Name: 액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 학습하세요 HS-MRM 분석법을 이용하여 이온 이동성 분리와 고분해능 질량 분석을 결합해 바이오제약 단백질에 존재하는 저농도 숙주 세포 단백질을 정량화하는 방법을. 이 기법은 펩타이드 바이오마커 정량 및 생물학적 치료제 특성 분석에 활용됩니다.

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저자는 레슬리 Malouin 및 바다 기업에서 토니 Catlin 그림 6의 원고를 준비 하 고 감사 하 고 싶습니다.

1. infliximab 다이제스트 (~ 24 h 절차)의 준비
<ol><li>50mm 염화 중 탄산염, 1% 음이온 계면 활성 제 50mm NH4HCO3, 500 m m dithiothreitol (DTT) 50mm NH4HCO3, 및 50 mM NH4HCO3500 m m iodoacetamide (IAM)의 신선한 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>50mm NH4HCO3의 750 µ L에 infliximab mAb (10mg/mL)의 200 µ L와 1%의 음이온 계면 활성 제 용액의 50 µ L을 추가 하 고 0.05% 음이온 계면 활성 제 존재 60 ° C에서 15 분 동안 단백질을 변성.</li>
	<li>500 mM DTT의 40 µ L을 추가 하 고 20mm DTT의 면 전에 서 60 ° C에서 60 분에 대 한 샘플을 줄일.</li>
	<li>500 mM IAM의 20 µ L을 추가 하 고 ~ 10 mM IAM의 어둠 속에서 실 온에서 30 분에 대 한 샘플을 알.</li>
	<li>MS 시퀀싱 급 리스 C/trypsin의 20 µ g를 포함 하는 유리 유리병에 microcentrifuge 튜브의 내용을 추가 하 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 소화</li>
	<li>MS 시퀀싱 급 리스 C/트립 신 다이제스트 샘플 하룻밤 (12-15 h) 37 ° c.에서의 20 µ g를 포함 하는 다른 유리 유리병을 소화 샘플을 전송 하 여 두 번째 효소 aliquot (20 µ g)를 추가</li>
	<li>하룻밤 베이스 후 100% 포 름 산 (FA)의 5 µ L을 추가 하 고 산 성 정한 음이온 계면 활성 제를 분해를 37 ° C에서 30 분에 대 한 다이제스트를 품 어.</li>
	<li>음이온 계면 활성 제의 불용 성 구성 요소 침전을 원심 분리기에 4000 x g에서 15 분에 대 한 다이제스트 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>~ 1000 µ L infliximab 다이제스트의 복구를 액정 자동 샘플러 유리병; 다이제스트 농도 ~ 2 mg/mL 해야 합니다. LC/MS 시스템 분석에 대 한 준비가 될 때까지는-20 ° C에서 냉동 실에 다이제스트를 저장 합니다.</li>
</ol>2. 급상승 펩타이드 표준 (~ 30 분)
<ol><li>실 온에서 벤치에 유리 유리병에 냉동된 샘플을 배치 하 여 infliximab 다이제스트를 녹여.</li>
	<li>유리병 (유리병 각 펩 티 드의 1 nmol 포함)에 포함 된 FA H 한 토끼 phosphorylase b (포)2O 다이제스트 유리병에 1 µ M 포 라고에서 모든 6 개의 펩 티 드 표준에 대 한 재고 솔루션을 준비 하는 0.1%의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>0.1, 1, 10, 및 100 nM 펩 티 드, 0.1%를 사용 하 여 포함 하는 솔루션을 얻기 위해 포 재고 솔루션의 4 x 1 mL 희석 준비 희석 용 매로 FA. 유리 튜브 (LC 자동 샘플러 튜브)에 모든 희석을 준비 하 고 모든 튜브에 배경 매트릭스로 infliximab 다이제스트의 100 µ L를 추가 합니다. 각 10 µ L 주입으로 열에 다이제스트 배경 2 µ g를 로드 합니다. 희석된 infliximab 다이제스트를 포함 하는 빈 샘플 준비 (동일한 1시 10분 희석), 아무 아군된 펩 티 드와 함께.</li>
</ol>3. LC/HDMS 전자 데이터 수집 방법의 설정
주: HS MRM 인수를 설정 하는 데 필요한 단계를 요약 하는 워크플로 그림 1에 묘사 되 고 섹션 3-6에 자세히 설명 되어. 데이터 독립적인 HDMS전자 데이터 집합의 수집 각 모니터링된 펩 티 드, 분무 이온화, 다음 가장 풍부한 펩 티 드 이온의 부모 m/z의 보존 기간을 설정 하는 데 필요한 및 해당 CCS (collisional 크로스 섹션) 이온 이동성 분리에서 파생. 또한, 데이터 독립적인 집합 각 펩 티 드 선구자에 대 한 3 개의 가장 풍부한 조각 이온의 m/z에 관한 정보를 제공합니다. 워크플로 (CE 최적화)의 두 번째 단계에서는 분석 결과의 감도 조정 각 조각 이온에 대 한 높은 이온 강도를 충돌 세포 에너지 증가 됩니다. 마지막으로, 마지막 단계에서 위에서 설명한 모든 매개 변수 모니터링 각 펩 티 드에 대 한 HS MRM 기가에 소개.
<ol><li>4 중 극 비행 시간 (QTOF) 질량 분석기 (HDMSE) 독립적인 데이터 수집 방법을 사용 하 여 울트라 고성능 액체 크로마토그래피 시스템에 결합에 LC/MS 실험을 수행 합니다. 참고: 악기 구성에 관한 자세한 내용은 소재 섹션에 포함 됩니다. 이 악기는 펩 티 드 선구자10의 분리에 대 한 여행 파 이온 이동성 장치를 사용합니다.</li>
	<li>0.1% 물 (용 매 A)에서 FA와 0.1%를 포함 하는 두 모바일 단계 준비 이기 (용 매 B)에서 FA. 참고: 아군된 mAb 다이제스트의 분리에 대 한 청구 표면 하이브리드 (CSH) C18 열 (2.1 x 150 m m, 1.7 µ m 입자와 포장)를 사용 합니다.</li>
