액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

HS-MRM 분석의 전반적인 목표는 펩타이드 전구체의 이온 이동도 분리와 단편 이온의 고분해능 질량 분광 검출을 결합하여 펩타이드 또는 단백질 정량화에 영향을 미치는 MRM 간섭 현상을 줄이는 것입니다. 이 방법은 단백질 또는 펩타이드 바이오마커 정량화 및 정량적 단백질체학뿐만 아니라 생물 치료 특성화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 바이오 제약 단백질에 존재할 수 있는 부족한 숙주 세포 단백질을 검출할 수 있다는 것입니다.

먼저 데이터 수집 소프트웨어에서 분석 방법 생성을 클릭하고 생성 및 수집 및 처리 방법을 선택합니다. 분석법 이름과 설명을 입력하고 분석법 폴더로 이동한 후 다음을 클릭합니다. 분석 유형에서 펩타이드 맵 IMS를 선택하고 다음을 클릭합니다.

그런 다음 현재 시스템 구성을 선택하고 다음을 클릭하고 마침을 클릭합니다. 새로 생성된 Method에서 기기 탭을 클릭하고, Binary Solvent Manager를 선택하고, 그래디언트 설정을 편집하여 분당 0.2밀리리터의 유속으로 펩타이드 분리를 달성합니다. 30분 내에 용매 B를 1%에서 40%로 희석한 후 2분 컬럼 세척 및 10분 평형을 사용하여 총 45분 동안 사용할 수 있습니다.

그런 다음 Sample Manager를 선택하고 샘플 온도를 섭씨 10도로 설정하고 컬럼 온도를 섭씨 60도로 설정합니다. 기기 탭에서 Vion IMS QTof 기기를 선택합니다. 설정 섹션에서 분석기 모드에 대한 감도를 선택하고 모세관 전압에 대해 3킬로볼트, 소스 온도에 대해 섭씨 100도, 탈용매화 온도에 대해 섭씨 250도, 원뿔 가스 흐름에 대해 시간당 50리터, 탈용매 가스 흐름에 대해 시간당 500리터를 입력합니다.

실험 탭을 클릭하고 모드에 대해 고화질 MSE를 선택합니다. 그런 다음 낮은 질량의 경우 100, 높은 질량의 경우 2000, 스캔 시간의 경우 0.4초를 입력합니다. 충돌 에너지 섹션에서 저에너지 설정에 대해 6개의 전자 볼트를 입력하고 15에서 40전자 볼트 사이의 고에너지 램프를 선택합니다.

획득 시간의 경우 5분에서 30분 사이의 사용자 지정 런타임을 사용합니다. 그런 다음 옵션 탭을 클릭하고 자동 잠금 수정 간격이 5분인 자동 잠금 수정 모드를 선택합니다. 그런 다음 Continue with lock correction(잠금 수정 계속) 옵션을 선택하고 자동 감지기 검사가 비활성화되어 있는지 확인합니다.

현재 시스템 구성 메뉴에서 Vion IMS QTof 기기를 선택하고 도구를 클릭합니다. 모세관 전압의 경우 3kV, 샘플링 콘의 경우 40V, 소스 오프셋의 경우 100V, 소스 온도의 경우 섭씨 100도, 탈용매화 온도의 경우 섭씨 250도, 원뿔 가스 흐름의 경우 시간당 50리터, 탈용매 가스 흐름의 경우 시간당 500리터, 기준 모세관 전압의 경우 3kV를 입력합니다. 10마이크로리터의 시료를 기기에 주입하여 방금 설명한 LC-HDMSE 분석을 사용하여 이전에 준비된 10나노몰의 가짜 스파이크 샘플을 분석합니다.

가짜 펩타이드 혼합물에 포함된 6개의 phosphorylase B 펩타이드 표준물질의 개별 서열은 HDMSE 실험에서 관찰된 머무름 시간 및 가장 풍부한 전구체와 함께 여기에 나와 있습니다. Infliximab digest에 스파이크된 가짜 펩타이드 중 하나에 대해 획득한 HDMSE 스펙트럼이 여기에 표시됩니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 분석 방법 생성을 클릭하고 생성 및 수집 및 처리 방법을 선택합니다.

분석법 이름과 설명을 입력하고 분석법 폴더로 이동한 후 다음을 클릭합니다. 분석 유형의 경우 quantify를 선택하고 Quantify Assay Tof 2D Chromatographic을 선택한 후 다음을 클릭합니다. 그런 다음 현재 시스템 구성을 선택하고 다음을 클릭하고 마침을 클릭합니다.

새로 생성된 Method에서 Instruments 탭을 클릭합니다. Binary Solvent Manager를 선택하고 그래디언트 설정을 편집하여 분당 0.2밀리리터의 유속으로 펩타이드를 분리할 수 있습니다. 30분 내에 용매 B를 1%에서 40%로 희석한 후 2분 컬럼 세척 및 10분 평형을 사용하여 총 45분 동안 사용할 수 있습니다.

기기 탭에서 Sample Manager를 선택하고 샘플 온도를 섭씨 10도로 설정하고 컬럼 온도를 섭씨 60도로 설정합니다. 이제 Vion IMS QTof 기기를 선택하고 설정 섹션에서 분석기 모드에 대한 감도를 선택합니다. 그런 다음 모세관 전압의 경우 3kV, 소스 온도의 경우 섭씨 100도, 탈용매 온도의 경우 섭씨 250도, 원뿔 가스 흐름의 경우 시간당 50리터, 탈용매 가스 흐름의 경우 시간당 500리터를 입력합니다.

