Name: Solea Senegalensis 정 충에 반응성 산소 종의 세포내 위치 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 학습하세요 Solea senegalensis 정자에서 활성산소 종의 세포내 위치를 공초점 현미경으로 평가하는 방법을. DCFH-DA 형광염색과 미토콘드리아 염색을 활용하여 2시간 내에 완료할 수 있는 이 기법은 생식생물학 연구에 필수적입니다.

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우리 AQUAGAMETE FA 1205 비용 작업을 감사합니다. 이 작품 AGL201568330-c 2-1-R 프로젝트 (MINECO/페더)에 의해 재정적으로 지원 되었다. 데이비드 G. 발 카 르 세 드 의회에 의해 투자 되었다 카스 티 야와 레온 (EDU1084/2012)와 Fondo 사회 Europeo. 저자는 박사 아나 Riaza 및 Stolt 바다 농장 소화기, 닥터 폴 리 드 파스, 박사가 그 나 시오 마르티네스 몬테로 호세 라몬 Guiérrez 인정합니다. 우리 또한 videography 폴라 페르난데스 Colado 감사.

참고: 형광 색소 외피와 confocal 분석 컨트롤 및 치료 샘플에 대 한 2-3 h 이상 소요 됩니다. 데이터 처리는이 시간 계산에 포함 되지 않습니다. 필요한 재료는 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 또는 cryopreserved 정 충에 적용할 수 있습니다. Solea senegalensis 냉 수, 차가운 조건 (4-7 ° C)에서 항상 작업에서에서 생성 하는 어 종입니다. 프로토콜의 일반적인 보기에 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.
1. 실험 하기 전에 준비 작업
<ol><li>1mm 미토 콘 드리 아 얼룩 분석 학년 DMSO 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>4 ' 1 μ g/mL, 이온된 수에서 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>200 mOsm/kg 벨 솔루션 (116 m m NaCl, 2.9 m m KCl, 1.8 m m CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7) 준비</li>
	<li>4 m m 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-다) 재고 솔루션 분석 학년 메탄올에서 준비 합니다. 참고:-20 ° C까지 필요에서 aliquots에 재고 솔루션을 유지.</li>
	<li>4-7 ° c.에 있는 microcentrifuge를 설정</li>
</ol>2. 형광 색소 부 화 하기 전에 샘플 준비
참고: 정 충의 부드러운 처리 때 바람직한 pipetting 및 resuspending.
<ol><li>Cryopreserved 셀 작동, Solea senegalensis 정 충1040 ° C에 녹고 물 목욕 준비. 7 물 목욕에 짚 샘플을 담가 s.</li>
	<li>잘라가 위를 사용 하 여, 샘플 microfuge 관으로 빈 하 고 1000 x g, 1 분에 4-7 ° C에서 원심.</li>
	<li>정액 플라스마 또는 cryoprotectants와 정액 플라스마 cryopreserved 샘플에서 pipetting 얼룩 프로토콜을 방해할 수 있는 모든 구성 요소를 삭제 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>4 ° C 200 mOsm/kg 벨 솔루션의 50-100 μ 셀 resuspend</li>
	<li>Neubauer 또는 입체 현미경 비슷한 세 챔버 정자 농도 결정 합니다.</li>
	<li>1-4 ° C 벨 솔루션에에서 0.5 mL의 최종 볼륨에서 106 셀/mL x 2를 세포 현 탁 액을 희석.</li>
</ol>3. 형광 색소 인큐베이션
참고: 형광 특히 솔루션에서에서 낮은 조명 조건에서 처리 되어야 합니다.
<ol><li>DCFH-다 재고 솔루션의 3.125 μ 추가 (샘플에서 최종 농도: 25 μ M) 작업 샘플 희석을. 어둠10에서 40 분 4-7 ° C에서 품 어.</li>
	<li>30 분 후 DAPI 재고 솔루션의 0.5 μ 추가 (샘플에서 최종 농도: 2 μ M) 및 재고 솔루션 얼룩은 미토 콘 드리 아의 0.5 μ (샘플에서 최종 농도: 100 nM) 샘플을. 어둠 속에서 10 분 동안 두 형광을 품 어.</li>
</ol>4. 샘플 준비 Confocal 현미경 검사 법에 대 한