	<li>데이터 수집 소프트웨어에서 "만들기/분석 방법"에 클릭 하 고 선택 "인수를 생성 하 고 처리 하는 방법." 메서드 이름을 입력, 방법 폴더 (디렉토리)를 탐색 하 고 "다음"을 클릭</li>
	<li>"분석 유형"에 대 한 "펩 티 드 지도 (IMS),"를 선택 하 고 "악기 시스템" 탭에서 "제 사기 용 매 관리자" 악기를 선택 합니다. 200 µ L/분 사용 용 매 B 30 분에서 뒤에 2 분 열 세척과 9 분 평형 40 %1에서 그라데이션 차입의 유량에서 펩 티 드 분리를 달성, 50 분의 총 런타임은 이러한 실험 소개 그라데이션 설정 편집 LC 메서드 편집기에서 매개 변수입니다.</li>
	<li>"악기 시스템" 탭에서 "샘플 관리자" 악기를 선택 합니다. 샘플 온도 10 ° C와 60 ° c 열 온도를 설정합니다</li>
	<li>긍정적인 이온 30000 FWHM의 전형적인 해결 능력으로 ESI 감도 모드에서에서 QTOF 질량 분석기를 작동 합니다. 참고: 낮은 에너지 (MS 채널 1 스캔에 대 한 6 V)와 높은 에너지 (15-40 V 경사로 사이 LC/HDMSE 는 빠르게 검사 (충돌 셀)에 충돌 에너지를 교류를 수집 하 여 운영 하는 독립적인 데이터 수집 (디 아) 모드 MS 채널 2에서에서 전조 선택 없이 조각화 스펙트럼 생성).<ol>
<li>데이터 수집 소프트웨어에 기본 소스 관련 MS 매개 변수를 입력: "내 작품/악기 시스템,"에서 "Vion IMS Qtof" 탭을 선택 하 고 "도구" 메뉴에서 이러한 매개 변수를 입력: 3.0 k v 모 세관 전압, 100 ° C 소스 온도, 100 V 소스 오프셋, 50 L/h 콘 가스 흐름, 그리고 40 V 콘 전압. Desolvation 온도 250 ° C, 500 L/h, desolvation 가스 유량 및 설정 3.0 기준 모 세관 전압 kV.</li>
		<li>데이터 수집 소프트웨어에서 "만들기/분석 방법"에 클릭 하 고 선택 "인수를 생성 하 고 처리 하는 방법." 메서드 이름을 입력 하 고 메서드 폴더 (디렉토리)를 이동한 다음 클릭 합니다 "다음."</li>
		<li>"분석 유형"에 대 한 "펩 티 드 지도 (IMS),"를 선택 하 고 "악기 시스템" 탭에서 "Vion IMS QTof" 악기를 선택 합니다. 마침 클릭 합니다 "." 참고: 새로 만든된 LC/HDMSE 방법 "악기 방법 구성" 화면에서 자동으로 열립니다.</li>
		<li>"설정" 탭에서 이러한 매개 변수를 입력: 3.0 k v 모 세관 전압, 소스 온도 100 ° C, 250 ° C desolvation 온도, 50 L/h 콘 가스 흐름, 그리고 500 L/h desolvation 가스 흐름.</li>
		<li>"실험" 탭 설정에서 "높은 정의 MSE"를 선택 하 고 선택 "분석 방법은 런타임입니다." "검색 설정" 탭에서 이러한 매개 변수를 입력: 낮은 질량, 100; 높은 질량, 2000; 그리고 검색 시간, "CE" 탭에서 400 양 낮은 에너지 설정에 대 한 "6 V"를 입력 하 고 "사용 안 함 데이터 감소" 체크를 확실히 확인 대 40 15에서 에너지 램프를 선택.</li>
		<li>50 ng/mL, 신 enkephalin (르) 0.1%와 50% 이기에 준비의 솔루션에 주입 잠금 질량 캘리브레이션 데이터 수집 중에 10 µ L/min의 유량에서 FA. 참고: 잠금-대량 데이터 같은 대량 범위 같은 획득 율을 사용 하 여 모든 5 분 획득 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(열에 로드 하는 금액은 각 펩 티 드 표준에 대 한 100 fmol) 샘플의 10 µ L를 주입 하 여 위에서 설명한 LC/HDMSE 분석 결과 사용 하 여 10 nM, 포 아군 샘플을 분석 합니다.</li>
</ol>4. 충돌 에너지 (CE) 최적화를 위한 Tof MRM 방법의 설정
<ol><li>LC/HDMS전자 데이터 집합에서 보존 기간, 선구자, 및 각 포 펩 티 드에 대 한 조각 이온 m/z를 얻을. M/z와 가장 풍부한 대 한 충전 상태를 유지 선구자 이온 및 가장 풍부한 해당 3 조각 이온. 참고: 일반적으로 LC/HDMSE 분석 결과 의해 기록 된 낮은 에너지 및 에너지 스펙트럼의 예는 그림 2에 표시 됩니다.</li>
	<li>SRM/MRM 실험에서 충돌 에너지 (CE) 최적화를 사용 하 여 각 펩 티 드23에 대 한 최고의 신호를 얻으려면.<ol>
<li>데이터 수집 소프트웨어에서 "만들기/분석 방법"에 클릭 하 고 선택 "인수를 생성 하 고 처리 하는 방법." 메서드 이름을 입력, 방법 폴더 (디렉토리)를 탐색 하 고 "다음"을 클릭</li>
		<li>"분석 유형," 선택 "계량" "계량 분석 결과 크로마 Tof 2D"를 선택 하 고 클릭 합니다 "." "악기 시스템" 탭에서 "Vion IMS QTof"를 선택 하 고 마침 클릭 합니다 "." 참고: 새로 만든된 Tof MRM 메서드는 "악기 방법 구성" 화면에서 자동으로 열립니다.</li>
		<li>"설정" 탭에서 이러한 매개 변수를 입력: 3.0 k v 모 세관 전압, 소스 온도 100 ° C, 250 ° C desolvation 온도, 50 L/h 콘 가스 흐름, 그리고 500 L/h desolvation 가스 흐름.</li>
		<li>"실험" 탭 설정에서 "함수 테이블"을 선택 하 고 선택 "하나 이상의 MS, MSM 또는 MRM 기능." 아래쪽 화살표를 사용 하 여, 3 "전환" (가장 풍부한 전조와 그것의 가장 풍부한 조각 이온의 3의 조합)를 입력 하 여 각 펩 티 드에 대 한 "Tof-MRM" 기능을 설정 합니다. 참고: Tof MRM 모드에서 높은 감도 달성 예정 된 MRM 접근을 사용 하 여.</li>
