Name: 조류 정액 컬렉션 Cloacal 마사지와 정액에서 DNA의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 배우세요 조류 정액 수집을 위한 항문 마사지 기법과 정액에서 고품질 DNA를 분리하는 방법을. 이 비침습적 기술은 야외 및 실험실 환경에서 번식기 수컷 조류에 적용 가능하며 유전학 및 후성유전학 연구에 활용됩니다.

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우리를 통해 초기 cloacal 마사지, 호세 Noguera를 감사 하 고 제프리 Kittilson 연구소에 대 한 지원. 이 작품을 BJH ND EPSCoR FAR0022429 수상에 의해 지원 되었다. 출판 비용 아낌없이 NDSU 학과 생물 과학을 지원 했다.

이 프로토콜은 척추 동물 주제를 포함 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 노스 다코타 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 정액 passerine 새 cloacal 마사지를 사용 하 여 컬렉션
참고: Cloacal 마사지 재생산으로 활동적인 새만, 효과적인 정액 컬렉션 기법 이지만, 적절 한 조임 상황에서 번 식 시즌 밖에 성공적으로 수행할 수 있습니다. 생식 활동 cloacal 마사지를 사용 하 여 이전 대상 종에 대 한 결정 되어야 합니다. 캡처 시 야생 조류 또는 조류 포로에서 개최에이 기술을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>(사육 조건)에 남성 새부터 손바닥 (그림 1)를 만지고 그것의 복 부 측으로 지배적인 손을 비 지배적인 손에 bander의 그립 전송 새.<ol>
<li>새의 머리는 손바닥의 측면 가장자리에 가까운 인지 확인 합니다. 가볍게 머리와 몸을 핑 키, 반지, 그리고 가운데 손가락을 사용 하 여 보호 합니다. 이것은 조류의 환기와 꼬리 노출.</li>
		<li>느슨한 또는 가볍게 손바닥을 사용 하 여 절제 된 새의 다리를 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> 그림 1 : Cloacal 마사지에 대 한 그립. 새는 복 부 쪽 손바닥과 머리 핑 키 손가락에 의해 보안 감동 지배적인 손에 가볍게 확보 된다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"><li>지배적인 검지와 엄지는 cloaca의 우수한 끝의 양쪽에 놓고 가볍게 함께 ( 그림 2) 꼬리 쪽으로 아주 약간의 압력을 적용 하는 동안 손가락을 꼬집어. cloaca cloacal 점 막 (핑크 인테리어) 노출 evert 것입니다. 참고: 새 하지 않으면 정액, 현재 생산 cloacal 융기 작은 수 고는 cloaca evert 어렵다. 경험, 재생산으로 활성 및 비활성 남성5,11의 cloacas 사이 분화 하기 쉽습니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> 그림 2 : 손가락 위치와 cloacal 융기. 우수한 끝 (A)을 약간의 압력을 적용 하 여는 cloaca evert. 재생산으로 활동적인 남성 참새목 cloacal 융기는 분명 하 고 회사 (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="3"><li>비 지배적인 손을 가진 안정 손, 꼬리의 기지의 등 쪽 측에 검지 손가락의 패드를 놓고 나왔으며 cloaca 바로 아래 엄지손가락의 끝을 놓습니다. 참고: 짧고 부드러운 축소판 cloacal 마사지를 수행 하기 위한 유리한 이며 실수로 부상에서 새를 보호 한다.</li>
	<li>아래는 cloaca 머물고, 중간 압력으로 반복적인 움직임에 cranially 깊은 비 지배적인 엄지 이동. 새는 사정 될 때까지 계속 합니다. 개인에 따라이 일반적으로 1, 몇몇 다스 선 사이의 걸립니다.</li>