<ol><li>보육 시간 후 1000 x g, 1 분에 4-7 ° C에 세포 현 탁 액을 원심.</li>
	<li>Pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 삭제 합니다.</li>
	<li>200 mOsm/kg 벨 솔루션의 10-20 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>집중된 세포 현 탁 액의 장소 5 μ 슬라이드에 드롭.</li>
	<li>신중 하 게, 준비에 커버 슬라이드를 넣어 그것을 봉인 폴란드어와. 폴란드는 건조, 일단 준비는 confocal 현미경 검사 법에 대 한 준비.</li>
</ol>5. 실험 전에 confocal 설치
참고: 현미경, 따라 DCFH 다 수 수 "점화". 먼저 비-귀중 한 샘플을 최상의 조건을 설정 합니다.
<ol><li>현미경, 레이저, 카메라와 현미경을 실행 하는 컴퓨터를 켭니다.</li>
	<li>설정된 여기 레이저 각 형광 색소의 여기 및 방출 최대값을 고려:<ol>
<li>DAPI, 358의 여기 최대 사용 nm와 465의 방출 최대 nm.</li>
		<li>미토 콘 드 리아 얼룩 사용 644의 여기 최대 nm와 662의 방출 최대 nm.</li>
		<li>DCFH-다, 504의 여기 최대 사용 및 525의 방출 최대 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>25 X 목표는 정 충에 초점 작업을 시작 합니다. 이 형광 색소는 높은 강도 보고 있기 때문에 초점 DAPI 채널을 선택 합니다. 셀의 초점을 맞추고 사용 하 여 63 X 또는 100 X 목표 철저 한 평가 위해 Solea senegalensis 정 충 크기 때문에 약 2 μ m.</li>
	<li>각 채널에 대 한 최적화 pinhole, 이득 및 전압. 같은 방식으로 배경을 줄이기 위해 디지털 오프셋을 조정 합니다. 모든 매개 변수는 사용 하는 형광 색소에 대 한 최적화 설정을 저장. 단일에 대 한 일상적인 실험 Solea senegalensis 정자 세포 (이 매개 변수는 각 실험에서 변경 될 수 있습니다) 다음 사용: 1, 750 V의 이득 전압의 작은 구멍.</li>
</ol>6입니다. 이미지 수집
<ol><li>이미지 수집에 대 한 원하는 품질 조건을 선택 합니다. 비트 깊이, 이미지 포맷, 빛 시트 두께, 수집 설정을 정의 하 고 단일 양면된 조명 선택 합니다. 단일에 대 한 일상적인 실험 Solea senegalensis 정 충 (이 매개 변수는 각 실험에서 변경 될 수 있습니다) 다음 사용: 프레임 크기 1024 픽셀; 16;의 픽셀 당 비트 스캔의 속도 2-4)입니다.</li>
	<li>열고 시작 하는 필드의 이미지 스캔 영역을 가운데로.</li>
	<li>자르기 도구를 사용 하 여 관심 영역을 선택 하 고 라이브를 누릅니다.</li>
	<li>범위 표시기 도구의 도움으로 배경을 줄이기 위해 디지털 오프셋을 조정 합니다. 각 채널에 대 한이 작업을 수행 하 고 이미지를가지고.</li>
	<li>각 형광 색소와 그들의 조합에 대 한 개별 채널의 품질을 확인 합니다.</li>
</ol>7. 3D 이미지 비디오를 만들기
<ol><li>Z-스택 수집 설정입니다.<ol>
<li>소프트웨어에서 Z-스택 옵션을 선택 합니다.</li>
		<li>단일 셀을 셀의 그룹 또는 관심 영역을 선택 하 고 그것을 집중.</li>
		<li>Z-스택 ' 첫 번째 조각 '과 ' 마지막 조각 ' 옵션으로 구분 하 고 정밀한 초점의 도움으로 0.2 µ m 간격 z 단계를 설정. 이 형광 색소는 높은 강도 보고할 수 있습니다 쉽게 전체 정 충 머리를 선택할 수 있기 때문에 초점 DAPI 채널을 선택 합니다. 각 채널에 대 한 최적의 인수 매개 변수를 선택 하 고 실험을 실행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Z-스택 실험을 실행 합니다. 채널을 분할 하 고 각 신호는 세포 내에서 지역화 합니다.</li>
	<li>Z-스택 프로세스입니다.<ol>
<li>볼륨 렌더링: 실험 완료 되 면 Z 스택 처리 소프트웨어의 옵션을 선택 하 고 볼륨 렌더링 옵션을 선택 하십시오. 단계와 회전도 (360 °)의 수를 선택 합니다. 비디오 확장명으로 파일을 저장 합니다.</li>
		<li>스테레오 입체 사진: 옵션에서 스테레오 글리프를 선택 프로세스 창. 이 도구는 분할 채널 비디오 3D 이미지를 만들 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li>
<li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