		<li>"Tof-MRM" 함수 편집기에서 선택 각 펩 티 드 (적어도 1 분 긴), 대 한 보존 시간 창 펩 티 드 차입 순서에 따라 정렬 합니다. "Tof-MRM" 함수 편집기에서 삽입 펩 티 드 선구자 m/z와 제품 m/z; 펩 티 드 선구자;에 대 한 "낮은" (창 4 다) 쿼드 격리 창 선택 100 밀리초; 고정된 검색 시간을 선택 14-36 V의 범위에서 12 개의 다른 충돌 에너지 값을 다음과 같이 선택 하 고: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 그리고 36, 그림 3에서 예제 에서처럼. 참고: 위에서 설명한 Tof MRM 방법으로 크로마 피크 당 적어도 10 데이터 포인트 각 전환에 지정 된 각 CE에 대해 수집 됩니다. 데이터 파일 크기를 줄이려면 조각 이온의 신호 (창 6-다) "넓은" 옵션을 선택 합니다. CE 최적화 값의 예는 표 2에 표시 됩니다.</li>
		<li>(열에 로드 하는 금액은 각 펩 티 드 표준에 대 한 100 fmol) 샘플의 10 µ L를 주입 하 여 위에서 설명한 Tof MRM 분석 결과 사용 하 여 10 nM, 포 아군 샘플을 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 펩 티 드 선구자의 이온 이동성 분리를 사용 하 여 펩 티 드 정량화에 대 한 최종 HS MRM 수집 방법의 설정
<ol><li>데이터 수집 소프트웨어의 "조사" 메뉴에서 모든 펩 티 드에 대 한 각 CE에 대해 생성 된 모든 11 크로마 흔적을 표시 하 고 봉우리는 "처리 옵션/작업" 도구 모음;에서 "통합" 버튼을 사용 하 여 통합 높은 피크 지역 각 전환에 대 한 최고의 CE 표시 됩니다.</li>
	<li>시각적으로 각 펩 티 드의 3 조각에 대 한 최고의 피크 넓이 비교 하 고 유지만 최고 "전환" (조각 이온 가장 강한 신호를 생성 하는); 표 2는 최고 4 개의 포 펩 티 드에서 얻은 "전환"이 표시 됩니다.</li>
	<li>펩 티 드 당 하나의 조각 이온을 포함 하는 HS MRM 메서드를 설치. LC/HDMS전자 데이터 집합에서 각 펩 티 드 선구자의 CCS 값을 사용 합니다.<ol>
<li>"Tof-MRM" 기능 대신 "HS-MRM" 기능을 선택 하 여 이전 섹션 (제 4)에서 만든 Tof MRM 메서드를 수정 합니다.</li>
		<li>"HS-MRM" 함수 편집기에서 다음과 같은 전조 관련 매개 변수를 입력: m/z, 4 중 극 해상도: 낮은 (4 다), 충전 상태, 전조 CCS 값 및 전조 CCS 해상도: 낮은. 제품 이온의 m/z, 최적의 충돌 에너지 입력, 0.4 s와 선택의 검색 시간을 선택 "" 광범위 한 설정 (6 다) 그것의 동위의 모든 포함 하도록. 모든 4 개의 펩 티 드에 대 한 최종 HS MRM 수집 방법의 예는 그림 4에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 샘플 mAb 다이제스트 빈 시작 HS MRM 방법을 사용 하 여 (비 아군 샘플), 뒤에 다음과 같은 농도의 4 복제 주사 (10 µ L 각) 분석: 0.1, 1, 10, 및 100 nM 포 펩 티 드.</li>
</ol>6. 창조의 HS MRM 데이터 집합의 분석에 대 한 처리 방법
<ol><li>HS-MRM 데이터 집합의 분석에 대 한 처리 메서드를 만듭니다.<ol>
<li>분석 방법 "HS-MRM" 데이터 수집 방법에 대 한 생성, "목적" 탭을 클릭 하 고 선택 "관리 구성 요소."</li>
		<li>"실험 유형" 드롭다운 메뉴에서 "HS MS/MS/HS-MRM" 옵션을 선택 합니다.</li>
		<li>"만들기/새 항목"을 클릭 하 고 처리 메서드 편집기에서 다음 매개 변수를 소개: 펩 티 드 보존 시간 (RT), 전조 충전 상태, 전조 m/z, 그리고 전조 드리프트 시간 (DT). 조각 이온에 대 한 m/z 및 충전 상태를 입력 하 고 "XIC" 추적 추출 모드를 지정 합니다.</li>
		<li>같은 "HS-MRM" 수집 방법의 "목적" 탭에서 "기본 금액"에 클릭 하 고 다음 농도 입력: 0.1, 1, 10, 및 100 nM 포 펩 티 드.</li>
		<li>"처리/추출 설정"에서 다음 매개 변수를 입력: 기본 대량 관용, 10 ppm (모든 조각 이온의 m/z)에 대 한 기본 시간, 5%; 드리프트 포 펩타이드 처리 방법의 예는 그림 5에 표시 됩니다.</li>
		<li>교정 유형에 대 한 선형 커브 피팅 1 /2 가중치 X를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 chromatograms를 통합 하 고 각 포 펩 티 드의 보정 곡선을 건설 하기 위하여 HS MRM 데이터를 처리 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutic+proteins+by+comprehensive+online+two-dimensional+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry.</a> MAbs. 4, 24-44 (2012).</li>
<li>Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+host-cell+protein+impurities+in+biotherapeutics+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry.</a> Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+tracking+of+host-cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6, 659-670 (2014).</li>
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<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).</li>
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</ol>