실험 탭을 클릭하고 실험 유형에 대해 하나 이상의 MS, MSMS 또는 MRM 함수를 함수 테이블을 선택합니다. 기본 획득 기능을 삭제하고, add plus MRM을 클릭하고, runtime 섹션에서 보존 기간 매개변수를 편집합니다. Tof MRM 함수 편집기에서 펩타이드 전구체 마스터 전하 비율을 입력하고, 전구체 분해능에 대해 low를 선택하고, 전구체 전하 상태로 들어갑니다.

그런 다음 시작 충돌 에너지에 대해 제품 마스터 전하 비율 16 전자 볼트, 고정 스캔 시간에 대해 0.1초, 스펙트럼 열에 대해 너비를 입력합니다. 복제 버튼을 사용하여 MRM 전환을 10개 더 추가하고 18에서 36 전자 볼트 범위의 다른 충돌 에너지 값을 사용합니다. 각 펩타이드에 대해 3개의 최상의 전이를 확립한 후, 각 펩타이드에 대해 생성된 신호를 최대화하기 위한 최적의 충돌 에너지를 찾기 위해 Tof MRM 실험을 수행했습니다.

다음으로, 펩타이드당 하나의 단편 이온만 포함하는 HS-MRM 방법을 설정합니다. Tof MRM 함수 대신 HS-MRM 함수를 선택하여 이전에 생성한 Tof MRM 방법을 수정합니다. HS-MRM 기능 편집기에서 마스터 전하 비율을 입력하고, 전구체 분해능에 대해 low를 선택하고, 전구체 전하 상태로 들어갑니다.

그런 다음 전구체 CCS 값을 입력하고 전구체 CCS 분해능에 대해 낮음을 선택합니다. 제품 이온의 경우 마스터 전하 비율을 입력하고, 최적의 충돌 에너지를 선택하고, 0.4초의 스캔 시간을 선택하고, 모든 동위원소를 포함하는 넓은 스펙트럼 설정을 선택합니다. 최종 HS-MRM 분석은 각 펩타이드에 대해 최상의 전이만 유지하며 모든 스파이크 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

HS-MRM 데이터 수집 방법을 위해 생성된 분석 방법에서 용도 탭을 클릭하고 구성 요소 관리를 선택합니다. 실험 유형 아래의 드롭다운 메뉴에서 HS MSMS/HS MRM 옵션을 선택합니다. create를 클릭하고 구성 요소 이름, 예상 머무름 시간, 추출 시간 창 및 전구체 마스터 전하 비율을 입력합니다.

XIC 추출 모드를 선택하고 예상 CCS 값을 입력합니다. fragment ion의 경우 전하 상태와 마스터 전하 비율을 입력합니다. 그런 다음 HS-MRM 분석으로 모니터링되는 모든 펩타이드 성분을 입력합니다.

동일한 HS-MRM 획득 방법의 용도 탭에서 기본 양을 클릭하고 모든 인조 펩타이드 성분에 대해 0.1, 1, 10 및 100 나노몰을 입력합니다. 첫 번째 값을 입력한 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 채우기 옵션을 선택하여 모든 구성 요소에 대해 동일한 농도를 입력합니다. 검량선의 4개 농도 모두에 대해 동일한 절차를 반복합니다.

이제 처리 탭으로 이동하여 추출 설정을 클릭합니다. 질량 허용 오차에 대해 10PPM을 입력합니다. 그런 다음 CCS 드리프트 시간 허용 오차를 클릭하고 CCS 허용 오차에 대해 5%를 입력합니다.

Processing 탭에서 최대 처리 설정을 선택합니다. 매끄럽게 섹션에서 mean을 평활 알고리즘으로, 하나는 절반 너비로, 다른 하나는 반복으로 선택합니다. 적분 섹션에서 automatic peak width와 automatic detection 옵션이 모두 선택되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 처리 탭에서 대상 화면 설정을 선택하고 RT 창에서 RT에 가장 가까운 옵션을 선택합니다. 그런 다음 보존 시간 허용 오차로 0.2분을 입력합니다. 정량 설정을 선택하고 보정 메뉴에서 검량 곡선 맞춤 유형에 대해 선형을 선택하고, 중량 유형에 대해 1 over x squared를 선택하고, 성분 값 유형에 대해 농도를 선택하고, 성분 값 단위에 대해 리터당 밀리몰을, 평균을 통한 검량점 계산에 대해 none을 선택합니다.

quantify 메뉴에서 area를 반응 값으로 선택합니다. 모든 농도에 걸쳐 가짜 펩타이드에 대해 생성된 HS-MRM 크로마토그램의 예가 여기에 제시되어 있습니다. HS-MRM 피크 적분 후 각 펩타이드에 대해 얻은 검량선이 여기에 표시되어 있습니다.

4번의 반복 주입을 기반으로 계산된 피크 면적 상대 표준 편차가 여기에 요약되어 있습니다. 고선택성 MRM 어세이는 Ion Mobility 전구체 분리와 표적 고분해능 질량 분석 검출을 모두 통합하기 때문에 바이오 의약품 배치 전반에 걸쳐 여러 숙주 세포 단백질에 대한 빠른 고처리량 모니터링 어세이가 될 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 Vion IMS QTof 기기에서 고선택성 MRM 어세이를 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.