그것은 잘 알려진 미토 콘 드리 아는 정자의 운동 성 및 기능에 대 한 주요 세포입니다. 이러한 세포는 동시에 직접 선생님 생산에 참여 했다. 흥미롭게도, 선생님의 제어 수준은 적절 한 정자 기능1필요 합니다. 다 산과 산화 스트레스 사이의 긍정적인 관계 포유류11 에 표시 되었습니다 하지만 과도 한 수준에 영향을 미칠 정자 품질12. 긍정적 이거나 부정적인 효과로 결정 될 수 있는 하나의 중요 한 요소는 선생님 수준 뿐만 아니라 선생님 세포내 지역화입니다. 선생님의 해로운 효과의 한 DNA 손상9 생산 고 따라서 선생님의 핵 존재 반면 선생님 수준 미토 콘 드리 아에서 정상적인 수 핵에서 손상의 지표로 될 수 있습니다. 그것은 같은 선생님 세포내 지역화에 대 한 정보를 제공할 수 있는 confocal 현미경 검사 법 기술로 기존의 양적 방법(, cyt...

정자 품질 반응성 산소 종 생산 연결 되었습니다 최근1. 미토 콘 드리 아에서 선생님 생산 정상적인 생리 적인 과정 이라고 여겨질 수 있다, 비록 선생님 생산의 과잉에 의해 산화 스트레스 서로 다른 수준에서 정 충에 손상의 명확한 원인입니다. 인간에서는, 산화 스트레스는 남성 불 임, 운동 성 및 capacitation2;을 능력 변경 관련 포유류에서 냉동된 정자 샘플에서 DNA 무결성의 변화는 H2O23의 합성에도 관련 되어있다.
Cryopreservation은 유전자 은행 양식 업에 대 한 일반적인 기법입니다. 이 기술은 Solea senegalensis같은 생식 문제 종에서 특히 중요 하다. 시장에서이 귀중 한 종 구 혼의 부족으로 인해 포로에서 태어난 개인 생식 기능 장애를 보여줍니다. 이 사실은 정자 cryopreservation 인공 수정 위한 정자 가용성 필요 합니다. 그러나, cryopreservation 연구 항 산화 보충의 유익한 효과 보고 있다 정 충4 해로운 수 있는 산화 스트레스의 원천이 될 수 있습니다. 선생님 억제 대상으로 미토 콘 드 리아 산화를 통해 소문에 하면 정자 cryopreservation 노란색 메기5에 대 한 유익한 했다.
따라서, 정자 샘플에서 선생님의 수준을 알고, 특히 cryopreservation6,7 후 있기 때문에 이러한 분자 정자 생존 및 다 산8에 대 한 단점으로 인정을 받고 있다 중요 하다. 또한, 셀 내에 선생님의 배급을 공부 하 고 손상의 정도 추정 하는 것 중요 한 수 있습니다. 예를 들어, 정상 및 정자 기능, 호환 되는 미토 콘 드리 아에서 선생님의 낮은 수준의 추측 될 수 있지만 핵 내 선생님의 높은 수준의 정 충 DNA 손상의 지표 수 있습니다. H2O2 는 미토 콘 드리 아에서 나올 수 있는 작고 충전 없는 분자9이기 때문에 핵을 관통 하는 가장 관련성이 높은 선생님 중 하나입니다. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-다) 특히 녹색 형광을 방출 하는 세포내 과산화물을 밝힐 수 있다. 이 문서에서는, Solea senegalensis 정자 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 H2O2 세포내 지역화를 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜 제공 됩니다.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&프라임;,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 분석 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>메탄올, 분석 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker딥 레드&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 (냉장)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerchamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