모든 저자는 여러 가지 시 약 및이 문서에서 사용 된 계기의 생산 물 법인의 직원.

고해상도 (Rs > 20000) 질량 분석 악기 플랫폼의 다양 한 치료 단백질의 구조적 특성에 대 한 정기적으로 사용 됩니다. 반면, MS 기반 단백질 정량화는 일반적으로에 의해 수행 SRM/MRM 저해상도 (Rs ~ 1000) 협동 사중 극 자 질량 분석기 서명 펩 티 드 단백질11,12 의 효소 분열에 의해 생성 된 사용 하 여 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. 단일 차원 컬럼에 분판 완전히 복잡 한 펩 티 드 혼합물 효소 소화에 의해 생산을 확인할 수 없습니다, 펩 티 드 공동 차입은 단일 단백질 다이제스트의 경우에 일반적인 발생. (예를 들어, 1-100 ppms HCPs의 치료 단백질에 의해 생성 하는 펩 티 드-풍부한 배경 앞의 정량화에 대 한) 매우 복잡 한 단백질 다이제스트, 감도, 정확도, 또는 SRM/MRM의 선형성에 대 한 분석 결과 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 합니다.
SRM/MRM 분석 전조/조각 중의 "독특한" 결합에만 의존 하는 unidimensional 선택 도가 있다. 이러한 이유로,이 분석 실험 실패 상황에서 펩 티 드 배경 예기치 않게 변경 될 때 (예를 들어, 의약품 샘플에 대 한 다른 정화 절차에서 얻은). 이러한 한계를 극복 하기, 우리 제안 여기는 이온 이동성 기반 고해상도 4 중 극 비행 시간 (QTOF) 하이브리드 질량 분석기에 구현 높은 선택도 (HS) MRM 분석 결과 (악기 다이어그램 그림 6 참조).
악기 관심의 펩 티 드의 선구자 이온 이동성 셀에 다른 공동 eluting (간섭) 펩 티 드 선구자에서 분리, 4 중 극에 선구자의 전체 동위 봉투를 격리 하 고 고정 ce에 조각 된 충돌 셀입니다. 그것의 가장 풍부한 펩 티 드 조각에 의해 생성 하는 신호는 선택적으로 못 살게 굴지의 대량 지역 모든 이온, 보다는 오히려 비행 튜브로 전체 검사와 마찬가지로 미는 주파수 (대상 향상), 조정 하 여 더 향상 됩니다. 펩 티 드 부 량이 조각 이온에 의해 생성 하는 높은-MS-해상도 (Rs ~ 30000) 신호를 사용 하 여 수행 됩니다. SRM/MRM 분석 실험과 비교해, HS MRM 분석 결과 선택도의 두 개의 추가 수준을 제공 합니다: 두 번째 TOF 분석기의 증가 대량 해결책에 의해 제공 하나 전조 수준 이온 이동성 분리에 의해 제공 됩니다. 이러한 선택도 개선에 의해 가져온 결과 그림 7에 표시 된 3 개의 크기 순서에서 방해의 무료는 HS MRM chromatograms에서 볼 수 있습니다.
SRM/MRM 분석 달리는 HS MRM 분석 실험을 최적화 하기 위해 조정 될 수 있는 몇 가지 매개 변수: (일반적으로 0.2 분 설정) 펩 티 드 선구자, 4 극 자 격리 창 (4 다), 드리프트 시간대 RT 창 주위는 전조 (± 해당 이온 mobilogram에서 전조 피크의 FWHM), 그리고의 조각 이온 (20000-40000) MS 해상도. HS-MRM 분석 실험은 매우 민감한: 검색 된 각 포 펩 티 드에 대 한 최저 금액은 1 femtomole에 열 (또는 0.1 nM 펩 티 드 농도 점에서). 펩 티 드 MW를 고려할 때 (정확한 MWs 표 1 참조), 양을 발견에 열 1-2 페이지, 순서 열 mAb 다이제스트에서 배경 펩 티 드의 상당히 높은 금액 (2 µ g)와 함께 로드 되는 동안.
아군된 펩 티 드 파생 했다 전장 포 단백질 (97.2 kDa)의 분자량을 고려 하 여 분석 결과 고 풍요 배경 이온의 존재는 단백질 불순물의 50 ppm 검출 수 있다. (5-10 ppm) 검출의 더 낮은 한계 더 낮은 분자량 HCPs (10-20 kDa)에 대 한 달성할 수 있다. 분석 결과 3 개의 크기 순서 (에서 같이 보정 곡선 그림 8에서), 그것은 1-1000 ppm 범위에서 HCPs를 측정할 수 있는 즉 다룹니다. 또한, 표 3에 나와 있는 HS MRM 분석 실험의 재현성 피크 면적 RSDs 15% 보다 더 작은 분자 SRM/MRM 분석 실험의 재현성 매우 잘 일치 합니다.
우리 아군된 펩타이드 표준 단일 클론 항 체 (mAb) 소화에서의 정량화에 대 한 새로운 분석 결과의 기능을 탐색 하 고 그것의 감도 넓은 동적 범위 (적어도 3 개의 크기 순서)를 일반적으로 커버 하는 유틸리티 설명 HCP 분석에서 발생 했습니다. 모든 6 개의 펩 티 드 기준 0.1로 낮은 농도에서 발견 된 높은 풍부 펩 티 드 배경 (mAb 다이제스트 로드에-열 2 µ g) 존재 nM (1 femtomole 2.1 m m ID 컬럼에 열에 로드 된). 통합 함으로써 타겟된 HRMS와 이온 이동성 전조 분리, HS MRM 분석 결과 바이오의 여러 일괄 처리에서 여러 HCPs에 대 한 빠르고, 높은 처리량 모니터링 분석 결과 되기 위한 큰 잠재력이 있다.

산업 설정에서 큰 생체 (단백질)의 정량화는 현재 기반 immunoassays (예를 들어, ELISAs), 여러 장점으로 인해 주로: 감도, 높은 처리량, 사용의 용이성 및 샘플 당 낮은 비용. 하지만 그들은 일반적으로 제공 총 HCP 농도 (일반적으로 ppm 또는 표현 ng HCP/mg mAb)을이 생물학 분석 실험 단백질 치료제에 낮은 풍부한 단백질 불순물 (호스트 세포 단백질 (HCPs)의 1-100 ppm) 분석에 적용 하면, 식별 하 고 개별 HCP 오염 물질을 측정할 수 없습니다. 여러 MS 기반 분석 최근 ELISAs를 보완 하거나 ELISAs 실패1,2,3,4,,56 을 제공 하는 정보를 제공 하도록 개발 되었습니다. , 7 , 8 , 9. 샘플 복잡성과 HCP 펩 티 드 농도 (적어도 3 배나)에 넓은 동적 범위에 걸쳐 검색 요구 사항, 때문에 광범위 한 샘플 분류를 입찰 하는 다차원 크로마 방법 있다 전통적으로 낮은 풍부 HCPs1,2,3,,45,6,7을 식별 하는 데 고용 되었다.
자연 HCP 식별 다음 단계와 검증은 HCP 추적 (모니터링) 바이오의 여러 일괄 처리에서. 이 상황에서 단일 차원 LC/MS 방법 샘플 처리량8,9를 개선 하기 위해 제안 되었습니다. 그러나, 정확도 HCP의 동적 범위 측정 수도 영향을 받을 1 D LC/MS 분석 결과에서 의약품 펩 티 드의 압도적인 존재. 다차원 별거에 비해, 신호 간섭19,20,,2122 에 대 한 잠재적인 증가 차원 컬럼에 분리에서 때문에 대 한 확률 공동 eluting 되도록 더 많은 펩 티 드 선구자 증가 된다. 펩 티 드 선구자 컬럼에 분리 시간을 연장 하지 않고 분리 직교 의미의 명확 하 게 유리할 것 이다. 여행 웨이브 이온 이동성 (TWIM)10 밀리초에 혼잡 한 MS 스펙트럼을 해결 하는 기능이 있다. 약 500 이동성 분판 한 단일 펩 티 드의, 10의 전체 크로마 피크 폭 가정 차입 기간 동안 실행 될 수 있다 s 그리고 이온 이동성 악기에 IM 분리의 런타임 20 ms는 고려.
단백질 정량화에 대 한 대량 spectrometric 분석 지난 성공적으로 개발 되었습니다 10 년 잘 허용 사용 하 여 선택 (여러) 반응 모니터링 방법 (SRM/MRM 방법) 탠덤 질량 분석기11, 구현 12,13,14,15,,1617,18,19,20,21 ,,2223. 이 저해상도 대량 spectrometric 분석 결과의 한계 중 하나는 간섭 현상19,20,21,22 의 펩 티 드 "같은" 때 관찰은 전조와 조각 대량 다른 공동 eluting 펩 티 드 (1-다 창) 내에서 샘플에 존재. SRM/MRM 방법의 정확성을 개선 하는 방법은 두 가지: 1 옵션 포함 다른 옵션을 전조/조각 검출의 MS 해상도 증가 하는 동안 방해 선구자 이온을 제거 하는 전조 수준 추가 분리 단계 겹치는 MS 신호를 하지 마십시오. 높은 선택도 (HS) MRM 획득 모드 설명 여기 활용 방법 모두 고해상도 (rs ~ 30000) 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리 결합 하 여 펩 티 드 파편의 MS 검출. 분석 결과 설명 여기 커버 최소한 3 개의 크기 순서, 동적 범위를 일반적으로 SRM/MRM proteomics 실험17,,1824에서 관찰.
HCP 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과의 유틸리티는 단일 클론 항 체 다이제스트에서 다양 한 농도 (0.1-100 nM 범위)에서 아군 6 펩 티 드 기준 생산 신호의 선형성을 모니터링 하 여 시연 했다.