	<li>최대한 빨리 사정 하는 새, microhematocrit 튜브에 정액을 수집 합니다. 여러 ejaculates 얻기 위해 cloacal 마사지를 반복 합니다. 참고: Passerine 정액은 밝은 갈색 및 일반적으로 다소 두꺼운 견실 함이 있다. cloaca에서 배출 하는 흰색 또는 어두운 물질 정액, 고 정액 샘플을 오염 시킬 수 있습니다. cloaca에 혈액의 작은 금액의 외관에 혼합 또는 정액 일반적으로 마사지 하는 동안 너무 많은 압력에 의해 발생.</li>
	<li>DNA 추출에 대 한 1 x PBS (pH 7.4)의 20 µ L 가진 microcentrifuge 관에 정액을 놓습니다. 참고: 1 x PBS에 저장 된 정액 인공 수정에 적합 하지 않습니다 하지만 DNA 추출 나중에 사용할 수 있습니다-80 ° c.에 저장 될 때 PBS 실내 온도 될 수 또는 냉장, 있지만 정액 샘플 예금 될 때 액체 상태에 있어야 한다.<ol>
<li>적은 양의 화합물 현미경 (그림 3) 희석된 샘플을 보고 샘플에서 정자의 존재를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>추출까지-80 ° C에 희석된 정액을 저장 합니다.</li>
</ol>2입니다. 새 정액에서 DNA 추출
참고:이 프로토콜 여러 상업 DNA 추출 키트, 테스트 되었습니다 하지만 단지 하나의 DNA 키트12와 함께 사용 하면 성공 했습니다. 단계를 수정 키트 프로토콜에서 표시 됩니다 *.
<ol><li>물에서 dithiothreitol (DTT)의 1 분 솔루션을 준비 하 고는 vortex.*를 사용 하 여 혼합<ol>
<li>약 수 DTT 솔루션 사용 직전까지-20 ° C에서 그것을 저장 하 고. 각 샘플 추출에 필요한 1 M DTT solution.*의 10 µ L</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 mM Tris-Cl, pH 8.0;을 포함 하는 버퍼를 준비 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; 그리고 4 %SDS. 각 샘플 추출에 필요한이 buffer.*의 90 µ L<ol>
<li>실 온에서 버퍼를 저장 합니다. 그것은 시 켰 던 경우 dissolve.*에 56 ° C에 따뜻한</li>
	</ol>
</li>
	<li>포함 하는 로커 또는 65 흔드는 인큐베이터를 예 열 ° C.*</li>
	<li>바로 시작 하기 전에 추출, 10 µ L DTT 솔루션 10 샘플을 추출 하는 경우 각 샘플을 추출, 예: 900 µ L 버퍼 플러스 100 µ L DTT 솔루션 단계 2.2에서에서 준비 하는 버퍼의 90 µ L 믹스. 이 혼합물 DTT buffer.* 라는 것입니다.</li>
	<li>70 µ L 1 x PBS 전체 희석된 정액 샘플을 추가 하 고는 vortex.*를 사용 하 여 잘 혼합</li>
	<li>100 µ L를 추가 DTT 버퍼 및 10 µ L 성분 K 솔루션 샘플을. 20 초간 소용돌이 다음 품 어 따뜻한 인큐베이터에서 1 시간 로커 또는 shaker.*에 대 한</li>
	<li>200 µ L 버퍼 알 및 200 µ L 추가 신선한 EtOH (100%)와 20 seconds.*에 대 한 소용돌이</li>
	<li>전체 샘플 스핀 열을 전송 하 고 원심 6000 x g. 삭제에서 1 분 컬렉션 튜브.</li>
	<li>새로운 튜브에 열을 놓고 500 µ L 준비 버퍼 AW1를 추가 합니다. 6000 x g. 삭제에서 1 분 컬렉션 튜브 원심.</li>
	<li>새로운 튜브에 열을 놓고 500 µ L 준비 버퍼 AW2 추가 합니다. 6000 x g.에서 1 분간 원심 분리기는 흐름을 통해 장소와 열 튜브에 다시 삭제 합니다.</li>
	<li>원심 20000 x g. 삭제 3 분 컬렉션 튜브 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에는 열을 놓습니다.</li>
	<li>피펫으로 35 AE의 µ L 열 막에 직접 버퍼 및 5 신속성에 대 한 실 온에서 품 어</li>
	<li>원심 1 분 14000 x g. 삭제에서 스핀 열 고-80 ° c.에서 추출한 샘플을 저장</li>
</ol>