solea senegalensis 정 충에 반응성 산소 종의 세포내 위치 평가

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

산화 스트레스는 감소 하는 정자의 품질에 중요 한 요소 중 하나입니다. 어떤 종에서 높은 중요성의 이다 정 충에 반응성 산소 종 (선생님)을 탐지 하기 위한 효율적인 프로토콜을 개발 하지만 이러한 메서드는 거의 사용 하 고 덜 teleost에. Cryopreservation은 유전자 은행을 포함 하 여 다른 목적에 대 한 양식 업에 유용한 기술 이며 연중 정자 가용성을 보장 합니다. 냉동/해 동 절차 선생님 생산을 일으킬 수 있고, 정자 세포 손상. 고려는 예비 손상 선생님 생산의 과잉 발생할 수 그들의 지역화, 여기에 따라 정 충에 H2O2 를 감지 하 고 그것의 세포내 지역화 confocal 현미경 검사 법에 의해 평가 하는 상세한 방법론 제공 됩니다. 이 위해 3 형광 (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-다), 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 및 4, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI))의 조합2 H2O의 공동 지역화를 평가 하 되 정 충 핵 이나 미토 콘 드리 아 Solea senegalesis 정자 샘플에.

Confocal 현미경 검사 법 teleost 정자에서 세포내 선생님 평가 위한 이상적인 방법입니다. 이 연구는 (그림 1)에 3 개의 형광 (DAPI 미토 콘 드리 아 얼룩, DCFH-다)의 조합 기초 연구에 적용 될 수 있으며 응용 프로그램에 사용 되는 절차를 개선 할 수 있는 많은 유용한 정보를 제공 합니다. 산업 양식 식물, cryopreservation 프로토콜 등입니다. 다른 유형의 분석 세포내 선생님 존재와 다른 매개 변수를 연결 하기 위해 실행 될 수 있습니다: 운동 성, 생존, 좋은 나쁜 종 축, 운동 성 또는 많은 다른 사람 사이 계절 정자 변이의 활성화 사이 다른 패턴. 현재 작업에는 정 충 내에서 세포내 H2O2 분산의 두 가지 서로 다른 패턴 같습니다: mitochondrion 또는 확산 핵 (그림 2, 3)에 배치. 그 정 ...

이 프로토콜 H2O2 지역화 Solea senegalensis 정 충을 사용 하 여 민감한 형광 색소 DCFH 다 선생님, 미토 콘 드리 아에 대 한 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 DAPI 핵에 대 한 내 검색에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 시각화, 각각. 프로토콜은 신선한 또는 해 동 정 충으로 2 시간 내에서 수행 하도록 설계 되었습니다.