<table><tbody><tr><td>Vion IMS Qtof 질량분석기</td><td>Waters</td><td>186009214</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class Quaternary Solvent Manager (QSM)</td><td>Waters</td><td>186015041</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM)</td><td>Waters</td><td>186015040</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class Column Manager (CM)</td><td>Waters</td><td>186015043</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 중탄산염</td><td>시그마 Aldrich</td><td>40867-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC 컬럼, 1.8 &마이크로; m 입자</td><td>Waters</td><td>186005298</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>포름산, LC/MS용 용리액 첨가제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56302-10X1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard</td><td>Waters</td><td>186006011</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAM)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>I-1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>LC 바이알(12x32 mm 유리 바이알, 스크류 넥)</td><td>Waters</td><td>186000327c</td><td></td></tr><tr><td>Leucine Enkephalin acetate salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9133-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 2.0 mL tube, (2x50)</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 &micro; g)</td> <td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>물, LC / MS 등급</td><td>시그마 Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td></td></tr></tbody></table>

액체 크로마토그래피 이온 이동성 qtof 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 hs mrm 분석 결과

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

낮은 레벨 (1-100 ppm) 단백질 불순물 (예: 호스트 세포 단백질 (HCPs)) 단백질 biotherapeutics의 분석은 도전 분석 결과 높은 감도 넓은 동적 범위를 필요로 합니다. 질량 분석 기반 정량화 분석 실험 단백질에 대 한 일반적으로 뒤에 선택적 반응 모니터링/다중 반응 감시 (SRM/MRM) 정량화 저해상도 (Rs ~ 1000) 탠덤을 사용 하 여 펩 티 드의 단백질 소화를 포함 4 극 자 질량 분 서 계입니다. 이 방법의 제한 사항 중 하나 때 관심의 펩타이드는 "동일한" 전조와 조각 질량 (m/z 값)에서 다른 공동 eluting 펩 티 드 (1-다 창) 내에서 샘플에 관찰 하는 간섭 현상입니다. 이 현상을 방지 하려면 다른 대량 spectrometric 접근, 고해상도 (rs ~ 30000) 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리 결합 하 여 높은 선택도 (HS) MRM 분석 결과 제안 한다 펩 티 드 파편의 MS 검출. 우리는 낮은 풍부 펩타이드 표준 단일 클론 항 체 (mAb) 다이제스트에 아군과 감도 및 동적 범위 (최소 3 배나) 일반적으로 HCP에 달성 있다는 증명 계량에이 방법의 기능 탐구 분석입니다. 모든 6 개의 펩 티 드 기준 0.1로 낮은 농도에서 발견 된 높은 풍부 펩 티 드 배경 (mAb 다이제스트 로드에-열 2 µ g) 존재 nM (1 femtomole 2.1 m m ID 컬럼에 열에 로드 된). 토끼 phosphorylase (97.2 kDa), 아군된 펩 티 드 파생 했다 MW를 고려할 때이 분석 결과의 LOQ는 50 ppm 보다 낮습니다. 피크 넓이의 상대 표준 편차 (RSD) (n = 4 복제) 조사 전체 농도 범위에 걸쳐 15% 미만 했다 (0.1-100 nM 또는 1-1000 ppm)이이 연구에서.

