 간격으로 충분한 z-섹션을 촬영합니다. 부착 세포에서 섬모 위치의 정량 분석을 위해, DAPI 채널을 통해 세포가 융합된 연속적인 시야 3~8개를 선택합니다. 각 시야에서 이미지 스택을 획득합니다.ImageJ를 사용하여 일차 섬모의 수를 정량화합니다. Plugins Analyze 대화 상자를 열고 Cell Counter 도구를 선택하여 GPCR 양성 섬모를 가진 세포의 수를 측정합니다. 계수 및 데이터 내보내기를 위해 동일한 실험에서 얻은 모든 이미지에 대해 유사한 이미지 강도 및 대비 파라미터를 사용하십시오.분리된 세포를 NSC 배지 또는 기아 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 세포를 고정하고 녹색으로 표시된 GPR161, 적색으로 나타나는 ARL13B, 그리고 청색으로 표시된 DNA에 대해 면역 염색을 수행하였습니다. 왼쪽의 대조군 세포와 오른쪽의 기아 상태 세포에서 GPR161 양성 섬모가 관찰됩니다. 이는 확대된 이미지에서 확인할 수 있습니다.흰색 화살표와 화살표 머리는 각각 GPR161 양성 및 음성 섬모를 나타냅니다. 이 이미지는 ARL13B 양성 섬모 세포의 정량화 결과를 보여줍니다. 정량화는 단일 실험의 기술적 반복구 2개에서 각각 두 개의 시야를 통해 수행되었습니다.기아 상태에서 ARL13B 양성 섬모 세포의 비율이 증가합니다. 이 이미지는 대조군 세포와 기아 상태 세포에서 ARL13B 양성 섬모에 국소화된 GPR161의 정량 분석 결과를 보여줍니다. ARL13B 양성 섬모에 국소화된 GPR161의 비율 또한 기아 상태에서 증가합니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 종양 발생에서 섬모의 역할과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 일차 종양 유래 세포를 배양하는 또 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 일차 섬모 분야의 연구자들은 일차 신경구 기반 시스템에서 섬모의 생합성과 수송을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 영상을 시청하고 나면, 뉴로스피어(neurosphere) 기반 배양에서 유래한 신경줄기세포, 신경전구세포 및 뉴런의 일차 섬모를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

using-primary-neurosphere-cultures-to-study-primary-cilia

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

여기에 제시된 것은 고밀도 도금 뉴런으로부터 신경 전구 세포에서 농축된 신경구의 자발적인 생성을 위한 프로토콜이다. 동일한 실험 동안, 뉴런은 낮은 밀도에서 도금 될 때, 프로토콜은 또한 장기간된 기본 쥐 신경 배양 결과.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

1 차적인 섬모는 센티미터와 관련되었던 세포 외 구조물입니다. 면역 형광 염색에 의한 1 차 적인 섬모 검출은 매우 높은 품질의 심상을 초래하는 비교적 간단한 절차입니다. 이 프로토콜에서, 1 차적인 섬모를 표현하는 섬유아세포는 형광 또는 공초점 현미경으로 고정되고, 면역 염색되고, 심상화되었습니다.

면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출

이미지를 분석하기 위해 인공 지능(Ai)을 사용하는 것은 일반적으로 사용되는 방법에 비해 강력하고 편향이 적으며 빠른 접근 으로 부상하고 있습니다. 여기서 우리는 Ai가 세포 세포, 1차 섬모를 인식하고 길이 및 염색 강도와 같은 특성을 엄격하고 재현 가능한 방식으로 분석하도록 훈련했습니다.

1차 섬모 평가에 대한 인공 지능 접근 방식

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

이 방법은 조직 수집에서 섬모 조직 분석에 이르기까지 광물화된 조직의 넓은 영역에 걸쳐 원발성 섬모를 3차원으로 제 자리에서 이미지화하기 위해 ARL13B-CENTRIN-2 형질전환 마우스 모델에서 내인성 신호를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 조직에도 적용될 수 있습니다.

ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석

생체 외 직립 액적 배양은 현재의 시험관 내 및 생체 내 실험 기술의 대안입니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 더 적은 양의 시약이 필요하며 태아 혈관화, 형태 형성 및 기관 형성을 조작하고 연구할 수 있는 기능을 허용합니다.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

배우세요 신경줄기세포 및 전구세포에서 1차 섬모 생물학적 발생과 신호단백질 이동을 연구하는 Neurosphere 배양법. 이 기술은 신경발달 및 섬모 관련 질병 연구에 필수적인 기초를 제공합니다.

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

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