Solea Senegalensis 정 충에 반응성 산소 종의 세포내 위치 평가

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

본 실험의 전반적인 목표는 공초점 현미경을 이용하여 Solea senegalensis 정자 내 활성산소종의 세포 내 위치를 평가하는 것입니다. 활성산소종은 효율적인 정자 기능에 위해를 가하며 다양한 수준에서 세포 손상을 유발합니다. 지질 과산화가 운동성과 수정에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로, 정자는 특히 산화적 스트레스에 민감할 수 있습니다.활성 산소종은 내인성 세포 사멸 경로를 유발할 수 있습니다. 과산화물은 미토콘드리아에서 방출되며, 크기가 작은 무전하 분자이기 때문에 핵 내부로 침투하여 DNA에 영향을 줄 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 세포 내로 도입된 후 산화 반응에 의해 변형되어 녹색 형광을 발하는 형광체를 사용합니다.따라서 활성 산소종의 정확한 국소화 위치를 알 수 있습니다. 본 영상에서는 Solea senegalensis 정자를 사용하였으나, 상업적 가치가 있는 유사 종이나 Sibrifis 또는 Mirica와 같은 모종에도 이 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 물리 반응 생물학 또는 양봉 분야에서 이 기술을 활용한 몇 가지 예시는 다음과 같습니다.프로토콜에 따른 저온침전의 평가. 정자 활성화 전후의 활성산소종 표지 비교. 또는 활성산소종 표지를 양호한 호흡자와 불량한 호흡자와 상관 분석할 수 있습니다.먼저, 형광색소의 스톡 용액을 준비하십시오. 형광색소 취급 시에는 반드시 물질안전보건자료(SDS)의 권장 사항을 따라야 함에 유의하십시오. 스톡 용액을 칭량하고 준비할 때는 각별한 주의를 기울여야 합니다.스톡 용액은 필요할 때까지 -20 °C에서 소분하여 보관하십시오. 본 프로토콜에서는 세 가지 형광색소를 사용합니다. 원적색 형광 염료는 살아있는 세포의 미토콘드리아를 염색하며, 미토콘드리아 국소화 확인에 사용할 수 있습니다.DAPI는 DNA 염색을 위해 형광 현미경에서 널리 사용되는 프로브입니다. 이는 DNA의 아데닌-티민 풍부 지역에 강력하게 결합합니다. 그리고 27-dichlorofluorescein diacetate는 세포 투과성 비형광 프로브입니다.이는 세포 내에서 탈에스테르화되며, 산화 시 강한 형광을 띠는 27-dichlorofluorescein으로 전환됩니다. 이 프로토콜은 신선한 정자 또는 동결 보존된 정자로 시작할 수 있습니다. 본 실험에서는 동결 보존된 샘플을 사용하였습니다.40°C에서 해동하기 위한 배스를 준비하십시오. 재료를 세척하십시오. 적절한 신체 보호 장구를 착용한 상태에서 동결 보존된 스트로를 선택하십시오.스트로를 배스에 7초 동안 담급니다. 가위로 스트로를 잘라 해동된 시료를 마이크로원심분리관에 옮깁니다. 모든 작업은 항상 4°C에서 수행하십시오.샘플을 1분 동안 원심분리합니다. 펠렛 형태의 sowels에 영향을 주지 않도록 동결보호제를 조심스럽게 제거합니다. 50 또는 100 µL의 소량의 RINGA 용액에 재현탁합니다.새 bower 또는 이와 유사한 계수기에 세포 현탁액 희석액을 넣고 세포 수를 셉니다. 