<ol><li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1349186">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li>
<li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+life+histories%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li>
<li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+male+gamete%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li>
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<li>Wolfson, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4510381?seq=1#page_scan_tab_contents">The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds.</a> Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).</li>
<li>Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4089416?seq=1#page_scan_tab_contents">Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment.</a> The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).</li>
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<li>Purchase, C. F., Earle, P. T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jai.12070/abstract">Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data.</a> J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).</li>
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<li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-048X.2008.04623.x/abstract">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li>
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<li><a target="_blank" href="https://www.scribd.com/document/54238221/QIAamp-DNA-Micro-Handbook">QIAamp DNA Micro Handbook</a>. , Third edition (2014).</li>
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<li>Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li>
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<li>Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/232663050_Attempted_Semen_Collection_Using_the_Massage_Technique_and_Semen_Analysis_in_Various_Psittacine_Species">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

재생산으로 활성 상태에 있는 중소 조류에서 정액을 수집 하 고 조류 정액에서 DNA를 추출 하는 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다.
설명된 정액 DNA 추출 프로토콜 편의상 키트에서 수정 했지만 조류 정액에서 사용 하기 위해 정제 된. 정자는 표준 추출 화학 물질9,13, 세포 및 passerines에서 수집 된 정액 샘플은 매우 작은 (일반적으로 몇 가지 microliters). 이러한 요소 및 65 ° c.에 잠복기 DTT의 적절 한 농도 사용 하 여 성공적으로 극복 과제 제시 이 방법을 사용 하 여, 우리는 지속적으로 고립 된 정자 telomere 길이 (일반적으로 사이 40-250 ng / µ L, 사정 볼륨에 따라)의 정량 분석에 대 한 사용 가능한 양의 DNA.
DTT는 이전 페 놀/클로 프롬 반응<s...

새 생물학 연구에서 널리 이용 되 고 정자 수 쉽게 샘플링할 cloacal를 사용 하 여 정자 품질 및 경쟁1, 정자 telomere 역학2, epigenetics3및 유사한 주제를 포함 하는 연구를 위한 이상적인 주제는 마사지. Cloacal 마사지 새4,,56에서 정액을 모으기를 위한 부드러운, 비-침략 적 수동 기술입니다. 반복된 샘플을 쉽게 얻을 수 있습니다 그리고 특별 한 도구가 필요, 필드 또는 실험실에서 수행 하는 간단 하 합니다. Cloacal 마사지 수십 년 동안 사용 되었습니다, 비록 사용할 수 설명 작성에서 배울 하기가 어렵습니다. 이 게시는 시간과 cloacal 마사지 학습에 관련 된 불확실성을 줄일 것입니다.
Cloacal 마사지를 사용 하 여 새 들에서 수집 하는 정액 운동 성 평가4,7 또는8인공 수정 대 한 즉시 사용 하거나 고급 이미징, DNA 추출 등 다른 용도 대 한 동결 수 있습니다. Passerine 새에서 정액 샘플 작은 하지만 밀도가 포장된 정자를 포함. DNA는 정자9의 특수 보호 기능을 극복 하기 위해 수정 편의상 상업 추출 키트를 사용 하 여 추출 됩니다. 추출 후 정자 telomeres 정량10를 사용 하 여 측정 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Microhematocrit 모세관</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>모든 공급업체를 사용할 수 있습니다. 더 작은 튜브는 치핑 스패로우와 같은 매우 작은 참새류 조류와 같이 작은 정액 샘플을 수집하는 데 더 효과적일 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Any</td><td></td><td>DNA 추출 전에 정액 샘플을 보관하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>시그마-알드리치</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마-알드리치</td><td>10708976001</td><td>모든 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>모든 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>793566</td><td>모든 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>모든 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 마이크로 키트</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Qiagen QIAamp DNA 마이크로 키트를 특별히 권장합니다. 이 DNA 추출 프로토콜은 다른 상용 키트와 함께 시도되었지만 거의 성공하지 못했습니다. 그 이유는 우리에게 알려져 있지 않습니다.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