6 phosphorylase b 펩타이드 표준 포 펩 티 드 혼합물에 포함 된 개별 시퀀스 보존 시간을 함께 표 1에 표시 되 고 그들의 가장 풍부한 선구자 HDMSE 에서 관찰 실험. 높은 선택도 (HS) MRM 분석 결과의 개발의 첫 번째 단계는 해당 가장 함께 각 포 펩타이드의 차입 시간 설정 하 HDMS전자 데이터 집합의 인수 풍부한 전조와 3 개의 가장 풍부한 조각. 그림 2 HDMS전자 스펙트럼 중 포 펩 티 드 (Pep 6) infliximab 다이제스트에 아군에 대 한 인수를 표시 합니다. 3 최고 각 펩 티 드에 대 한 "전환" (선구자 및 조각 질량의 조합)을 설정한 후 Tof MRM 실험 각 펩 티 드에 대 한 발생 하는 신호를 극대화 하기 위해 최적의 충돌 에너지를 찾기 위해 수행 됩니다. CE 최적화 실험의 결과 표 2에 요약 되어 있습니다. 최종 HS MRM 분석 결과 최고 각 펩 티 드에 대 한 "전환"을 유지 하 고 모든 아군된 샘플을 분석 하는 데 사용 됩니다 (그림 4 참조). HS-MRM chromatograms 조사 모든 농도에서 4 포 펩 티 드에 대 한 생성의 예는 그림 7에 표시 됩니다. 4 교정 곡선 얻은 각 펩 티 드 다음 그림 7에서 강조 하는 HS MRM 봉우리의 통합 그림 8에 표시 됩니다. 또한, 피크 지역 상대 표준 편차, 계산된에 따라 4 복제 주사는 4 테이블 표 3에 표시 된 요약.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>펩 티 드</td>
			<td colspan="2">펩 티 드</td>
			<td>보존</td>
			<td colspan="4">충전 상태</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">시퀀스</td>
			<td>시간 (분)</td>
			<td>+ 1</td>
			<td>+ 2</td>
			<td>+ 3</td>
			<td>+ 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 1</td>
			<td colspan="2">VLYPNDNFFEGK</td>
			<td>19.4</td>
			<td>1442.6951</td>
			<td>721.8512</td>
			<td>481.5699</td>
			<td>361.4292</td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>1874.9065</td>
			<td>937.9569</td>
			<td>625.6404</td>
			<td>469.4821</td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 3</td>
			<td colspan="2">IGEEYISDLDQLRK</td>
			<td>18.9</td>
			<td>1678.8646</td>
			<td>839.9360</td>
			<td>560.2931</td>
			<td>420.4716</td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>1440.7369</td>
			<td>720.8721</td>
			<td>480.9172</td>
			<td>360.9397</td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>1890.0080</td>
			<td>945.5076</td>
			<td>630.6742</td>
			<td>473.2574</td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17.7</td>
			<td>1262.5939</td>
			<td>631.8006</td>
			<td>421.5362</td>
			<td>316.4039</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 포 펩타이드 표준 infliximab 다이제스트에 아군 질량 준비 믹스에 포함 된. 펩 티 드 보존 시간과 그들의 가장 풍부한 선구자 (굵게 강조 표시)를 테이블 형식으로 표시 됩니다.
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>펩 티 드</td>
			<td colspan="2">펩 티 드</td>
			<td>보존</td>
			<td colspan="2">펩 티 드 선구자</td>
			<td colspan="3">가장 풍부한 조각 이온/충전</td>
			<td>최적</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">시퀀스</td>
			<td>시간 (분)</td>
			<td>m/z 및 충전</td>
			<td>드리프트 시간 (밀리초)</td>
			<td>난</td>
			<td>2 세</td>
			<td>3 세</td>
			<td>CE (V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>625.6404 (+ 3)</td>
			<td>6.2</td>
			<td>714.3781 (+ 1)</td>
			<td>807.4177 (+ 2)</td>
			<td>827.4621 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>720.8721 (+ 2)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>865.4050 (+ 1)</td>
			<td>964.4734 (+ 1)</td>
			<td>1214.5688 (+ 1)</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>630.6742 (+ 3)</td>
			<td>6.3</td>
			<td>642.3570 (+ 1)</td>
			<td>689.8391 (+ 2)</td>
			<td>832.4236 (+ 2)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>흠 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17.7</td>
			<td>631.8006 (+ 2)</td>
			<td>7.0</td>
			<td>830.3931 (+ 1)</td>
			<td>945.4200 (+ 2)</td>
			<td>1016.4571 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. Tof MRM 최적화 실험의 결과: 해당 최적화 된 충돌 에너지와 함께이 연구에서 계량 하 각 포 펩 티 드의 3 개의 가장 풍부한 조각 표시 됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>광</td>
			<td>금액</td>
			<td colspan="6">흠 2 피크 지역 (표 3A)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>열에 (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>평균</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>439</td>
			<td>462</td>
			<td>431</td>
			<td>456</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>5121</td>
			<td>4842</td>
			<td>5198</td>
			<td>4842</td>
			<td>5001</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>63853</td>
			<td>64279</td>
			<td>66111</td>
			<td>62509</td>
			<td>64188</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>612392</td>
			<td>605553</td>
			<td>613229</td>
			<td>611004</td>
			<td>610545</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>광</td>
			<td>금액</td>
			<td colspan="6">흠 4 피크 넓이 (테이블 3B)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>열에 (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>평균</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>275</td>
			<td>359</td>
			<td>325</td>
			<td>288</td>
			<td>312</td>
			<td>12.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>3559</td>
			<td>3694</td>
			<td>3287</td>
			<td>3754</td>
			<td>3574</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>45259</td>
			<td>45775</td>
			<td>42976</td>
			<td>45548</td>
			<td>44890</td>
			<td>2.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>459374</td>
			<td>467927</td>
			<td>436272</td>
			<td>458994</td>
			<td>455642</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>광</td>
			<td>금액</td>
			<td colspan="6">흠 5 피크 넓이 (테이블 3C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>열에 (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>평균</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>3194</td>
			<td>3243</td>
			<td>3202</td>
			<td>3257</td>
			<td>3224</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>31464</td>
			<td>31150</td>
			<td>31464</td>
			<td>31433</td>
			<td>31378</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>313638</td>
			<td>320712</td>
			<td>311943</td>
			<td>311943</td>
			<td>314559</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>2845736</td>
			<td>2840031</td>
			<td>2882006</td>
			<td>2864052</td>
			<td>2857956</td>
			<td>0.7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>광</td>
			<td>금액</td>
			<td colspan="6">Pep 6 피크 넓이 (차원 테이블)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>열에 (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>평균</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>583</td>
			<td>440</td>
			<td>440</td>
			<td>488</td>
			<td>13.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>6429</td>
			<td>6429</td>
			<td>6848</td>
			<td>6623</td>
			<td>6582</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>71295</td>
			<td>70400</td>
			<td>71563</td>
			<td>70400</td>
			<td>70915</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>707640</td>
			<td>707640</td>
			<td>694461</td>
			<td>729490</td>
			<td>709808</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3입니다. HS-MRM chromatograms의 피크 넓이 포함 하는 테이블 4 포 펩 티 드 (2, 4, 5, 및 6 Pep)에 대 한 각 LC/MS 주입 (16 LC/MS 실행 및 테스트 4 농도)에 대 한 기록. 상대 표준 편차 조사 전체 농도 범위에서 모든 펩 티 드에 대 한 15% 보다 더 나 았다.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig1.jpg"> 그림 1입니다. HS-MRM 인수 메서드를 설정 하는 데 필요한 세 단계를 요약 하는 워크플로 다이어그램. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig2.jpg"> 그림 2입니다. HDMSE 데이터의 예: (A) 낮은 에너지 스펙트럼 Pep 6 선구자 이온을 보여주는. (상위 3 가장 풍부한 조각 이온 (동그라미) Tof MRM 충돌 에너지 최적화 선택 표시 같은 펩 티 드의 B) 고 에너지 조각화 스펙트럼. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig3.jpg"> 그림 3입니다. 매개 변수는 Tof MRM 최적화 설정에 사용 되는 실험. 각 전환에 대 한 11 개의 충돌 에너지 (16 ~ 36 V의 범위)에서 테스트 되었습니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig4.jpg"> 그림 4입니다. 최종 HS MRM 방법의 예입니다. 여러 매개 변수는 각 "전환" 펩 티 드 선구자 m/z, 충전 상태 및 이온 이동성 드리프트 시간, 가장 풍부한 조각 이온, 최적의 충돌 에너지와 MS 획득 시간의 m/z를 포함 하 여 필요 합니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig5.jpg"> 그림 5입니다. HS-MRM 데이터 집합을 분석 하기 위한 처리 방법에서 사용 하는 설정입니다. 각 펩 티 드 단일 "전환" 펩 티 드 선구자 m/z에 의해 기술에 의해 모니터링 하 고 충전 상태, 가장 풍부한 조각 및 충전 상태로의 m/z와 함께 보존 기간, 예상. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig6.jpg"> 그림 6입니다. 이온 이동성 질량 분석기의 다이어그램입니다. HS-MRM 수집 모드에서 계량 되는 펩 티 드의 선구자 이온 이동성 셀, 4 중 극에 의해 분리 하 고 고정된 충돌 에너지에 조각에 다른 공동 eluting (간섭) 펩 티 드 선구자에서 분리는 충돌 셀입니다. 신호 펩 티 드 파편 이온에 의해 생산은 미는 주파수를 조정 하 여 향상 및 펩 티 드 정량화 높은 MS 해상도 사용 하 여 수행 됩니다 (> 30000) 각 펩 티 드의 가장 강렬한 단편 이온 생성 신호. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2.jpg"> 그림 7입니다. HS-MRM chromatograms 4 다른 농도 3 배나 확장에 4 포 펩 티 드에 대 한 기록 (0.1, 1, 10, 및 100 nM). (A) 흠 2 chromatograms, (B) 흠 4 chromatograms, (C) 흠 5 chromatograms, 그리고 (D) 흠 6 chromatograms. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2.jpg"> 그림 8입니다. 4 다른 농도 걸쳐 4 포 펩 티 드에 대 한 교정 곡선 (0.1, 1, 10, 및 100 nM). 각 곡선 아래 테이블은 각 테이블에서 두 번째 열에서 예상된 된 선형 응답 백분율 편차를 보여 각 주입에 대 한 기록 개별 피크 넓이 (Y-값)를 표시 합니다. (A) 흠 2 교정, (B) 흠 4 교정, (C) 흠 5 교정, 및 (D) 흠 6 교정 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리 뒤에 고해상도 (~ 30000) MS-탐지 아군된 펩타이드 표준 단일 클론 항 체에의 정량화에 대 한 펩 티 드 파편의 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리와 결합 하 여 크로마 분석 결과 설명 다이제스트입니다.