이 샘플의 농도를 계산하십시오. 미리 냉각된 RINGA 용액을 사용하여 최종 부피 0.5 milliliters 내의 세포 농도가 mm³당 100만에서 200만 cells가 되도록 세포 현탁액을 희석하십시오.피펫팅 및 재현탁 시 정자를 조심스럽게 다루어야 합니다. dichlorofluorescein diacetate 스톡 용액 3.125 µL를 작업 시료 용액에 첨가하십시오. 시료 내 최종 농도는 25 µM입니다.4~7°C에서 40분 동안 배양하십시오. 30분이 지난 후, 샘플에 0.5 µL의 DAPI 스톡 용액과 0.5 µL의 미토콘드리아 염색 스톡 용액을 첨가하십시오. 두 형광색소의 배양 시간은 각각 10분입니다.슬라이드 위에 5 µL의 농축된 세포 현탁액 한 방울을 떨어뜨립니다. 준비된 표본 위에 커버 글라스를 조심스럽게 덮고 밀봉합니다. 장비를 켜고 제어 패널에서 100배 배율 대물렌즈를 선택합니다.현미경에서 시료의 위치를 찾고 램프를 켭니다. 시스템 소프트웨어를 통해 필요한 형광색소를 목록에서 직접 선택할 수 있습니다. 해당 세트를 선택하십시오.방출 최대 파장이 465 nanometers인 DAPI, 방출 최대 파장이 662 nanometers인 MitoTracker Deep Red, 그리고 방출 최대 파장이 525 nanometers인 DCF를 사용합니다. 빔을 접안렌즈로 전환합니다. 관심 영역에 초점을 맞춥니다.소프트웨어로 돌아가 프레임 크기를 선택합니다. 더 나은 해상도를 위해 양방향 스캐닝 모드를 설정합니다. 원하는 스캔 속도를 선택합니다.시작하려면 스캔 영역을 열고 중앙에 맞춥니다. 해당 시야의 스냅샷을 찍습니다. 자르기 도구를 사용하여 관심 영역을 선택하고 Live를 누릅니다.그런 다음 작업 영역을 선택합니다. 범위 표시 도구(range-indicator tool)를 사용하여 디지털 오프셋을 조정해 배경을 줄이십시오. 각 채널에 대해 이 작업을 수행한 후 스냅샷을 찍으십시오.이는 결과의 예시입니다. 병합 이미지, 각 형광색소의 개별 채널 및 이들의 조합을 나타냅니다. 이는 Solea senegalensis 정자 세포의 라벨링 도식입니다.획득한 이미지를 통해 DAPI와 MitoTracker가 예상대로 각각 핵과 미토콘드리아 링 내에 위치함을 확인할 수 있습니다. 첫 번째 단계는 z-stack 실험을 수행하는 것입니다. z-stack 창으로 이동하여 미세 초점을 이용하여 획득할 첫 번째 위치와 마지막 위치를 선택하십시오.최적의 획득 파라미터를 선택하고 실험을 수행하십시오. 각 슬라이드에 대한 이미지를 얻게 됩니다. 이것은 z-stack 결과의 예시입니다.채널을 분리하여 세포 내 각 신호의 위치를 관찰할 수 있습니다. 3D 창으로 이동하면 다양한 그래프 옵션을 선택할 수 있습니다. 여러 매개변수를 사용자 정의할 수 있으며, 채널을 분리하거나 병합할 수 있습니다.이것은 Solea senegalensis 정자 내에서 활성산소종의 위치가 서로 다른 패턴을 보이는 3D 뷰의 예시입니다. 위쪽 영역에서는 DCF가 주로 미토콘드리아와 공국소화되어 있는 반면, 아래쪽 영역에서는 신호가 핵까지 확장되어 있습니다. 이 영상을 시청함으로써, 공초점 현미경을 사용하여 이 정자들의 세포 내 과산화물 국소화를 평가하는 방법을 알 수 있습니다.문제 해결 방법 및 기타 정보는 텍스트에서 확인하실 수 있습니다.