조류 정액 컬렉션 cloacal 마사지와 정액에서 dna의 분리

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

정액의 컬렉션은 다양 한 정자의 품질, 정자 telomere 역학, 그리고 epigenetics 관련 된 연구를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 유용할 수 있습니다. 새 생물학 연구에 널리 사용 되는 과목 이며 반복된 정자 샘플을 포함 하는 연구에 이상적입니다. 그러나, 몇 가지 리소스는 그 수집 및 조류 정액에서 DNA를 추출 하는 방법을 배울 하고자 현재 사용할 수 있습니다. 여기는 cloacal 마사지, 조류 정자를 수집 하기 위한 부드러운, 비-침략 적 수동 기술에 설명 합니다. 비록이 기술은 문학에서 설립, 그것은 사용 가능한 설명에서 배울 어려울 수 있습니다. 우리는 또한 상업적인 추출 키트를 사용 하 여 수정 하는 조류 정액에서 DNA를 추출에 대 한 정보를 제공 합니다. Cloacal 마사지는 생식 상태에서 어떤 중간 소형 남성 조류에 쉽게 사용할 수 있습니다. 컬렉션, 다음 정액 운동 성 분석에 대 한 즉시 사용 하거나 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 DNA 추출에 대 한 동결 될 수 있습니다. 이 추출 프로토콜 조류 정자에 대 한 세련 되었고 여러 passerine 종 (통행 인 domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus및 Turdus migratorius에서에서 수집 된 샘플에서 성공적으로 사용 되었습니다. )와 1 개의 columbid (비둘기 리비아).

Cloacal 마사지 그리고 DNA 추출을 사용 하 여 설명된 프로토콜 여러 passerine 종과 한 columbid (표 1)에서 수행 되었습니다. 정액 샘플 cloacal 마사지에 의해 수집 된에 정자의 존재는 400 배 확대 (그림 3)에서 복합 현미경 희석된 샘플의 작은 금액을 확인 하 여 확인 되었다. 집 참새는 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여에서 수집 하는 정액 샘플에서 DNA를 추출, 젤 전기 이동 법 (세 가지 예제는 그림 4에서 볼 수 있습니다) DNA 사다리와에 8 개의 샘플 실행 되었습니다. 번짐 없이 독특한 밴드 고품질 DNA의 성공적인 분리를 나타내는 샘플 레인의 모든 8에서 볼 수 있었다. 이 프로토콜을 사용 하 여 추출 하는 다른 모든 샘플 (참조 표 1) 분 광 광도 계...

이 프로토콜 cloacal 마사지를, 조류, 그리고 수정 상업 추출 키트를 사용 하 여 새 정자에서 DNA 추출에서 정액을 수집 하는 비-침략 적 수동 기술에 설명 합니다.