액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

HS-MRM 분석의 전반적인 목표는 펩타이드 전구체의 이온 이동도 분리와 단편 이온의 고해상도 질량 분석 검출을 결합함으로써, 펩타이드 또는 단백질 정량에 영향을 미치는 MRM 간섭 현상을 줄이는 것입니다. 이 방법은 단백질 또는 펩타이드 바이오마커 정량 및 정량 프로테오믹스는 물론, 바이오 치료제 특성 분석 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 바이오 의약품 단백질에 존재할 수 있는 저함량의 숙주 세포 단백질을 검출할 수 있다는 점입니다.먼저, 데이터 획득 소프트웨어에서 분석 방법 생성(create analysis method)을 클릭하고 생성, 획득 및 처리 방법(generate and acquire and process method)을 선택합니다. 방법 이름과 설명을 입력하고, 방법 폴더를 찾아본 후 다음(next)을 클릭합니다. 분석 유형으로는 peptide map IMS를 선택하고 다음(next)을 클릭합니다.그 다음 현재 시스템 구성을 선택하고 다음(next) 및 완료(finish)를 클릭하십시오. 새로 생성된 분석법(method)에서 기기(instruments) 탭을 클릭하고, 바이너리 용매 관리자(binary solvent manager)를 선택한 후, 0.2 mL/min의 유속에서 펩타이드 분리가 이루어지도록 그래디언트 설정을 수정하십시오. 30분 동안 용매 B를 1%에서 40%까지 그래디언트로 희석한 후, 2분간 컬럼 세척과 10분간의 평형화를 진행하여 총 분석 시간을 45분으로 설정하십시오.다음으로, 샘플 매니저를 선택하고 샘플 온도를 10 °C로, 컬럼 온도를 60 °C로 설정합니다. 기기 탭에서 Vion IMS QTof 기기를 선택합니다. 설정 섹션에서 분석기 모드로 sensitivity를 선택하고, 모세관 전압은 3 kV, 소스 온도는 100 °C, 탈용매화 온도는 250 °C, 콘 가스 유량은 50 L/h, 탈용매화 가스 유량은 500 L/h로 입력합니다.실험 탭을 클릭하고 모드에서 high definition MSE를 선택하십시오. 그런 다음 low mass에 100, high mass에 2000, scan time에 0.4 seconds를 입력하십시오. 충돌 에너지 섹션의 low energy 설정에는 6 eV를 입력하고, high energy ramp는 15에서 40 eV로 선택하십시오.획득 시간의 경우, 5분에서 30분 사이의 사용자 정의 런타임을 사용하십시오. 다음으로 옵션 탭을 클릭하고, 자동 잠금 보정 간격을 5분으로 설정하여 자동 잠금 보정 모드를 선택하십시오. 그런 다음 잠금 보정 계속 옵션을 선택하고, 자동 검출기 점검 기능이 비활성화되어 있는지 확인하십시오.현재 시스템 구성 메뉴에서 Vion IMS QTof 기기를 선택하고 도구(tools)를 클릭하십시오. 모세관 전압은 3 kV, 샘플링 콘은 40 V, 소스 오프셋은 100 V, 소스 온도는 100 °C, 탈용매 온도는 250 °C, 콘 가스 유량은 50 L/h, 탈용매 가스 유량은 500 L/h, 그리고 참조 모세관 전압은 3 kV로 입력하십시오. 앞서 설명한 LC-HDMSE 분석법을 사용하여, 미리 준비된 10 nM 가공 스파이크 시료 10 µL를 기기에 주입하여 분석하십시오.가상 펩타이드 혼합물에 포함된 6가지 포스포릴라제 B 펩타이드 표준품의 개별 서열이 머무름 시간 및 HDMSE 실험에서 관찰된 가장 풍부한 전구체와 함께 여기에 표시되어 있습니다. Infliximab 소화액에 첨가된 가상 펩타이드 중 하나의 HDMSE 스펙트럼이 여기에 표시됩니다. 데이터 획득 소프트웨어에서 분석 방법 생성(create analysis method)을 클릭하고 생성, 획득 및 처리 방법(generate and acquire and process method)을 선택하십시오.방법 이름과 설명을 입력하고, 방법 폴더로 이동한 후 다음을 클릭하십시오. 분석 유형에서는 quantify를 선택하고, Quantify Assay Tof 2D Chromatographic를 선택한 뒤 다음을 클릭하십시오. 그런 다음 현재 시스템 구성을 선택하고 다음을 클릭하여 마칩니다.새로 생성된 분석법(method)에서 기기(instruments) 탭을 클릭하십시오. 바이너리 용매 매니저(binary solvent manager)를 선택하고, 0.2 milliliters per minute의 유속에서 펩타이드 분리가 이루어지도록 그래디언트 설정을 편집하십시오. 30분 동안 용매 B를 1%에서 40%까지 그래디언트 희석한 후, 2분간 컬럼 세척과 10분간의 평형화를 거쳐 총 분석 시간을 45분으로 설정하십시오.기기 탭에서 샘플 매니저를 선택하고 샘플 온도를 10 °C로, 컬럼 온도를 60 °C로 설정하십시오. 이제 Vion IMS QTof 기기를 선택하고 설정 섹션에서 분석기 모드를 감도로 선택하십시오. 그런 다음 모세관 전압을 3 kV로, 소스 온도를 100 °C로, 탈용매화 온도를 250 °C로, 콘 가스 유량을 50 L/h로, 그리고 탈용매화 가스 유량을 500 L/h로 입력하십시오.실험 탭을 클릭하고 실험 유형(experiment type)에서 하나 이상의 MS, MSMS 또는 MRM 기능을 포함하는 기능 표를 선택하십시오. 기본 획득 기능을 삭제하고 'add plus MRM'을 클릭한 후, 런타임 섹션에서 머무름 시간 창(retention window) 파라미터를 편집하십시오. Tof MRM 기능 편집기에서 펩타이드 전구체 마스터 전하비(precursor master charge ratio)를 입력하고, 전구체 분해능(precursor resolution)을 low로 선택한 다음 전구체 전하 상태(precursor charge state)를 입력하십시오.그런 다음 생성물의 마스터 전하비에 16 electron volts의 초기 충돌 에너지, 0.1 seconds의 고정 스캔 시간, 그리고 스펙트럼 컬럼에 wide를 입력합니다. 복제 버튼을 사용하여 MRM 전이를 10개 더 추가하고, 18에서 36 electron volts 범위 내의 서로 다른 충돌 에너지 값을 사용합니다. 각 펩타이드에 대해 최적의 전이 3가지를 설정한 후, 각 펩타이드에서 생성되는 신호를 최대화하기 위한 최적 충돌 에너지를 찾기 위해 Tof MRM 실험을 수행하였습니다.다음으로, 펩타이드당 하나의 프래그먼트 이온만 포함하는 HS-MRM 메서드를 설정합니다. 이전에 생성한 Tof MRM 메서드에서 Tof MRM 기능 대신 HS-MRM 기능을 선택하여 수정하십시오. HS-MRM 기능 편집기에서 마스터 전하 비율을 입력하고, 전구체 해상도를 low로 선택한 후 전구체 전하 상태를 입력하십시오.그런 다음 전구체 CCS 값을 입력하고 전구체 CCS 분해능을 low로 선택하십시오. 생성 이온의 경우, 해당 마스터 전하비를 입력하고 최적 충돌 에너지를 선택하며, 스캔 시간을 0.4초로 설정하고 모든 동위원소가 포함되도록 wide 스펙트럼 설정을 선택하십시오. 최종 HS-MRM 분석법은 각 펩타이드에 대해 최적의 전이(transition)만을 유지하며, 모든 스파이크 시료를 분석하는 데 사용됩니다.HS-MRM 데이터 획득 방법을 위해 생성한 분석 방법에서 목적(purpose) 탭을 클릭하고 구성 요소 관리(manage components)를 선택하십시오. 실험 유형(experiment type) 아래의 드롭다운 메뉴에서 HS MSMS/HS MRM 옵션을 선택하십시오. 생성(create)을 클릭한 후 구성 요소 이름, 예상 머무름 시간, 추출 시간 창 및 전구체 마스터 전하비(precursor master charge ratio)를 입력하십시오.XIC 추출 모드를 선택하고 예상되는 CCS 값을 입력하십시오. 조각 이온의 경우, 전하 상태와 마스터 전하 비율을 입력하십시오. 그런 다음 HS-MRM 분석으로 모니터링하는 모든 펩타이드 성분을 입력하십시오.동일한 HS-MRM 분석 방법의 목적(purpose) 탭에서, 기본 양(default amounts)을 클릭하고 모든 가상 펩타이드 성분에 대해 0.1, 1, 10, 100 nanomolar를 입력하십시오. 첫 번째 값을 입력한 후, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 아래로 채우기(fill down) 옵션을 선택하여 모든 성분에 동일한 농도를 입력하십시오. 검정 곡선의 네 가지 농도 모두에 대해 동일한 절차를 반복하십시오.이제 processing 탭으로 이동하여 extraction settings를 클릭하십시오. 질량 허용 오차(mass tolerance)에 10 PPM을 입력하십시오. 그런 다음 CCS drift time tolerance를 클릭하고 CCS 허용 오차(CCS tolerance)에 5%를 입력하십시오.프로세싱 탭에서 피크 프로세싱 설정을 선택합니다. smooth 섹션에서 smoothing algorithm으로 mean을, half width로 1을, iterations로 1을 선택합니다. integrate 섹션에서 automatic peak width와 automatic detection 옵션이 모두 체크되어 있는지 확인합니다.다음으로, 처리 탭에서 대상 스크린 설정을 선택하고 RT 창에서 RT에 가장 가까운 옵션을 선택하십시오. 그런 다음 유지 시간 허용 오차에 0.2분을 입력하십시오. 정량 설정을 선택하고 검정 메뉴에서 검정 곡선 적합 유형은 선형, 가중치 유형은 1/x², 성분 값 유형은 농도, 성분 값 단위는 mmol/L, 평균값을 이용한 검정 지점 계산은 '없음'으로 선택하십시오.정량 메뉴에서 반응 값으로 영역(area)을 선택하십시오. 모든 농도에 대해 가상 펩타이드를 대상으로 생성된 HS-MRM 크로마토그램의 예시가 여기에 제시되어 있습니다. HS-MRM 피크 적분 후 각 펩타이드에 대해 얻은 검정 곡선이 여기에 표시되어 있습니다.4회 반복 주입을 기반으로 계산된 피크 면적의 상대 표준 편차를 여기에 요약하였습니다. 고선택성 MRM 분석법은 이온 이동 전구체 분리와 표적 고해상도 질량 분석 검출을 모두 포함하므로, 바이오 의약품의 여러 배치에 걸쳐 다수의 숙주 세포 단백질을 신속하게 고처리량으로 모니터링하는 분석법이 될 가능성이 큽니다. 이 영상을 시청한 후에는 Vion IMS QTof 장비에서 고선택성 MRM 분석법을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