evaluation-intracellular-location-reactive-oxygen-species-solea

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 정량적 연구를위한 각종 아메바 및 포유류의 세포 모델에 적용 할 수있는 활성 산소 종 (ROS)의 측정을위한 일련의 프로토콜을 채택.

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

여기에서 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 산화 스트레스를 측정하는 프로토콜을 보고합니다. 이 절차를 통해 전체 배아 조직과 단일 세포 집단 모두에서 활성 산소 종(ROS)을 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 정성적 분석과 정량적 분석을 모두 수행합니다.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

전자 상자성 공명 (EPR) 분광학은 자유 래 디 칼을 측정 하는 명확한 방법입니다. 선택적 스핀 프로브를 사용 하 여 다른 세포질 격실에서 자유 래 디 칼의 검출에 대 한 수 있습니다. 우리는 치료, 저장 및 전송 EPR 측정용 샘플을 용이 하 게 하는 생물 학적 샘플을 수집 하는 실용적이 고 효율적인 방법을 제시.

사용 주위 온도 77 K에서 생물학 견본에서 전자 상자성 공명

여기, 우리는 spermatozoan 막 무결성, 정자의 수정 능력와 관련 된 세포 기능을 평가 하는 방법론을 제시. 우리 정자 세포 막의 fluorimetric 평가 대 한 세 가지 기술에 설명: 특정 형광 프로브, 형광 현미경 검사 법, 그리고 고급 정자 전용 cytometry 동시 얼룩. 방법론을 결합의 예제도 제공 됩니다.

정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

이 프로토콜은 셀 내의 세포 전체 구획 별 레독스 상태의 평가를 설명합니다. 레독스에 민감한 형광 프로브는 그대로 있는 세포에서 편리한 비율 측정 분석을 허용합니다.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

대장균은 신생아 그람 음성 세균성 뇌막염의 주요 원인입니다. 세균성 감염 도중, 호중구에 의해 생성된 반응성 산소 종은 중요한 bactericidal 역할을 합니다. 여기서 우리는 뇌막염 대장균에 대응하여 호중구에서 반응성 산소 종을 검출하는 방법을 소개한다.

수막 대장균에 감염된 호중구의 반응성 산소 종의 실시간 정량화

여기에서는 뮐러 아교 세포 (MGC)에서 2',7'-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA)를 사용하여 세포 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기위한 체계화되고 접근 가능하며 재현 가능한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 유세포 분석기로 총 세포 ROS 수준을 정량화합니다. 이 프로토콜은 사용하기 매우 쉽고 적합하며 재현 가능합니다.

뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

고분해능 호흡 측정법에 의한 정자 미토콘드리아 기능 분석은 밀폐 챔버 시스템에서 자유롭게 움직이는 정자의 산소 소비량을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 정자 미토콘드리아 특성 및 무결성에 대한 정보를 제공하는 인간 정자의 호흡을 측정하는 데 적용할 수 있습니다.

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

이 논문은 정액에서 과산화효소 양성 백혈구를 검사하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. CASA(Computer-Assisted Semen Analysis) 시스템의 도움으로 정액의 과산화효소 양성 백혈구 농도를 총 60분 이내에 얻을 수 있어 남성학 실험실 및 남성학자의 효율성을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다.

정액에서 과산화효소 양성 백혈구 검사

이 프로토콜은 고처리량 스크리닝 접근 방식을 사용하여 형광 염료 프로브로 디하이드로에티듐(DHE)을 사용하여 세포 내 활성 산소종(ROS)을 정량화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 세 가지 서로 다른 간세포 암종 세포주에서 세포 내 활성 산소종(ROS)의 정량적 평가 방법을 설명합니다.

Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

학습하세요 Solea senegalensis 정자에서 활성산소 종의 세포내 위치를 공초점 현미경으로 평가하는 방법을. DCFH-DA 형광염색과 미토콘드리아 염색을 활용하여 2시간 내에 완료할 수 있는 이 기법은 생식생물학 연구에 필수적입니다.

Solea Senegalensis 정 충에 반응성 산소 종의 세포내 위치 평가

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