조류 정액 컬렉션 Cloacal 마사지와 정액에서 DNA의 분리

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

이 절차의 전반적인 목표는 수컷 조류로부터 정액을 채취하고 정액 샘플에서 DNA를 분리하는 것입니다. 이 방법은 정자 경쟁 및 후성유전적 유전과 관련된 행동 및 진화 생태학의 핵심 질문들에 답하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사용법이 쉽다는 점입니다.총배설강 마사지는 현장이나 실험실에서 빠르게 수행할 수 있으며, DNA 추출 방법은 시판 키트를 수정하여 사용합니다. 이 기술은 번식기 동안 야생 조류나 사육 조류에 적용할 수 있으며, 특정 사육 환경에서는 연중 내내 효과적일 수 있습니다. 비우세 손으로 밴더 그립(bander's grip)을 사용하여 생식 활동 중인 수컷을 잡으십시오.그 다음, 복측이 손바닥에 닿게 하고 머리가 손바닥의 외측 가장자리에 오도록 하여 우세손으로 옮깁니다. 이제 새끼손가락, 약지, 중지를 사용하여 머리와 몸통을 가볍게 고정합니다. 이렇게 하면 조류의 총배설강과 꼬리가 노출됩니다.다리는 느슨하게 두거나 손바닥을 사용하여 가볍게 고정할 수 있습니다. 다음으로, 우세손의 검지와 엄지를 총배설강 상단의 양쪽에 대고 가볍게 꼬집듯이 잡은 후 꼬리 방향으로 가벼운 압력을 가해 총배설강을 외번시킵니다. 조류가 정액을 생성하고 있다면 분홍색의 총배설강 점막이 분명하게 나타나야 합니다.경험이 쌓이면 생식 능력이 있는 수컷과 없는 수컷의 총배설강을 쉽게 구분할 수 있습니다. 정액을 채취하려면, 안정성을 위해 비우세손의 검지 끝부분을 꼬리 기저부의 등쪽에 놓고, 엄지 끝을 외반된 총배설강 바로 아래에 둡니다. 이때 손톱을 짧고 매끄럽게 다듬을 것을 강력히 권장합니다.이제 엄지손가락을 깊고 머리 방향으로 중간 정도의 압력을 가해 반복적으로 움직이며, 새가 사정할 때까지 총배설강 아래쪽을 유지하십시오. 이는 단 한 번의 동작에서 수십 번의 동작이 필요할 수 있습니다. 새가 사정하는 즉시, 점성이 있는 연갈색 정액을 마이크로헤마토크릿 튜브에 수집하십시오.흰색 또는 어두운 색의 물질은 오염물질이며, 혈액이 조금이라도 섞여 있다면 너무 강한 압력을 가한 것을 의미합니다. 필요에 따라 마사지를 반복하여 여러 번의 사정을 유도하십시오. DNA 추출을 위해, 샘플을 20 µL의 PBS가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.시료 내 정자의 존재를 확인하려면, 희석된 시료의 소량을 복합 현미경의 400배 배율로 관찰하십시오. 그 후, 필요할 때까지 정자 시료를 -80 °C에서 보관하십시오. 본 프로토콜은 상용 키트를 수정하여 적용한 것입니다.1 M DTT 수용액을 10 µL씩 분주하여 -20 °C에 보관하십시오. DNA 추출을 시작하기 직전에, 각 샘플당 DTT 분주액과 tris chloride 분주액을 혼합하십시오. 그다음 각 샘플에 PBS 70 µL를 첨가하고 혼합물을 볼텍싱하십시오.그 다음, 각 샘플에 DTT 버퍼 혼합물 1분량과 proteinase K 용액 10 µL를 추가합니다. 샘플을 혼합하기 위해 20초 동안 볼텍싱합니다. 이제 샘플을 셰이커가 장착된 65 °C 인큐베이터에 넣고, 부드럽게 흔들어주며 1시간 동안 배양합니다.배양 후, buffer AL 200 µL와 신선한 100% ethanol 200 µL를 첨가하고 샘플을 20초 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음 각 샘플을 스핀 컬럼으로 옮기고 6,000G에서 1분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브를 버리고 컬럼을 새 튜브에 넣습니다.컬럼에 buffer AW1 500 µL를 넣고 다시 원심분리합니다. 컬럼 수집 튜브를 다시 버리고 새로운 튜브에 컬럼을 배치합니다. 이제 buffer AW2 500 µL를 넣고 원심분리 사이클을 반복합니다.다음으로 통과액(flowthrough)을 버리고, 스핀 컬럼을 다시 원심분리기에 넣어 20,000G에서 3분 동안 원심분리합니다. 그 후 컬렉션 튜브를 버리고 컬럼을 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 이제 컬럼 멤브레인 위에 직접 buffer AE 35 µL를 첨가하고, 상온에서 5분 동안 DNA가 용출되도록 둡니다.그다음 60초 동안 원심분리를 하여 DNA가 포함된 용출 버퍼를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이제 컬럼을 폐기하고 DNA를 -80 °C에서 보관합니다. 설명된 총배설강 마사지 및 DNA 추출 방법은 여러 참새목 종과 한 종의 비둘기목 종에 성공적으로 적용되었습니다.추출된 DNA의 젤 전기영동 결과에서 스미어 현상 없이 뚜렷한 밴드가 나타나면, 이는 고순도의 DNA가 성공적으로 분리되었음을 나타냅니다. 본 예시는 참새 정액에서 추출한 DNA입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 총배설강 마사지를 통해 번식기의 수컷 조류로부터 정액 샘플을 부드럽게 채취하는 방법과 추출 키트를 사용하여 해당 정액 샘플에서 DNA를 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.숙달되면, 적절하게 수행했을 때 총배설강 마사지는 단 몇 초 만에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

남성에서 spermatids을 분리하고 활성화하기위한...