an-hs-mrm-assay-for-quantification-host-cell-proteins-protein

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

안정 동위 원소 표준 및 안티 펩타이드 항체 (SISCAPA) 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공하기 위해 안정 동위 원소 희석 질량 분석법 (MRM - MS)과 펩티드의 커플 선호도 농축하여 캡처합니다. 여기서 우리는 부분적으로 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용하여 프로토콜을 설명합니다.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

이 프로토콜은 선택된 반응 모니터링을 사용하여 복잡한 생물학적 샘플 내 표적 단백질의 절대 정량화 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 마우스 대식세포 화학주성 신호전달 경로의 단백질을 정확하게 정량화하는 데 사용되었습니다. 표적 펩타이드 선택, 분석 개발, 정성적 및 정량적 분석이 자세히 설명되어 있습니다.

절대 단백질 정량 질량 분석을 모니터링 선정 반응

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

이 프로토콜에는 단백질, 단백질 복합물, 및 다른 유형의 샘플에 펩 티 드의 정확한 어 금 니 질량 결정에 대 한 다 각 산란과 높은 특이성 이온-교환 크로마토그래피를 사용 하 여를 설명합니다. 이 메서드는 네이티브 올리고, 충전 변종 및 혼합 단백질 견본 특성에 관해서는 품질 평가 대 한 귀중 한.

단백질 분리 및 특성에 대 한 다 각 산란 (MALS)를 결합 하는 이온 교환 크로마토그래피 (전류 구동)

이 프로토콜은 임상 샘플에서 단백질의 다중 반응 모니터링 (MRM)에 대한 트리플 쿼드러폴 질량 분광계의 사용을 소개하는 것을 목표로합니다. 우리는 샘플 준비에서 임상 샘플을 위한 데이터 분석에 이르기까지 필요한 모든 예방 조치를 취하도록 체계적인 워크플로우를 제공했습니다.

인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

의약품(DP)에서 숙주 세포 단백질(HCP)을 농축하고 단백질체 농축 비드를 사용하여 펩타이드를 검출하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 자체 제조한 단클론 항체(mAb) 원료의약품(DS)을 사용하여 시연되며, 이는 성능 측면에서 다양한 방법을 평가하고 비교하기 위한 잘 특성화된 표준 물질입니다.

제한된 분해와 결합된 농축 비드를 사용한 숙주 세포 단백질 분석

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

학습하세요 HS-MRM 분석법을 이용하여 이온 이동성 분리와 고분해능 질량 분석을 결합해 바이오제약 단백질에 존재하는 저농도 숙주 세포 단백질을 정량화하는 방법을. 이 기법은 펩타이드 바이오마커 정량 및 생물학적 치료제 특성 분석에 활용됩니다.

액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

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