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

이 비디오는 정액에 정자가 없는 것을 특징으로 하는 상태인 무정자증(azoospermia)을 앓고 있는 환자의 부고환 정자(epirealymal spermatozoa)의 경피적 흡인을 보여줍니다. 이 절차에는 음낭 부위를 소독하고, 특수 배양 용액이 있는 주사기를 사용하여 부고환액을 흡인하고, 수집된 샘플을 처리하여 생존 가능한 정자를 분리하는 작업이 포함됩니다. 그런 다음 준비된 정자는 고급 불임 치료 절차에 사용할 준비가 됩니다.

경피적 부고환 정자 흡인 및 처리를 위한 기술

남성 생식계열의 새로운 돌연변이는 다음 세대에서 건강에 해로운 결과에 기여할 수 있습니다. 여기에서는 환경 인자에 의해 유도된 수컷 생식 세포의 돌연변이를 정량화하기 위한 형질전환 설치류 모델의 사용 프로토콜에 대해 설명합니다.

형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

이 논문에서 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 기술 및 정자 생리학 연구에 응용 프로그램의 성능에 설명 하고자 합니다.

조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

체외 수정은 실험실 인구를 유지하고 다운스트림 응용을 위한 동기화된 배아를 생성하기 위하여 모형 유기체의 다양한 통용되는 기술입니다. 여기에서는 멕시코 테트라 물고기인 Astyanax멕시코어의 다양한 개체군에 대해 이 기술을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.

아스티야낙스 멕시코의 게임테 컬렉션 및 체외 수정

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

이 프로토콜은 이온 채널 활동을 직접 기록하는 것을 목표로 전체 세포 구성에서 포유류 정자 세포의 전기 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 정자 이온 채널의 전기 생리학적 프로파일을 설명하는 데 중요한 역할을 했으며 분자 정체성과 조절을 밝히는 데 도움이 되었습니다.

포유류 정자 세포의 원형질막을 가로지르는 전기 전류 기록

이 프로토콜은 정자 운동성 특성과 thigmotaxis를 활용하여 DNA 단편화 지수가 낮은 고품질 정자를 스크리닝하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 U자형 수평 수영 레인을 사용하여 고품질 정자가 완충 방울을 통해 반대쪽에 도달할 수 있도록 하고 죽은 정자, 세포 파편 및 불순물은 배제합니다.

낮은 DNA 단편화 지수로 고품질 정자를 준비하기 위한 U자형 수평 수영 기술

이 절차는 2H2O 또는 U13C 포도당으로 안정 동위원소 표지를 사용하여 수정 중에 정자에서 난모세포로 전달되는 대사 산물을 확인한 후 대사체 분석을 수행하는 것을 목표로 합니다. 중수소 표지 된 씨수말은 표지되지 않은 댐과 짝짓기를 합니다. 수집된 착상 전 배아는 질량 분석법으로 분석하여 모계(비중수소화된) 대사 산물에서 부계(중수소화된) 대사 산물을 분류합니다.

Stable Isotope In-Vivo Labeling for Mass-Spectrometry Identification of Paternal Metabol Ites Transport to Spermation During fertilization (수정 중 정자에서 난모세포로 전달된 부계 대사산물의 질량 분광법 식별을 위한 안정 동위원소 생체 내 라벨링)

이 프로토콜은 냉동 보존된 말 정액에서 생존 가능한 체세포(SCs)를 분리하는 간단한 미세 흡인 기법을 제시합니다. 전통적인 방법과 달리, 이 기술은 장기간 시험관 배양을 피하고 정자 오염을 극복하여 체세포 클로닝에 즉각적으로 활용할 수 있게 합니다.

클로닝을 위한 핵 기증자로서 냉동 보존된 말 정액에서 체세포를 분리하는 간단한 미세 흡기 기법

배우세요 조류 정액 수집을 위한 항문 마사지 기법과 정액에서 고품질 DNA를 분리하는 방법을. 이 비침습적 기술은 야외 및 실험실 환경에서 번식기 수컷 조류에 적용 가능하며 유전학 및 후성유전학 연구에 활용됩니다.

조류 정액 컬렉션 Cloacal 마사지와 정액에서 DNA의 분리

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